專(zhuān)利名稱(chēng)：：中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥及其提取物的分析方法，特別是一種采用高效液相色譜法進(jìn)行中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法。
背景技術(shù)：
：生物堿為中藥附子的主要有效成分，在附子藥材及其提取物中，生物堿主要為雙酯型、單酯型烏頭堿類(lèi)生物堿，其中主要的九種烏頭堿類(lèi)生物堿的具體結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>現(xiàn)有技術(shù)中記載烏頭堿類(lèi)生物堿具有鎮(zhèn)痛強(qiáng)心等作用，用于回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，逐風(fēng)除濕等。本發(fā)明指紋圖譜實(shí)驗(yàn)方法按2005版中國(guó)藥典一部附錄VID規(guī)定的高效液相色譜法和《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但藥典高效液相色譜法及《技術(shù)要求》只是一個(gè)通則和準(zhǔn)則，并未描述具體中藥品種的分析方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種中藥附子或其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法，具有簡(jiǎn)便、快速、可靠、信息全面的特點(diǎn)，能較全面的反映附子及其提取物的質(zhì)量，對(duì)中藥附子質(zhì)量研究控制研究具有積極意義。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是一種中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法，采用反相高效液相色譜法，以十八烷基硅垸鍵合硅膠(C18)或八垸基硅烷鍵合硅膠(C8)為填充劑，以有機(jī)相-緩沖液為流動(dòng)相，所述的有機(jī)相-緩沖液用醋酸調(diào)節(jié)pH值為3.08.0，檢測(cè)波長(zhǎng)230240nm，有機(jī)相占流動(dòng)相體積百分比的2070%，其中，有機(jī)相為乙腈或甲醇；所述的緩沖液為醋酸銨-醋酸緩沖液、三乙胺-醋酸緩沖液、三乙胺-醋酸銨-醋酸緩沖液、三乙胺-乙酸銨-醋酸緩沖液中的一種；配制對(duì)照品溶液將適量烏頭堿、新烏頭堿或次烏頭堿用流動(dòng)相溶解，制成含烏頭堿、新烏頭堿或次烏頭堿4080Pg/ml的對(duì)照品溶液,優(yōu)選用新烏頭堿作為對(duì)照品，新烏頭堿的理論塔板數(shù)不低于2000;配制供試品溶液將附子粉末用濃氨浸潤(rùn)3060分鐘，加入氨水飽和過(guò)的乙醚，超聲震蕩520分鐘，38。C冷藏過(guò)夜，過(guò)濾，殘?jiān)冒彼柡瓦^(guò)的乙醚洗滌多次，過(guò)濾，合并濾液，揮干乙醚，以甲醇溶解，用流動(dòng)相稀釋制成供試品溶液，過(guò)0.22Mm微孔膜；或者，將附子提取物用鹽酸溶解，無(wú)水乙醚萃取，水層用氨液調(diào)pH至910，用無(wú)水乙醚萃取多次，合并乙醚萃取液，揮干乙醚，用流動(dòng)相配成供試品溶液，過(guò)0.22Mm微孔膜；測(cè)定精密吸取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，制定中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜。本發(fā)明的反相高效液相色譜法采用C18或C8作為填充劑(固定相)；有機(jī)相-緩沖溶液作為流動(dòng)相，流動(dòng)相經(jīng)過(guò)濾脫氣處理；檢測(cè)波長(zhǎng)為230240nm;調(diào)整流動(dòng)相比例，使色譜峰分離良好，在60min內(nèi)使所有色譜峰出峰。本發(fā)明供試品中的主要成分為單酯或雙酯型生物堿，而新烏頭堿峰型良好，保留時(shí)間穩(wěn)定，且有對(duì)照品標(biāo)示，故選用新烏頭堿色譜峰作為參照色譜峰。在上述方案的基礎(chǔ)上，所述醋酸銨或乙酸銨的摩爾濃度為1040mmol/L，所述三乙胺體積濃度為0.050.2%。在上述方案的基礎(chǔ)上，所述有機(jī)相-緩沖液的pH值為5.07.0。在上述方案的基礎(chǔ)上，所述的有機(jī)相占流動(dòng)相體積百分比為3060%，進(jìn)一步優(yōu)選在3652%。利用上述指紋圖譜的建立方法測(cè)定中藥附子及其提取物中的生物堿，獲得21個(gè)共有峰，其中，超過(guò)或接近總峰面積10%的色譜峰有4個(gè)，為8號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.391，平均相對(duì)峰面積為24.109;IO號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.460，平均相對(duì)峰面積為4.691;12號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.546，平均相對(duì)峰面積為7.010;17號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.900，平均相對(duì)峰面積為7.395。