專利名稱：用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品的世代毒性的方法
技術領域：
用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品的世代毒性的方法，涉及一種用秀麗線蟲 測定藥品與個人護理品類物質(PPCPs)的世代毒性的方法。屬于環(huán)境保護、生
態(tài)風險評價等技術領域。
背景技術：
秀麗線蟲(Cae/K>r/ a6A'"seJega/3S)屬于線形動物門、線蟲綱動物，生活 在世界各地的泥土中，以細菌為食，容易人工養(yǎng)殖，對人、動物和植物沒有危害， 非寄生，安全性高。它能感知氣味和味道，對光線、溫度有反應。秀麗線蟲基因 組全序列測定在1998年底完成，是第一個已知基因組全序列的多細胞動物。現(xiàn) 在，已知的線蟲基因組有97 Mbp，相當于人類基因組的1/30。該模式生物具有 生命周期短、體積小、容易培養(yǎng)等諸多優(yōu)點，易于在試驗室中進行培養(yǎng)。另外， 秀麗線蟲對外界環(huán)境的變化非常敏感，環(huán)境脅迫會改變它們的生殖速度、生命周 期以及其他發(fā)育特性。無論是利用胚胎發(fā)育來檢測毒物的毒性試驗，還是在分子 生物學水平對毒物進行分析，秀麗線蟲都是比較可靠而有效的模式生物。秀麗線 蟲是國內(nèi)外研究的模式生物中最為簡單、遺傳與發(fā)育背景了解最清楚的物種之 一，已經(jīng)在2002年和2006年獲得諾貝爾生理學/醫(yī)學獎，2008年獲得諾貝爾化 學獎，這么短的時間獲得三次諾貝獎，己經(jīng)充分證明了秀麗線蟲研究的優(yōu)勢，也 充分奠定了秀麗線蟲豐厚的基礎數(shù)據(jù)。
采用秀麗線蟲作為毒性測試模式動物是很普遍的現(xiàn)象，諸多文獻所采用的方 法均采用行為學的指標相似，而且對行為學指標的界定已經(jīng)非常明確，但是對于 世代毒性的檢測并沒有非常明確，而且尚無文章提出對藥品和個人護理品類物質 (PPCPs)采用線蟲進行毒性測試的方法研究。
已經(jīng)有很多文獻報道，藥品與個人護理品類物質(PPCPs)在全球環(huán)境中普 遍存在，無論是飲用水源、瓶裝飲用水，還是污水處理廠的出水、普通江河湖泊 里的水均有檢出。鑒于藥品等物質能夠增強環(huán)境中微生物對藥品的抗性作用以及 藥品等物質能夠隨著食物鏈等途徑對人體發(fā)揮預想不到的作用，確定PPCPs的毒
5性以及致毒機理至關重要。普通的急性毒性測試方法，雖然具有快速的優(yōu)點，但 是由于其濃度的選擇均明顯高于環(huán)境中檢出的PPCPs的濃度而無法判斷真實環(huán) 境中的PPCPs產(chǎn)生的毒性效應，從而無法判斷真實環(huán)境中的PPCPs所產(chǎn)生的生態(tài) 風險。而普通的慢性毒性，所檢測的是PPCPs在其所選受試生物(比如小白鼠等) 生命期內(nèi)某段時間所產(chǎn)生的毒性效應，無法表征PPCPs對生物、生物子代及其子 代的子代等的長期作用的毒性效應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方便快捷、成本低廉、操作簡單的用秀麗線蟲測 定藥品與個人護理品的世代毒性的方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明充分利用秀麗線蟲已有的豐厚的基礎數(shù)據(jù)，在急 性毒性和傳統(tǒng)的慢性毒性測試方法的基礎上進行進一步的研究，通過檢測PPCPs 對秀麗線蟲產(chǎn)生的世代毒性，能夠測定待測PPCPs在很低的濃度條件產(chǎn)生的毒性 效果，并且能夠判斷得出該效果是否能夠傳遞給下一代，而且通過檢測指標可以 判斷毒性效果的產(chǎn)生是基于對何種器官的剌激而引起的，以及對不同的器官產(chǎn)生
毒性作用的相對順序，從而初步判斷致毒機理。具體包括如下步驟
A，卵液的制備將秀麗線蟲放在接種有大腸桿菌0P50 (0P50 的 NGM固體培養(yǎng)基上，23'C培養(yǎng)三天后用M9溶液沖洗得到含有秀麗線蟲蟲體的NGM 固體培養(yǎng)基得到蟲液，將蟲液轉移至離心管中，靜置30min，用移液槍移去上清 液，按照蟲液clorox溶液4:7體積比，將clorox溶液加入蟲液中，混合搖勻， 反應20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對clorox溶液有抵抗能力的 蟲卵，2500rpm離心3min，棄上清液，再加入M9溶液至離心前相同的刻度，搖 勻，2500rpm離心3min，棄上清液，重復該操作兩次，然后向離心管內(nèi)加入M9 溶液，搖勻，標記為卵液，待用； B，同步化蟲液的獲得
