專利名稱：：一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明特別涉及一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：核酸適體(aptamer)是指利用上個(gè)世紀(jì)末建立而發(fā)展起來(lái)的SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)體夕卜篩選技術(shù)，從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選獲得的短單鏈寡核苷酸配基，它能夠與靶分子特異結(jié)合，從而本身發(fā)生構(gòu)象變化。通過(guò)體外篩選技術(shù)，理論上可篩選到任意物質(zhì)的核酸適體，再加上高通量篩選的技術(shù)特點(diǎn)與核酸適體精確識(shí)別、易體外合成與修飾等特性，使得核酸適體在分析化學(xué)與生物醫(yī)藥研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，核酸適體在生物傳感器的設(shè)計(jì)中具有重要作用，被應(yīng)用于生物學(xué)、環(huán)境、安全等領(lǐng)域的檢測(cè)，包括蛋白質(zhì)(凝血酶、生長(zhǎng)因子、HIV相關(guān)多肽等)、有機(jī)小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金屬離子(K+、Hg2+、Pb"等)，其他新的令人興奮的應(yīng)用包括基于核酸適體的蛋白質(zhì)芯片，和在蛋白質(zhì)組學(xué)中用于高通量成像、基于DNA酶和RNA酶的分子尺度的邏輯DNA分子計(jì)算機(jī)等。除此之外，還有一些其他的DNA序列也可以在某一特定環(huán)境下發(fā)生構(gòu)象變化。核酸適體和這些DNA對(duì)各自的靶物質(zhì)來(lái)說(shuō)都有其特異性的核酸結(jié)構(gòu)，可與耙物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，從而本身發(fā)生構(gòu)象的變化。這種核酸結(jié)構(gòu)在遇到相應(yīng)的靶分子進(jìn)行結(jié)合時(shí)通常會(huì)伴有明顯的構(gòu)象變化。這種結(jié)構(gòu)的差異形成了基于核酸結(jié)構(gòu)傳感器的理論基礎(chǔ)。一個(gè)典型的基于核酸結(jié)構(gòu)的傳感器包括一個(gè)雙標(biāo)記的寡核苷酸序列(電子傳遞或能量傳遞的受體和供體)，因此，靶分子結(jié)合導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化可以直接影響到受體和供體之間的距離，從而可以高靈敏度的檢測(cè)到電信號(hào)或光信號(hào)的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，核酸結(jié)構(gòu)在分析化學(xué)方面的應(yīng)用逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，例如，Tan等將核酸適體應(yīng)用于分子信標(biāo)研究，發(fā)展了一種高效、高靈敏檢測(cè)生物分子的方法一分子aptamer信標(biāo)(MAB)，并進(jìn)一步用于凝血酶和血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)的檢測(cè)。另外，由于核酸適體與抗體具有類似的特異結(jié)合性質(zhì)，因此在ELISA、免疫學(xué)分析、Western印跡法和生物傳感器等許多應(yīng)用中具有更大的發(fā)展?jié)摿?，并取得初步結(jié)果。目前這種基于DNA構(gòu)象變化的分子信標(biāo)的方法，主要是應(yīng)用雙標(biāo)記核酸序列，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，而猝滅基團(tuán)又主要以Dabcyl(4-[4'-二甲基胺基苯基氮]安息香酸)為主。為了進(jìn)一步提高熒光猝滅效率和檢測(cè)的靈敏度，科學(xué)家們不斷的研究開(kāi)發(fā)新型的猝滅劑。近年來(lái)，科學(xué)家們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)與常規(guī)猝滅基團(tuán)DABCYL相比，納米金可以在可見(jiàn)到近紅外的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，有效地猝滅各種熒光染料，猝滅率達(dá)到90%以上。納米金顆粒在生物學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，目前，核酸結(jié)構(gòu)-納米復(fù)合物在分析檢測(cè)中的應(yīng)用也受到了關(guān)注。1996年，Mirkin和Alivisatos所在工作組分別報(bào)道了納米金-DNA復(fù)合物的重要應(yīng)用，并將其發(fā)展為基于納米結(jié)構(gòu)的新型檢測(cè)平臺(tái)。