專利名稱：一種制備條斑紫菜r-藻紅蛋白熒光探針的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備藻膽蛋白熒光探針的方法，特別是涉及一種制備條斑紫菜
R-藻紅蛋白熒光探針的方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白是很好的純天然色素，有鮮艷的顏色，可用作食物色素、化妝品、添加劑等，同時(shí)，藻膽蛋白也是一種新型熒光物質(zhì)，包括藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白等，可以作為抗體熒光標(biāo)記物質(zhì)以替代合成熒光物質(zhì)，它們作為生物體內(nèi)的熒光示蹤物質(zhì)，正被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、免疫標(biāo)記等領(lǐng)域。特別是R-藻紅蛋白(R-PE)因其極高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率，較大的斯托克(STOKES)位移，以及其黃橙色特征熒光，可以避開(kāi)大多數(shù)生物環(huán)境中的內(nèi)源熒光分子干擾，制成的熒光探針的檢測(cè)效果顯著高于傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物。但由于熒光探針制備工藝難度較大，所用的藻紅蛋白及單克隆抗體的純度要求又較高，使目前國(guó)內(nèi)科研和醫(yī)療單位使用的藻紅蛋白熒光標(biāo)記物完全依賴進(jìn)口 ，成為限制其擴(kuò)大應(yīng)用的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種制備條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針的方法，它不但能高效地制備R-藻紅蛋白熒光探針，而且，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的一種制備條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針
的方法在溫度為2(TC條件下進(jìn)行以下各步驟 (1)以3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與R-藻紅蛋白(R-PE)摩爾比為40 : l進(jìn)行R-藻紅蛋白(R-PE)的衍生化，搖床避光低速振蕩2小時(shí)，用S印hadex G-25脫鹽柱收集衍生化的R-藻紅蛋白(R-PE); (2)以二硫蘇糖醇(DTT)與抗體摩爾比為500 : 1進(jìn)行抗體的巰基化，搖床低速振蕩1小時(shí)，用S印hadex G-25脫鹽柱收集巰基化的抗體； (3)按衍生前R-藻紅蛋白與抗體的質(zhì)量比3 : 5的比例取衍生化的R-藻紅蛋白與巰基化的抗體混合，搖床低速震蕩12小時(shí)，后加入100 的N-乙基馬來(lái)酰亞胺，反應(yīng)30分鐘，接著以S印hacryl S-300HR層析柱分離純化，洗脫液為50mmol/L磷酸鹽緩沖液+150咖01/1氯化納、1^7.0，收集分離的交聯(lián)產(chǎn)物，即為條斑紫菜1 -藻紅蛋白(R-PE)熒光探針。 所述的搖床低速震蕩為50轉(zhuǎn)/分。 所述的N-乙基馬來(lái)酰亞胺為用無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)溶解，濃度為80mmol/L。
所述的S印hacryl S-300HR層析柱為C 16mmX1000mm的S印hacrylS-300HR層析柱。 由于本發(fā)明以條斑紫菜R-藻紅蛋白(R-PE)為材料，通過(guò)R-藻紅蛋白(R-PE)衍生化、抗體巰基化，交聯(lián)產(chǎn)物分離純化等方法制備條斑紫菜R-藻紅蛋白(R-PE)熒光探針，因此，具有以下優(yōu)點(diǎn) 1、藻膽蛋白來(lái)源豐富，我國(guó)是紫菜生產(chǎn)大國(guó)，年產(chǎn)量20億張左右，目前市場(chǎng)上大
多是自然涼干的紫菜，銷售價(jià)格在每千克20-30元，而每噸飼料級(jí)螺旋藻干粉6-8萬(wàn)元人民
幣(60-80元/千克)，曾一度高達(dá)每kg30美元(約240元/千克)，是紫菜的十倍，因此本
