專利名稱：一種炎癥性疾病相關(guān)的藥物靶點及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾
病相關(guān)的藥物靶點及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病主要是由活化的淋巴細胞攻擊特定的靶器官引起 的局部炎性浸潤、器官功能受累、多種并發(fā)癥的發(fā)生。免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病包括器官 特異性自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、結(jié)腸炎、克隆氏病、葡 萄膜炎、免疫細胞介導(dǎo)肝損傷、多發(fā)性肌炎及皮肌炎、橋本甲狀腺炎、慢性甲狀腺炎、甲狀腺 功能亢進、原發(fā)性膽汁性肝硬變、尋常天皰瘡、類天皰瘡、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出 血腎炎綜合征、實驗變態(tài)反應(yīng)性神經(jīng)炎、重癥肌無力、交感性眼炎、原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)萎縮、 梅毒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、男性自了性不育癥、硬皮病等，這些疾病的發(fā)生會引起多種臨床癥
狀，包括特定靶器官的功能受損，并且伴隨著疾病的復(fù)發(fā)和緩解。此外，還有一些由免疫細 胞的活化引起的局部的炎性浸潤，如超敏反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)等。上述這些疾病的共同 特點就是由抗原活化的淋巴細胞所引起，是威脅人類健康、導(dǎo)致身體狀況不良乃至引起惡 性腫瘤的重要原因。 本領(lǐng)域?qū)τ诿庖呒毎閷?dǎo)的自身免疫性疾病的病因尚不清楚。目前的研究認為免 疫細胞攻擊自身組織或器官引起的自身免疫病主要涉及MHCII分子限制的自身抗原特異 性的T細胞誘導(dǎo)的靶器官的功能受損。這些疾病給病人的身心健康及經(jīng)濟帶來很大的影 響，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，增加社會負擔(dān)。因此，尋找有效藥物及手段有效治療及徹底治愈免 疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病成為本領(lǐng)域密切關(guān)注的問題。 因此，本領(lǐng)域非常有必要找到與免疫細胞介導(dǎo)的炎癥相關(guān)的新的藥物靶點，為免 疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病，特別是自身免疫病的治療提供新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種Y _氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1 (GAT-1)或其激動劑的 用途，用于制備抑制哺乳動物炎癥性疾病的組合物。 本發(fā)明的另一 目的在于提供一種篩選可用于抑制炎癥性疾病的潛在物質(zhì)的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1(GAT-1)或其激動劑 的用途，用于制備抑制哺乳動物炎癥性疾病的組合物。 在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥性疾病是免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病。
在另一優(yōu)選例中，所述的免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病選自多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性
關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、移植物抗宿主反應(yīng)、超敏反應(yīng)、結(jié)腸炎、克隆氏病、葡萄膜炎、免疫細胞
介導(dǎo)肝損傷、多發(fā)性肌炎及皮肌炎、橋本甲狀腺炎、慢性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、原發(fā)性
膽汁性肝硬變、尋常天皰瘡、類天皰瘡、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血腎炎綜合征、實
驗變態(tài)反應(yīng)性神經(jīng)炎、重癥肌無力、交感性眼炎、原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)萎縮、梅毒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、男性自了性不育癥、硬皮病等。 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于抑制哺乳動物體內(nèi)單個核細胞的增殖；或用 于降低哺乳動物單個核細胞或脊髓中炎性細胞因子的表達。 在另一優(yōu)選例中，所述的炎性細胞因子選自:TNF-a 、 IFN-Y 、 IL_12、 IL_6、 IL-17 或IL-23。 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于提高抗炎癥細胞因子IL-5的表達。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于預(yù)防或治療多發(fā)性硬化(MS)或其并發(fā)癥。
在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥性疾病是腦脊髓炎。 在另一優(yōu)選例中，所述的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型l的激動劑選自(但不限 于)Y-氨基丁酸、雌激素、蛋白酶C激動劑(包括佛波脂、(-)-Indolactam V等)、磷脂酶 抑制劑(包括環(huán)胞酶素A、 Okadaic Acid等)。 在另一優(yōu)選例中，所述GAT-1的激動劑是一表達載體，所述表達載體包含一基因 盒，所述的基因盒含有編碼分泌蛋白GAT-1的基因及與之操作性相連的表達調(diào)控序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種篩選可用于抑制炎癥性疾病的潛在物質(zhì)的方法， 所述的方法包括 (1)將候選物質(zhì)與表達Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的體系接觸；