通過(guò)深入了解金膠獨(dú)特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，Mirkin等人隨后發(fā)展了一系列方法對(duì)DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行超微量檢測(cè)。他們的方法依賴于巰基DNA探針在金膠表面的修飾，當(dāng)加入靶時(shí)，可以引起金膠的團(tuán)聚或解聚，從而引起宏觀上顏色的紅-藍(lán)變化。Huang等用納米金顆粒(GNPs)與核酸適體5'端的-SH直接作用形成的結(jié)合物(即Apt-AuNPs)來(lái)檢測(cè)PDGF及其受體(PDGFR)，發(fā)現(xiàn)由于Apt-AuNPs具有簡(jiǎn)易性和專一性，所以非常適合于蛋白質(zhì)分析和癌癥診斷。Parlor等還將Apt-AuNPs用于光學(xué)檢測(cè)凝血酶。Dwarakanath等將熒光性能優(yōu)異的半導(dǎo)體納米晶粒-量子點(diǎn)用于標(biāo)記核酸適體，開(kāi)辟了量子點(diǎn)技術(shù)與SELEX技術(shù)聯(lián)合使用的先河。Korgd等通過(guò)生物素和抗生物素的作用將前列腺專一性膜抗原(PSMA)的核酸適體連接到具有近紅外發(fā)光性能的CdTe量子點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞，取得了較好的結(jié)果，這給核酸適體量子點(diǎn)標(biāo)記在活細(xì)胞及生物體內(nèi)的分析檢測(cè)提供了新思路。但是這些方法主要是基于納米金和HS-DNA的組裝來(lái)進(jìn)行的，由于DNA需要標(biāo)記，而且組裝的過(guò)程較為繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，不利于推廣應(yīng)用。最近，Ro她erg等人報(bào)道了一種利用未經(jīng)修飾的金膠檢測(cè)靶DNA的比色法(H.Li,L.Rothberg,PNAS101,14036,September28,2004)。該法基本原理是納米金顆?？梢院蛦捂淒NA,通過(guò)靜電作用發(fā)生瞬時(shí)的吸附結(jié)合，從而可以在高離子強(qiáng)度條件下有效地穩(wěn)定納米金，而雙鏈DNA則不具有這種作用。核酸結(jié)構(gòu)在溶液中為無(wú)規(guī)巻曲狀態(tài)，可以吸附在納米金表面并提高其穩(wěn)定性。而當(dāng)有耙分子存在時(shí)，核酸分子會(huì)形成剛性的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不能吸附在納米金表面。但是由于對(duì)靶分子進(jìn)行特異性識(shí)別的DNA分子不同，形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)也有差異，例如可以形成四分體、莖環(huán)、三葉草、凸起、假結(jié)等結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與納米金的作用類似但是又有一定的差異，因此該方法在具體操作過(guò)程中需要一對(duì)一的進(jìn)行設(shè)計(jì)，只能對(duì)特定的DNA進(jìn)行檢測(cè)，而不適用于任意靶物質(zhì)的檢測(cè)，并且比色法的靈敏度有限。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是克服現(xiàn)有的納米金檢測(cè)靶DNA的方法中對(duì)不同的靶分子，需要對(duì)檢測(cè)方案進(jìn)行不同設(shè)計(jì)的缺陷，提供一種快速、特異性高、靈敏度高、通用型的納米金檢測(cè)靶物質(zhì)的方法，可以很方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)任意靶物質(zhì)的檢測(cè)。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，核酸結(jié)構(gòu)在溶液中為無(wú)規(guī)巻曲狀態(tài)，可以吸附在納米金表面，因此將DNA序列的一端用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，當(dāng)它吸附在納米金表面時(shí)，其熒光基團(tuán)離納米金表面非常近(小于10nm)，熒光被猝滅。而當(dāng)有靶分子存在時(shí)，核酸分子會(huì)形成剛性的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不能吸附在納米金表面，熒光素與納米金的距離足夠遠(yuǎn)，納米金不能夠猝滅DNA上的熒光。因此本發(fā)明人提出了新的檢測(cè)策略利用納米金高效猝滅熒光的性質(zhì)將其發(fā)展成為檢測(cè)核酸結(jié)構(gòu)的探針，可以很方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)任意靶物質(zhì)的高靈敏檢測(cè)，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是，一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測(cè)方法，可依次包括以下步驟1)將能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與熒光標(biāo)記的cDNA雜交形成雙鏈捕獲探針；2)加入待檢溶液進(jìn)行反應(yīng)；3)加入納米金溶液進(jìn)行反應(yīng)，記錄反應(yīng)溶液的熒光光譜。