專利名稱：：一種增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法及應(yīng)用其的生物檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法及應(yīng)用其的生物檢測(cè)的方法，屬于納米生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：納米金顆粒具有獨(dú)特的物理性能，尤其是光學(xué)性能，比如納米金具有很高的消光系數(shù)。而且這些特性隨著納米顆粒的尺寸，形狀和表面的修飾的變化而變化。因此納米材料，尤其是納米金顆粒，非常適合在生物檢測(cè)和環(huán)境檢測(cè)中作為信號(hào)來(lái)標(biāo)志檢測(cè)物的存在與否。納米金最近幾年被用于檢測(cè)各種各樣的物質(zhì)，比如DNA，蛋白質(zhì)和金屬離子等。在現(xiàn)有技術(shù)中，為了利用納米金進(jìn)行生物檢測(cè)和環(huán)境檢測(cè)，必須利用納米金獨(dú)特的表面等離子共振的光學(xué)性能，獨(dú)立存在的納米金是紅色的，而聚集在一起的納米金是藍(lán)灰色或紫色的。也就是說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)在進(jìn)行生物檢測(cè)和環(huán)境檢測(cè)時(shí)必須直接或間接地引起納米金聚集，或者將聚集的納米金重新分散，從而引起納米金顏色的變化，可見(jiàn)光的吸收波長(zhǎng)產(chǎn)生高達(dá)300nm的移動(dòng)。這種顏色變化可以直接用肉眼觀察，無(wú)需任何復(fù)雜設(shè)備，也可以使用光譜儀進(jìn)行定量檢測(cè)?，F(xiàn)有的引起納米金的聚集的方法可以分為兩大類。第一類方法是檢測(cè)物作為交聯(lián)劑將納米顆粒聯(lián)結(jié)在一起，從而引起聚集。比如DNA誘導(dǎo)的通過(guò)顆粒間交聯(lián)造成的聚集方法。這類方法需要將單鏈DNA，DNA酶，RNA酶或核酸適配體連接到納米材料的表面。實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)繁瑣，DNA，DNA酶，RNA酶或核酸適配體的用量大。第二類方法是非交聯(lián)的納米顆粒聚集方法，這種方法利用納米顆粒在加入檢測(cè)物后穩(wěn)定性的降低。這種穩(wěn)定性的降低或者是由于納米顆粒表面用于提高納米金穩(wěn)定性的DNA分子或ATP的破壞，取代或消耗；或者由于與未修飾納米顆粒相互作用的溶液中可以穩(wěn)定納米顆粒的ATP或單鏈DNA的減少。這類方法大多使用未修飾的納米材料，只有少數(shù)使用DNA修飾的納米金。如上所述，目前基于納米材料穩(wěn)定性變化而設(shè)計(jì)的納米顆粒非交聯(lián)檢測(cè)方法多是在檢測(cè)物存在的時(shí)候使納米材料的穩(wěn)定性下降，產(chǎn)生聚集。這一類的檢測(cè)方法僅適用于檢測(cè)物的存在降低納米材料穩(wěn)定性的情況，所有方法都基于以下幾種分子對(duì)納米金穩(wěn)定性的差異雙鏈DNA結(jié)構(gòu)比單鏈DNA穩(wěn)定納米金差，長(zhǎng)的單鏈DNA比三磷酸腺苷dNTP穩(wěn)定納米金差，ADP和脲苷比ATP穩(wěn)定納米金差。該類方法在使用上具有局限性。比如對(duì)檢測(cè)物涉及除以上幾種分子以外的分子，未見(jiàn)報(bào)道。另外該方法在檢測(cè)靈敏度上比較差，這是由于少量的聚集不容易觀測(cè)。最近報(bào)道了一例利用納米材料穩(wěn)定性提高進(jìn)行鉛離子檢測(cè)的方法(HuiWei，Nanotechnology19(2008)095501(5pp);ZhidongWang等人Adv.Mater.2008，20，3263-3267)。在他們的方法中，鉛離子可以將雙鏈DNA(由單鏈DNA基體和單鏈DNA酶形成)中的單鏈DNA基體切斷。然后利用所生成的單鏈DNA比雙鏈DNA能夠更好地穩(wěn)定納米金來(lái)檢測(cè)鉛離子的存在。這種方法顯著提高了檢測(cè)的靈敏度。但該方法仍然是基于雙鏈DNA結(jié)3構(gòu)和單鏈DNA穩(wěn)定納米金能力的差異。以上所述方法存在著以下不足1、可檢測(cè)物種類的局限性，僅限于檢測(cè)體系中存在雙鏈DNA，或/和單鏈DNA，或/和dNTP，或/和ADP和脲苷，或/和ATP。