(2)檢測候選物質(zhì)對Y _氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的影響； 若所述候選物質(zhì)可提高Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的表達、活性或分泌，則表明 該候選物質(zhì)是可用于抑制哺乳動物炎癥性疾病的潛在物質(zhì)。 在另一優(yōu)選例中，步驟(1)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達Y-氨基丁 酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的體系中；和/或 步驟(2)包括檢測測試組的體系中Y -氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的表達或活性， 并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白 亞型1的體系； 如果測試組中Y _氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的表達、活性或分泌在統(tǒng)計學(xué)上高于 (優(yōu)選顯著高于，如高20%以上，較佳的高50%以上；更佳的高80%以上)對照組，就表明 該候選物質(zhì)是可用于抑制哺乳動物炎癥性疾病的潛在物質(zhì)。 在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自細胞體系(或細胞培養(yǎng)物體系)、亞細胞體系、 溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。
在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和
/或動物試驗，以從候選物質(zhì)中進一步選擇和確定對于抑制炎癥性疾病有用的組合物。
另一方面，提供一種抑制哺乳動物炎癥性疾病的方法，所述方法包括上調(diào)所述哺
乳動物免疫細胞或中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型l的表達或活性。 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1. EAE誘導(dǎo)后，GAT-1在脊髓中表達情況的變化。其中， A為通過Real-Time PCR的方法檢測GAT-l的表達水平。所示數(shù)據(jù)代表3次試驗的結(jié)果。*p<0.01。 B為通過Western-blotting的方法檢測GAT_1的表達水平。 圖2.野生型和GAT-1-/-小鼠誘導(dǎo)EAE后表現(xiàn)出的EAE臨床癥狀比較。所示數(shù)據(jù)
代表4次試驗的結(jié)果的平均值。 圖3丄八1-1-/-￡八￡小鼠在脊髓部位顯示了更為明顯的炎性浸潤和脫髓鞘(放大倍 數(shù)X100)。圖中所示數(shù)據(jù)代表4次試驗的結(jié)果。 圖4. GAT-1-/-EAE小鼠脾臟單個核細胞在抗原M0G35-55的剌激下增殖的更為顯 著。所示數(shù)據(jù)代表4次試驗的結(jié)果。**p<0.01。 圖5. GAT-1的缺失引起EAE發(fā)生過程中細胞因子分泌格局的變化。所示數(shù)據(jù)代表 3次試驗的結(jié)果。*p < 0. 05， **p < 0. 01，微p < 0. 001。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次論證了 Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型 1 (GAT-1)對炎癥性疾病有抑制作用，下調(diào)GAT-1會明顯加重炎癥性疾病的癥狀，可見GAT-1 對于抑制炎癥性疾病是必要的。因此，GAT-1其本身或其激動劑能夠用于抑制炎癥性疾??； 并且，可基于GAT-1的上述功能，篩選抑制炎癥性疾病的物質(zhì)。
GAT-1及其用途 Y -氨基丁酸(GABA)作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與興奮型神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸相互 平衡維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。由神經(jīng)元釋放至突觸間隙的GABA部分與位于突觸后 膜的GABA受體結(jié)合，而大部分GABA則通過突觸前膜的GABA轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。GAT-1 作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的主要轉(zhuǎn)運體之一，最早被科學(xué)家們所發(fā)現(xiàn)，目前認為其主要表達在 嗅球、神經(jīng)皮質(zhì)、小腦、上丘、基質(zhì)核，并且主要分布在突觸前膜末端、神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞，對 于維持體內(nèi)較低濃度的GABA起著重要的作用。 本發(fā)明利用GAT-1基因缺失動物，首次在一種模擬多發(fā)性硬化(MS)發(fā)病機制的動 物模型(實驗性自身反應(yīng)性腦脊髓膜炎模型，EAE)中發(fā)現(xiàn)，GAT-1基因的缺失使得動物出 現(xiàn)更為嚴(yán)重的炎癥表現(xiàn)，證實了 GAT-1對于EAE有重要的病理生理作用。進一步的研究顯 示，GAT-1的下調(diào)引起多種炎性細胞因子表達的升高(如Y干擾素(IFN-Y)、腫瘤壞死因 子a (TNF-a)、白介素-6(IL-6)、白介素-17(IL-17)、白介素-23(IL-23))以及抗炎癥細胞 因子表達的降低(如白介素_5 (IL-5))，從而加重EAE的發(fā)生。 因此，GAT-l是一種新的抑制炎癥性疾病，特別是免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的分 子。所述的免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病表現(xiàn)為哺乳動物體內(nèi)單個核細胞對于抗原的增殖反 應(yīng)增強、哺乳動物單個核細胞或病灶部位炎性細胞因子的高表達、哺乳動物抗炎癥細胞因 子的降低表達等。通過促進GAT-1的表達可以作為治療免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的新的 有效的治療方法。 因此，基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了 GAT-1蛋白的用途，用于制備抑制免 疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的組合物；或用于篩選抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的物質(zhì)。