本發(fā)明步驟1)為將能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與熒光標(biāo)記的cDNA雜交形成雙鏈捕獲探針。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)(凝血酶、血小板衍生性生長(zhǎng)因子、溶菌酶、HIV相關(guān)多肽等)、有機(jī)小分子(cAMP、ATP、可卡因等)、金屬離子(K+、Hg2+、Pl^+等)、甚至整個(gè)病毒顆粒等靶分子的檢測(cè)，所述耙分子不包括DNA分子。較佳的靶分子可為三磷酸腺苷(ATP)、可卡因(Cocaine)、凝血酶(thrombin)、血小板衍生性生長(zhǎng)因子(PDGF)、溶菌酶(lysozyme)、鉀離子、汞離子或氫離子(pH值)。本發(fā)明所述的特異性DNA為核酸適體和一些其他的DNA序列，這些DNA序列也可以在某一特定環(huán)境下發(fā)生構(gòu)象變化，核酸適體和這些DNA對(duì)各自的靶物質(zhì)來(lái)說(shuō)都有其特異性的核酸結(jié)構(gòu)，可與靶物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，從而本身發(fā)生構(gòu)象的變化。較佳的特異性DNA為核酸適體、MSO(mercury-specificOligonuclide，特異性結(jié)合汞離子的寡核苷酸)、PSO(特異性結(jié)合鉀離子的寡核苷酸)或具有i-motif結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸。所述的熒光標(biāo)記所用的熒光基團(tuán)較佳的可選自熒光素(FAM)、花菁染料Cy3和花菁染料Cy5、羅丹明B(RodamineB)、異硫氰酸熒光素(FITC)和6-羰基-羅丹明(ROX傳有機(jī)染料。較佳的，所述的特異性DNA與其cDNA溶液的反應(yīng)濃度可各為0.110^iM;更佳的，所述的特異性DNA與其cDNA溶液的摩爾量可以相等。同常規(guī)，步驟l)所述的雜交形成雙鏈捕獲探針時(shí)的反應(yīng)體系中可加入雜交緩沖溶液。雜交緩沖溶液如PBS、胂酸鹽或Tris-HCl等，反應(yīng)濃度為1025mM。為了保證檢測(cè)不同靶分子所用的與納米金的發(fā)生吸附作用的核酸分子都具有相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，統(tǒng)一檢測(cè)的具體操作過(guò)程；更佳的，可以對(duì)雙鏈探針中互補(bǔ)序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，例如，由于G能夠淬滅熒光，因此在距離G、C比較近的地方加入A或者T的序列來(lái)降低G的影響，本發(fā)明中優(yōu)選加ATT。另外，對(duì)于富含GGG和富含CCC的序列作為互補(bǔ)鏈時(shí)，由于在不同pH和鉀離子存在下會(huì)形成剛性的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致不能吸附到納米金表面，因此本發(fā)明優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)修改，包括減少末端G或C的個(gè)數(shù)，序列中間的GGG或CCC的其中一個(gè)堿基換為其他堿基如A、T。這些修飾提高了不同雙鏈探針中cDNA結(jié)構(gòu)的一致性，使得它們與納米金的相互作用也盡量保持一致，從而使得檢測(cè)的準(zhǔn)確度、重復(fù)性以及通用程度都有很大提高。本發(fā)明步驟2)為向步驟1)的雜交溶液中加入待檢溶液進(jìn)行反應(yīng)。其中，所述的待檢溶液的反應(yīng)濃度較佳的可為0.01100pM待檢溶液與特異性DNA的摩爾比較佳的為10:1~1:10。較佳的反應(yīng)溫度為4~37°C，反應(yīng)時(shí)間為530分鐘。本發(fā)明步驟3)為將步驟2)的反應(yīng)溶液加入納米金溶液中進(jìn)行反應(yīng)，記錄反應(yīng)溶液的熒光光譜。其中，所述的納米金的粒徑較佳的為10~20nm，納米金溶液的反應(yīng)濃度較佳的為1100nM，納米金與特異性DNA的摩爾比較佳的為1:11:100。反應(yīng)溫度較佳的為437"C，反應(yīng)時(shí)間較佳的為1~5分鐘。所述的反應(yīng)較佳的在加入緩沖溶液進(jìn)行反應(yīng)后再觀察熒光光譜。同常規(guī)，所述的緩沖溶液較佳的可為Tris、PBS或胂酸鹽緩沖溶液，反應(yīng)濃度較佳的可為0.1~10mM。同時(shí)根據(jù)需要還可以加入其他鹽以更好的滿足靶分子與DNA的結(jié)合。所述觀察熒光光譜的方法較佳的可為分光光度法。分光光度法可為儀器檢測(cè)溶液的熒光光譜的變化光譜保持不變的，待檢溶液不含靶分子，呈陰性；對(duì)于FAM，光譜530nm處吸收降低的，待檢溶液含靶分子，呈陽(yáng)性。同常規(guī)，本發(fā)明可以采用水或靶分子類似物替換步驟2)中所加的靶分子溶液作為對(duì)照組。所述的靶分子類似物可以是靶分子的結(jié)構(gòu)類似物或性質(zhì)類似物。