向依照傳統(tǒng)方法配置但并沒有接種0P50 ￡ cWi的NGM固體培養(yǎng)基上接種上 述A步的卵液200u L，培養(yǎng)1-2天至秀麗線蟲四次蛻皮后，其生長狀態(tài)相對同 步化。與NGM固體培養(yǎng)基配方相同，不使用瓊脂粉，配置NGM培養(yǎng)液，用于沖洗 固體培養(yǎng)基，將得到的含有秀麗線蟲的溶液轉移至已滅菌的離心管中，溶液中蟲濃度很高時需要稀釋，直至每100uL溶液中有10±1只秀麗線蟲，標記為"蟲 液"，待用。
若NGM培養(yǎng)液能夠使待測PPCPs的澄清溶液變渾濁，則使用M9溶液代替本 步驟的NGM培養(yǎng)液。
C,用于測定半數(shù)致死濃度(LC5。)的待測PPCPs樣品的制備
先確定待測PPCPs的溶解性及溶劑若PPCPs溶于水，則采用去離子水；若 PPCPs不溶于水，則采用體積百分濃度為P/。的二甲亞砜(DMS0)作為溶劑。在待 測PPCPs溶解度的濃度以下根據(jù)等對數(shù)間距的原則配置十一個濃度梯度的 PPCPs，采用與待測PPCPs溶劑相同的溶液作為空白對照，得到不同濃度的樣品 十二組，每組八個平行，共計96個樣品，待測。
D，樣品與蟲液的混合
將C步驟獲得的十二組不同濃度、每組八個平行，共計96個樣品加入96 孔板中，樣品的使用量均為100uL;向96個樣品中加入蟲液100uL。 96孔板 中每一孔的混合液中合計有200 u L的液體和10±1只秀麗線蟲。
E，半數(shù)致死濃度(LC5。)的測定
采用體視顯微鏡對步驟D操作后的96孔板中的秀麗線蟲進行觀察，每4小 時(4h)觀測一次，蟲體僵直則認定其死亡，記錄死亡數(shù)目，直至空白對照組的 秀麗線蟲出現(xiàn)幼蟲/卵為止。以濃度對數(shù)為橫坐標，死亡率為縱坐標，采用直線 內(nèi)插法獲得半數(shù)致死濃度(LC5。)。
若所設定的濃度梯度沒有同時包含死亡率大于50%與死亡率小于50%的效 應，則根據(jù)情況調整待測PPCPs的濃度梯度若所設定的濃度梯度所產(chǎn)生的死亡 率均小于50%，則保持待測PPCPs樣品空白對照組之外的最低濃度不變，適當增 加所采用的等對數(shù)間距，設定較高的濃度梯度；若所設定的濃度梯度所產(chǎn)生的死 亡率均大于50%，則保持待測PPCPs樣品的最高濃度不變，適當增加所采用的等 對數(shù)間距，設定較低的濃度梯度。然后重復步驟A、 B、 D、 E，直至獲得半數(shù)致 死濃度(LC5。)。其特征是-
F，用于測定世代毒性的待測PPCPs樣品的制備
在步驟E獲得的半數(shù)致死濃度(LC5。)以下，根據(jù)等對數(shù)間距的原則設定十一個濃度梯度，采用與待測PPCPs溶劑相同的溶液作為空白對照，得到不同濃度 的樣品十二組，每組設有8個平行，共計96個樣品，待測。
G，重復步驟A、 B，獲得同步化的蟲液，10士l只/100yL，并將該蟲液標記 為親代，待用。
H，待測PPCPs對親代的毒性結果的測定
將步驟F獲得的十二組不同濃度、每組8個平行，共計96個樣品加入96 孔板，樣品的使用量均為100y L;向96個樣品中加入L由步驟G獲得的 親代蟲液。96孔板中每一孔的混合液中合計有200uL的液體、10±1只秀麗 線蟲。
暴露4h后，用移液槍移取十二組濃度中每一組濃度的八個平行中的四個樣 品，置于同一個離心管中，即每一組濃度收集一份混合液，該平板共收集對應于 十二組濃度的十二個離心管?？紤]到水分蒸發(fā)和移液槍無法完全吸取的原因，每 一個離心管的混合液為500-700uL。向離心管中加入4mLM9溶液，搖勻后靜置 10min，去上清，再次加入4mLM9溶液，搖勻后靜置10min，去上清。加入適量 M9溶液，以使秀麗線蟲保持5± 1只/50 y L。 23'C下，采用體視顯微鏡對親代(P。) 進行如下指標的測定壽命測定，孵化規(guī)模及世代時間測定；身體大小測定，身 體彎曲頻率測定，逆向運動檢測，嗅覺刺激測定。
壽命與孵化規(guī)模和世代時間同時測定，嗅覺剌激與身體大小、身體彎曲頻率、 逆向運動同時測定，以簡化操作。
采用待測PPCPs的濃度對數(shù)作為橫坐標，采用上述指標作為縱坐標，獲得秀 麗線蟲相應的指標在不同的PPCPs濃度下暴露4h所受到的毒性結果，記錄為"待 測PPCPs對P。的毒性結果(4h)"。
I，待測PPCPs對P。的子一代(F,)的毒性結果的測定
在對親代(P。)進行步驟H時，每一個濃度系列(共八孔)的剩余部分(四 孔)也停止對待測PPCPs的暴露。用移液槍將蟲液從96孔板中取出， 一個濃度 系列的蟲液置于一個有0P50 ￡ 生長的NGM培養(yǎng)基上，每一個暴露時間的 96孔板上的12個濃度對應著12個培養(yǎng)皿。重復步驟A，獲得親代(P。)不同濃 度組對應的"卵液"；重復步驟B，獲得子一代(F,)的"蟲液"，重復步驟H，獲得"待測PPCPs對F,的毒性結果(4h)"。