發(fā)明所用原料來(lái)源廣泛，無(wú)需加工，成本相對(duì)于螺旋藻便宜的多； 2、目前從條斑紫菜提取高純度藻紅蛋白工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，得率較高； 3、R-藻紅蛋白(R-PE)檢測(cè)效果好，R-藻紅蛋白(R-PE)因其極高的消光系數(shù)和量
子產(chǎn)率，較大的斯托克(STOKES)位移，以及其黃橙色特征熒光，可以避開(kāi)大多數(shù)生物環(huán)境
中的內(nèi)源熒光分子干擾，制成的R-藻紅蛋白(R-PE)熒光探針的檢測(cè)效果顯著高于傳統(tǒng)的
熒光標(biāo)記物。


圖1是在明場(chǎng)下肝癌SMCC-7721細(xì)胞的形態(tài)。 圖2是在綠色激發(fā)光下羊抗兔抗體檢測(cè)SMCC-7721細(xì)胞(對(duì)照組)。 圖3是在綠色激發(fā)光下R-藻紅蛋白熒光探針檢測(cè)SMCC-7721細(xì)胞。 圖4是在綠色激發(fā)光下R-藻紅蛋白衍生物R-PE-PDP檢測(cè)SMCC-7721細(xì)胞(對(duì)照組)。 圖5是在藍(lán)色激發(fā)光下R-藻紅蛋白熒光探針檢測(cè)SMCC-7721細(xì)胞。 圖6是在藍(lán)色激發(fā)光下R-藻紅蛋白衍生物R-PE-PDP檢測(cè)SMCC-7721細(xì)胞(對(duì)照組)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本實(shí)施例中所用的材料為條斑紫菜R-藻紅蛋白(R-PE)和羊抗兔抗體，所述的條斑紫菜R-藻紅蛋白(R-PE)從上海安譜科學(xué)儀器有限公司購(gòu)得，所述的羊抗兔抗體從武漢華美生物工程有限公司購(gòu)得。 (1)、以3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與R-藻紅蛋白(R-PE)摩爾比為40 : l進(jìn)行R-藻紅蛋白(R-PE)的衍生化，在搖床以50轉(zhuǎn)/分避光振蕩2小時(shí)，再用S印hadex G-25脫鹽柱去除未反應(yīng)的3_(2_吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)，收集衍生化的R-藻紅蛋白(R-PE); (2)、以二硫蘇糖醇(DTT)與羊抗兔抗體摩爾比為500 : 1進(jìn)行羊抗兔抗體的巰基化，在2(TC下，在搖床以50轉(zhuǎn)/分振蕩1小時(shí)，用S印hadex G-25脫鹽柱去除未反應(yīng)的二硫蘇糖醇(DTT)，收集巰基化的羊抗兔抗體； (3)、按衍生前R-藻紅蛋白(R-PE)與羊抗兔抗體的質(zhì)量比3 : 5的比例取衍生化的R-藻紅蛋白(R-PE)與巰基化的羊抗兔抗體混合，在搖床以50轉(zhuǎn)/分震蕩，反應(yīng)12小時(shí)，后加入100 iil的用無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)溶解的濃度為80mmol/L的N-乙基馬來(lái)酰亞胺，反應(yīng)30分鐘，再以S印hacrylS-300HR層析柱(<2 16mmX1000mm)分離純化，洗脫液為50mmol/L磷酸鹽緩沖液+150mmol/L氯化納、PH7. 0，收集分離的交聯(lián)產(chǎn)物，即制得條斑紫菜R-藻紅蛋白(R-PE)熒光探針。
上述各步驟在溫度為2(TC條件下進(jìn)行。
實(shí)施例2 條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針在肝癌SMCC-7721細(xì)胞檢測(cè)上的應(yīng)用步驟如下
1.取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干，用0.9%氯化納溶液洗滌三遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入肝癌SMCC-7721細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜。 2.吸盡六孔板內(nèi)培養(yǎng)液，加入lml固定液，4t:固定過(guò)夜。
3.去除固定液，用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，吸盡液體。