本發(fā)明整個(gè)反應(yīng)的體系可控制在微升級(jí)別，較佳的反應(yīng)體系的體積為101000微升，優(yōu)化實(shí)施方案可表述如下分別取2pL反應(yīng)濃度為0.1~10|iM的特異性DNA溶液與2|aL同等濃度的FAM標(biāo)記的cDNA(FAM-cDNA)溶液(可以使用的熒光基團(tuán)包括FAM、Cy3、Cy5、RodamineB、FITC或ROX等有機(jī)染料)，加入14pL的雜交緩沖溶液(雜交緩沖溶液如Tris-HCl、PBS或胂酸鹽等，反應(yīng)濃度為1025mM)混勻，加熱到85'C后緩慢降到室溫(對(duì)于本身無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列室溫條件下反應(yīng)530分鐘即可)，充分雜交形成雙鏈探針。然后向雜交液中加入2)iL反應(yīng)濃度為O.Ol-lOOiiM靶分子溶液，進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加靶分子溶液一組、以及加入靶分子類似物的一組作為對(duì)照。然后分別取2pL的上述反應(yīng)溶液加入10~1000pL的納米金(粒徑10~20nm，反應(yīng)濃度在1-lOOnM)溶液(Au:DNA的摩爾比例范圍在Lll:100)，用緩沖溶液(Tris、PBS、胂酸鹽等常規(guī)生化體系，反應(yīng)濃度為(U10mM)補(bǔ)足總體積0.2lmL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。本發(fā)明的基本原理可總結(jié)為利用納米金對(duì)不同結(jié)構(gòu)DNA的吸附作用不同，以及納米金高效猝滅熒光的性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的區(qū)分。首先設(shè)計(jì)任意靶的特異性DNA-熒光標(biāo)記cDNA雙鏈作為捕獲探針，加入靶后釋放出的熒光標(biāo)記cDNA以單鏈形式存在，靶與特異性DNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。由于單鏈DNA可以通過(guò)表面氨基吸附到納米金顆粒表面，因此cDNA的熒光被納米金猝滅。而雙鏈DNA和其它剛性的二級(jí)結(jié)構(gòu)均不能吸附到納米金表面，因此雙鏈的熒光沒(méi)有明顯降低。本發(fā)明的檢測(cè)原理圖可參見(jiàn)圖1。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下1)本發(fā)明改變了目前所使用的單鏈探針依賴于探針本身結(jié)構(gòu)變化提供信號(hào)的檢測(cè)模式，建立了一種通用的工作模式。也就是說(shuō)本發(fā)明的檢測(cè)方法具有通用性，檢測(cè)對(duì)象可以是任意靶分子，包括蛋白質(zhì)(如凝血酶、血小板衍生性生長(zhǎng)因子、溶菌酶、HIV相關(guān)多肽等)、有機(jī)小分子(如cAMP、ATP、可卡因等)、金屬離子(如K+、Hg2+、PP等)、甚至整個(gè)病毒顆粒，所述靶分子不包括DNA分子，因此本發(fā)明應(yīng)用范圍廣。因?yàn)樵诶碚撋先魏伟形镔|(zhì)都可以通過(guò)SELEX技術(shù)尋找到特異性的核酸適體，而且自然界中還存在大量可以發(fā)生構(gòu)象變化的DNA片段是基于某一特定環(huán)境和特定物質(zhì)的。2)本發(fā)明的檢測(cè)方法具有高度特異性。因?yàn)楹怂峤Y(jié)構(gòu)通常都具有非常高的親和力，而高親和力使得可以很方便地檢測(cè)到極微量的靶分子，并將反應(yīng)信號(hào)直接傳輸?shù)綑z測(cè)元件進(jìn)行讀取，同時(shí)又不受其他非靶物質(zhì)的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子的特異性檢測(cè)。3)本發(fā)明的檢測(cè)方法靈敏度高，利用熒光素和納米金，可以提高檢測(cè)的靈敏度到10—14mol數(shù)量級(jí)。4)本發(fā)明檢測(cè)快速。本發(fā)明建立了一種通用的工作模式，利用納米金進(jìn)行熒光檢測(cè)，可以很方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子的快速的檢測(cè)。以下結(jié)合本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)。圖1是本發(fā)明的檢測(cè)原理示意圖。圖2是本發(fā)明納米金反應(yīng)液的熒光光譜圖。I:可卡因；II:空白；III:苯甲酰芽子堿(Nl);IV:芽子堿甲酯(N2)。具體實(shí)施例方式下面用本發(fā)明對(duì)三磷酸腺苷(ATP)、可卡因、凝血酶、血小板衍生性生長(zhǎng)因子(PDGF)、溶菌酶、汞離子、鉀離子、pH(氫離子)檢測(cè)的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中的"室溫"是指進(jìn)行實(shí)施例操作的實(shí)驗(yàn)室溫度，為2225"C。