在本發(fā)明中，所用的GAT-1蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺 乳動物。此外，所述的GAT-1蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因 程重組 技術(shù)來生產(chǎn)重組GAT-1蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的GAT-1蛋白。
任何適合的GAT-1蛋白均可用于本發(fā)明。所述的GAT-1蛋白包括全長的GAT_1蛋 白或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的GAT-1蛋白的氨基酸序列可以與GenBank登錄號 NP_848818所示的序列基本上相同。 經(jīng)過-個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的GAT-1蛋白的氨基酸序 列也包括在本發(fā)明中。GAT-1蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列， 所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本 領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實施并且確保不改變所得分子的生物活性。這 些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上 不會改變生物活性。見Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987， The 任何一種GAT-1蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，GAT-1蛋白 的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的GAT-1蛋白的全部或部分 功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長GAT-1蛋白的活性。在更優(yōu) 選的條件下，所述活性片段能夠保持全長GAT-1蛋白的60% 、70% 、80% 、90% 、95% 、99%、 或100%的活性。 本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的GAT-1蛋白，比如，可采用為了促進其半衰期、有 效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的GAT-l蛋白。所述經(jīng)過修飾或改良的 GAT-1蛋白可以是一種GAT-1蛋白的共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述 經(jīng)過修飾或改良的GAT-1蛋白可以是與天然存在的GAT-1蛋白具有較小的共同點，但也能 抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響 GAT-1蛋白的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。 根據(jù)GAT-1蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相應(yīng)的核苷酸編碼序列。優(yōu)選 的，所述的GAT-1蛋白的核苷酸序列可以與GenBank登錄號NM_178703所示的序列基本上 相同。 GAT-1的激動劑及其用途 基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種GAT-1的激動劑的用途，用于制 備抑制炎癥性疾病，特別是免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的組合物。 如本文所用，所述的GAT-1的激動劑包括了促進劑、上調(diào)劑等。任何可提高GAT-l 蛋白的活性、維持GAT-1蛋白的穩(wěn)定性、促進GAT-1蛋白的表達、促進GAT-1蛋白的分泌、延 長GAT-1蛋白有效作用時間、或促進GAT-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用 于抑制炎癥性疾病的有效物質(zhì)。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的GAT-1的激動劑包括(但不限于)Y-氨基丁酸、 雌激素、蛋白酶C激動劑(佛波脂、(-)-Indolactam V等)、磷脂酶抑制劑(環(huán)胞酶素A、 0kadaic Acid等)。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的GAT-1蛋白的激動劑包括(但不限于)在轉(zhuǎn)入細 胞后可表達(優(yōu)選過表達)GAT-1的表達載體或表達構(gòu)建物。通常，所述表達載體包含一基 因盒，所述的基因盒含有編碼GAT-1的基因及與之操作性相連的表達調(diào)控序列。所述的"操 作性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控 制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。 本發(fā)明中，GAT-1多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。只要能在宿主體內(nèi)復(fù) 制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于本發(fā)明。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制 起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含GAT-1的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻 譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。 所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。轉(zhuǎn)化載體還
包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