本發(fā)明的有益效果是以所選定的有機(jī)相-緩沖溶液作流動(dòng)相，能很好分離附子中的各生物堿，且分離出的色譜峰數(shù)目是現(xiàn)有技術(shù)中最多的，能全面反映附子及其提取物的質(zhì)量。本發(fā)明采用的有機(jī)相-緩沖鹽溶液流動(dòng)相對(duì)附子中生物堿具有很好的分離作用，且峰型良好，保留時(shí)間穩(wěn)定，符合指紋圖譜要求。圖1為本發(fā)明的附子生物堿指紋圖譜。具體實(shí)施例方式以下將進(jìn)一步結(jié)合實(shí)例來(lái)詳細(xì)描述具體實(shí)施方案，以下的實(shí)施例并非限定本發(fā)明方案。一種中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法，采用反相高效液相色譜法，用十八垸基硅垸鍵合硅膠或八垸基硅垸鍵合硅膠為固定相，以有機(jī)相-緩沖液為流動(dòng)相，所述的有機(jī)相-緩沖液的PH值為3.08.0，檢測(cè)波長(zhǎng)230240nm，所述的有機(jī)相占流動(dòng)相體積百分比的2070%，其中，有機(jī)相為乙腈或甲醇；所述的緩沖液為醋酸銨-醋酸緩沖液、三乙胺-醋酸緩沖液、三乙胺-醋酸銨-醋酸緩沖液、三乙胺-乙酸銨-醋酸緩沖液中的一種；配制對(duì)照品溶液將適量新烏頭堿用流動(dòng)相溶解，制成含新烏頭堿70l^g/ml的對(duì)照品溶液，新烏頭堿的理論塔板數(shù)不低于2000。配制供試品溶液A、附子稱(chēng)取不同產(chǎn)地各批號(hào)的附子粗粉各10g，置具塞錐形瓶中，以5ml濃氨浸潤(rùn)l小時(shí)左右，加入100ml氨水飽和的乙醚，超聲震蕩10分鐘，4'C冷藏過(guò)夜，過(guò)濾，殘?jiān)园彼柡偷囊颐严礈?次，過(guò)濾，合并濾液，揮干乙醚，以甲醇溶解，過(guò)濾至10ml量瓶中，少量多次用甲醇蕩洗轉(zhuǎn)移至量瓶中，稀釋至刻度，反相高效液相色譜分析前用0.22ym微孔濾膜過(guò)濾，備用。B、附子提取物稱(chēng)取不同產(chǎn)地各批號(hào)的附子粗粉進(jìn)行水提，提取物50mg，精密稱(chēng)定，20mL0.01mo1鹽酸溶解，50mL無(wú)水乙醚萃取，水層用氨試液調(diào)pH至910，分別用50mL、30mL、20mL無(wú)水乙醚萃取三次，合并乙醚層，35'C揮干乙醚，用流動(dòng)相溶解配制成不同濃度的供試品溶液，反相高效液相色譜分析前用過(guò)0.22um濾膜，備用。測(cè)定儀器Waters高效液相色譜儀包括Waters1525雙色譜泵，Waters2487DualXAbsorbance紫外檢測(cè)器，Waters717plus自動(dòng)進(jìn)樣器，Watersin-line脫氣機(jī)，WatersBreeze色譜工作站。測(cè)定方法分別精密吸取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液20uL注入高效液相色譜儀，記錄60分鐘的色譜圖。實(shí)施例1采用本發(fā)明的方法對(duì)樣品A進(jìn)行測(cè)定時(shí)，以C18為填料(Phe隱enexC18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-緩沖液為流動(dòng)相，緩沖液為20mmol/L醋酸銨-醋酸緩沖液，以醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.3，甲醇與緩沖液的體積比為48:52，檢測(cè)波長(zhǎng)234nm。新烏頭堿色譜峰保留時(shí)間為48.1248.25min，新烏頭堿的理論塔板數(shù)不低于2000。實(shí)施例2采用本發(fā)明的方法對(duì)樣品B進(jìn)行測(cè)定時(shí)，以C18為填料(KromasilC18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-緩沖液為流動(dòng)相，緩沖液為0.2%三乙胺-醋酸緩沖液，以醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.5，甲醇與緩沖液的體積比為38:62，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。新烏頭堿色譜峰保留時(shí)間為48.9349.01min，理論塔板數(shù)不低于2000。實(shí)施例3采用本發(fā)明的方法對(duì)樣品C進(jìn)行測(cè)定時(shí)，以C18為填料(AlltimaC18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-緩沖液為流動(dòng)相，緩沖液為0.05%三乙胺-10mmol/L醋酸銨-醋酸緩沖液，以醋酸調(diào)節(jié)pH值為6.0，甲醇與緩沖液的體積比為50:50，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。新烏頭堿色譜峰保留時(shí)間為47.8947.99min，理論塔板數(shù)不低于2000。實(shí)施例4采用本發(fā)明的方法對(duì)樣品D進(jìn)行測(cè)定時(shí)，以C18為填料(Nucleosil100-5C18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-緩沖液為流動(dòng)相，緩沖液為0.ly。