J，待測PPCPs對P。的子二代(F2)的毒性結果的測定
在對子一代(FO進行步驟H時，每一個濃度系列(共八孔)的剩余部分(四 孔)也停止對待測PPCPs的暴露。用移液槍將秀麗線蟲從96孔板中取出， 一個 濃度系列的秀麗線蟲置于一個有0P50 ￡ 生長的NGM培養(yǎng)基上，每一個暴露 時間的96孔板上的12個濃度對應著12個培養(yǎng)皿。重復步驟A，獲得子一代(F,) 不同濃度組對應的"卵液"；重復步驟B，獲得子二代(F2)的"蟲液"，重復步 驟H，獲得"待測PPCPs對F2的毒性結果(4h)"。
K，待測PPCPs暴露不同時間的世代毒性測定
將暴露時間修改為8h，重復步驟H、 I、 J，獲得8h待測PPCPs對親代的毒 性結果和待測PPCPs對子一代的毒性結果以及待測PPCPs對子二代的毒性結果； 依照上述步驟，將暴露時間修改為12h、 16h、 20h、 24h，共獲得12h待測PPCPs 對親代、子一代和子二代的毒性結果；16h待測PPCPs對親代、子一代和子二代 的毒性結果;20h待測PPCPs對親代、子一代和子二代的毒性結果；24h待測PPCPs 對親代、子一代和子二代的毒性結果；
L，世代毒性的評價
釆用軟件Origin 7.5對數(shù)據(jù)進行顯著性分析將同一個暴露時間下獲得的 待測PPCPs對秀麗線蟲親代(P。)、子一代(F')和子二代(F2)的同一個指標的 三個毒性結果輸入數(shù)據(jù)列表，在statistics下打開anova的下拉按鈕中的 one-way anova，從候選列表中將"P。"與"F,"的數(shù)據(jù)選擇，并將"顯著性參數(shù)" 設定為0. 05，進行計算。若計算結果顯示為"At the 0. 05 level, the population means are not significantly different."則說明所測PPCPs對親代與子一代 的該指標的毒性效果之間沒有顯著差異；若結果顯示為"At the 0.05 level, the population means are significantly different.，，則說明所測PPCPs對親代 與子一代的該指標的毒性效果之間具有顯著差異。對"F,與"F2"之間的數(shù)據(jù) 進行相同的分析，就可以獲得所測PPCPs對子一代與子二代的毒性效果之間是否 具有顯著差異。結論若PPCPs的毒性效果在"P。與F"和"F,與F/'兩個比較 中均得到"顯著差異"的結果，說明所測PPCPs對該指標具有明確的世代毒性，并且其毒性效果隨著世代增加而增強；若前者比較結果為"非顯著差異"而后者 比較結果為"顯著差異"，說明PPCPs對該指標具有世代毒性，但是其世代毒性 需要長期的作用才能夠顯現(xiàn)出來；若前者比較結果為"顯著差異"而后者比較結 果為"非顯著差異"或者兩個比較中均為"非顯著差異"，則說明所測PPCPs對 該指標不具有世代毒性。
對其它的指標通過相同的步驟進行"顯著性分析"，即可獲得所測PPCPs對 哪些指標具有世代毒性。
在不同的暴露時間下獲得的待測PPCPs對親代、子一代和子二代的同一個指 標的毒性效果的數(shù)據(jù)，采用同樣的"顯著性分析"的方法，可以用于進一步佐證 "PPCPs對秀麗線蟲該指標的毒性是否隨著暴露時間的增加而具有更強的世代 毒性"。
本發(fā)明的效果和優(yōu)點是
1. 與以往的慢性毒性試驗相比，指標更全面，不僅應用了對秀麗線蟲身體 的直接影響，還有對其神經(jīng)、肌肉以及嗅覺的影響等，而且秀麗線蟲具有豐厚的 基礎數(shù)據(jù)可以進行比對；而且它還具有更易培養(yǎng)、占據(jù)空間小，便于操作、便于 存放；該方法中的秀麗線蟲敏感性高、對儀器要求少(體視顯微鏡)；同時，相 較于生命期較長的暴露時間所產(chǎn)生的毒性效應還能夠用于判斷毒性產(chǎn)生作用的 順序及機理，并且有利于指導下一步致毒機理研究的方向。
2. 不同濃度的PPCPs在不同的暴露時間里所產(chǎn)生的不同的時代毒性的比較， 能夠獲得在秀麗線蟲暴露于不同的時間后所遭受到的世代毒性的強弱。從而在暴 露劑量和暴露時間兩個層面上為真實環(huán)境中的PPCPs毒性的檢測與預測提供指 導，也能夠為PPCPs相關的生產(chǎn)過程、突發(fā)事件后續(xù)處理方法的實效判斷、新型 PPCPs的生態(tài)風險等等內(nèi)容，提供快速的評價途徑。
具體實施例方式
實施例1