組合物 本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ;較佳的 0. 00001-20wt^;更佳的，0. 0001-10wt% )的所述的GAT-1蛋白或其激動劑，以及藥學(xué)上可 接受的載體。 本發(fā)明的組合物可直接用于抑制炎癥性疾病，特別是免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾 病。此外，還可同時與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。 通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其 中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。 如本文所用，術(shù)語"含有"表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物 中。因此，術(shù)語"主要由...組成"和"由...組成"包含在術(shù)語"含有"中。如本文所用，術(shù) 語"有效量"或"有效劑量"是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物 所接受的量。 如本文所用，"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良 副反應(yīng)(如毒性、剌激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語"藥學(xué)上 可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。 本發(fā)明的組合物含有安全有效量的GAT-1蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。這類載 體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與 給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄 糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。 活性成分的給藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
本發(fā)明所述的GAT-1蛋白或其激動劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病 的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確 定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的GAT-1蛋白或其激動劑的藥 代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的 體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的GAT-1蛋白或其激動劑每天以約 0. 00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的0. 0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予，能得到 令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝?按比例地減少。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的激動劑是Y-氨基丁酸，當(dāng)每天以0. l-500mg/kg 動物體重給藥時，具有較好的效果；優(yōu)選地每天以l-200mg/kg動物體重給藥；更優(yōu)選地每 天以5-100mg/kg動物體重給藥。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的激動劑是雌激素，當(dāng)每天以0. 1-800 g/kg動物 體重給藥時，具有較好的效果；優(yōu)選地每天以0. 5-300 g/kg動物體重給藥；更優(yōu)選地每天 以1-200 ii g/kg動物體重給藥。 本發(fā)明還提供了一種抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的方法，包括給予受試者有 效量的GAT-1蛋白或其激動劑。當(dāng)用于抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病時，優(yōu)選采用重組 的GAT-1蛋白。 本發(fā)明的GAT-1蛋白或其激動劑的給藥方式?jīng)]有特別的限制，可以是全身的或局 部的。例如，本發(fā)明的GAT-1蛋白或其激動劑可通過脊髓鞘內(nèi)注射、腹腔注射、靜脈注射、口 服、皮下注射、皮內(nèi)注射等的方式給予動物，較為優(yōu)選的是脊髓鞘內(nèi)注射。
在得知了所述的GAT-1蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述 的GAT-1蛋白或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。優(yōu)選的，可采用基因治療的 手段進行，比如可直接將GAT-1蛋白通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定 的途徑將攜帶GAT-1基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，并使之表 達活性的GAT-1蛋白。 作為本發(fā)明的一種實施方式，可將所述的GAT-1蛋白直接給藥于哺乳動物(比如 人)，或者，可將編碼GAT-1蛋白的基因通過常規(guī)的方法克隆到適當(dāng)?shù)妮d體(如常規(guī)原核或 真核表達載體、或病毒載體如皰疹病毒載體或腺病毒載體)中，將所述的載體導(dǎo)入到可表 達所述GAT-1蛋白的細胞中，使所述的細胞表達GAT-1蛋白?？赏ㄟ^將適量的所述細胞引 入到哺乳動物身體的適當(dāng)部位，實現(xiàn)GAT-1蛋白的表達。 GAT-1蛋白的激動劑的給藥方式主要取決于所述激動劑的類型和特性，這是本領(lǐng) 域人員可以評估的。 篩選抑制炎癥性疾病的潛在物質(zhì)的方法 在得知了所述的GAT-1蛋白在抑制炎癥性疾病，特別是免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾
病的用途后，可以基于該特征來篩選促進GAT-1的表達或活性的物質(zhì)。 因此，本發(fā)明提供一種篩選可用于抑制炎癥性疾病的潛在物質(zhì)的方法，所述的方
法包括將候選物質(zhì)與表達GAT-1的體系接觸；和檢測候選物質(zhì)對GAT-1的影響；若所述候
選物質(zhì)可提高GAT-1的表達或活性或分泌，則表明該候選物質(zhì)是可用于抑制炎癥性疾病的
潛在物質(zhì)。 在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進行篩選時，為了更易于觀察到GAT-1的表達或活性 的改變，還可設(shè)置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達GAT-1的體系。