2、當(dāng)利用雙鏈DNA和單鏈DNA對(duì)納米金穩(wěn)定性差異進(jìn)行DNA檢測(cè)時(shí)，由于雙鏈DNA和單鏈DNA對(duì)納米金穩(wěn)定性的差異不是很大，尤其是單鏈DNA對(duì)納米金的穩(wěn)定作用顯著地受其組成影響，比如含有連續(xù)T的單鏈DNA不能很好地穩(wěn)定納米金，被檢測(cè)DNA的摩兒量需要和DNA探針的摩兒量盡量接近，才可以直接肉眼觀測(cè)到的顯著差異。當(dāng)被檢測(cè)的DNA樣品是復(fù)雜樣品，很難定量時(shí)，就需要大量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，其目的在于提供一種增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法及應(yīng)用其的生物檢測(cè)的方法。本發(fā)明的增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法，是將dNMP加入納米金溶液中。優(yōu)選的，本發(fā)明的增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法，其特征在于加入納米金溶液中的dNMP的數(shù)量為應(yīng)大于納米金摩兒量的50倍。優(yōu)選的，本發(fā)明的增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法，其特征在于加入納米金溶液中的dNMP的濃度大于150nM。優(yōu)選的，本發(fā)明的增強(qiáng)納米金或納米銀穩(wěn)定性的方法，其特征在于利用各種各樣的核酸酶反應(yīng)來(lái)生成dNMP。本發(fā)明的一種生物檢測(cè)方法，是利用檢測(cè)過(guò)程中生成的dNMP來(lái)檢測(cè)被分析物。該方法利用納米金的顏色變化來(lái)標(biāo)明被檢測(cè)物的存在與否。被分析物可以是酶，蛋白質(zhì)，核酸，小分子，金屬離子。本發(fā)明的生物檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將被檢測(cè)物與某種特定的酶，以及其它酶反應(yīng)所需要的成分混合，并在酶反應(yīng)所需要的條件下保存，酶反應(yīng)將生成dNMP;(2)將反應(yīng)溶液與納米金溶液混合；(3)加入適量的鹽溶液(比如氯化鈉)，通過(guò)溶液顏色變化來(lái)判定被檢測(cè)物的存在。被分析物的存在于否可以由紫外可見(jiàn)吸收定量分析。被分析物的存在于否可以由溶液的顏色變化定性地分析。本發(fā)明的一種生物檢測(cè)方法，是將所生成的dNMP加入納米金溶液中，通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行A核酸外切酶的活性檢測(cè)。優(yōu)選的，本發(fā)明的生物檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將不同濃度的A核酸外切酶與其基體(比如5端磷酸化的雙鏈DNA)混合，并在37度下保溫一段時(shí)間，75度下加熱10分鐘；(2)將反應(yīng)混合物與納米金溶液混合；(3)加入適量的鹽溶液(比如氯化鈉)。本發(fā)明的另一種生物檢測(cè)方法，其特征在于，該方法是將所生成dNMP加入納米金溶液中，通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行SI核酸酶的活性檢測(cè)。優(yōu)選的，本發(fā)明的生物檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將不同濃度的S1核酸酶與其基體(比如單鏈DNA)混4合，并在37度下保溫一段時(shí)間；(2)將反應(yīng)混合物與納米金溶液混合；(3)加入適量的鹽溶液(比如氯化鈉)。本發(fā)明的再一種生物檢測(cè)方法，其特征在于，該方法是將所生成的dNMP加入納米金溶液中，通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行DNA的恒熱放大檢測(cè)。優(yōu)選的，本發(fā)明的生物檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將被檢測(cè)DNA樣品(互補(bǔ)的和不互補(bǔ)的單鏈DNA)與5端磷酸化的檢測(cè)DNA探針混合，并在室溫下保存5分鐘；(2)將反應(yīng)混合物與A核酸外切酶混合，并在37度下保溫一段時(shí)間，75度下加熱10分鐘；(3)將反應(yīng)混合物與納米金溶液混合；(4)加入適量的鹽溶液(比如氯化鈉)。