首先，進行毒性測試所用的材料和器具準備體視顯微鏡(包含成像系統(tǒng))， 96孔板(無菌)，離心管(滅菌)，移液槍(含滅菌的槍頭)，培養(yǎng)皿(滅菌)， 鉑絲等；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、胰蛋白胨、蛋白胨、瓊脂粉、膽固醇、硫酸鎂、氯化鈣、次氯酸鈉(溶液)、酵母浸膏。然后配制LB (LuriaBertani) 培養(yǎng)基、NGM (Nematode Growth Medium)固體培養(yǎng)基、M9溶液和Clorox溶液。 LB培養(yǎng)基的配方(1L)是10g胰蛋白胨、5g酵母浸膏、10g氯化鈉，用lmol/L 氫氧化鈉溶液將pH值調為7. 0，在121°C、 0. 105MPa滅菌20min。 NGM固體培養(yǎng) 基的配方(1L): 17g瓊脂粉、2. 5g蛋白胨、3g氯化鈉、25mLp^6. 0的K2HP04_KH2P04 溶液，121°C、 0. 105MPa高壓滅菌20min，冷卻至5(TC左右時，加入經(jīng)抽濾滅菌 處理過的lmol/LMgS04、 lmol/LCaCl2、 5mg/mL膽固醇乙醇溶液各lmL，混合均勻 后倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，靜置冷卻至室溫凝固后，待接種。
① 配制lmol / L K2HP04-KH2P04緩沖液(pH=6. 0): 11. 4g (K2HP04'3H20)十50mL 蒸餾水；6. 8g KH2P04+50mL蒸餾水；按2:1比例配成pH=6. 0的緩沖液。
② 配制lmL膽固醇溶液(5mg/mL乙醇)0. 025g膽固醇+5mL無水乙醇溶解。
③ 配制lmol/L MgS04: 1.232g (MgS(V7H20) +5mL蒸餾水；配制lmol/L CaCl2lmL: 0. 554g+5mL蒸餾水。
④ 抽濾除菌用無菌①13mm孔徑0.45 um的硝酸纖維素膜過濾菌類。將濾 膜裝在高溫滅菌處理過的容量為5mL的玻璃注射器靠針管處，將待過濾的液體裝 入注射器，推壓注射器活塞桿，壓出液膜的溶液即抽濾除菌后的溶液。
配制NGM培養(yǎng)液配方除了不使用瓊脂粉之外，其余的與NGM固體培養(yǎng)基配 置方法相同。121°C、 0. 105MPa滅菌20min。
M9溶液配方(1L): 15. 12gNa2HP(V12H20(或6gNa2HP04)， 3gKH2P04， 5gNaCl， 0. 25g MgS04'7H20。 121°C、 0. 105MPa滅菌20min。
clorox溶液含有1%體積的Na0Cl， 0. 5mol/L的Na0H。根據(jù)需要的量現(xiàn)用 現(xiàn)配。
將大腸桿菌0P50 (0P 50 ￡ 接種至滅菌后恢復至室溫的LB培養(yǎng)基
中，37。C培養(yǎng)24h，待用。將培養(yǎng)好的0P50 Ac^y接種至NGM培養(yǎng)基上，37°C 培養(yǎng)24h，待用。將線蟲接種至有0P50AcWi的NGM培養(yǎng)基上，23。C常規(guī)培養(yǎng)。
待測PPCPs的世代毒性測定的具體步驟
A，"卵液"的制備采用NGM培養(yǎng)基、大腸桿菌0P50 (0P50￡c。Ji)作為 食物，23t培養(yǎng)秀麗線蟲。本發(fā)明所用秀麗線蟲由復旦大學發(fā)育生物學研究所惠贈。應用范圍本方法適用于無揮發(fā)性或者揮發(fā)性較弱的可溶于水或者DMSO的 藥品及個人護理品類物質(簡稱PPCPs)的世代毒性測試。
三天后，采用2mL的M9溶液沖洗培養(yǎng)皿表面，將含有蟲體的M9溶液轉移至 15mL的離心管，靜置30min，用移液槍移去上清液。按照1:7 (蟲液clorox溶 液)的體積比例，加入clorox溶液，混合搖勻，反應20min，每五分鐘搖勻一 次，殺死母體，保留對clorox溶液有抵抗能力的蟲卵。平衡離心管之間的重量 之后，2500rpm離心3rain，棄上清液。加入M9溶液至相同刻度，搖勻，2500rpm 離心3min，棄上清液；重復該操作兩次。然后向離心管內(nèi)加入2mLM9溶液，搖 勻，標記為"卵液"，待用。
B，同步化"蟲液"的獲得
向依照傳統(tǒng)方法配置但并沒有接種OP50的NGM固體培養(yǎng)基上接種上述A步 驟獲得的"卵液"200"L，培養(yǎng)l-2天至秀麗線蟲四次蛻皮后(L4期)，其生長 狀態(tài)相對同步化。參照NGM固體培養(yǎng)基的配方，不使用瓊脂粉，配置NGM培養(yǎng)液， 用于沖洗培養(yǎng)基表面，將含有秀麗線蟲的溶液轉移至已滅菌的離心管中，蟲液濃 度很高時需要稀釋，直至每100uL溶液中有10士l只秀麗線蟲，標記為"蟲液"， 待用。
若NGM培養(yǎng)液能夠使待測PPCPs的澄清溶液變渾濁，則使用M9溶液代替本 步驟的NGM培養(yǎng)液。
