專利名稱：：苦參堿液相色譜測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種化學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
的方法，具體是一種苦參堿液相色譜測定方法。
背景技術(shù)：
：高效液相色譜分析方法是藥物分析中常用的方法，該法以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和技術(shù)，流動相采用高壓輸送，并使用高效固定相及現(xiàn)代化色譜工作站，可實現(xiàn)在線分離和分析。具有適用范圍廣、分離效率高、分析速度快、靈敏度高等特點。所以，近年來廣泛應(yīng)用于中草藥及其制劑化學(xué)成分分離、鑒定及含量測定?？鄥A為豆科植物苦參、苦豆子和山豆根含有的主要生物堿之一，臨床主要用來治療癌癥，病毒性肝炎，心臟病，以及皮膚病牛皮癬和濕疹，還是一種天然植物農(nóng)藥，值得關(guān)注開發(fā)。苦參堿現(xiàn)行純度分析方法有薄層色譜法、毛細管電色譜法、高效液相色譜法。其中高效液相法大多使用了離子對試劑或者強酸堿，或者采用氨基柱、離子交換柱，洗脫方式也多為梯度洗脫，這些分析方法的不足之處在于①離子對試劑或強酸堿的引入容易產(chǎn)生沉淀，使高效液相色譜儀中高壓泵的柱塞和密封墊摩擦產(chǎn)生系統(tǒng)漏液，損害較大；②氨基柱、離子交換柱造價高、壽命短、保養(yǎng)困難；③梯度洗脫法溶劑的配比隨時間而變化，每次分離都需要重新平衡，分析時間長、操作復(fù)雜、重現(xiàn)性不及等度洗脫；④流動相配制相當復(fù)雜，不易操作。另外，由于苦參堿的最大吸收波長在210nm左右，而許多試劑在波長210nm左右也有強烈吸收，容易對檢測造成干擾，導(dǎo)致紫外檢測器靈敏度降低。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利申請?zhí)?00610060119.3，公開號CN101046467A，記載了一種"青柏潔身洗液中苦參堿含量的測定方法"，包括下列步驟稱取苦參堿對照品適量，加甲醇配制成0.010.1mg/mL的溶液；制備供試品溶液精密量取本品520mL，加濃氨試液0.25lmL，用氯仿振搖提取3次以上，每次20mL，合并氯仿液，蒸干，殘渣加少量氯仿(約5mL)溶解，裝入堿性氧化鋁柱(80200目，15g)，氯仿-甲醇(210:02)1050ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得，分別精密吸取對照品溶液54(HiL，供試品溶液540^iL，注入液相色譜儀，測定，計算得出結(jié)果。但是該技術(shù)具有操作復(fù)雜，成分分離度不佳及分析結(jié)果重現(xiàn)性不佳的不足。又經(jīng)過檢索發(fā)現(xiàn)，侯惠嬋在《中國新醫(yī)藥》(2004，Vol.3-No.9-P.83)上，發(fā)表了《山豆根中氧化苦參堿和苦參堿的含量測定》，記載了一種以RP-HPLC法同時測定山豆根中苦參堿和氧化苦參堿的含量的方法，但是該技術(shù)具有流動相配制復(fù)雜，線性范圍窄的不足。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種苦參堿液相色譜測定方法，操作步驟簡單，適應(yīng)性強，分析結(jié)果重現(xiàn)性好。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟①取苦參堿樣品10mg，用甲醇定容于容量瓶中，超聲溶解得供試品溶液；②取苦參堿對照品5mg，用甲醇定容于容量瓶中，超聲溶解得苦參堿標準液；所述的甲醇為色譜純級甲醇。'③各取10pL的供試品溶液和苦參堿標準液注入液相色譜儀進行測定；所述的液相色譜儀為包含有紫外檢測器的高效液相色譜儀和十八垸基硅烷鍵合硅膠色譜柱。所述的液相色譜儀所采用的流動相為包含甲醇、磷酸和三乙胺的水溶液，其中甲醇與磷酸和三乙胺的水溶液的體積比為1:3，該流動相的流速為0.81.2mL/min，柱溫為2550。C。所述的測定時采用的洗脫方式是等度洗脫;檢測波長為210±2nm，進樣量220nL下進行檢測。④記錄峰面積，按外標法以峰面積^對苦參堿含量x計算回歸方程，獲得所述的回歸方程為"L32x106jc—1.16x105相關(guān)系數(shù)為0.9996，線性范圍為0.321.92嗎。⑤根據(jù)上述步驟，依次對步驟①的苦參堿樣品進行精密度測定、24小時穩(wěn)定性測定、重現(xiàn)性測定以及回收率測定。所述的精密度測定是指吸取苦參堿標準液6nL，按步驟③和步驟④將溶液注入液相色譜儀進行峰面積測定共6次，然后計算該6次的平均峰面積及相對標準偏差RSD。