專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高免疫檢測(cè)靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種提高免疫分析檢測(cè)靈敏度的方法。
背景技術(shù)：
免疫分析法(immunoassay，ΙΑ)是基于抗原和抗體特征性反應(yīng)的一種技術(shù)。由于 免疫分析試劑在免疫反應(yīng)中所體現(xiàn)出的獨(dú)特的選擇性和極低的檢測(cè)限，使這種分析手段在 臨床、生物制藥和環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。生物素(biotin) —親合素(avidin)是免疫分析技術(shù)中的重要工具，主要是因?yàn)?其有下述幾個(gè)特點(diǎn)①親和素對(duì)生物素的親和力極高，為抗原抗體反應(yīng)的百萬(wàn)倍，具高度特異性和穩(wěn) 定性。②生物素分子小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，極易與抗體、核酸、多糖及多種酶等生物大分子以共 價(jià)鍵穩(wěn)定結(jié)合，同時(shí)對(duì)結(jié)合物的原始生物活性無(wú)不良影響。③親和素性質(zhì)極為穩(wěn)定，每分子可結(jié)合4個(gè)生物素衍生物，其作為生物素化分子 與信號(hào)物之間的橋，起到信號(hào)放大作用，從而提高檢測(cè)的靈敏度。由生物素-親和素反應(yīng)建立信號(hào)放大系統(tǒng)，一般有兩種方法一是用生物素標(biāo)記 抗體，與固相抗原結(jié)合后，再加入親和素_酶結(jié)合物，從而使測(cè)定反應(yīng)放大；二是使用生物 素-抗體、游離親和素和生物素-酶結(jié)合物三種試劑，于固相抗原中加入試劑的順序?yàn)樯?素_抗體、親和素和生物素_酶。上述方法之所以可行，在于親和素對(duì)生物素的4價(jià)結(jié)合能力，上述多步模 式也可通過(guò)預(yù)先制成可溶的親和素-生物素化酶復(fù)合物而得到簡(jiǎn)化，亦即所謂的 ABC (avidin-biotin-complex)方法(參見(jiàn)US專(zhuān)利4684609)，這種生物素-親和素放大系 統(tǒng)可使常規(guī)的酶免疫分析法(EIA)或熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay, FIA) 的檢測(cè)靈敏度提高2 100倍。然而，目前現(xiàn)有的這些檢測(cè)方法還不能令人滿意地滿足臨 床上檢測(cè)人血清中極低含量生物分子的需求。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)進(jìn)一步提高免疫檢測(cè)靈敏度的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種進(jìn)一步提高免疫檢測(cè)靈敏度的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種生物素_親和素的復(fù)合物，所述復(fù)合物包括(a)固相載體；(b)根序列，所述的根序列是固定于所述固相載體表面上的寡核苷酸單鏈；(c)弓I發(fā)序列，所述的弓I發(fā)序列是互補(bǔ)結(jié)合于所述根序列的、并且在一端標(biāo)記有生 物素的寡核苷酸單鏈；(d)第η級(jí)親和素，其中η為1_20的正整數(shù)；并且當(dāng)η為1時(shí)，則第1級(jí)親和素結(jié)
