專利名稱：：含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑的質(zhì)量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及飼料添加劑的化學(xué)分析方法，具體地說(shuō)是含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑的質(zhì)量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑是從松針、松皮等原材料中提取出來(lái)而制成，其主要成分是前花青素(又名原花青素)，具有良好的抗氧化和清除自由基能力，對(duì)人體微循環(huán)具有改善作用，并可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗突變、抗過(guò)敏及抗炎等作用。由于前花青素具有廣泛的生化和藥理活性，已經(jīng)成為醫(yī)藥、保健品的重要原料及食品、飼料、化妝品的重要添加劑。但是，由于前花青素是一類多酚聚合物，是由黃烷-3-醇和黃烷_(kāi)3，4-二醇的配位縮合或聚合而成的低聚物或多聚物。所以，前花青素提取物的質(zhì)量控制方法存在著不少缺點(diǎn)利用Bates-smith法和Porter法可以進(jìn)行提取物中前花青素值的測(cè)定，但它們僅是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式求得前花青素的相對(duì)含量，并不能代表前花青素提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，有必要尋求一種能夠控制松樹(shù)前花青素飼料添加劑產(chǎn)品質(zhì)量的方法。指紋圖譜技術(shù)是能評(píng)價(jià)植物提取物產(chǎn)品質(zhì)量的一種操作簡(jiǎn)便的實(shí)際可行方法，其特點(diǎn)是穩(wěn)定、精密度高、重復(fù)性好。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種方便快捷、穩(wěn)定、精密度高、重復(fù)性好的指紋圖譜方法及其對(duì)照指紋圖譜來(lái)控制含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑的質(zhì)量。本發(fā)明的技術(shù)方案是對(duì)利用各種植物提取工藝技術(shù)所得到的松樹(shù)前花青素提取物而制成的飼料添加劑產(chǎn)品進(jìn)行分析，采用高效液相色譜法確立指紋圖譜來(lái)控制質(zhì)量，其方法按如下步驟進(jìn)行(1)供試樣品溶液的制備不同批次(至少10批)的含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑，分別取細(xì)粉用甲醇溶解，配成lml中含100mg細(xì)粉的溶液。(2)指紋圖譜的建立分別精密吸取各批次的供試樣品各5iU，進(jìn)入高效液相色譜儀，按照高效液相色譜法測(cè)定，保留時(shí)間105min，記錄色譜圖，并確定對(duì)照指紋圖譜，應(yīng)用20個(gè)特征指紋峰，以其中第9號(hào)峰的保留時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間為0.145±0.005、0.388±0.005、0.411±0.005、0.449±0.010、0.468±0.010、0.589±0.005、0.788±0.005、0.825±0.005、1.000(S)、1.034±0.005、1.091±0.005、1.224±0.005、1.425±0.005、1.699±0.005、1.798±0.005、2.089±0.005、2.432±0.005、2.448±0.005、2.480±0.005、2.673±0.005;供試樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度不得小于O.90。采用不同的高效液相色譜儀器及選用的色譜條件得到的對(duì)照指紋圖譜有所不同，其20個(gè)特征峰的出峰時(shí)間、保留時(shí)間、峰面積也有有所不同。本發(fā)明經(jīng)過(guò)多次、反復(fù)的實(shí)驗(yàn)和條件摸索，確立較佳的色譜條件是色譜柱AgilentZORBAXEclipseSB-C18柱(4.6mmX250mrn，5iim);檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，柱溫30°C，流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量5yL，流動(dòng)相甲醇-0.5%冰醋酸溶液，采用梯度洗脫。本發(fā)明的優(yōu)越性是建立了含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑的對(duì)照指紋圖譜，可以很方便地辨別其飼料添加劑產(chǎn)品的真假，可以有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量；該方法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，操作方法簡(jiǎn)便、精密度高。圖1是含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑的對(duì)照指紋圖譜；圖2是10批含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑樣品的指紋圖譜。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明所涉及的方法，但并不限制本發(fā)明。實(shí)施例1使用的儀器是Agilent100型高效液相色譜儀系列(脫氣機(jī)G1322A、四元泵G1311A、自動(dòng)進(jìn)樣機(jī)G1313A、柱恒溫箱G1316A和二極管陣列檢測(cè)器DADG1315B)。取不同時(shí)間生產(chǎn)的IO批松樹(shù)前花青素提取物飼料添加劑(Sl，2007/04/05;S2，2007/08/09;S3，2007/09/16;S4，2007/10/08;S5，2007/10/20;S6，2007/11/10;S7，2007/11/20;S8，2007/12/23;S9，2007/01/02;SIO，2008/01/27)，均由上海朝翔生物技術(shù)有限公司提供。甲醇為色譜純(CaledonLaboratoriesLTD.Georgetown,Ont.，Canada)，水為二次重蒸餾水。色譜條件為色譜柱是AgilentZORBAXElicpseSB-C18柱(4.6mmX250mm，5ym);檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，柱溫30°C，流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量5yL，流動(dòng)相甲醇_0.5%冰醋酸溶液，采用梯度洗脫程序，如表1所示表1HPLC流動(dòng)相梯度程序時(shí)間(min)甲醇0.5%冰醋酸溶液0-1315%85%13-4515-45%85-55%45-6545-70%55-30%65-7570-88%30-12%75-9088%88%<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>供試樣品溶液的制備精密稱取10批的松樹(shù)前花青素提取物飼料添加劑各5.0g，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，加入約40ml甲醇，超聲波溶解處理30分鐘后，用甲醇定容至刻度，待用。供試樣品溶液每次進(jìn)樣前，分別吸取lml，用10000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心機(jī)離心20分鐘處理，取上清液體，再使用0.2m微孔濾膜過(guò)濾。精密度試驗(yàn)取編號(hào)為SI(2007/04/05)的樣品，按上述方法制備供試樣品，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)進(jìn)樣5次，檢測(cè)指紋圖譜。