專利名稱：：檢測人前列腺癌中17β一羥基類固醇脫氫酶7表達(dá)量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及一種檢測人前列腺癌樣本中1713—羥基類固醇脫氫酶7(1713-HSD7)mRNA表達(dá)量的實時熒光定量PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)資料顯示，前列腺癌發(fā)病率和病死率存在明顯的地區(qū)差異，美國、北歐、西歐和澳洲是前列腺癌的高發(fā)地區(qū)，而亞洲和北非是相對低發(fā)地區(qū)。但前列腺癌低發(fā)地區(qū)從20世紀(jì)70年代起發(fā)病率也有大幅度上升的趨勢.。過去，我國前列腺癌發(fā)病率較低，但隨著人均壽命的延長、膳食結(jié)構(gòu)的改變及診斷技術(shù)的進(jìn)步，其發(fā)病率在逐年提高，已躍居為男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。臨床目前的診斷技術(shù)主要有前列腺的腫瘤標(biāo)志物、直腸指檢(DRE)、影像學(xué)檢查和前列腺穿剌活檢等。目前前列腺特異性抗原(PSA)作為一種無創(chuàng)簡便的檢測手段已被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的診治。然而一個理想的前列腺癌腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有前列腺特異性、能夠早期診斷腫瘤并能夠同良性前列腺增生癥相鑒別、便于檢測和隨訪等特點。顯然這些并不是PSA就能夠全部滿足的，因此，尋找更多的腫瘤標(biāo)志物，對于前列腺癌的早期診斷和治療有重要意義。人17P-羥基類固醇脫氫酶(17P-HSD7)是一個膜相關(guān)還原酶，它是催化低生物活性的雌酮生成為與高生物活性的雌二醇的關(guān)鍵酶之一，并能轉(zhuǎn)化雙氫睪酮為5a-雄烷-313，1713-二元醇，其催化還原的部位為底物17位點或3位點的酮基團(tuán)。1713-HSD7對黃體酮和20a—羥基孕酮次要的313-HSD樣活性也被檢測到。人17P-HSD7存在于生成類固醇的組織和一些周緣組織，象肝、肺和胸腺，除了性激素外17P-HSD7也有其它的底物，在膽固醇的生物合成中，1713-HSD7起酮類固醇還原酶作用。將酵母甾酮轉(zhuǎn)化為酵母甾醇。1713-HSD7作為性激素代謝的關(guān)鍵酶之一與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展有著密切的關(guān)系，其表達(dá)量在在前列腺癌的病程中呈現(xiàn)規(guī)律的變化，因此檢測17P-HSD7的表達(dá)量對于前列腺癌的早期診斷，治療，預(yù)后評估都有著潛在的價值。傳統(tǒng)的基因檢測技術(shù)主要運用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法大量擴增待測基因，然后通過溴化乙錠染色和瓊脂糖凝膠電泳定量待測基因。以上方法有著極高的高靈敏度，但基于PCR反應(yīng)的特點，反應(yīng)終點的產(chǎn)物量往往無法正確反映反應(yīng)初始階段DNA的含量，因此定量不夠精確，同時其檢測的分辨率也不高，DNA的量的差異如果低于五倍，往往檢測不出。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測人前列腺癌樣本中1713—羥基類固醇脫氫酶7(17P-HSD7)mRNA表達(dá)量的實時熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包含2X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，20X逆轉(zhuǎn)錄酶，DEPC-H20，2XPCR反應(yīng)液，20X檢測用引物、熒光探針，標(biāo)準(zhǔn)品。其中2X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有RT緩沖液、DEPC-H20、Oligo(dT)、dNTPs、Rnasin。其中2XPCR反應(yīng)含有PCR緩沖液，MgCl2，dNTPs，Taq酶。所述的檢測用引物包括17P-HSD7上游引物序列5'-GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3'17P-HSD7下游引物序列5'-CATGTTCCTGCACGCCAAAC-3'GAPDH上游引物序列5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'GAPDH下游引物序列5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'所述的熒光探針包括17P-HSD7熒光探針5'-FAM-GAAAGGTGGTTTTGATCACCG-TAMRA-3'GAPDH熒光探針5'-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3'本發(fā)明中，2X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，2XPCR反應(yīng)液，DEPC-H20保存于4t:;20X逆轉(zhuǎn)錄酶，20X檢測用引物、熒光探針保存于_20°C。標(biāo)準(zhǔn)品為人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的cDNA。