本發(fā)明將納米材料和酶反應(yīng)有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，具有如下的技術(shù)效果1、對(duì)dNMP和具有相同堿基摩兒濃度的單鏈DNA對(duì)13nm納米金顆粒的穩(wěn)定性差異進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)dNMP比具有相同堿基摩兒濃度的單鏈DNA能夠更顯著地提高13nm納米金顆粒的穩(wěn)定性?；谶@種差異可以用來(lái)設(shè)計(jì)各種各樣的生物傳感器，極大地?cái)U(kuò)展了利用未修飾納米金或銀顆粒進(jìn)行生物檢測(cè)的方法的使用范圍。比如，可以進(jìn)行各種核酸酶活性的檢測(cè)。2、由于對(duì)dNMP和具有相同堿基摩兒濃度的單鏈DNA對(duì)13nm納米金顆粒的穩(wěn)定性具有顯著的差異，這種差異可以用來(lái)提高檢測(cè)的范圍和靈敏度，以及降低對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化的需要。比如當(dāng)檢測(cè)DNA的摩兒量與DNA探針的摩兒量比例在10到0.05的范圍內(nèi)都可以清晰地看到互補(bǔ)DNA樣品和不互補(bǔ)DNA樣品的區(qū)別。3、dNMP是DNA(包括單鏈，雙鏈DNA，DNA酶和適配體)的降解產(chǎn)物。大量具有獨(dú)特功能的核酸酶都可以將DNA進(jìn)行選擇性的降解。這種過(guò)程可以與納米檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，極大地提高檢測(cè)的靈敏度和專一性。本發(fā)明涉及使用未修飾的納米金顆粒進(jìn)行生物，醫(yī)藥和環(huán)境檢測(cè)的方法。在該方法中，當(dāng)檢測(cè)物靶標(biāo)存在的時(shí)候，檢測(cè)體系中產(chǎn)生可以極大地穩(wěn)定納米金的成份。在本發(fā)明中檢測(cè)體系中產(chǎn)生的是單核苷酸dNMP，dNMP能夠比單鏈和雙鏈DNA更好地穩(wěn)定未修飾的納米金。利用這種穩(wěn)定性的提高，對(duì)檢測(cè)物進(jìn)行無(wú)需任何設(shè)備的顏色檢測(cè)。并且可以在對(duì)DNA和小分子的檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)恒熱的信號(hào)放大。本發(fā)明方法可以用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)，酶，DNA，小分子，金屬離子和細(xì)菌等。本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)可以通過(guò)下面的實(shí)施例來(lái)體現(xiàn)。需要指出的是，以下實(shí)施例僅用來(lái)舉例說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進(jìn)行各種各樣的變化和修改。圖1(A)-圖1(C)是本發(fā)明中所使用的未修飾13nm金顆粒的透射電鏡(TEM)圖像和紫外可見(jiàn)吸收譜。樣品在測(cè)量紫外可見(jiàn)吸收前稀釋10倍，特征吸收峰在519nm。圖1(D)是納米金的穩(wěn)定性測(cè)定曲線。納米金的穩(wěn)定性隨dNMP的用量增加而定量提高。圖2.是納米金溶液與雙鏈DNA，單鏈DNA和dNMP混合和加入鹽溶液后的紫外可見(jiàn)吸收光譜。插圖是所觀察到的不同混合物的顏色。圖3(A)-圖3(E)是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行入核酸外切酶的活性檢測(cè)的方法。該實(shí)施例中A核酸外切酶將雙鏈DNA中的5端磷酸化的單鏈DNA分解成單核苷酸dNMP。5圖4(A)-圖4(C)是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行SI核酸酶的活性檢測(cè)的方法。該實(shí)施例中SI核酸酶將單鏈DNA分解成單核苷酸dNMP。圖5(A)-圖5(C)是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行DNA的恒熱放大檢測(cè)的方法。該實(shí)施例中當(dāng)靶標(biāo)與DNA探針互補(bǔ)時(shí)，A核酸外切酶將5端磷酸化的單鏈DNA探針?lè)纸獬蓡魏塑账醖NMP。