熒光光譜檢測(cè)HitachiF4500Fluorescenespectrophotometer,激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)射波長(zhǎng)4卯900nm，用20(VL石英比色皿，取200jaL樣品進(jìn)行測(cè)量。本發(fā)明實(shí)施例中所用納米金顆粒參考文獻(xiàn)(S.Dwamkanathetal.,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications325,739,2004)制備。具體步驟如下，將100mL0.01X(w/w)的氯金酸溶液加熱到沸騰后，在劇烈攪拌下快速加入2~5mL的檸檬酸三鈉溶液(10mg/mL)并繼續(xù)加熱1530min,溶液變成酒紅色。停止加熱繼續(xù)攪拌30min后，靜置過(guò)夜。然后用0.22pm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，并放置在冰箱4'C保存。根據(jù)本方法得到粒徑為10-20nm，濃度為8~1nM的納米金溶液。在制備納米金時(shí)，使用的是同一濃度的氯金酸溶液，生成的顆粒越大，對(duì)應(yīng)的濃度就越低。此處，10nm金的濃度為8nM左右，而20nm的金的濃度為lnM左右。本發(fā)明實(shí)施例中所用的各種DNA序列如表1所示。這些序列都帶有熒光標(biāo)記FAM。在本領(lǐng)域，其他的熒光標(biāo)記也明顯適用于實(shí)施例中的反應(yīng)，因此不再贅述。表1所示的DAN均按照己公布的序列進(jìn)行了修飾，修飾前的序列見(jiàn)括號(hào)中序列，修飾后不同的堿基用下劃線標(biāo)出。其中，檢測(cè)ATP、PDGF、可卡因、凝血酶和溶菌酶所用的特異性DNA為核酸適體，檢測(cè)鉀離子、汞離子、pH值所用的特異性DNA分別為PSO、MSO和具有i-motif結(jié)構(gòu)的DNA。這些序列均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。表1.寡聚核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例l可卡因的檢測(cè)步驟分別取2nL濃度為100nM的可卡因的核酸適體溶液與2pL濃度為100pM的cDNA溶液，加入14pL的緩沖溶液(25mMTris，pH8.2，0.3MNaCl)后，加熱至85"C后緩慢冷卻至室溫，使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。然后向雜交液中加入2pL濃度為0.01lmM的可卡因鹽酸鹽的水溶液，室溫條件下反應(yīng)30min使其進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加可卡因，加入2pL水的一組作為空白、以及加入2jaLlmM的苯甲酰芽子堿(Nl)、芽子堿甲酯(N2)的兩組作為對(duì)照。然后分別取2^L的上述反應(yīng)溶液加入100pL的納米金溶液(Bnm，3.5nM)，反應(yīng)5min后，用上述緩沖溶液(25mMTris，pH8.2，0.3MNaCl)補(bǔ)足總體積0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖l所示的原理和操作步驟，熒光光譜圖見(jiàn)圖2，可見(jiàn)在含有可卡因的一組溶液中，可卡因與雙鏈探針中的核酸適體結(jié)合，釋放出FAM-cDNA單鏈，吸附到納米金表面從而熒光被猝滅70%以上。而沒(méi)有加可卡因的一組，以及N1、N2組，雙鏈探針的結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化，因此加入納米金后熒光降低幅度較小(小于30%，可能是由于雜交效率而導(dǎo)致溶液中部分FAM-cDNA以單鏈形式存在)。通過(guò)優(yōu)化條件，最低可以檢測(cè)出納米金溶液中可卡因的濃度在10nM，按照檢測(cè)時(shí)體積為0.2mL計(jì)算，可以檢測(cè)到2pmo1的可卡因，如果用nano-drop熒光光譜檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)時(shí)樣品體積最小為1^L，此時(shí)可以最低檢測(cè)到lOfmol的可卡因。實(shí)施例2ATP的檢測(cè)步驟分別取2pL濃度為100pM的ATP的核酸適體溶液與2pL濃度為10(^M的cDNA溶液，加入14pL的緩沖溶液(25mMTris，pH8.2，0.15MNaCl)后，加熱至85"C后緩慢冷卻至室溫，使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。然后向雜交液中加入2^iL濃度為0.01lmM的ATP的水溶液，室溫條件下反應(yīng)30min使其進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加ATP，加入2pL水的一組作為空白、以及加入2pLlmM的CTP、UTP、GTP的三組作為對(duì)照。然后分別取2pL的上述反應(yīng)溶液加入100pL的納米金溶液(20nm，lnM)，反應(yīng)5min后，用上述緩沖溶液(25mMTris，pH8.2，0.15MNaCl)補(bǔ)足總體積0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入ATP的一組熒光顯著降低，而空白組和對(duì)照組熒光下降幅度較小。