所述的24小時穩(wěn)定性測定是指吸取供試品溶液6pL，分別在靜置4小時后，靜置8小時后、靜置12小時后以及靜置24小時后重復(fù)步驟③和步驟④將溶液注入液相色譜儀進行峰面積測定共5次，然后計算該5次的平均峰面積及相對標準偏差RSD。所述的重現(xiàn)性測定是指取同一含苦參堿樣品共5份，按步驟①方法制備出5份供試品溶液，從每一份供試品溶液中精密吸取6pL后按步驟③和步驟④將溶液注入液相色譜儀進行峰面積測定，并將測定所得結(jié)果代入步驟④中的回歸方程中，得到供試品溶液中苦參堿的平均含量及相對標準偏差RSD和平均保留時間及相對標準偏差RSD。所述的回收率測定是指將苦參堿對照品以不同劑量加入到已知苦參堿含量的樣品中并按步驟①方法制備法制備出每一組相同劑量3份的若干份供試品溶液，從每一份供試品溶液中吸取6pL并按步驟③和步驟④將溶液注入液相色譜儀進行峰面積測定并計算回收量與加入量的比值，即回收率，計算平均回收率及相對標準偏差RSD。本發(fā)明能對苦參堿進行有效分離和定量測定，操作簡單、省時、專一性強、分析結(jié)果重現(xiàn)性好。具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施儀器與試劑島津LC一10Avp高效液相色譜儀，YMC公司YMC-PackODS-A分析柱。色譜純甲醇、分析純磷酸、分析純?nèi)野?，苦參堿標準品。6色譜條件分析柱YMC-PackODS-A(5pm，250mmx4.6mm)色譜柱；流動相甲醇一0.05mol/L磷酸與0.05mol/L三乙胺等體積混合的水溶液(25:75);檢測波長210nm;柱溫3(TC下檢測；理論塔板數(shù)以苦參堿計算不低于5000;控制進樣量在220nl之間。檢測步驟①取含苦參堿樣品10mg，精密稱定，用無水甲醇定容于容量瓶中，超聲溶解得供試品溶液；②取苦參堿對照品5mg，精密稱定，用無水甲醇定容于容量瓶中，超聲溶解得苦參堿標準液；(D各取10|aL的供試品溶液和苦參堿標準液注入液相色譜儀進行測定；所述的液相色譜儀為包含有紫外檢測器的高效液相色譜儀和十八垸基硅垸鍵合硅膠色譜柱。所述的液相色譜儀所采用的流動相為包含甲醇、磷酸和三乙胺的水溶液，其中甲醇與磷酸和三乙胺的水溶液的體積比為1:3，該流動相的流速為0.81.2mL/min，柱溫為2550。C。所述的測定時采用的洗脫方式是等度洗脫;檢測波長為210±2nm，進樣量220laL下進行檢測。④記錄峰面積，按外標法以峰面積對苦參堿含量計算回歸方程，獲得所述的回歸方程為>;=1.32x106jc-1.16x105，相關(guān)系數(shù)為0.9996，線性范圍為0.32L92叫。(D精密度測定精密吸取苦參堿標準液6nL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果具體如下表所示，從表1中可見平均峰面積為1187830±22557，RSD為1.90%，精密度良好。次數(shù)123456流量穩(wěn)定性(%)峰面積1146457118547111881701193942119960412133411.90表1精密度測定結(jié)果7⑥24小時穩(wěn)定性測定取同一供試品溶液6pL，分別于0，4，8，12，24h測定峰面積，結(jié)果具體如下表所示，從表2中可見平均峰面積為1159533±54349，RSD4.69%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表224小時穩(wěn)定性測定結(jié)果⑦重現(xiàn)性測定取同一樣品共5份，按供試品溶液的制備法制備供試液，進樣6pL測定，代入回歸方程，計算供試品溶液中苦參堿平均含量及相對標準偏差RSD和平均保留時間及相對標準偏差RSD，結(jié)果具體如下表所示，從表3中可見測得供試品溶液中苦參堿平均含量為7.36%，RSD為1.36y。；其平均保留時間為17.408min，RSD為0.07%，表明本方法重現(xiàn)性良好。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>⑧回收率測定精密稱取一定量的苦參堿對照品，加入到己知苦參堿含量的樣品中，按供試品溶液的制備法制備供試液，進樣6pL測定，設(shè)0.90mg、1.50mg以及2.10mg三個劑量，每個劑量平行3次測定，計算回收率(回收量與加入量的比)，平均回收率及相對標準偏差RSD，結(jié)果具體如下表所示，從表4可見平均回收率為99.85%，相對標準偏差RSD〈2。/。。