C，用于測定半數(shù)致死濃度(LCs。)的待測PPCPs樣品的制備
先確定待測PPCPs的溶解性及溶劑若PPCPs溶于水，則采用去離子水；若 PPCPs不溶于水，則采用體積百分濃度1%的二甲亞砜(DMSO)作為溶劑。在待測 PPCPs溶解度的濃度以下根據(jù)等對數(shù)間距的原則配置十一個濃度梯度的PPCPs， 采用與待測PPCPs溶劑相同的溶液作為空白對照，得到不同濃度的樣品十二組， 每組八個平行，共計96個樣品，待測。
D，樣品與"蟲液"的混合
將C步驟獲得的十二組不同濃度、每組八個平行，共計96個樣品加入96 孔板中，樣品的使用量均為lOOixL;向96個樣品中加入"蟲液"100uL。 96 孔板中每一孔的混合液中合計有200uL的液體、IO土I只秀麗線蟲。E，半數(shù)致死濃度(LC5。)的測定
采用體視顯微鏡對步驟D操作后的96孔板中的秀麗線蟲進行觀察，每4小 時(4h)觀測一次，蟲體僵直則認定其死亡，記錄死亡數(shù)目，直至空白對照組的 秀麗線蟲出現(xiàn)幼蟲/卵為止。以濃度對數(shù)為橫坐標，死亡率為縱坐標，采用直線 內(nèi)插法獲得半數(shù)致死濃度(LCs。)。
若所設定的濃度梯度沒有同時包含死亡率大于50%與死亡率小于50%的效 應，則根據(jù)情況調整待測PPCPs的濃度梯度若所設定的濃度梯度所產(chǎn)生的死亡 率均小于50%，則保持待測PPCPs樣品空白對照組之外的最低濃度不變，適當增 加所釆用的等對數(shù)間距，設定較高的濃度梯度；若所設定的濃度梯度所產(chǎn)生的死 亡率均大于50%，則保持待測PPCPs樣品的最高濃度不變，適當增加所采用的等 對數(shù)間距，設定較低的濃度梯度。然后重復步驟A、 B、 D、 E，直至獲得半數(shù)致 死濃度(LC5。)。
F，用于測定世代毒性的待測PPCPs樣品的制備
在步驟E獲得的半數(shù)致死濃度(LC5。)以下，根據(jù)等對數(shù)間距的原則設定十 一個濃度梯度，采用與待測PPCPs溶劑相同的溶液作為空白對照，得到不同濃度 的樣品十二組，每組設有8個平行，共計96個樣品，待測。
G，重復步驟A、 B，獲得同步化的"蟲液"，10土l只/100uL，并將該蟲液 標記為P。，待用。
H，待測PPCPs對P。的毒性結果的測定
將步驟F獲得的十二組不同濃度、每組8個平行，共計96個樣品加入96 孔板，樣品的使用量均為100yL;向96個樣品中加入100yL由步驟G獲得的 蟲液"P。"。 96孔板中每一孔的混合液中合計有200iiL的液體、10±1只秀麗 線蟲。
暴露4h后，用移液槍移取十二組濃度中每一組濃度的八個平行中的四個樣 品，置于同一個15mL離心管中，即每一組濃度收集一份混合液，該平板共收集 對應于十二組濃度的十二個15mL離心管?？紤]到水分蒸發(fā)和移液槍無法完全吸 取的原因，每一個離心管的混合液為500-700uL。向離心管中加入4mLM9溶液， 搖勻后靜置10min，去上清，再次加入4mLM9溶液，搖勻后靜置10min，去上清。保持5士1只/50uL。 23'C室溫下，采用體視顯 微鏡對親代(P。)進行如下指標的測定壽命測定，孵化規(guī)模及世代時間測定； 身體大小測定，身體彎曲頻率測定，逆向運動檢測，嗅覺刺激測定。 a，壽命、孵化規(guī)模和世代時間測定
將秀麗線蟲置于NGM培養(yǎng)基上(平均每個培養(yǎng)基上有5個左右的L4期的線 蟲)，此時記為T。,培養(yǎng)皿在23'C培養(yǎng)，在孵化期，每隔1.5天就將成年秀麗線 蟲轉接到新的NGM培養(yǎng)基上；在第二天計數(shù)原培養(yǎng)基上孵化出的秀麗線蟲數(shù)。在 孵化期之后，每隔四天將成年秀麗線蟲轉移到新的培養(yǎng)基上。
如果反復的觸碰刺激其尾端而秀麗線蟲沒有反應，那么就認定其死亡，記為 T，，T,與T。之間的時間間隔即為秀麗線蟲的壽命。由于偶然因素導致的線蟲的損 失，比如線蟲爬離培養(yǎng)基或者在培養(yǎng)皿側壁干燥致死，不計入分析數(shù)據(jù)。
孵化規(guī)模，即每一只秀麗線蟲所產(chǎn)生的后代數(shù)目。世代時間，即從親代P。 的卵出現(xiàn)到子一代F,的卵出現(xiàn)的時間間隔，以及從子一代F,的卵出現(xiàn)到子二代 F2的卵出現(xiàn)的時間間隔，以及子二代F2的卵到其子代再次產(chǎn)卵之間的時間間隔。
重復10個培養(yǎng)皿以保證統(tǒng)計學可靠性。
b，嗅覺刺激對逆向運動的影響，同時進行身體大小、身體彎曲頻率、逆向 運動檢測