三乙胺-25ramol/L醋酸銨-醋酸緩沖液，以醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.3，甲醇與緩沖液的體積比為40:60，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。新烏頭堿色譜峰保留時(shí)間為48.0048"0min，理論塔板數(shù)不低于2000。實(shí)施例5采用本發(fā)明的方法對(duì)樣品E進(jìn)行測(cè)定時(shí)，以C18為填料(ThermoBDSHypersilC18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-緩沖液為流動(dòng)相，緩沖液為0.1%三乙胺-37mmol/L乙酸銨-醋酸，以醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.3，甲醇與緩沖液的體積比為46:54，檢測(cè)波長(zhǎng)234nm。新烏頭堿色譜峰保留時(shí)間為47.9548.02min，理論塔板數(shù)不低于2000。實(shí)施例6采用本發(fā)明的方法對(duì)樣品F進(jìn)行測(cè)定時(shí)，以C18為填料(UltimateXB-C18(250iranX4.6mm，5"m))，甲醇-緩沖液為流動(dòng)相，緩沖液為18mmo1乙酸銨-醋酸，以醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.5，甲醇與緩沖液的體積比為45:55，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。新烏頭堿色譜峰保留時(shí)間為47.9048.OOmin，理論塔板數(shù)不低于2000。實(shí)施例7采用同實(shí)例1的方法對(duì)樣品G進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例8采用同實(shí)例2的方法對(duì)樣品H進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例9采用同實(shí)例3的方法對(duì)樣品I進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例10采用同實(shí)例4的方法對(duì)樣品J進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例11采用同實(shí)例5的方法對(duì)樣品K進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例12采用同實(shí)例6的方法對(duì)樣品L進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例13采用同實(shí)例6的方法對(duì)樣品M進(jìn)行測(cè)定。請(qǐng)參閱圖1為本發(fā)明的附子生物堿指紋圖譜，13批附子及其提取物指紋圖譜中都存在的共有峰有21個(gè)，以對(duì)照品新烏頭堿的色譜峰為參照色譜峰，其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為1.000，計(jì)算其他各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。經(jīng)過(guò)以下實(shí)施例測(cè)定13批不同產(chǎn)地的附子樣品(標(biāo)示為A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J，K，L，M)，得到的指紋圖譜技術(shù)數(shù)據(jù)見(jiàn)表13。表1為指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間表。對(duì)照品溶液色譜圖為標(biāo)示指紋圖譜中共有峰中的幾個(gè)特征色譜峰，其中，以新烏頭堿峰為參照色譜峰，計(jì)算其它指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，標(biāo)定共有指紋峰。表l峰號(hào)ABCDEFG10.1200.1180.1180.1190.1180.1170.11720.1490.1470.1490.1480.1470.1470.14630.1600.1580.1570.1580.1580.1570.15740.2300.2280.2270.2280.2280.2270.22650.2640.2620.2610.2620.2610.2600.26060.3190.3160.3160.3160.3160.3150.31570.3400.3370.3360.3370.3370.3360.33580.3940.3920.3900.3920.3910.3910.39190.4490.4410.4390.4400.4380.4350.434100.4640.4610.4600.4610.4600.4600.459110.5220.5160.5150.5160.5150.5130.512120.5490.5460.5460.5470.5460.5460.546130.6060.6020.6020.6030.6020.6010.601140.7030.7000.6990.6990.6