詳細(xì)說(shuō)明〃AuNPs"or"AuNPs"指金納米顆粒，通常是球形的，典型的尺寸為直徑1-lOOnm.dNMP是單核苷酸dAMP，dGMP，dCMP和dTMP的混合物。適配體指能夠?qū)Ｒ恍缘嘏c靶標(biāo)分子結(jié)合的DNA(或者RNA)分子，耙標(biāo)可以是蛋白質(zhì)，DNA，小分子和金屬離子等等。DNA(或者RNA)酶是能夠催化化學(xué)反應(yīng)的DNA(或RNA)分子。具體實(shí)施例方式在下述各實(shí)施例的各附圖中，試管中納米金溶液的顏色從左到右依次為圖2灰色，灰色，灰色和紅色。圖3(B)灰色和紅色。圖3(C)灰色，紫色，暗紅色，暗紅色，紅色，紅色，紅色和紅色。圖3(E)紅色，灰色和紫色。圖4(B)灰色，紫色和紅色。圖4(C)紫色，紅色和灰色。圖5(A)第一列灰色和紫色；第二列暗紅色和暗紅色。圖5(C)紫色和灰色；紅色和紫色。實(shí)施例材料和方法HAuCI4從ACROSORGANIC購(gòu)買。AMP，TMP，CMP，GMP從上?？笊锛夹g(shù)有限公司購(gòu)買。檸檬酸三鈉從國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司購(gòu)買。A核酸外切酶從Biolabs購(gòu)買。Sl核酸酶從TaKaRa(大連)購(gòu)買。所有DNA從TaKaRa(大連)購(gòu)買。13納米的金顆粒(AuNP)按照經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制，最終的濃度大約是12.7nM.實(shí)施例1:未修飾的納米金的制備和dNMP對(duì)納米金的穩(wěn)定性的提高。檸檬酸三鈉的水溶液(25ml，38.8mM)快速加入沸騰的金氯酸HAuCI4溶液中(250ml，ImM)。幾分鐘后，溶液的顏色從淺黃色變成深紅色。溶液繼續(xù)回流攪拌15分鐘使反應(yīng)完全。然后慢慢地地冷卻到室溫。4度保存。按照納米金在520nm的紫外吸收強(qiáng)度(圖1(C))，所制備的納米金的的濃度是12.7nM，尺寸是13nm(見(jiàn)圖l(A)和(B)。納米金的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，納米金的濃度是3nM，100iiL。dNMP是dAMP，dTMP，dGMP和dCMP的混合溶液(100yM或者/ImM)，其中各單核苷酸的比例與單鏈DNA(5'CCGCAAATTGTTC)相同。表1中的0.6MNaCl磷酸緩沖液的用量是使納米金在10秒鐘內(nèi)完全聚集(A520=0)時(shí)的用量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單如下100微升3nM的納米金溶液與不同量的dNMP溶液混合，立即加入適量的0.6MNaCl磷酸緩沖液使納米金在10秒鐘內(nèi)完全聚集(A520=0)。最終的NaCl濃度(mM)用下式計(jì)算0.6x1000x0.6MxNaCl磷酸緩沖液6的用量(微升)/{100+0.6MNaCl磷酸緩沖液的用量(微升)+dNMP的用量(微升)}。dNMP可以有效提高納米金的穩(wěn)定性。納米金的穩(wěn)定性隨著dNMP加入量的增加而顯著提高(表1，圖ID)。沒(méi)加入dNMP時(shí)，納米金在NaCl濃度54.5mM時(shí)就完全聚集，而加入dNMP后，納米金可以承受顯著高濃度的NaCl。承受NaCl的濃度越高，說(shuō)明納米金的穩(wěn)定性越高。表1.納米金的穩(wěn)定性測(cè)定。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2:dNMP，單鏈DNA和雙鏈DNA對(duì)未修飾納米金的穩(wěn)定影響的差異雙鏈DNA樣品PM/A:0.25微升100yM的5端磷酸化的單鏈DNA探針A(5'CCGCAAGACCGCTAGC)，0.25微升100iiM與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的革巴標(biāo)DNAPM(GCTAGCGGTCTTGCGG)，1微升的緩沖液(0.6MNaCl，lOmM磷酸鹽，pH7.4)，禾口0.5微升的水在室溫下保存10分鐘。單鏈DNA樣品PM:0.25微升100iiM與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的靶標(biāo)DNAPM(GCTAGCGGTCTTGCGG)，1微升的緩沖液(0.6MNaCl，10mM磷酸鹽，pH7.4)，和0.75微升的水在室溫下保存10分鐘。單鏈DNA樣品A:0.25微升100iiM5端磷酸化的單鏈DNA探針A(5'CCGCAAGACCGCTAGC)，1微升的緩沖液(0.6MNaCl，10mM磷酸鹽，pH7.4)，和0.75微升的水在室溫下保存10分鐘。