將秀麗線蟲置于沒有0P50 ￡ 的NGM培養(yǎng)基上，并且允許其自由爬行以 脫離黏附的0P50 ￡ co乃'。然后將這些秀麗線蟲轉移到新的無0P50 ￡ c^i的NGM 培養(yǎng)基上，在其適應環(huán)境之后(約1分鐘)，采用體視顯微鏡所帶的成像軟件對 秀麗線蟲進行3min的錄像。
通過錄像測定秀麗線蟲的身體大小、身體彎曲頻率、逆向運動檢測以及嗅覺 刺激。
秀麗線蟲的身體大小采用其身體平滑表面的面積來表征。 身體彎曲的定義為如果設定秀麗線蟲的運動方向為x軸方向，則其咽后部 球形部分在y軸方向上的運動方向的一次改變，即為一次身體彎曲。
逆向運動任何從前向后的運動的改變就計數(shù)為一次逆向運動；"歐米伽轉
向"也作為逆向運動的一種。"歐米伽轉向"指的是，線蟲的身體通過頭部向尾
14部的彎曲而完成180度的轉彎而使得其運動方向反向的轉向。5s內(nèi)沒有運動的 線蟲不作為分析對象(這樣的線蟲總是占極少數(shù)的)。
在線蟲經(jīng)過了 3min的逆向運動檢測之后，1 U L的特定氣味的物質被置于培 養(yǎng)皿的上蓋，上蓋隨后重新蓋在培養(yǎng)皿上(如果有氣味的物質為液體，則開蓋 3h，待上蓋干燥后再將上蓋蓋好)，再次進行3min的逆向運動檢測。
I，待測PPCPs對P。的子一代(F,)的毒性結果的測定
在對親代(P。)進行步驟H時，每一個濃度系列(共八孔)的剩余部分(四 孔)也停止對待測PPCPs的暴露。用移液槍將秀麗線蟲從96孔板中取出， 一個 濃度系列的秀麗線蟲置于一個有OP50 ￡ cW/生長的NGM培養(yǎng)基上，每一個暴露 時間的平板上的12個濃度對應著12個培養(yǎng)皿。重復步驟A，獲得親代(P。)不 同濃度組對應的"卵液"；重復步驟B，獲得子一代(F,)的"蟲液"，重復步驟 H,獲得"待測PPCPs對Fi的毒性結果(4h)"。
J，待測PPCPs對P。的子二代(F2)的毒性結果的測定
在對子一代(F。進行步驟H時，每一個濃度系列(共八孔)的剩余部分(四 孔)也停止對待測PPCPs的暴露。用移液槍將秀麗線蟲從96孔板中取出， 一個 濃度系列的秀麗線蟲置于一個有0P50 ￡ 生長的NGM培養(yǎng)基上，每一個暴露 時間的平板上的12個濃度對應著12個培養(yǎng)皿。重復步驟A，獲得子一代(FJ 不同濃度組對應的"卵液"；重復步驟B，獲得子二代(F2)的"蟲液"，重復步 驟H，獲得"待測PPCPs對F2的毒性結果(4h)"。
K，待測PPCPs暴露不同時間的世代毒性測定
將暴露時間修改為8h，重復步驟H、 I、 J，獲得"待測PPCPs對P。的毒性 結果(8h)"、"待測PPCPs對R的毒性結果(8h)"、"待測PPCPs對F2的毒性結 果(8h)"。
依照上述步驟，將暴露時間修改為12h、 16h、 20h、 24h，共獲得"待測PPCPs 對P。的毒性結果(12h)"、"待測PPCPs對R的毒性結果(12h)"、"待測PPCPs 對F2的毒性結果(12h)";"待測PPCPs對P。的毒性結果(16h)"、"待測PPCPs 對F,的毒性結果U6h)"、"待測PPCPs對F2的毒性結果(16h)";"待測PPCPs 對P。的毒性結果(20h)"、"待測PPCPs對R的毒性結果(20h)"、"待測PPCPs對F2的毒性結果(20h)";"待測PPCPs對P。的毒性結果(24h)"、"待測PPCPs 對F,的毒性結果(24h)"、"待測PPCPs對F2的毒性結果(24h)"。 L，世代毒性的評價
采用軟件Origin 7.5對數(shù)據(jù)進行顯著性分析將同一個暴露時間下獲得的 待測PPCPs對秀麗線蟲親代(P。)、子一代(F》和子二代(F2)的同一個指標的 三個毒性結果輸入數(shù)據(jù)列表，在statistics下打開anova的下拉按鈕中的 one-way anova，從候選列表中將"P。"與"F,的數(shù)據(jù)選擇，并將"顯著性參數(shù)" 設定為0. 05，進行計算。若計算結果顯示為"At the 0. 05 level, the population means are not significantly different.，，則說明所測PPCPs對親代與子一代 的該指標的毒性效果之間沒有顯著差異；若結果顯示為"At the 0. 05 level, the population means are significantly different."卯J說明所測PPCPs對親代 與子一代的該指標的毒性效果之間具有顯著差異。對"F,與"F2"之間的數(shù)據(jù) 進行相同的分析，就可以獲得所測PPCPs對子一代與子二代的毒性效果之間是否 具有顯著差異。結論若PPCPs的毒性效果在"P。與FZ，和"F,與F/'兩個比較 中均得到"顯著差異"的結果，說明所測PPCPs對該指標具有明確的世代毒性， 并且其毒性效果隨著世代增加而增強；若前者比較結果為"非顯著差異"而后者 比較結果為"顯著差異"，說明PPCPs對該指標具有世代毒性，但是其世代毒性 需要長期的作用才能夠顯現(xiàn)出來；若前者比較結果為"顯著差異"而后者比較結 果為"非顯著差異"或者兩個比較中均為"非顯著差異"，則說明所測PPCPs對 該指標不具有世代毒性。