990.6980.698150.7840.7810.7790.7800.7790.7770.777160.8240.8190.8170.8170.8170.8150.814170.9090.9040.9030.9030.9020.9000.900180.9390.9350.9330.9340.9340.9320.93219(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000201.0761.0761.0761.0731.0731.0751.073211.1971.1951.2021.1941.1931.1971.191峰號(hào)HI了KM均值RSD(%)10.1170.1170.1160.1160.1160.1170.1171.1020.1470.1470.1470.1450.1450.1470.1470.7330.1570.1560.1550.1550.1550.1560.1570.8540.2260.2260.2240.2250.2250.2260.2270.6750.2600.2600.2590.2590.2590.2600.2610.5960.3150.3140.3130.3130.3120.3140.3150.5570.3360.3350.3340.3340.3340.3350.3360.4780.3910.3930.3930.3890.3890.3910.3910.3890.4330.4310.4270.4270.4260,4310.4351.50100.4600.4590.4580.4570.4570.4600.4600.37110.5110.5090.5060.5070.5060.5100.5120.94120.5460.5460.5440.5450.5440.5460.5460.23130.6010.6000.5980.5990.5980.6010.6010.33140.6990.6980.6970.6980.6980.7000.6990.20150.7770.7750.7740.7740.7740.7770.7780.38160.8120.8090.8070.8070.8070.8120.8140.64170.8990.8960.8950.8960.艦0.8980.9000.48180.9310.9290.9270.9280.9260.9290.9310.4119(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000201.0721.0761.0741.0691.0751.0761.0740.19211.1901.2141.1831.1831.2041.2011.1960.71表2為各共有峰的相對(duì)峰面積表。表2峰號(hào)ABCDEFG10.8430.8750.8550.8230.9921.1020.97621.0951.0100.8500.7311.4843.1821.84731.8870.9341.5261.1561.4561.5571.38840.5950.4640.6090.5640.4940.6570.69250.8681.0100.9650.8790.9691.3360.96960,5710.5340.5280.4950.5230.7370.55870.6110.6120.5990.5720.6000.8440.665820.35420.92124.48620.66622.54228.28822.37590.3090.2390.3010.2510.2280.3470.241104.5624.1644.3233.5734.1655.0104.276110,6180.3990.4800.4820.4280.5840.499126.8736.4196.4255.8316.3427.4156.096131.7061.5241.2821.3601.4121.8891.464141.5861.5551.9151.8531.5331.9371.695150.4030.2940.3790.4450.2790.1970.271160,3730.3360.3230.3400.3050.3870.304175.6036.2127.5355.7406.6948.6598.189180.6600.6700.4500.8290.8120.5200.65619(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000203.0402.7272.4403.3313.4132.9953.457210.1740.2000.1500.2420.2770.2410.279<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>如表2所示，在21個(gè)共有峰中超過(guò)或接近總峰面積10%的色譜峰有4個(gè)，這四個(gè)色譜峰為8號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.391，平均相對(duì)峰面積為24.109;IO號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.460，平均相對(duì)峰面積為4.691;12號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.546,平均相對(duì)峰面積為7.010;17號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.900，平均相對(duì)峰面積為7.395?！