所述的表達GAT-1的體系例如可以是細胞(或細胞培養(yǎng)物)體系，所述的細胞可 以是內(nèi)源性表達GAT-1的細胞；或可以是重組表達GAT-1的細胞。所述的表達GAT-1的體 系還可以是(但不限于)亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物 模型)等。 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的體系是表達GAT-1的細胞體系。較佳地，表達 GAT-1的免疫細胞可來源于以下3種制備方法
①來源于正常哺乳動物的單個核細胞 取正常哺乳動物單個核細胞(淋巴結(jié)、外周血、脾臟)經(jīng)過，例如(但不限于) anti-CD3和anti_CD28或佛波脂和離子酶素剌激后，該細胞可表達GAT-1蛋白。將該種細胞作為用于篩選抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的藥物的細胞模型。 ②T淋巴細胞系，選自(但不限于)0VA-特異性T細胞系、M0G-特異性T細胞系、MBP-特異性T細胞系、Jurkat細胞系、YAC-1細胞系、人T淋巴細胞系(H9) 、 Hut-102等。
取T淋巴細胞系經(jīng)過抗原或anti-CD3和anti-CD28或佛波脂和離子酶素剌激后，該細胞可表達GAT-1蛋白。將該種細胞作為用于篩選抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的藥物的細胞模型。 ③來源于抗原免疫后或疾病狀態(tài)的哺乳動物的單個核細胞 取抗原免疫后或疾病狀態(tài)的哺乳動物的單個核細胞(外周血、淋巴結(jié)、脾臟、病灶部位等)經(jīng)過剌激(抗原、anti-CD3和anti-CD28、佛波脂和離子酶素)活化后，該細胞可表達GAT-1蛋白。將該種細胞作為用于篩選抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的藥物的細胞模型。 作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方式，所述的體系是動物模型體系。較佳地，可采用具有致病性的抗原或致病性的免疫細胞來制備致病的動物模型。所述的動物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔等。誘導(dǎo)方法可如下經(jīng)抗原免疫主動誘導(dǎo)致?。唤?jīng)被動轉(zhuǎn)移致病性(但不限于)T細胞或B細胞或免疫因子(如抗體等)誘導(dǎo)致病。所述的動物模型也可以是自發(fā)性的發(fā)病的動物模型。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于抑制炎癥性疾病真正有用的物質(zhì)。
本發(fā)明對于GAT-1蛋白的表達、活性、存在量或分泌情況的檢測方法沒有特別的限制?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的蛋白定量或半定量檢測技術(shù)，例如(但不限于)SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等。 另 一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于抑制炎癥性疾病的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谝种泼庖呒毎閷?dǎo)的炎癥性疾病真正有用的物質(zhì)，從而用于臨床。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于 (1)本發(fā)明提供了一種全新的免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病藥物靶點，從而提供了一條抑制哺乳動物免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的新途徑。 (2)可以以GAT-1作為藥物篩選耙點，篩選通過促進GAT-1的表達而抑制哺乳動物免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的物質(zhì)。 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York : Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。 實驗組1)對照組(野生型)小鼠；
2)GAT_1基因缺陷小鼠。 評價臨床效果的指標(biāo)臨床評分、脊髓的組織病理染色、脾臟單個核細胞的體外增殖實驗、脾臟單個核細胞及脊髓的RNA抽提、RNA逆轉(zhuǎn)及real-timePCR等。
實施例1. EAE小鼠的脊髓中GAT-1的表達下降
實驗性自身反應(yīng)性腦脊髓膜炎模型(EAE)是一種模擬MS發(fā)病機制的動物模型，可以通過給動物直接免疫相應(yīng)的髓鞘蛋白進行主動誘導(dǎo)，也可通過髓鞘抗原特異性的T淋巴細胞的被動轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)模型的發(fā)生。EAE以進行性癱瘓、脊髓血管周圍的炎性浸潤以及炎癥性細胞因子(IFN-Y、TNF-a 、 IL_6、 IL-17及IL-23)表達的升高和抗炎癥性細胞因子(IL-5)表達的下降為主要特征，因此，EAE已廣泛地用于研究MS的發(fā)病機制以及作為探討對于MS治療方法的有用模型。 C57BL/6小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)每組四只，分為兩組，一
組作為對照組(Naive)，不予以任何處理；另一組EAE組，通過給小鼠在第0天皮下免疫
M0G35-55 (購自吉爾生化有限公司)和CFA (購自Sigma公司)等體積混合的乳化抗原(含
M0G35-55300 y g，含CFA 500 y g)，同時給予尾靜脈注射百日咳毒素200ng ;第2天再給予小
鼠尾靜脈注射百日咳毒素200ng，以誘導(dǎo)EAE的發(fā)生。在誘導(dǎo)EAE的第18天，EAE組的小鼠
達到發(fā)病高峰，處死兩組小鼠，取出小鼠的脊髓分別抽去RNA和膜蛋白。通過常規(guī)的Real-Time PCR和Western-Blotting的方法檢測GAT-1的表達水平，
結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，在EAE組小鼠的脊髓中GAT-1的表達顯著低于對照組。 實施例2. GAT-1-/-小鼠誘導(dǎo)EAE后表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的EAE臨床癥狀 GAT-1-/-小鼠的構(gòu)建方法參考Cai YQ等，Journal of Neuroscience Research,