本發(fā)明試劑盒具有如下特點近年來不斷完善的實時定量PCR技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累監(jiān)控整個PCR的進(jìn)程，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA精確定量。由于只對指數(shù)期反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行檢測和熒光基團(tuán)的信號放大作用，它克服了傳統(tǒng)PCR的定量不精確，分辨率低的缺點。本發(fā)明建立了利用T叫man技術(shù)檢測17P-HSD7表達(dá)的方法，并經(jīng)檢測患者表明該方法切實可行。由于本方法采用了PCR擴增技術(shù)，使得1713-HSD7表達(dá)的檢測敏感性大大提高，使得臨床實踐中可以在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息，而且由于熒光探針的應(yīng)用使得特異性也大大提高，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率。本方法所設(shè)計的引物、探針以及檢測結(jié)果可以為熒光定量PCR檢測試劑盒的開發(fā)提供可靠的依據(jù)。在本發(fā)明中，采用了目前特異性最高的的熒光探針雜交定量PCR檢測技術(shù)，在保持高敏感性的前提下能盡量減少假陽性干擾。在實時熒光定量PCR檢測技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對PCR模板的無法精確定量，都是通過PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結(jié)果進(jìn)行計算機圖像處理，根據(jù)電泳條帶的亮度來確定最終PCR產(chǎn)物的量，即使PCR條件以最優(yōu)化，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定因素仍會給結(jié)果分析帶來影響。實時熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，臨床檢驗中可以真正地做到對PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高靈敏性，而且由于特異性熒光探針雜交技術(shù)的應(yīng)用，使得被檢測基因的特異性大大提高。本發(fā)明試劑盒使用方法如下每次檢測應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照。標(biāo)準(zhǔn)品可做陽性對照，也可使用自行制備的前列腺癌DNA樣本，陰性對照用DEPC-H20即可。逆轉(zhuǎn)錄總體積20iil，其中2ii1待測RNA，10iU2X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，1yl20X逆轉(zhuǎn)錄酶，7ii1DEPC-H20。25°C10分鐘，37。C120分鐘。擴增在熒光定量PCR以上進(jìn)行，總體積為lOiU，其中2iU檢測樣品，5iU2XPCR反應(yīng)液，0.5iU20X檢測用引物、熒光探針，2.5iUDEPC-H20。反應(yīng)條件95。C104分鐘變性，95t:15秒、60。C1分鐘進(jìn)行40個循環(huán)。圖1是HSD17B7標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2是GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合具體實施例做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1熒光定量RT-PCR檢測人前列腺癌樣本中17P-HSD7的表達(dá)量—、實驗材料Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶，TaqDNA聚合酶，OligodT購自美國Promega公司；7900HT熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。二、引物及探針設(shè)計與合成以17P-HSD7，GAPDH全長cDNA序列為模板，使用PrimerExpress2.0軟件分析T叫Man引物和探針位點，選取最佳組合。檢測用引物17P-HSD7上游引物序列5'-GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3'17P-HSD7下游引物序列5'-CATGTTCCTGCACGCCAAAC-3'GAPDH上游引物序列5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'GAPDH下游引物序列5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'熒光探針17P-HSD7熒光探針5'-FAM-GAAAGGTGGTTTTGATCACCG-TAMRA-3'GAPDH熒光探針5'-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3'均由Invitrogen公司合成。三、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取標(biāo)準(zhǔn)品按十倍梯度進(jìn)行稀釋，濃度依次為5000ng/iil，500ng/iil，50ng/ia，5ng/iU，0.5ng/iil，各取2iil，在10ia總反應(yīng)體積內(nèi)用7900HT熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增檢測，反應(yīng)條件為95°C10分鐘變性，95t:15秒、6(TC1分鐘進(jìn)行40個循環(huán)。