都夹g(shù)要求》規(guī)定對(duì)于單峰面積大于或等于20%的共有峰，與指紋圖譜共有模式中該峰面積的差值不得大于20%;單峰面積占總峰面積大于或等于10%，而小于20%的共有峰，其差值不得大于士25%;單峰面積占總峰面積小于10%的共有峰，峰面積比值不作要求，但必須標(biāo)定相對(duì)保留時(shí)間。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>按《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》規(guī)定，指紋圖譜中非共有峰的峰面積不得超過(guò)總色譜峰面積的10%。表3為超過(guò)或接近總峰面積10%的4個(gè)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積表。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1、一種中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法，采用反相高效液相色譜法，用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以有機(jī)相-緩沖液為流動(dòng)相，其特征在于所述的有機(jī)相-緩沖液的pH值為3.0～8.0，檢測(cè)波長(zhǎng)230～240nm，有機(jī)相占流動(dòng)相體積百分比的20～70％，其中，有機(jī)相為乙腈或甲醇；所述的緩沖液為醋酸銨-醋酸緩沖液、三乙胺-醋酸緩沖液、三乙胺-醋酸銨-醋酸緩沖液、三乙胺-乙酸銨-醋酸緩沖液中的一種；配制對(duì)照品溶液將適量烏頭堿、新烏頭堿或次烏頭堿用流動(dòng)相溶解，制成含烏頭堿、新烏頭堿或次烏頭堿40～80μg/ml的對(duì)照品溶液；配制供試品溶液將附子粉末用濃氨浸潤(rùn)30～60分鐘，加入氨水飽和過(guò)的乙醚，超聲震蕩5～20分鐘，3～8℃冷藏過(guò)夜，過(guò)濾，殘?jiān)冒彼柡瓦^(guò)的乙醚洗滌多次，過(guò)濾，合并濾液，揮干乙醚，以甲醇溶解，用流動(dòng)相稀釋制成供試品溶液，過(guò)0.22μm微孔膜；或者，將附子提取物用鹽酸溶解，無(wú)水乙醚萃取，水層用氨液調(diào)pH至9～10，用無(wú)水乙醚萃取多次，合并乙醚萃取液，揮干乙醚，用流動(dòng)相配成供試品溶液，過(guò)0.22μm微孔膜；測(cè)定取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，制定中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述醋酸銨或乙酸銨的摩爾濃度為1040mmol/L，所述三乙胺的體積濃度為0.050.2%。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法，其特征在于:所述有機(jī)相-緩沖液的PH值為5.07.0。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述的有機(jī)相占流動(dòng)相體積百分比的3060%。5、利用權(quán)利要求1至4之一所述的指紋圖譜的建立方法測(cè)定中藥附子及其提取物中的生物堿，獲得21個(gè)共有峰，其中，超過(guò)或接近總峰面積10%的色譜峰有4個(gè)，為8號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.391，平均相對(duì)峰面積為24.109;10號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.460，平均相對(duì)峰面積為4.691;12號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.546，平均相對(duì)峰面積為7.010;17號(hào)峰，其平均相對(duì)保留時(shí)間RT為0.900,平均相對(duì)峰面積為7.395。全文摘要本發(fā)明涉及一種中藥附子或其提取物中生物堿指紋圖譜的建立方法。該方法采用反相高效液相色譜法，用十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以有機(jī)相-緩沖液為流動(dòng)相，所述的有機(jī)相-緩沖液的pH值為3.0～8.0，檢測(cè)波長(zhǎng)230～240nm，有機(jī)相占流動(dòng)相體積百分比的20～70％，其中，有機(jī)相為乙腈或甲醇；所述的緩沖液為醋酸銨-醋酸緩沖液、三乙胺-醋酸緩沖液、三乙胺-醋酸銨-醋酸緩沖液、三乙胺-乙酸銨-醋酸緩沖液中的一種；用適量烏頭堿、新烏頭堿或次烏頭堿配制對(duì)照品溶液；配制供試品溶液；精密吸取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，制定中藥附子及其提取物中生物堿指紋圖譜。文檔編號(hào)G01N30/00GK101433604SQ20081020745公開(kāi)日2009年5月20日申請(qǐng)日期2008年12月19日優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日發(fā)明者喬德水,劉躍躍,楊春艷,彬林,成王,高雪芹申請(qǐng)人:江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司