dNMP樣品dNMP樣品與單鏈DNA樣品A具有相同的堿基摩兒濃度。1.75微升的100iiM的dCMP，1微升的100iiM的dGMP，1微升的100iiM的dAMP，0.25微升的100iiM的dTMP，和1微升的緩沖液(0.6MNaCl，10mM磷酸鹽，pH7.4)，在室溫下保存10分鐘。在以上樣品中分別加入100微升的12.7nM的納米金，然后立即加入IO微升的0.6MNaCl磷酸鹽溶液。雙鏈，單鏈DNA樣品立即產(chǎn)生聚集，而dNMP樣品保持穩(wěn)定的紅色(圖2)。然后進(jìn)行了UV-Vis吸收測(cè)量(圖2)。dNMP由于較小的空間位阻和較小的分子尺寸，以及較小的電負(fù)性，dNMPs能夠比具有相同堿基濃度的單鏈和雙鏈DNA更好地穩(wěn)定納米金。由于dNMPs和DNA都可以不同程度上穩(wěn)定納米金AuNPs，在特定的鹽濃度下dNMP/AuNP保持穩(wěn)定，而DNA/AuNP聚集。實(shí)施例3:通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行A核酸外切酶的活性檢測(cè)10微升的酶反應(yīng)溶液中含有5端磷酸化的單鏈DNA探針A(100pmole，10iiM)，(5'P04_CCGCAAGACCGCTAGC)與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的耙標(biāo)DNAPM(lOOpmole，10iiM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)，反應(yīng)緩沖液(67mMGlycine-KOH，2.5薩gCI2，50iig/mlBSA，pH9.4)，和不同量的A核酸外切酶(從limitto0.limit)。反應(yīng)在37。C下進(jìn)行1小時(shí)，然后在75t:下加熱10分鐘使酶失活。然后反應(yīng)溶液與200微升的納米金AuNP(12.7nM)混合，加入100微升的0.2MNaCl磷酸鹽溶液。進(jìn)行UV-Vis吸收測(cè)量，波峰的移位用來(lái)定量顏色變化和酶的活性。A核酸外切酶對(duì)基體的選擇性也可以按照上訴實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。具體如下三種基體分別是(1)5'端磷酸化的單鏈DNA探針A(100pmole，10iiM)，(5'P04-CCGCAAGACCGCTAGC)與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的耙標(biāo)DNAPM(100pmole，10yM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)形成的雙鏈DNA;(2)5'端沒(méi)有磷酸化的單鏈DNA探針B(lOOpmole，10iiM)，(5'CCGCAAGACCGCTAGC)與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的耙標(biāo)DNAPM(lOOpmole，10yM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)形成的雙鏈DNA;(3)5'端磷酸化的單鏈DNA探針A(lOOpmole，10iiM)，(5，P04_CCGCAAGACCGCTAGC)。limit的A核酸外切酶。其它實(shí)驗(yàn)條件同上。討論A核酸外切酶作用于雙鏈DNA，沿5'到3'方向漸進(jìn)性催化去除5'單核苷酸。最適合的底物是5'磷酸化的雙鏈DNA。如圖3所示，(A)A核酸外切酶將雙鏈DNA中的5端磷酸化的單鏈DNA探針A酶解成dNMP。由于dNMPs和DNA都可以不同程度上穩(wěn)定納米金AuNPs，對(duì)A核酸外切酶活性的檢測(cè)在特定的鹽濃度下進(jìn)行，在此濃度下dNMP/AuNP保持穩(wěn)定，而DNA/AuNP聚集。(B)是酶反應(yīng)溶液與納米金混合后的紫外可見(jiàn)吸收譜圖，(C)是不同濃度的入核酸外切酶反應(yīng)溶液(O，O.OlU/iiL，O.02U/iiL0.03U/iiL，O.04U/iiL，O.05U/iiL，0.075U/iiL和0.lU/iiL)與納米金混合后的照片。如圖(C)所示，隨著入核酸外切酶濃度的增加，更多的單鏈DNA探針A酶解成dNMP，納米金越來(lái)越穩(wěn)定，納米金的顏色由藍(lán)色逐漸成為紅色，當(dāng)酶的濃度大于0.05U/iiL時(shí)，所產(chǎn)生的dNMP已經(jīng)能夠在本實(shí)施例的鹽濃度下安全穩(wěn)定納米金。