4.用封閉液封閉60分鐘。 5.去除封閉液，加稀釋的兔抗肌動(dòng)蛋白多克隆抗體(1 : 400)作用60分鐘。 6.去除一抗，用洗滌液洗滌3-5次，每次3-5分鐘。 7.去除洗滌液，加入1毫升R-藻紅蛋白熒光探針作用60分鐘。 8.回收熒光標(biāo)記的二抗。用洗滌液洗滌蓋玻片3-5次，每次3-5分鐘。 9.滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，使細(xì)胞接觸封片液。 10.在熒光顯微鏡下用綠光激發(fā)，觀察并拍照。 同時(shí)以異雙功能試劑衍生化但未與羊抗兔抗體交聯(lián)的R-藻紅蛋白衍生物(R-PE-PDP)及單獨(dú)使用羊抗兔抗體作對(duì)照組。
結(jié)果 圖1是肝癌SMCC-7721細(xì)胞在明場(chǎng)情況下20倍的照片，細(xì)胞形態(tài)清楚可與其后的熒光激發(fā)圖片做對(duì)比。 圖2顯示只與羊抗兔抗體結(jié)合的SMCC-7721細(xì)胞自身不具有熒光能用于熒光標(biāo)記檢測(cè)。 經(jīng)兔抗肌動(dòng)蛋白多克隆抗體處理的肝癌細(xì)胞能與R-藻紅蛋白熒光探針發(fā)生特異性的結(jié)合，在綠色激發(fā)光下顯示出紅色的細(xì)胞形態(tài)(圖3)，與對(duì)照組(圖4)相比，其熒光強(qiáng)度大細(xì)胞形態(tài)清晰明顯，說(shuō)明未與抗體交聯(lián)的衍生化R-PE大部分未與肝癌細(xì)胞上的第一抗體(兔抗肌動(dòng)蛋白多克隆抗體)發(fā)生結(jié)合且其他非特異性吸附也較弱會(huì)被緩沖液洗出。而藍(lán)色激發(fā)光下顯示出橙色的細(xì)胞形態(tài)(圖5)，與對(duì)照組(圖6)相比，其熒光強(qiáng)度也明顯較大，但整個(gè)細(xì)胞形態(tài)不如在綠色激發(fā)光下清晰。
藻膽蛋白熒光探針優(yōu)點(diǎn) 在免疫分析技術(shù)中以往常用的放射性同位素標(biāo)記法因半衰期短、需防護(hù)、廢物處理困難；酶聯(lián)標(biāo)記法因易失活，靈敏度低，假性反應(yīng)不易控制等缺點(diǎn)，正在被熒光標(biāo)記法所取代。而用于免疫熒光分析，藻膽蛋白熒光探針具有傳統(tǒng)熒光染料無(wú)法比擬的優(yōu)越性
1)各種藻膽蛋白在可見(jiàn)光區(qū)有強(qiáng)烈的吸收，熒光強(qiáng)度比常用的熒光素強(qiáng)30倍。
2)所發(fā)熒光不為天然生物大分子及其它物質(zhì)自發(fā)淬滅。 3)在含水環(huán)境中高度可溶，各種藻膽蛋白的等電點(diǎn)均位于pH4. 7 5. 3范圍內(nèi)，在生理pH值條件下，藻膽蛋白和細(xì)胞表面都帶負(fù)電荷，其非特異性結(jié)合少。
4)藻膽蛋白的熒光激發(fā)和發(fā)射的斯托克位移較大(吸收光譜區(qū)寬，發(fā)射光譜區(qū)窄)，根據(jù)能量轉(zhuǎn)移原理可使用特殊的技術(shù)構(gòu)建兩種藻膽蛋白的分子間交聯(lián)體或藻膽蛋白與其它熒光染料的結(jié)合物，可使其斯托克位移更為擴(kuò)大，發(fā)射的熒光更趨近于可見(jiàn)光譜的紅端，減少和排除了樣品本底熒光、拉曼散射、瑞利散射的干擾。有利于激發(fā)光的選擇，較大程度地提高了熒光檢測(cè)的靈敏度。 5)藻膽蛋白的吸光度和熒光量子產(chǎn)率很高，并且與環(huán)境的pH值無(wú)關(guān)，有利于提高靈敏度。在較寬的PH范圍內(nèi)具有較寬的吸收光譜，比較容易選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)，從而得到高效熒光發(fā)射，且激發(fā)時(shí)有特異的熒光發(fā)射峰。 6)藻膽蛋白易用化學(xué)方法與其它分子結(jié)合而不影響其熒光性質(zhì)，從而形成多種交
聯(lián)體可以用于可見(jiàn)光區(qū)的單一激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射不同顏色的熒光?？衫米鞫?、三色等多
色標(biāo)記，分別標(biāo)記不同的單抗，實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)測(cè)定。藻膽蛋白在pH4 11的范圍內(nèi)其吸