測(cè)得其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<2%(n=5)，相對(duì)峰面積比值RSD<3%(n=5)，表明實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)取編號(hào)為SI(2007/04/05)的樣品5份，按上述方法制備供試樣品，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，分別進(jìn)樣，檢測(cè)指紋圖譜。測(cè)得其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<2%(n=5)，相對(duì)峰面積比值RSD<3%(n=5)，表明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)取編號(hào)為SI(2007/04/05)的樣品，按上述方法制備供試樣品，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，分別在0，2，4，6，12h進(jìn)樣。測(cè)得其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<2%，相對(duì)峰面積比值RSD<3%，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。指紋圖譜及各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)取不同時(shí)間生產(chǎn)的10批含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑樣品，按照上述方法進(jìn)行制備供試樣品，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析。得到10批飼料添加劑樣品的HPLC圖譜。色譜圖特征峰的標(biāo)定及參考峰的選擇根據(jù)10批供試樣品的HPLC圖譜給出的相關(guān)參數(shù)，考察松樹(shù)前花青素提取物105min內(nèi)的色譜峰，其中20個(gè)峰是各批供試樣品所共有的，因此確定這20個(gè)峰為共有特征指紋峰，并且對(duì)其特征峰依次標(biāo)號(hào)1，2，……，20。在松樹(shù)前花青素提取物樣品指紋圖譜的特征峰中，9號(hào)峰的峰面積比例較大，且與其它峰分離度好，保留時(shí)間居于中間，故選9號(hào)峰為參考峰。特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積以9號(hào)峰為參照物，測(cè)定并計(jì)算其特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表23。表210批含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑樣品指紋圖譜特征峰的相對(duì)保留時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表310批含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑樣品指紋圖譜特征峰的相對(duì)峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從10批松樹(shù)前花青素提取物飼料添加劑產(chǎn)品的分析結(jié)果可以看出，特征指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間比較穩(wěn)定。對(duì)照?qǐng)D譜的建立利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(版本2004A，國(guó)家藥典委員會(huì))，對(duì)所得到的10批松樹(shù)前花青素飼料添加劑樣品的HPLC圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并選擇特征指紋峰，得到含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑的對(duì)照指紋圖譜，并對(duì)對(duì)照指紋圖譜的特征峰進(jìn)行標(biāo)號(hào)，如圖1所示。指紋圖譜的建立利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(版本2004A，國(guó)家藥典委員會(huì))，建立10批含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑的指紋圖譜，如圖2所示；并分析其相似度，見(jiàn)表4。表4松樹(shù)前花青素提取物的相似度分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于，按如下步驟進(jìn)行(1)供試樣品溶液的制備至少10批且批次不同的含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑，分別取該飼料添加劑的細(xì)粉用甲醇溶解，配成1ml中含100mg細(xì)粉的溶液；(2)指紋圖譜的建立分別精密吸取各批次的供試樣品各5μl，進(jìn)入高效液相色譜儀，按照高效液相色譜法測(cè)定，保留時(shí)間105min，記錄色譜圖，并確定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；取標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中保留時(shí)間(S)分別為0.145±0.005、0.388±0.005、0.411±0.005、0.449±0.010、0.468±0.010、0.589±0.005、0.788±0.005、0.825±0.005、1.000、1.034±0.005、1.091±0.005、1.224±0.005、1.425±0.005、1.699±0.005、1.798±0.005、2.089±0.005、2.432±0.005、2.448±0.005、2.480±0.005、2.673±0.005的20個(gè)特征指紋峰，以其中第9號(hào)峰的保留時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度不小于0.90時(shí)為合格產(chǎn)品。2.根據(jù)要求1所述的松樹(shù)前花青素提取物的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于，所述指紋圖譜的色譜條件是色譜柱AgilentZORBAXEclipseSB-C18柱，尺寸是4.6mmX250mrn，5iim;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，柱溫30°C，流速為1.Oml/min，進(jìn)樣量5yL，流動(dòng)相甲醇-0.5%冰醋酸溶液，采用梯度洗脫。全文摘要本發(fā)明涉及含松樹(shù)前花青素提取物的飼料添加劑的質(zhì)量控制方法，即利用化學(xué)分析方法，采用高效液相色譜法建立指紋圖譜控制產(chǎn)品的質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜有20個(gè)特征指紋峰，各指紋峰保留時(shí)間是0.145±0.005、0.388±0.005、0.411±0.005、0.449±0.010、0.468±0.010、0.589±0.005、0.788±0.005、0.825±0.005、1.000(S)、1.034±0.005、1.091±0.005、1.224±0.005、1.425±0.005、1.699±0.005、1.798±0.005、2.089±0.005、2.432±0.005、2.448±0.005、2.480±0.005、2.673±0.005；供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度不得小于0.90。該方法可以有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量；重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，操作方法簡(jiǎn)便、精密度高。文檔編號(hào)G01N30/86GK101713769SQ20081020088公開(kāi)日2010年5月26日申請(qǐng)日期2008年10月8日優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日發(fā)明者盧艷花,吳德峰,席世玲,牛江龍,陳佳銘申請(qǐng)人:華東理工大學(xué);上海朝翔生物技術(shù)有限公司