利用此法檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)限參考實(shí)施例1。實(shí)施例3二價(jià)汞離子的檢測(cè)(一)步驟分別取lpL濃度為lpM的MSO溶液與lpL濃度為lpM的cDNA溶液，加入16pL的緩沖溶液(lOmM胂酸-胂酸鈉，pH6.8，0.3MNaCl)后，室溫條件下反應(yīng)10min使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。然后向雜交液中加入2jiL濃度為100nM0.1mM的Hg^的水溶液，室溫條件下反應(yīng)5min使其進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加Hg2+，加入2pL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。另外選擇性分析通過(guò)兩組實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行，一組加入2pL各25mM的Ca^、Mg^的，另外一組加入各0.5mM的混合離子(Fe2+，Cu2+,Co2+,Mn2+,Ni2+,Zn2+,Cd2+)。然后分別取5pL的上述反應(yīng)溶液加入5pL的納米金溶液(lOnm，100nM)，反應(yīng)lmin后，用上述緩沖溶液(10mM胂酸-胂酸鈉，pH6.8，0.3MNaCl)補(bǔ)足總體積0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入Hg2+的一組熒光顯著降低，而空白組和對(duì)照組熒光下降幅度較小。利用此法檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)限參考實(shí)施例1。實(shí)施例4二價(jià)汞離子的檢測(cè)(二)步驟分別取2|aL濃度為lOOjxM的MSO溶液與2pL濃度為100pM的cDNA溶液，加入14pL的緩沖溶液OOmM胂酸-胂酸鈉，pH6.8，0.3MNaCl)后，室溫條件下反應(yīng)lOmin使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。然后向雜交液中加入2pL濃度為0.01mMlmM的Hg"+的水溶液，室溫條件下反應(yīng)5min使其進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加Hg2+，加入2pL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。另外選擇性分析通過(guò)兩組實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行，一組加入2nL各25mM的Ca2+、Mg2+的，另外一組加入各0.5mM的混合離子(Fe2+，Cu2+,Co2+,Mn2+,Ni2+,Zn2+,Cd2+)。然后分別取2pL的上述反應(yīng)溶液加入lOOOjiL的納米金溶液(lOnm，lnM)，反應(yīng)5min后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入Hg2+的一組熒光顯著降低，而空白組和對(duì)照組熒光下降幅度較小。利用此法檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)限參考實(shí)施例1。實(shí)施例5鉀離子的檢測(cè)步驟分別取2jliL濃度為lOOpM的PSO溶液與2pL濃度為lOO]uM的cDNA溶液，加入14nL的緩沖溶液(lOmMPB，pH7.4，0.3MLiCl)后，室溫條件下反應(yīng)5min使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。然后向雜交液中加入2pL濃度為O.OlmM-lmM的K+的水溶液，(C下反應(yīng)5min使其進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加K+，加入2pL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)，以及加入2pL300mM的Na+作為對(duì)照組。然后分別取2pL的上述反應(yīng)溶液加入在4'C預(yù)冷的100nL的納米金溶液(13nm，10nM)，反應(yīng)5min后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入K+的一組熒光顯著降低，而空白組和對(duì)照組熒光下降幅度較小。利用此法檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)限參考實(shí)施例1。實(shí)施例6pH-DNA結(jié)構(gòu)的檢測(cè)步驟分別取2pL濃度為100pM的pH-DNA溶液與2pL濃度為100pM的cDNA溶液，加入14pL的緩沖溶液(10mMPB，pH7.0，0.3MNaCl)后，室溫條件下反應(yīng)15min使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。用HC1或NaOH調(diào)節(jié)如上制備而得的納米金溶液(13nm，5nM)的pH分別為4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0。