2006,84 :255-67。 對照組(野生型)和實驗組(6八1-1-/-)，每組4_5只小鼠，通過給小鼠在第0天皮下免疫M0G35-55和CFA等體積混合的乳化抗原(含M0G35-55300 y g，含CFA 500 y g)，同時給予尾靜脈注射百日咳毒素200ng ;第2天再給予小鼠尾靜脈注射百日咳毒素200ng，以誘導(dǎo)EAE的發(fā)生。
臨床評分標(biāo)準(zhǔn)如下 O分沒有異常表現(xiàn)； l分尾巴癱瘓； 2分后肢受影響，無力，跛行； 3分雙后肢完全癱瘓； 4分后肢癱瘓同時前肢受影響； 5分死亡。 結(jié)果如圖2所示，與野生型(WT)小鼠相比，GAT-1-/-小鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的EAE臨床癥狀。 實施例3. GAT-1-/-小鼠誘導(dǎo)EAE后脊髓部位顯示更為明顯的炎性浸潤和脫髓鞘 對照組(野生型)和實驗組(GAT-1-/-)，每組4-5只小鼠，按照實施例2所述的方
式誘導(dǎo)EAE的發(fā)生，在免疫后的第34天，處死小鼠，取出小鼠的脊髓，用4X多聚甲醛進行固
定。對脊髓的組織切片進行Fast Blue染色，通過光學(xué)顯微鏡對其進行檢查。 結(jié)果見圖3?？梢钥吹紾AT-1-/-小鼠的脊髓顯示了更為嚴(yán)重的炎性浸潤和脫髓鞘。 實施例4. GAT-1-/-EAE小鼠脾臟誘導(dǎo)EAE后單個核細胞增殖更顯著對照組(野生型)和實驗組(GAT-1-/-)，每組4-5只小鼠，按照實施例2所述的
方式誘導(dǎo)EAE的發(fā)生，在免疫后的第18天，處死小鼠，取出脾臟，常規(guī)方法獲得單個核細胞。在96孔平底板中加入200 ii 1的脾臟單細胞懸液(2. 5X 106/ml)，以20 y g/ml的M0G35-55剌激72小時，在停止試驗前16小時加3H。抽膜后，通過13 -液閃計數(shù)儀測量摻入3H的細胞數(shù)。 細胞計數(shù)結(jié)果如圖4所示，可見6八1-1-/-￡八￡小鼠脾臟單個核細胞在抗原M0G35-55的剌激下增殖得更為顯著。上述結(jié)果說明，GAT-l的缺失引起致病性淋巴細胞的大量增殖，從而引起EAE疾病進展的加劇。
實施例5. GAT-l的缺失對于細胞因子的影響 對照組(野生型)和實驗組(GAT-l-/-)，每組4-5只小鼠，按照實施例2所述的方式誘導(dǎo)EAE的發(fā)生，在免疫后的第18天，處死小鼠，常規(guī)方法獲得單個核細胞及脊髓。
分別抽取單個核細胞的RNA和脊髓的RNA，通過常規(guī)的Real-Time PCR方法檢測脾臟單個核細胞中TNF- a 、 IFN- y 、 IL_12、 IL_6、 IL_17、 IL-23及IL-5RNA的表達情況分別如(A) 、 (C) 、 (E) 、 (G) 、 (I) 、 (K) 、 (M)所示；通過Real-TimePCR的方法檢測脊髓中TNF- a 、IFN- y 、 IL-12、 IL-6、 IL-17、 IL-23及IL-5RNA的表達情況分別如(B) 、 (D) 、 (F) 、 (H) 、 (J)、(L)、 (N)所示。 由結(jié)果可知，GAT-l-l-小鼠的單個核細胞和脊髓中細胞因子TNF-a 、 IFN-y 、IL-12、 IL-6、 IL-17、 IL-23的表達量均顯著高于野生型對照；而在脊髓中IL_5的表達量反而低于野生型對照。 實施例6. GAT-l激動劑(y -氨基丁酸)對于EAE的保護作用
1.臨床表現(xiàn) 對照組(不給予GAT-l激動劑y-氨基丁酸)和實驗組(給予GAT-l激動劑y-氨基丁酸)，每組4-5只小鼠，通過給小鼠在第0天皮下免疫M0G35-55和CFA等體積混合的乳化抗原(含M0G35-55300 y g，含CFA 500 y g)，同時給予尾靜脈注射百日咳毒素200ng ;第2天再給予小鼠尾靜脈注射百日咳毒素200ng，以誘導(dǎo)EAE的發(fā)生。在誘導(dǎo)EAE之前或同時給予小鼠皮下植入y-氨基丁酸的緩釋片，使其每天釋放一定劑量的y-氨基丁酸，直至實驗結(jié)束，在此期間，每天對小鼠進行臨床評分。每天釋放的y-氨基丁酸劑量設(shè)為25mg/kg，50mg/kg。 臨床評分標(biāo)準(zhǔn)如下 O分沒有異常表現(xiàn)； l分尾巴癱瘓； 2分后肢受影響，無力，跛行； 3分雙后肢完全癱瘓； 4分后肢癱瘓同時前肢受影響； 5分死亡。 根據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，給予y _氨基丁酸的小鼠EAE發(fā)病明顯減輕。
2.給予GAT-1激動劑y-氨基丁酸的小鼠誘導(dǎo)EAE后脊髓部位的炎性浸潤和脫髓鞘明顯減輕 對照組(不給予GAT-l激動劑y-氨基丁酸)和實驗組(給予GAT-l激動劑y-氨基丁酸)，每組4-5只小鼠，按照實施例6. 1所述的方式誘導(dǎo)EAE的發(fā)生并給予y _氨基丁酸處理。在免疫后的第30-34天，處死小鼠，取出小鼠的脊髓，用4%多聚甲醛進行固定。對脊髓的組織切片進行Fast Blue染色，通過光學(xué)顯微鏡對其進行檢查。 根據(jù)觀察可以看到y(tǒng)-氨基丁酸給予的小鼠脊髓的炎性浸潤和脫髓鞘，明顯減少。 3.給予GAT-l激動劑y -氨基丁酸的小鼠誘導(dǎo)EAE后單個核細胞增殖顯著下降
對照組(不給予GAT-l激動劑y-氨基丁酸)和實驗組(給予GAT-l激動劑y-氨基丁酸)，每組4-5只小鼠，按照實施例6. 1所述的方式誘導(dǎo)EAE并給予y-氨基丁酸處理。在免疫后的第15-20天，處死小鼠，取出脾臟，常規(guī)方法獲得單個核細胞。在96孔平底板中加入200 ill的脾臟單細胞懸液(2. 5X106/ml)，以20ii g/ml的M0G35-55剌激72小時，在停止試驗前16小時加3H。抽膜后，通過13 -液閃計數(shù)儀測量摻入3H的細胞數(shù)。
根據(jù)觀察可見，給予y-氨基丁酸的小鼠誘導(dǎo)EAE后脾臟單個核細胞在抗原M0G35-55的剌激下增殖顯著下降，說明GAT-l激動劑可以抑制致病性淋巴細胞的增殖，從而減輕EAE的發(fā)生。 實施例7. GAT-l激動劑(y -氨基丁酸)對于EAE的治療作用