(D)是不同濃度的A核酸外切酶反應(yīng)溶液(0，0.01U/iiL，0.02U/iiL0.03U/iiL，0.04U/iiL，0.05U/iiL，0.075U/iiL和0.1U/iiL)與納米金混合后紫外可見(jiàn)吸收A520/A600隨A核酸外切酶濃度變化的曲線，(E)是A核酸外切酶反應(yīng)對(duì)基體選擇性的照片。A核酸外切酶對(duì)雙鏈DNA中的5端磷酸化的單鏈DNA探針的反應(yīng)活性顯著高于單鏈的5端磷酸化的DNA和DNA中的沒(méi)有5端磷酸化的單鏈DNAB探針。在目前的研究中，典型的A核酸外切酶的檢測(cè)范圍是0.002U/iiL到0.1U/iiL。實(shí)施例4:通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行Sl核酸酶的活性檢測(cè)IO微升的酶反應(yīng)溶液中含有單鏈DNAC(100pmole，10iiM)，(5'AGGCTGGAGGTAAAACGACGGAACTAACATGCA)，反應(yīng)緩沖液(30mM醋酸鈉，280mMNaCI，lmMZnS04，pH4.6)，和5U的S1核酸酶。反應(yīng)在37t:下進(jìn)行15分鐘。然后5微升反應(yīng)溶液與100微升的納米金AuNP(12.7nM)混合，加入20微升的0.6MNaCl磷酸鹽溶液。進(jìn)行UV-Vis吸收測(cè)量，波峰的移位用來(lái)定量顏色變化和酶的活性。Sl核酸酶對(duì)基體的選擇性也可以按照上訴實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。具體如下兩種基體分別是(1)單鏈DNA探針B(100pmole，10iiM)，(5'CCGCAAGACCGCTAGC)與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的耙標(biāo)DNAPM(100pmole，10iiM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)形成的雙鏈DNA;(2)單鏈DNA探針B(100pmole，10iiM)，(5'CCGCAAGACCGCTAGC)。其它實(shí)驗(yàn)條件同上。討論為了驗(yàn)證本發(fā)明方法應(yīng)用的普遍性，我們使用該方法對(duì)S1核酸酶的活進(jìn)行了性檢測(cè)。Sl核酸酶是單鏈DNA特異的核酸內(nèi)切酶，能將DNA或RNA降解成為5'-P單核苷酸。如圖4所示，(A)Sl核酸酶將單鏈DNA探針A酶解成dNMP。(B)是酶反應(yīng)溶液與納米金混合后的紫外可見(jiàn)吸收譜圖和照片。當(dāng)溶液中存在Sl核酸酶時(shí)，單鏈DNA被酶解成dNMP，而dNMP能夠更好地穩(wěn)定納米金。在特定的鹽濃度下進(jìn)行，dNMP/AuNP保持穩(wěn)定，而DNA/AuNP聚集。因此可以檢測(cè)S1核酸酶的存在和活性。(C)是是S1核酸酶反應(yīng)對(duì)基體選擇性的照片。Sl核酸酶對(duì)單鏈DNA探針的反應(yīng)活性顯著高于雙鏈的DNA。實(shí)施例5:通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行DNA的恒熱放大檢測(cè)10微升的反應(yīng)溶液中含有5端磷酸化的單鏈DNA探針A(100pmole，10iiM)，(5，P04-CCGCAAGACCGCTAGC)與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的耙標(biāo)DNAPM(O.1iiM，1iiM，10iiM)(GCTAGCGGTCTTGCGG)，反應(yīng)緩沖液(67mMGlycine-KOH，2.5mMMgCI2，50iig/mlBSA，pH9.4)，和1U的A核酸外切酶。反應(yīng)在37t:下進(jìn)行1小時(shí)，然后在75t:下加熱IO分鐘使酶失活。然后5微升的反應(yīng)溶液與100微升的納米金AuNP(12.7nM)混合，加入20微升的0.6麗aCl磷酸鹽溶液。進(jìn)行UV-Vis吸收測(cè)量，波峰的移位用來(lái)定量顏色變化和DNA的檢測(cè)。負(fù)控制實(shí)驗(yàn)中使用不互補(bǔ)的靶標(biāo)DNAN(O.1iiM，1iiM，10iiM)(5'CCGACGCGCTGGAGTA)。