然后分別取2pL的上述反應(yīng)溶液加入不同pH值的100nL的納米金溶液，室溫反應(yīng)lmin后，用上述緩沖溶液補(bǔ)足總體積0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。結(jié)果在pH為5.5的一組溶液中，pH-DNA主要以四分體的剛性結(jié)構(gòu)存在，釋放出熒光標(biāo)記的cDNA單鏈，吸附到納米金表面，因此熒光顯著降低。而在pH為8.5的一組溶液中，仍主要以雙鏈形式存在，熒光降低較少。同時(shí)得到pH-DNA的結(jié)構(gòu)半轉(zhuǎn)換點(diǎn)在pH6.3附近，這與通過(guò)CD譜檢測(cè)得到的pH6.2的結(jié)構(gòu)半轉(zhuǎn)換點(diǎn)非常吻合。實(shí)施例7pH的檢測(cè)1、獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(1)分別取2pL濃度為lOOjaM的pH-DNA溶液與2|aL濃度為lOOpM的cDNA溶液，加入14jLiL的緩沖溶液(10mMPB，pH7.0，0.3MNaCl)后，室溫條件下反應(yīng)30min使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。(2)用HCl或NaOH制備pH分別為4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5,9.0，IO.O的水溶液,然后分別取50pL該不同pH值的水溶液加入到50nL如上制備而得的納米金溶液(13nm，3.5nM)中，混合均勻。(3)分別取2pL的步驟(1)的反應(yīng)溶液加入到步驟(2)的不同pH值的lOOpL的納米金溶液中，室溫反應(yīng)5min，加入上述緩沖溶液補(bǔ)足0.2mL后記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。2、樣品的檢測(cè)取50pL待測(cè)pH值的樣品加入到50如上制備而得的納米金溶液中(13nm，3.5nM)。再加入2pL的步驟(1)的反應(yīng)溶液，室溫反應(yīng)5min，然后加入上述緩沖溶液補(bǔ)足0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測(cè)溶液的pH值。結(jié)果可檢測(cè)的pH值的樣品的pH范圍是pH510。實(shí)施例8凝血酶的檢測(cè)步驟分別取2pL濃度為lpM的凝血酶的核酸適體溶液與2pL濃度為l|iM的cDNA溶液，加入14pL的緩沖溶液(20mMTris-乙酸，pH7.4，140mMNaCl，lmMCaCl2，lmMMgCl2)后，加熱至85'C后緩慢冷卻至室溫，使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。然后向雜交液中加入2pL濃度為10nM0.1mM的凝血酶的水溶液，室溫條件下反應(yīng)30min使其進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加凝血酶，加入2iiL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。以及加入2pLlmM的BSA的一組作為對(duì)照。然后分別取2pL的上述反應(yīng)溶液加入lOO)iL的納米金溶液(10nm，5nM)，反應(yīng)lmin后，用上述緩沖溶液(20mMTris-乙酸，pH7.4，140mMNaCl，lmMCaCl2，ImMMgCl2)補(bǔ)足總體積0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入凝血酶的一組熒光顯著降低，而空白組和對(duì)照組熒光下降幅度較小。利用此法檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)限參考實(shí)施例1。實(shí)施例9溶菌酶的檢測(cè)步驟分別取2piL濃度為100nM的溶菌酶的核酸適體溶液與2pL濃度為100nM的cDNA溶液，加入14pL的緩沖溶液(10mMPB，pH7.0，0.2MNaCl)后，加熱至85。C后緩慢冷卻至室溫，使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。然后向雜交液中加入2pL濃度為0.01lmM的溶菌酶的水溶液，室溫條件下反應(yīng)30min使其進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加溶菌酶，加入2pL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。以及加入2pLlmM的BSA的一組作為對(duì)照。然后分別取2pL的上述反應(yīng)溶液加入lOOpL的納米金溶液(13nm，10nM)，反應(yīng)5min后，用上述緩沖溶液(10mMPB，pH7.0，0.2MNaCl)補(bǔ)足總體積0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入溶菌酶的一組熒光顯著降低，而空白組和對(duì)照組熒光下降幅度較小。利用此法檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)限參考實(shí)施例1。