1.臨床表現(xiàn) 對照組(不給予GAT-l激動劑y-氨基丁酸)和實驗組(給予GAT-l激動劑y-氨基丁酸)，每組4-5只小鼠，通過給小鼠在第0天皮下免疫M0G35-55和CFA等體積混合的乳化抗原(含M0G35-55300 y g，含CFA 500 y g)，同時給予尾靜脈注射百日咳毒素200ng ;第2天再給予小鼠尾靜脈注射百日咳毒素200ng，以誘導(dǎo)EAE的發(fā)生。在EAE開始發(fā)病時給予小鼠皮下植入y-氨基丁酸的緩釋片，使其每天釋放一定劑量的y-氨基丁酸，直至實驗結(jié)束，在此期間，每天對小鼠進行臨床評分。每天釋放的y-氨基丁酸劑量設(shè)為25mg/kg/天，50mg/kg/天。 臨床評分標(biāo)準(zhǔn)如下 O分沒有異常表現(xiàn)； l分尾巴癱瘓； 2分后肢受影響，無力，跛行； 3分雙后肢完全癱瘓； 4分后肢癱瘓同時前肢受影響； 5分死亡。 根據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，給予y _氨基丁酸的小鼠EAE發(fā)病得到明顯抑制。 2.給予GAT-1激動劑y-氨基丁酸的小鼠誘導(dǎo)EAE后脊髓部位的炎性浸潤和脫髓鞘明顯減輕 對照組(不給予GAT-1激動劑y-氨基丁酸)和實驗組(給予GAT-1激動劑y-氨基丁酸)，每組4-5只小鼠，按照實施例7. 1所述的方式誘導(dǎo)EAE并給予激動劑處理。在免疫后的第30-34天，處死小鼠，取出小鼠的脊髓，用4%多聚甲醛進行固定。對脊髓的組織切片進行Fast Blue染色，通過光學(xué)顯微鏡對其進行檢查。 根據(jù)觀察可以看到y(tǒng)-氨基丁酸給予的小鼠脊髓的炎性浸潤和脫髓鞘，明顯減少，說明GAT-l激動劑的給予可以有效治療EAE。 3.給予GAT-l激動劑y -氨基丁酸的小鼠誘導(dǎo)EAE后單個核細胞增殖顯著下降
對照組(不給予GAT-1激動劑Y-氨基丁酸)和實驗組(給予GAT-1激動劑Y-氨基丁酸)，每組4-5只小鼠，按照實施例7. 1所述的方式誘導(dǎo)EAE并給予激動劑處理。在EAE誘導(dǎo)后的第15-20天，處死小鼠，取出脾臟，常規(guī)方法獲得單個核細胞。在96孔平底板中加入200 iil的脾臟單細胞懸液(2. 5X 106/ml)，以20 y g/ml的M0G35-55剌激72小時，在停止試驗前16小時加3H。抽膜后，通過13 -液閃計數(shù)儀測量摻入3H的細胞數(shù)。
根據(jù)觀察可見，給予GAT-1激動劑Y -氨基丁酸的小鼠誘導(dǎo)EAE后脾臟單個核細胞在抗原M0G35-55的剌激下增殖顯著下降，說明GAT-1激動劑可以抑制致病性淋巴細胞的增殖，從而減輕EAE的發(fā)生。 實施例8. GAT-1激動劑(雌激素)對于EAE的保護作用
1.臨床表現(xiàn) 對照組(不給予雌激素)和實驗組(給予雌激素)，每組4-5只小鼠，通過給小鼠
在第0天皮下免疫M0G35-55和CFA等體積混合的乳化抗原(含M0G35-55300 y g，含CFA
500 g)，同時給予尾靜脈注射百日咳毒素200ng ;第2天再給予小鼠尾靜脈注射百日咳毒
素200ng，以誘導(dǎo)EAE的發(fā)生。在誘導(dǎo)EAE之前或同時給予小鼠皮下植入雌激素的40天緩
釋片，使其每天釋放一定劑量的雌激素，直至實驗結(jié)束，在此期間，每天對小鼠進行臨床評
分。釋放的雌激素2劑量設(shè)為10 ii g/kg/天，50 ii g/kg/天。 臨床評分標(biāo)準(zhǔn)如下 O分沒有異常表現(xiàn)； l分尾巴癱瘓； 2分后肢受影響，無力，跛行； 3分雙后肢完全癱瘓； 4分后肢癱瘓同時前肢受影響； 5分死亡。 根據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，給予雌激素的小鼠EAE發(fā)病明顯減輕。
2.給予雌激素的小鼠誘導(dǎo)EAE后脊髓部位的炎性浸潤和脫髓鞘明顯減輕
對照組(不給予雌激素)和實驗組(給予雌激素)，每組4-5只小鼠，按照實施例8. 1所述的方式誘導(dǎo)EAE的發(fā)生并給予雌激素處理。在免疫后的第30-34天，處死小鼠，取出小鼠的脊髓，用4%多聚甲醛進行固定。對脊髓的組織切片進行Fast Blue染色，通過光學(xué)顯微鏡對其進行檢查。 根據(jù)觀察可以看到雌激素給予的小鼠脊髓的炎性浸潤和脫髓鞘，明顯減少。
3.給予雌激素的小鼠誘導(dǎo)EAE后單個核細胞增殖顯著下降 對照組(不給予雌激素)和實驗組(給予雌激素)，每組4-5只小鼠，按照實施例8. 1所述的方式誘導(dǎo)EAE并給予雌激素處理。在免疫后的第15-20天，處死小鼠，取出脾臟，常規(guī)方法獲得單個核細胞。在96孔平底板中加入200 ill的脾臟單細胞懸液(2. 5X106/ml)，以20 ii g/ml的M0G35-55剌激72小時，在停止試驗前16小時加3H。抽膜后，通過P -液閃計數(shù)儀測量摻入3H的細胞數(shù)。 根據(jù)觀察可見給予雌激素的小鼠誘導(dǎo)EAE后脾臟單個核細胞在抗原M0G35-55的剌激下增殖顯著下降，說明雌激素可以抑制致病性淋巴細胞的增殖，從而減輕EAE的發(fā)生。[O168] 實施例9. GAT-1激動劑(雌激素)對于EAE的治療作用
1.臨床表現(xiàn) 對照組(不給予雌激素)和實驗組(給予雌激素)，每組4-5只小鼠，通過給小鼠
在第0天皮下免疫M0G35-55和CFA等體積混合的乳化抗原(含M0G35-55300 y g，含CFA
500 g)，同時給予尾靜脈注射百日咳毒素200ng ;第2天再給予小鼠尾靜脈注射百日咳毒
素200ng，以誘導(dǎo)EAE的發(fā)生。在EAE開始發(fā)病時給予小鼠皮下植入雌激素2的30天緩釋
片，使其每天釋放一定劑量的雌激素，直至實驗結(jié)束，在此期間，每天對小鼠進行臨床評分。
釋放的雌激素劑量設(shè)為10 ii g/kg/天，50 ii g/kg/天，100 ii g/kg/天。 臨床評分標(biāo)準(zhǔn)如下 O分沒有異常表現(xiàn)； l分尾巴癱瘓； 2分后肢受影響，無力，跛行； 3分雙后肢完全癱瘓； 4分后肢癱瘓同時前肢受影響； 5分死亡。 根據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，給予雌激素的小鼠EAE發(fā)病得到明顯抑制。
2.給予雌激素的小鼠誘導(dǎo)EAE后脊髓部位的炎性浸潤和脫髓鞘明顯減輕
對照組(不給予雌激素)和實驗組(給予雌激素)，每組4-5只小鼠，按照實施例 9. 1所述的方式誘導(dǎo)EAE并給予激動劑處理。在免疫后的第30-34天，處死小鼠，取出小鼠 的脊髓，用4%多聚甲醛進行固定。對脊髓的組織切片進行Fast Blue染色，通過光學(xué)顯微 鏡對其進行檢查。 根據(jù)觀察可以看到雌激素給予的小鼠脊髓的炎性浸潤和脫髓鞘，明顯減少，說明 雌激素的給予可以有效治療EAE。 3.給予雌激素的小鼠誘導(dǎo)EAE后單個核細胞增殖顯著下降 對照組(不給予雌激素)和實驗組(給予雌激素)，每組4-5只小鼠，按照實施例 9. 1所述的方式誘導(dǎo)EAE并給予激動劑處理。在EAE誘導(dǎo)后的第15-20天，處死小鼠，取出脾 臟，常規(guī)方法獲得單個核細胞。在96孔平底板中加入200 1的脾臟單細胞懸液(2. 5 X 106/ ml)，以20 ii g/ml的M0G35-55剌激72小時，在停止試驗前16小時加3H。抽膜后，通過P -液 閃計數(shù)儀測量摻入3H的細胞數(shù)。 根據(jù)觀察可見給予雌激素的小鼠誘導(dǎo)EAE后脾臟單個核細胞在抗原M0G35-55的 剌激下增殖顯著下降，說明雌激素可以抑制致病性淋巴細胞的增殖，從而減輕EAE的發(fā)生。
實施例10.藥物篩選