同樣的DNA雜交的納米檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在不存在A核酸外切酶的條件下進(jìn)行，用于展示本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。討論如圖5所示，(A)DNA的檢測(cè)，按照專利US2005059042A1。當(dāng)5端磷酸化的單鏈DNA探針A與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的靶標(biāo)DNAPM的摩兒比例等于10或0.1時(shí)，無(wú)論用肉眼或紫外可見(jiàn)吸收測(cè)量不能夠檢測(cè)DNAPM的存在。(B)按照本發(fā)明的DNA的檢測(cè)。在本實(shí)施例中，單鏈DNA的摩兒比是指5端磷酸化的DNA探針A與耙標(biāo)DNAPM(或N)的摩兒比。當(dāng)5端磷酸化的單鏈DNA探針A與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的靶標(biāo)DNAPM的摩兒比例等于10或0.1時(shí)，仍然能夠用肉眼清晰地檢測(cè)到DNAPM的存在。當(dāng)使用紫外可見(jiàn)吸收測(cè)量時(shí)，檢測(cè)范圍可以擴(kuò)大一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)(表2)。表2.按照本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行DNA檢測(cè)的紫外可見(jiàn)吸收數(shù)據(jù)(A520/A650)。9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>專利US2005059042A1以及其它目前報(bào)道的方法都是利用雙鏈和單鏈DNA對(duì)穩(wěn)定納米金的能力的差異來(lái)設(shè)計(jì)檢測(cè)DNA的。然而由于雙鏈DNA和單鏈DNA對(duì)納米金穩(wěn)定性的差異不是很大，尤其是單鏈DNA對(duì)納米金的穩(wěn)定作用顯著地受其組成影B向，比如含有連續(xù)T的單鏈DNA不能很好地穩(wěn)定納米金，被檢測(cè)DNA的摩兒量需要和DNA探針的摩兒量盡量接近，才可以直接肉眼觀測(cè)到的顯著差異。當(dāng)被檢測(cè)的DNA樣品是復(fù)雜樣品，很難定量時(shí)，就需要大量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。然而本發(fā)明成功地利用了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象來(lái)提高使用未修飾納米金檢測(cè)的使用范圍和提高其靈敏度。第一個(gè)現(xiàn)象是，dNMPs，由于較小的空間位阻和較小的分子尺寸，以及較小的電負(fù)性，dNMPs能夠比具有相同堿基濃度的單鏈和雙鏈DNA更好地穩(wěn)定納米金。我們可以將區(qū)分雙鏈和單鏈DNA的問(wèn)題轉(zhuǎn)化為更容易的區(qū)分dNMPs和單鏈DNA的問(wèn)題。第二個(gè)現(xiàn)象核酸酶反應(yīng)的專一性和多樣性。眾多的高靈敏的DNA檢測(cè)方法都是依賴于高度專一性的酶，這些酶可以顯著地改變DNA的結(jié)構(gòu)和尺寸，這些變化都可以用于使用未修飾納米金進(jìn)行的DNA檢測(cè)中。比如在本實(shí)施例中，我們利用A核酸外切酶來(lái)對(duì)DNA進(jìn)行恒熱放大檢測(cè)。因此當(dāng)5端磷酸化的單鏈DNA探針A與單鏈DNA探針完全互補(bǔ)的靶標(biāo)DNAPM的摩兒比例大于等于100時(shí)，仍然有足夠的dNMPs產(chǎn)生來(lái)穩(wěn)定納米金，從而能夠檢測(cè)DNAPM的存在。權(quán)利要求一種增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法，其特征在于該方法是將單核苷酸dNMP加入納米金溶液中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法，其特征在于加入納米金溶液中的dNMP的數(shù)量應(yīng)大于納米金摩兒量的50倍。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法，其特征在于加入納米金溶液中的dNMP的濃度大于150nM。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法，其特征在于利用各種各樣的核酸酶反應(yīng)來(lái)生成dNMP。5.