實(shí)施例10PDGF的檢測(cè)步驟分別取2pL濃度為lOOjaM的溶菌酶的核酸適體溶液與2pL濃度為100nM的cDNA溶液，加入14pL的緩沖溶液(10mMPB，pH7.0，0.2MNaCl)后，加熱至85'C后緩慢冷卻至室溫，使其進(jìn)行充分雜交形成雙鏈探針。然后向雜交液中加入2|tiL濃度為0.01lmM的PDGF的水溶液，37'C條件下反應(yīng)30min使其進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加PDGF，加入2pL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。以及加入2pLlmM的BSA的一組作為對(duì)照。然后分別取2|aL的上述反應(yīng)溶液加入37。C預(yù)熱的lOOpL的納米金溶液(13nm，10nM)，反應(yīng)5min后，用上述緩沖溶液(10mMPB，pH7.0，0.2MNaCl)補(bǔ)足總體積0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入PDGF的一組熒光顯著降低，而空白組和對(duì)照組熒光下降幅度較小。利用此法檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)限參考實(shí)施例1。權(quán)利要求1、一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，依次包括以下步驟1)將能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與熒光標(biāo)記的cDNA雜交形成雙鏈捕獲探針；2)加入待檢溶液進(jìn)行反應(yīng)；3)加入納米金溶液進(jìn)行反應(yīng)，記錄反應(yīng)溶液的熒光光譜。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，步驟1)所述的耙分子為三磷酸腺苷、可卡因、凝血酶、溶菌酶、血小板衍生性生長(zhǎng)因子、鉀離子、汞離子或氫離子。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，步驟1)所述的特異性DNA為核酸適體、特異性結(jié)合汞離子的寡核苷酸、特異性結(jié)合鉀離子的寡核苷酸或具有i-motif結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，步驟1)所述的熒光標(biāo)記所用的熒光基團(tuán)選自熒光素、Cy3、Cy5、羅丹明B、異硫氰酸熒光素和6-羰基-羅丹明。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)所述的納米金的粒徑為10~20nm。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)所述的納米金的反應(yīng)濃度為1100nM。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)所述的納米金與特異性DNA的摩爾數(shù)比為1:1-1:100。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)的反應(yīng)溫度為4~37°C，反應(yīng)時(shí)間為1~5分鐘。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)所述的反應(yīng)還加入緩沖溶液進(jìn)行反應(yīng)。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的靶分子檢測(cè)方法，其特征在于，所述的緩沖溶液為常規(guī)的Tris、PBS或胂酸鹽緩沖溶液，反應(yīng)濃度為1025mM。11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的耙分子檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)所述觀察熒光光譜的方法為分光光度法。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測(cè)方法，依次包括以下步驟1)將能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與熒光標(biāo)記的cDNA雜交形成雙鏈捕獲探針；2)加入待檢溶液進(jìn)行反應(yīng)；3)加入納米金溶液進(jìn)行反應(yīng)，記錄反應(yīng)溶液的熒光光譜。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有通用性，檢測(cè)對(duì)象可以是任意靶分子，應(yīng)用范圍廣。利用本發(fā)明可以很方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子的快速、靈敏、選擇性檢測(cè)。文檔編號(hào)G01N21/76GK101424642SQ20081020273公開(kāi)日2009年5月6日申請(qǐng)日期2008年11月14日優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日發(fā)明者娟張,樊春海,王麗華申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所