1.細胞水平篩選 第一步表達GAT-1免疫細胞的制備。表達GAT-1的免疫細胞通過以下方法制備 常規(guī)方法獲取小鼠淋巴結(jié)的單個核細胞，用20ng/ml濃度的佛波脂和0. 5 y mol/1濃度的離 子酶素剌激2-12小時后，經(jīng)Real time PCR或Western blot檢測該細胞可表達GAT-1蛋 白。將該種細胞作為用于篩選抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的藥物的細胞模型。
第二步藥物篩選 測試組用候選物質(zhì)處理的上述細胞的培養(yǎng)物；
對照組不用候選物質(zhì)處理的上述細胞的培養(yǎng)物。
在處理后適當(dāng)時間，采用常規(guī)方法測定所述細胞的GAT-1蛋白的表達、活性、存在 量或分泌情況。如果與對照組相比，測試組中的GAT-1蛋白的表達、活性、存在量或分泌顯 著上升30%以上，則說明該候選物質(zhì)是潛在的抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的物質(zhì)。
2.動物水平篩選-被動免疫誘導(dǎo)的炎癥性疾病 用具有致病性的免疫細胞作為細胞抗原免疫小鼠，誘導(dǎo)小鼠發(fā)生免疫性炎癥。
測試組用候選物質(zhì)給予(通過腹腔注射、口服、靜脈注射、皮下注射或皮內(nèi)注射 等方式)哺乳動物； 對照組不用候選物質(zhì)給予哺乳動物。 在處理后適當(dāng)時間，采用常規(guī)方法測定哺乳動物體內(nèi)(包括炎性浸潤的病灶部 位，或淋巴結(jié)、脾臟、外周血單個核細胞)GAT-1蛋白的表達、活性、存在量或分泌情況。如果 與對照組相比，測試組中的GAT-1蛋白的表達、活性、存在量或分泌顯著上升30%以上，則 說明該候選物質(zhì)是潛在的抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的物質(zhì)。
3.動物水平篩選-主動免疫誘導(dǎo)的炎癥性疾病
經(jīng)抗原免疫小鼠主動誘導(dǎo)的免疫性炎癥。 測試組用候選物質(zhì)給予(通過腹腔注射、口服、靜脈注射、皮下注射或皮內(nèi)注射 等方式)哺乳動物； 對照組不用候選物質(zhì)給予哺乳動物。 在處理后適當(dāng)時間，采用常規(guī)方法測定哺乳動物體內(nèi)(包括炎性浸潤的病灶部 位，或淋巴結(jié)、脾臟、外周血單個核細胞)GAT-1蛋白的表達、活性、存在量或分泌情況。如果 與對照組相比，測試組中的GAT-1蛋白的表達、活性、存在量或分泌顯著上升30%以上，則 說明該候選物質(zhì)是潛在的抑制免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的物質(zhì)。 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
權(quán)利要求
一種γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1或其激動劑的用途，用于制備抑制哺乳動物炎癥性疾病的組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的炎癥性疾病是免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物用于抑制哺乳動物體內(nèi)單個核細胞的增殖；或用于降低哺乳動物單個核細胞或脊髓中炎性細胞因子的表達。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的炎性細胞因子選自TNF-a 、IFN-Y、IL-12、 IL-6、 IL-17或IL-23。
5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物用于提高抗炎癥細胞因子IL-5的表達。
6. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型l的激動劑選自Y _氨基丁酸、雌激素、蛋白酶C激動劑、磷脂酶抑制劑。
7. —種篩選用于抑制炎癥性疾病的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的方法包括(1) 將候選物質(zhì)與表達Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的體系接觸；(2) 檢測候選物質(zhì)對Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的影響；若所述候選物質(zhì)可提高Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的表達、活性或分泌，則表明該候選物質(zhì)是可用于抑制哺乳動物炎癥性疾病的潛在物質(zhì)。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(1)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型l的體系中；和/或步驟(2)包括檢測測試組的體系中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的表達或活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的體系；如果測試組中Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1的表達、活性或分泌在統(tǒng)計學(xué)上高于對照組，就表明該候選物質(zhì)是可用于抑制哺乳動物炎癥性疾病的潛在物質(zhì)。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的體系選自細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。
10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質(zhì)中進一步選擇和確定對于抑制炎癥性疾病有用的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病相關(guān)的藥物靶點及其應(yīng)用，所述的藥物靶點是γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型1(GAT-1)。本發(fā)明公開了GAT-1或其激動劑的用途，用于制備抑制哺乳動物免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的組合物。本發(fā)明還公開了篩選抑制哺乳動物免疫細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的潛在物質(zhì)的方法。
文檔編號G01N33/68GK101711862SQ20081020087
公開日2010年5月26日 申請日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日
發(fā)明者徐凌云, 王瑩 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院