4合于所述引發(fā)序列上的生物素；和(e)生長(zhǎng)序列，所述的生長(zhǎng)序列是兩端標(biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，所述生長(zhǎng)序 列中位于一端的生物素與第η級(jí)親和素結(jié)合，而位于另一端的生物素與第η+1級(jí)親和素結(jié) 合或處于未結(jié)合狀態(tài)，其中η為1-20的正整數(shù)。在另一優(yōu)選例中，所述的固相載體是微球；更佳地，所述的固相載體為磁性微球， 例如微米級(jí)微球、納米顆粒、或熒光微球。在另一優(yōu)選例中，η為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，或 19。在另一優(yōu)選例中，所述的根序列的長(zhǎng)度為20-60個(gè)堿基，更佳地為25-50個(gè)堿基。在另一優(yōu)選例中，所述的引發(fā)序列的長(zhǎng)度為10-50個(gè)堿基，更佳地為15-40個(gè)堿基。在另一優(yōu)選例中，所述引發(fā)序列與根序列的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度為20_40bp，更佳地 為 20-30bp。在另一優(yōu)選例中，所述的生長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度為8-30個(gè)堿基，更佳地為10-20個(gè)堿基。在另一優(yōu)選例中，所述的生長(zhǎng)序列是長(zhǎng)度為8-20個(gè)堿基的polyT。在本發(fā)明第二方面，提供了一種生物素-親和素的復(fù)合物，所述復(fù)合物包括(i)引發(fā)序列，所述的引發(fā)序列是在一端標(biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈；(ii)第η級(jí)親和素，其中η為1_20的正整數(shù)；并且當(dāng)η為1時(shí)，則第1級(jí)親和素 結(jié)合于所述引發(fā)序列上的生物素；和(iii)生長(zhǎng)序列，所述的生長(zhǎng)序列是兩端標(biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，所述生長(zhǎng) 序列中位于一端的生物素與第η級(jí)親和素結(jié)合，而位于另一端的生物素與第η+1級(jí)親和素 結(jié)合或處于未結(jié)合狀態(tài)，其中η為1-20的正整數(shù)。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種免疫檢測(cè)分析方法，在本發(fā)明第一或第二方面 中所述的生物素_親和素的復(fù)合物存在下進(jìn)行免疫分析檢測(cè)。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種在本發(fā)明第一或第二方面中所述的生物素-親 和素的復(fù)合物的用途，它用于制備提高免疫檢測(cè)靈敏度的靈敏度增強(qiáng)劑。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備的本發(fā)明所述生物素-親和素的復(fù)合物的 方法，包括步驟(a)將用作根序列的第一寡核苷酸單鏈固定于固相載體，(b)將用作引發(fā)序列的第二寡核苷酸單鏈與所述根序列接觸，所述的第二寡核苷 酸單鏈?zhǔn)窃谝欢藰?biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，從而形成相對(duì)穩(wěn)定的“根序列_引發(fā)序列” 雜合體，其中所述的引發(fā)序列互補(bǔ)結(jié)合于所述的根序列；隨后去除過(guò)量的引發(fā)序列；(c)將親和素與所述引發(fā)序列上的生物素接觸并結(jié)合；隨后去除過(guò)量的、未結(jié)合 的親和素，從而獲得第1級(jí)生物素_親和素的復(fù)合物；或者所述步驟(c)還包括重復(fù)以下步驟(cl)-(c2)共1至n-1次，從而獲得第η 級(jí)生物素_親和素的復(fù)合物，其中，η為2-20的正整數(shù)(Cl)將用作生長(zhǎng)序列的第三寡核苷酸單鏈與上一步驟獲得的生物素_親和素的 復(fù)合物接觸，其中所述第三寡核苷酸單鏈?zhǔn)莾啥藰?biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，從而使得 所述生長(zhǎng)序列中位于一端的生物素與上一步驟中形成的結(jié)合狀態(tài)的親和素形成結(jié)合；隨后 去除過(guò)量的、未結(jié)合的生長(zhǎng)序列；