收光譜和熒光光譜幾乎不變，與單抗結(jié)合也不改變其吸收光譜和熒光光譜。 7)藻膽蛋白表面具有較多的活性基團(tuán)如-SH基，-NH2基等，與抗體共價(jià)結(jié)合并不
影響它的光譜學(xué)特性，同時(shí)又保持了抗體的免疫特征。 8)受激后熒光衰減較緩，是優(yōu)良的熒光探針。液體或固體狀態(tài)存在時(shí)都極為穩(wěn)定，且長(zhǎng)期保存而熒光幾乎無(wú)衰減，這一性質(zhì)這對(duì)于研制中的普及型藻脂蛋白熒光標(biāo)記診斷試劑盒是極為有利的。檢測(cè)結(jié)果的長(zhǎng)期保存預(yù)示著有可能實(shí)現(xiàn)分散取樣，集中檢測(cè)，便于邊遠(yuǎn)地區(qū)的使用。
權(quán)利要求
一種制備條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針的方法，其特征在于該方法在溫度為20℃條件下進(jìn)行以下各步驟(1)以3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯與R-藻紅蛋白摩爾比為40∶1進(jìn)行R-藻紅蛋白的衍生化，搖床避光低速振蕩2小時(shí)，用Sephadex G-25脫鹽柱收集衍生化的R-藻紅蛋白；(2)以二硫蘇糖醇與抗體摩爾比為500∶1進(jìn)行抗體的巰基化，搖床低速振蕩1小時(shí)，用Sephadex G-25脫鹽柱收集巰基化的抗體；(3)按衍生前R-藻紅蛋白與抗體的質(zhì)量比3∶5的比例取衍生化的R-藻紅蛋白與巰基化的抗體混合，搖床低速震蕩12小時(shí)，后加入100μl的N-乙基馬來(lái)酰亞胺，反應(yīng)30分鐘，接著以Sephacryl S-300HR層析柱分離純化，洗脫液為50mmol/L磷酸鹽緩沖液+150mmol/L氯化納、PH7.0，收集分離的交聯(lián)產(chǎn)物，即為條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針。
2. —種制備條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針的方法，其特征在于所述的搖床低速震蕩 為50轉(zhuǎn)/分。
3. —種制備條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針的方法，其特征在于所述的N-乙基馬來(lái)酰 亞胺為用無(wú)水二甲基亞砜溶解，濃度為80mmol/L。
4. 一種制備條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針的方法，其特征在于所述的S印hacryl S-300HR層析柱為C 16mmX1000mm的S印hacryl S-300HR層析柱。
全文摘要
一種制備條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針的方法，特征是該方法在溫度為20℃條件下進(jìn)行以下各步驟先以3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯與R-藻紅蛋白摩爾比為40∶1進(jìn)行R-藻紅蛋白的衍生化，搖床避光低速振蕩2小時(shí)，用Sephadex G-25脫鹽柱收集衍生化的R-藻紅蛋白；再以二硫蘇糖醇與抗體摩爾比為500∶1進(jìn)行抗體的巰基化，搖床低速振蕩1小時(shí)，用Sephadex G-25脫鹽柱收集巰基化的抗體；最后按衍生前R-藻紅蛋白與抗體的質(zhì)量比3∶5的比例取衍生化的R-藻紅蛋白與巰基化的抗體混合，搖床低速震蕩12小時(shí)，后加入100μl的N-乙基馬來(lái)酰亞胺，反應(yīng)30分鐘，接著以Sephacryl S-300HR層析柱分離純化，洗脫液為50mmol/L磷酸鹽緩沖液+150mmol/L氯化納、pH7.0，收集分離的交聯(lián)產(chǎn)物，即為條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光探針。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101750482SQ200810204718
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者何培民, 周銘, 李春霞, 柳俊秀, 汪卿, 蔡春爾 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)