—種生物檢測(cè)方法，其特征在于，該方法利用檢測(cè)過(guò)程中生成的dNMP來(lái)檢測(cè)被分析物，該方法利用納米金的顏色變化來(lái)標(biāo)明被檢測(cè)物的存在與否。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物檢測(cè)方法，其特征在于，被分析物可以是酶，蛋白質(zhì)，核酸，小分子，金屬離子。7.—種生物檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(l)將被檢測(cè)物與某種特定的酶，以及其它酶反應(yīng)所需要的成分混合，并在酶反應(yīng)所需要的條件下保存，酶反應(yīng)將生成dNMP;(2)將反應(yīng)溶液與納米金溶液混合；(3)加入適量的鹽溶液(比如氯化鈉)，通過(guò)溶液顏色變化來(lái)判定被檢測(cè)物的存在。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物檢測(cè)方法，其特征在于，被分析物的存在于否可以由紫外可見(jiàn)吸收定量分析。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物檢測(cè)方法，其特征在于，被分析物的存在于否可以由溶液的顏色變化定性地分析。10.—種生物檢測(cè)方法，其特征在于，該方法是將所生成的dNMP加入納米金溶液中，通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行A核酸外切酶的活性檢測(cè)。11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(l)將不同濃度的A核酸外切酶與其基體(比如5端磷酸化的雙鏈DNA)混合，并在37度下保溫一段時(shí)間，75度下加熱10分鐘；(2)將反應(yīng)混合物與納米金溶液混合；(3)加入適量的鹽溶液(比如氯化鈉)。12.—種生物檢測(cè)方法，其特征在于，該方法是將所生成dNMP加入納米金溶液中，通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行SI核酸酶的活性檢測(cè)。13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將不同濃度的SI核酸酶與其基體(比如單鏈DNA)混合，并在37度下保溫一段時(shí)間；(2)將反應(yīng)混合物與納米金溶液混合；(3)加入適量的鹽溶液(比如氯化鈉)。14.一種生物檢測(cè)方法，其特征在于，該方法是將所生成的dNMP加入納米金溶液中，通過(guò)增強(qiáng)納米金的穩(wěn)定性進(jìn)行DNA的恒熱放大檢測(cè)。15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將被檢測(cè)DNA樣品(互補(bǔ)的和不互補(bǔ)的單鏈DNA)與5端磷酸化的檢測(cè)DNA探針混合，并在室溫下保存5分鐘；(2)將反應(yīng)混合物與A核酸外切酶混合，并在37度下保溫一段時(shí)間，75度下加熱10分鐘；(3)將反應(yīng)混合物與納米金溶液混合；(4)加入適量的鹽溶液(比如氯化鈉)。全文摘要本發(fā)明提供一種增強(qiáng)納米金穩(wěn)定性的方法及應(yīng)用其的生物檢測(cè)的方法。單核苷酸dNMP能夠比組成相同，且堿基濃度相同的單鏈DNA更好地穩(wěn)定納米金。dNMP可以由各種各樣的具有基體選擇性的核酸酶消化核酸形成。將dNMP能夠更好地穩(wěn)定納米金這一特性與特異性的酶反應(yīng)相結(jié)合，納米金的顏色變化可以用來(lái)簡(jiǎn)單方便地檢測(cè)多種多樣的分析物，包括酶和DNA等。該方法極大地?cái)U(kuò)大了使用未修飾納米金進(jìn)行生物檢測(cè)的檢測(cè)物范圍，提高了檢測(cè)的靈敏度。以DNA檢測(cè)為例，將檢測(cè)的探針和靶標(biāo)的摩兒比例范圍擴(kuò)大了三個(gè)數(shù)量級(jí)。該方法可以推廣到包括小分子和重金屬離子在內(nèi)的各種不同種類的物質(zhì)的檢測(cè)。文檔編號(hào)G01N21/78GK101762574SQ20081020762公開(kāi)日2010年6月30日申請(qǐng)日期2008年12月23日優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日發(fā)明者婁新徽,趙建龍申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所