(c2)將親和素與步驟(Cl)中所述生長(zhǎng)序列另一端的生物素接觸并結(jié)合；隨后去 除過(guò)量的、未結(jié)合的親和素。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟將形成的第η級(jí)生物素_親和素復(fù)合物與結(jié)合于固 相載體的根序列解離開(kāi)，從而獲得不含固相載體和根序列的生物素_親和素復(fù)合物。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，本申請(qǐng)上述以及下述的各技術(shù)特征可以各種方式進(jìn)行 組合，以構(gòu)成各種優(yōu)選例。例如，根序列的長(zhǎng)度一般范圍的下限20個(gè)堿基可以與優(yōu)選范圍 的上限50個(gè)堿基進(jìn)行組合，從而構(gòu)成范圍20-50個(gè)堿基。


圖1至圖5顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中生物素_親和素η級(jí)復(fù)合物的制備示意圖。圖6顯示了常規(guī)的免疫分析法產(chǎn)生信號(hào)的機(jī)制。圖7顯示了在本發(fā)明的免疫分析法中“生物素_親和素η級(jí)復(fù)合物”產(chǎn)生信號(hào)的 機(jī)制。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，基于生物素/親和素反應(yīng)的特性，首次提供了 一種新的生物素_親和素復(fù)合物的生產(chǎn)方法。利用該復(fù)合物，可進(jìn)一步顯著提高免疫檢測(cè) 靈敏度，通?？商岣?000倍至10000倍或更多(理論上，對(duì)免疫反應(yīng)信號(hào)的放大倍數(shù)可達(dá) IO6或更高)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法使免疫檢測(cè)靈敏度提高了至少1-2個(gè)數(shù)量級(jí)， 從而可以較好地滿足臨床上檢測(cè)人血清中極低含量生物分子的需求。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“根序列”指可通過(guò)例如共價(jià)鍵固定于固相載體的寡核苷酸單 鏈。此外，該術(shù)語(yǔ)還包括用于形成根序列或用作根序列的寡核苷酸單鏈。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“弓I發(fā)序列，，指互補(bǔ)結(jié)合于所述根序列的、并且在一端標(biāo)記有生 物素的寡核苷酸單鏈。此外，該術(shù)語(yǔ)還包括用于形成引發(fā)序列或用作引發(fā)序列的寡核苷酸 單鏈。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)序列，，指兩端標(biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，所述生長(zhǎng)序 列中位于一端的生物素與第η級(jí)親和素結(jié)合，而位于另一端的生物素與第η+1級(jí)親和素結(jié) 合或處于未結(jié)合狀態(tài)，其中η為1-20的正整數(shù)。此外，該術(shù)語(yǔ)還包括用作引發(fā)序列的寡核 苷酸單鏈。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“親和素”包括親合素(avidin)和鏈親和素(str印tavidin)。 該術(shù)語(yǔ)還包括野生型、突變型以及衍生型的親和素。在本發(fā)明的復(fù)合物中，以引發(fā)序列上的生物素為起點(diǎn)，可一層一層地通過(guò)“生物 素_親和素_生長(zhǎng)序列”方式連接的大的η級(jí)復(fù)合物。為了便于理解本發(fā)明，本發(fā)明人提供了以下基本原理。然而，應(yīng)理解，本發(fā)明的保 護(hù)范圍并不受限于本發(fā)明的基本原理。參見(jiàn)附圖1 5。