通過檢測得到的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。四、樣本檢測采集10例前列腺癌患者的癌組織待測樣本和1例健康男性的前列腺樣本，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，取2iilRNA在20iil反應(yīng)體積內(nèi)用OligodT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，之后分別用1713-HSD7和GAPDH的引物，熒光探針在7900HT熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增檢測，反應(yīng)條件為95°C10分鐘變性，95t:15秒、6(TC1分鐘進(jìn)行40個循環(huán)。得到每個樣本針對17P-HSD7禾口GAPDH的Ct值。五、樣品檢測結(jié)果檢測結(jié)果用待測樣本和健康樣本的比值(Ratio)表示，計算公式如下Ratio=2_AACt=2(Ct，h_Ct，g)control-(Ct，h_Ct，g)test其中(Ct，h-Ct，g)control表示健康組樣本17P-HSD7Ct值與GAPDHCt的差值；(Ct，h-Ct，g)test表示待測樣本17P-HSD7Ct值與GAPDHCt的差值，Ct，h表示17P-HSD7Ct值，Ct，g表示GAPDH基因Ct值。檢測結(jié)果顯示，本方法可以真正地做到對PCR模板的精確定量，該定量不僅保持了常規(guī)PCR的高靈敏性，而且被檢測基因的特異性明顯提高。表1為檢測結(jié)果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用做參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求檢測人前列腺癌中17β一羥基類固醇脫氫酶7表達(dá)量的試劑盒，其特征是所述的試劑盒含有2×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，20×逆轉(zhuǎn)錄酶，焦碳酸乙二酯處理的水，2×聚合酶鏈反應(yīng)液，20×檢測用引物、熒光探針，標(biāo)準(zhǔn)品，其特征是2×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、焦碳酸乙二酯處理的水、寡聚(dT)、dNTPs、RNA酶抑制劑，2×聚合酶鏈反應(yīng)液含有聚合酶鏈緩沖液、耐熱DNA聚合酶，MgCl2，dNTPs。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測人前列腺癌中1713—羥基類固醇脫氫酶7表達(dá)量的試劑盒，其特征是，所述的20X檢測用引物、熒光探針含有1713—羥基類固醇脫氫酶7上游引物、下游引物、熒光探針，3-磷酸甘油醛脫氫酶上游引物、下游引物、熒光探針，其中1713—羥基類固醇脫氫酶上游引物序列為5'-GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3'1713—羥基類固醇脫氫酶下游引物序列為5'-CATGTTCCTGCACGCCAAAC-3'1713—羥基類固醇脫氫酶熒光探針為5z-FAM-GAAAGGTGGTTTTGATCACCG-TAMRA-3'3_磷酸甘油醛脫氫酶上游引物序列為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'3_磷酸甘油醛脫氫酶下游引物序列為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'3_磷酸甘油醛脫氫酶熒光探針為5'-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3'。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測人前列腺癌中1713—羥基類固醇脫氫酶7表達(dá)量的試劑盒，其特征是，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的cDNA。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種檢測人前列腺癌樣本中17β一羥基類固醇脫氫酶7(17β-HSD7)mRNA表達(dá)量的實時熒光定量PCR試劑盒。本試劑盒含有2×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，20×逆轉(zhuǎn)錄酶，焦碳酸乙二酯處理的水，2×聚合酶鏈反應(yīng)液，20×檢測用引物、熒光探針，標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明建立了利用Taqman技術(shù)檢測17β-HSD7表達(dá)的方法，并經(jīng)檢測實踐表明，本發(fā)明試劑盒及檢測方法切實可行。由于本方法采用了PCR擴增技術(shù)，使得17β-HSD7表達(dá)的檢測敏感性大大提高，可以在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息，由于熒光探針的應(yīng)用使得特異性也大大提高，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率。文檔編號G01N21/64GK101760525SQ20081020754公開日2010年6月30日申請日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者姜梅,李瑤,毛裕民,謝毅申請人:復(fù)旦大學(xué)