對其它的指標通過相同的步驟進行"顯著性分析"，即可獲得所測PPCPs對 哪些指標具有世代毒性。
在不同的暴露時間下獲得的待測PPCPs對親代、子一代和子二代的同一個指 標的毒性效果的數(shù)據(jù)，采用同樣的"顯著性分析"的方法，可以用于進一步佐證 "PPCPs對秀麗線蟲該指標的毒性是否隨著暴露時間的增加而具有更強的世代 毒性"。
權利要求
1、用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品類物質的世代毒性的方法，包括A，卵液的制備將秀麗線蟲放在接種有OP50 E.coli的NGM固體培養(yǎng)基上，23℃培養(yǎng)三天后用M9溶液沖洗含有秀麗線蟲蟲體的NGM固體培養(yǎng)基得到蟲液，將蟲液轉移至離心管中，靜置30min，用移液槍移去上清液，按照蟲液clorox溶液＝1∶7體積比，將clorox溶液加入蟲液中，混合搖勻，反應20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對clorox溶液有抵抗能力的蟲卵，2500rpm離心3min，棄上清液，再加入M9溶液至離心前相同的刻度，搖勻，2500rpm離心3min，棄上清液，重復該操作兩次，然后向離心管內(nèi)加入M9溶液，搖勻，標記為卵液，待用；B，同步化蟲液的獲得將A步獲得的卵液200μL接種到依照傳統(tǒng)方法配置但并沒有接種OP50 E.coli的NGM固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1-2天至秀麗線蟲四次蛻皮，達到了生長狀態(tài)相對同步化后，用NGM培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)基表面，將含有秀麗線蟲的溶液轉移至已滅菌的離心管中；含有秀麗線蟲的溶液濃度很高時需要稀釋，直至每100μL溶液中有10±1只秀麗線蟲，標記為蟲液，待用；上述NGM培養(yǎng)液是按照NGM固體培養(yǎng)基的配方，但不使用瓊脂粉配置得到的，若NGM培養(yǎng)液能夠使待測PPCPs的澄清溶液變渾濁，則使用M9溶液代替本步驟的NGM培養(yǎng)液；C，制備用于測定半數(shù)致死濃度的PPCPs樣品先確定待測PPCPs的溶解性及溶劑，若PPCPs溶于水，則采用去離子水；若PPCPs不溶于水，則采用體積百分濃度為1％的二甲亞砜作為溶劑，在待測PPCPs的飽和溶液的濃度以下、根據(jù)等對數(shù)間距的原則配置十一個濃度梯度的PPCPs樣品，采用與待測PPCPs溶劑相同的溶液作為空白對照，得到不同濃度的PPCPs樣品十二組，每組八個平行，共計96個樣品；D，樣品與蟲液的混合將C步獲得的96個樣品加入96孔板中，每個孔內(nèi)的樣品量均為100μL，再向96個已經(jīng)有100μL樣品的孔中各加入B步得到的蟲液100μL；E，半數(shù)致死濃度的測定采用體視顯微鏡對D步的96孔板中的秀麗線蟲進行觀察，每4小時觀測一次，蟲體僵直則認定其死亡，記錄死亡數(shù)目，直至空白對照組的秀麗線蟲出現(xiàn)幼蟲/卵為止；以濃度對數(shù)為橫坐標，死亡率為縱坐標，采用直線內(nèi)插法獲得半數(shù)致死濃度，簡稱LC50；若所設定濃度梯度所產(chǎn)生的死亡率均小于50％，則保持待測PPCPs樣品空白對照組之外的最低濃度不變，適當增加所采用的等對數(shù)間距，設定較高的濃度梯度；若所設定的濃度梯度所產(chǎn)生的死亡率均大于50％，則保持待測PPCPs樣品的最高濃度不變，適當增加所采用的等對數(shù)間距，設定較低的濃度梯度；然后重復步驟A、B、D、E，直至獲得LC50，其特征是F，用于測定世代毒性的待測PPCPs樣品的制備在步驟E獲得的LC50以下，根據(jù)等對數(shù)間距的原則設定十一個濃度梯度，采用與待測PPCPs的溶劑相同的溶液作為空白對照，得到不同濃度的樣品十二組，每組設有8個平行樣品，共計96個樣品，待測；G，重復A步和B步，獲得同步化的每100μL溶液中有10±1只秀麗線蟲的蟲液，待用；H，待測PPCPs對親代的毒性結果的測定將步驟F獲得的96個樣品加入96孔板，加入量均為100μL；再向96個樣品中加入100μL由步驟G獲得的蟲液，暴露4h后，用移液槍移取十二組濃度中每一組濃度的八個平行樣品中的四個樣品，置于同一個15mL離心管中，再向離心管中加入4mLM9溶液，搖勻后靜置10