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.502.102,150102.381.502.102.114100.67i4回收率測定結(jié)果權(quán)利要求1、一種苦參堿液相色譜測定方法，其特征在于，包括以下步驟①取含苦參堿樣品10mg，用甲醇定容于容量瓶中，超聲溶解得供試品溶液；②取苦參堿對照品5mg，用甲醇定容于容量瓶中，超聲溶解得苦參堿標準液；③各取10μL的供試品溶液和苦參堿標準液注入液相色譜儀進行測定；④記錄峰面積，按外標法以峰面積y對苦參堿含量x計算回歸方程，獲得所述的回歸方程為y＝1.32×106x-1.16×105，相關(guān)系數(shù)為0.9996，線性范圍為0.32～1.92μg；⑤根據(jù)上述步驟，依次對步驟①苦參堿樣品的進行精密度測定、24小時穩(wěn)定性測定、重現(xiàn)性測定以及回收率測定。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦參堿液相色譜測定方法，其特征是，所述的甲醇為色譜純級甲醇。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦參堿液相色譜測定方法，其特征是，所述的液相色譜儀為包含有紫外檢測器的高效液相色譜儀和十八烷基硅垸鍵合硅膠色譜柱。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦參堿液相色譜測定方法，其特征是，所述的液相色譜儀所采用的流動相為包含甲醇、磷酸和三乙胺的水溶液，其中甲醇與磷酸和三乙胺的水溶液的體積比為1:3。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的苦參堿液相色譜測定方法，其特征是，所述的流動相的流速為0.81.2mL/min，柱溫為2550。C。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦參堿液相色譜測定方法，其特征是，所述的測定時采用的洗脫方式是等度洗脫；檢測波長為210±2nm，進樣量220pL下進行檢測。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦參堿液相色譜測定方法，其特征是，所述的精密度測定是指吸取苦參堿標準液6nL，按步驟③和步驟④將溶液注入液相色譜儀進行峰面積測定共6次，然后計算該6次的平均峰面積及相對標準偏差。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦參堿液相色譜測定方法，其特征是，所述的24小時穩(wěn)定性測定是指吸取供試品溶液6^L，分別在靜置4小時后，靜置8小時后、靜置12小時后以及靜置24小時后重復(fù)步驟③和步驟④將溶液注入液相色譜儀進行峰面積測定共5次，然后計算該5次的平均峰面積及相對標準偏差。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦參堿液相色譜測定方法，其特征是，所述的重現(xiàn)性測定是指取同一含苦參堿樣品共5份，按步驟①方法制備出5份供試品溶液，從每一份供試品溶液中精密吸取6pL后按步驟③和步驟④將溶液注入液相色譜儀進行峰面積測定，并將測定所得結(jié)果代入步驟④中的回歸方程中，得到供試品溶液中苦參堿的平均含量及相對標準偏差RSD和平均保留時間及相對標準偏差。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的苦參堿液相色譜測定方法，其特征是，所述的回收率測定是指將苦參堿對照品以不同劑量加入到已知苦參堿含量的樣品中并按步驟①方法制備出每一組相同劑量3份的若干份供試品溶液，從每一份供試品溶液中精密吸取6pL并按步驟③和步驟④將溶液注入液相色譜儀進行峰面積測定并計算回收量與加入量的比值，即回收率，計算平均回收率及相對標準偏差。全文摘要一種化學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
的苦參堿液相色譜測定方法，包括將含苦參堿樣品和苦參堿對照品分別用甲醇定容并以包含甲醇、磷酸和三乙胺的水溶液作為流動相注入液相色譜儀后依次進行苦參堿樣品的精密度測定、24小時穩(wěn)定性測定、重現(xiàn)性測定以及回收率測定。本發(fā)明方法操作步驟簡單，適應(yīng)性強，分析結(jié)果重現(xiàn)性好。文檔編號G01N30/02GK101458235SQ200810205059公開日2009年6月17日申請日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者何丹農(nóng),睿劉,尹龍萍,黃碧蘭,玲龍申請人:上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司