min，去上清液，再次加入4mLM9溶液，搖勻后靜置10min，再去除上清液，再加入適量M9溶液，使秀麗線蟲保持5±1只/50μL，23℃室溫下，采用體視顯微鏡對親代進行如下指標的測定壽命，孵化規(guī)模及世代時間，身體大小，身體彎曲頻率，逆向運動，嗅覺刺激；其中，壽命、孵化規(guī)模和世代時間同時測定，嗅覺刺激、身體大小、身體彎曲頻率和逆向運動同時測定，最后，采用待測PPCPs的濃度對數(shù)作為橫坐標，采用上述指標測定結果作為縱坐標，獲得秀麗線蟲在不同的PPCPs濃度下暴露4h所受到的毒性結果，記錄為4h待測PPCPs對親代的毒性結果；I，待測PPCPs對子一代的毒性結果的測定將進行H步待測PPCPs對親代的毒性結果的測定時留下的每一個濃度系列的剩余四孔也停止對待測PPCPs的暴露，用移液槍將蟲液從96孔板中取出，一個濃度系列的親代置于同一個有OP50E.coli的NGM固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，因此進行同樣4h的暴露時間的12個濃度系列對應了12個培養(yǎng)皿，重復步驟A，獲得親代不同濃度組對應的卵液；重復步驟B，獲得子一代的蟲液，重復步驟H，獲得4h待測PPCPs對子一代的毒性結果；J，待測PPCPs對子二代的毒性結果的測定將進行H步子一代的毒性結果的測定時留下的每一個濃度系列的剩余四孔也停止對待測PPCPs的暴露，用移液槍將秀麗線蟲蟲液從96孔板中取出，一個濃度系列的秀麗線蟲置于一個有OP50 E.coli的NGM固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，于是進行同樣的4h的暴露時間的12個濃度系列對應了12個培養(yǎng)皿，然后重復步驟A，獲得子一代不同濃度組對應的卵液；重復步驟B，獲得子二代的蟲液，重復步驟H，獲得4h待測PPCPs對子二代的毒性結果；K，待測PPCPs暴露不同時間的世代毒性測定將暴露時間修改為8h，重復步驟H、I、J，獲得8h待測PPCPs對親代的毒性結果和待測PPCPs對子一代的毒性結果以及待測PPCPs對子二代的毒性結果；依照上述步驟，將暴露時間修改為12h、16h、20h、24h，共獲得12h待測PPCPs對親代、子一代和子二代的毒性結果；16h待測PPCPs對親代、子一代和子二代的毒性結果；20h待測PPCPs對親代、子一代和子二代的毒性結果；24h待測PPCPs對親代、子一代和子二代的毒性結果；L，世代毒性的評價采用軟件Origin 7.5對數(shù)據(jù)進行顯著性分析將同一個暴露時間下獲得的待測PPCPs對秀麗線蟲親代、子一代和子二代的同一個指標的三個毒性結果進行顯著性分析，分別將親代與子一代、子一代與子二代進行比較若兩個比較均得到顯著差異的結果，則說明PPCPs對該指標具有明確的世代毒性，并且其毒性效果隨著世代增加而增強；若前者結果為非顯著差異而后者結果為顯著差異，則說明PPCPs對該指標具有世代毒性，但其世代毒性需要較長的時間才能夠顯現(xiàn)出來；若前者結果為顯著差異而后者結果為非顯著差異，或者兩個比較中均為非顯著差異，則說明所測PPCPs對該指標不具有世代毒性；對其它的指標通過相同的步驟進行顯著性分析，即可獲得所測PPCPs對哪些指標具有世代毒性；在不同的暴露時間下獲得的待測PPCPs對親代、子一代和子二代的同一個指標的毒性效果的數(shù)據(jù)，采用同樣的顯著性分析的方法，用于進一步佐證PPCPs對秀麗線蟲該指標的毒性是否隨著暴露時間的增加而具有更強的世代毒性。
全文摘要
用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品的世代毒性的方法，涉及一種用秀麗線蟲對藥品與個人護理品類物質(PPCPs)的世代毒性測試方法。在已同步化的秀麗線蟲對PPCPs不同濃度梯度和暴露時間的染毒后，對親代(P₀)、子一代(F₁)和子二代(F₂)的秀麗線蟲的壽命、孵化規(guī)模、世代時間、身體大小、身體彎曲頻率、逆向運動以及嗅覺刺激等指標進行檢測，并對結果進行比較。這些指標從不同的側面表征了PPCPs的毒性效應，以此評價其世代毒性。本發(fā)明操作、存放方便，儀器少，在暴露劑量和暴露時間兩個層面上為真實環(huán)境中的PPCPs毒性的檢測與預測提供指導，也能為PPCPs的生產(chǎn)過程、突發(fā)事件處理的實效判斷、新型PPCPs的生態(tài)風險等提供快速的評價途徑。
文檔編號G01N33/00GK101451983SQ20081020770
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權日2008年12月25日
發(fā)明者于振洋, 蕾 姜, 尹大強, 挺 徐, 胡霞林 申請人:同濟大學