將根序列固定于固相載體，在適宜的條件下引發(fā)序列與根序列形 成相對(duì)穩(wěn)定的雜合體(圖1)；去除過(guò)量的引發(fā)序列后，加入親和素與固相載體上引發(fā)序列 的生物素穩(wěn)定結(jié)合(圖2)；去除過(guò)量的、未結(jié)合的親和素，加入生長(zhǎng)序列，在固相載體上形 成“生物素_親和素1級(jí)復(fù)合物”，單個(gè)復(fù)合物的生物素的數(shù)量為3乂圖3)；去除過(guò)量的生長(zhǎng)序列，加入親和素，與固相載體上生長(zhǎng)序列的生物素穩(wěn)定結(jié)合(圖4)；去除過(guò)量的、未結(jié) 合的親和素，加入生長(zhǎng)序列，在固相載體上形成“生物素_親和素2級(jí)復(fù)合物”，單個(gè)復(fù)合物 的生物素?cái)?shù)為32 (圖5)，依此類(lèi)推，當(dāng)生成“生物素_親和素η級(jí)復(fù)合物”時(shí)，單個(gè)復(fù)合物的 生物素?cái)?shù)為3η，此時(shí)適當(dāng)?shù)馗淖內(nèi)芤簵l件，使引發(fā)序列脫離根序列，經(jīng)過(guò)分離得到處于穩(wěn)定 的溶液狀態(tài)下的“生物素_親和素η級(jí)復(fù)合物”，用于免疫反應(yīng)的信號(hào)放大，提高檢測(cè)的靈敏 度。參見(jiàn)圖6，圖中顯示了常規(guī)的免疫反應(yīng)產(chǎn)生信號(hào)的機(jī)制。捕獲抗體經(jīng)共價(jià)鍵固定于 固相載體，和相應(yīng)的抗原反應(yīng)后再與標(biāo)記了生物素的第二抗體反應(yīng)，夾心后再與連接了酶 或熒光染料的親和素穩(wěn)定結(jié)合，酶催化底物顯色或直接檢測(cè)熒光強(qiáng)度對(duì)抗原進(jìn)行定量，信 號(hào)強(qiáng)度(靈敏度)取決于經(jīng)一系列反應(yīng)后最終結(jié)合酶的量或熒光染料的量，圖示中第二抗 體標(biāo)記的生物素與最終的酶或熒光染料的量的比例關(guān)系為1 1。參見(jiàn)圖7，圖中顯示了本發(fā)明方法中，免疫反應(yīng)應(yīng)用了 “生物素_親和素η級(jí)復(fù)合 物”后產(chǎn)生信號(hào)的機(jī)制形成夾心的步驟與圖6完全一致，夾心后經(jīng)連接有酶或熒光染料的親和素將“生 物素_親和素η級(jí)復(fù)合物橋連于第二抗體，這樣圖示中第二抗體標(biāo)記的生物素與最終的酶 或熒光染料的量的比例關(guān)系約為1 3η，相應(yīng)地，靈敏度約為原來(lái)的3η倍。(1)生物素-親和素η級(jí)復(fù)合物的制備1. 1根序列固定于固相載體合成5’端修飾的一段寡核苷酸序列(如-ΝΗ2、生物素、-SH修飾等)，使其與完全 匹配的互補(bǔ)鏈形成的雜合體相對(duì)穩(wěn)定(如Tm在50 70°C之間)；選擇合適的商業(yè)化的表面經(jīng)相應(yīng)修飾(如羧基/親和素化的聚苯乙烯微球、羧基 /親和素化的磁性微球等)的固相載體，按其使用說(shuō)明或有關(guān)文獻(xiàn)將跟序列穩(wěn)定地固定于 固相載體；通過(guò)離心或施加磁場(chǎng)將固相載體與過(guò)量的游離的跟序列分離，固相載體經(jīng)洗滌后 存于緩沖液中備用。1. 2引發(fā)序列與根序列形成相對(duì)穩(wěn)定的雜合體合成5’端經(jīng)生物素修飾的一段寡核苷酸，其序列與跟序列完全互補(bǔ)；在適宜離子強(qiáng)度和溫度的緩沖液中，引發(fā)序列與固相載體表面的跟序列雜交1小 時(shí)后形成相對(duì)穩(wěn)定的雜合體；通過(guò)離心或施加磁場(chǎng)將固相載體與過(guò)量的游離的引發(fā)序列分離，固相載體經(jīng)洗滌 后存于緩沖液中備用。1. 3連接親和素在含有固相載體的緩沖液中加入游離的親和素溶液適量，靜置30min，固相載體表 面引發(fā)序列的生物素與親和素穩(wěn)定地結(jié)合；通過(guò)離心或施加磁場(chǎng)將固相載體與過(guò)量的游離的親和素分離，固相載體經(jīng)洗滌后 存于緩沖液中備用。1. 4生物素_親和素1級(jí)復(fù)合物的生成合成3’、5’均經(jīng)生物素修飾的一段寡核苷酸(生長(zhǎng)序列)，堿基數(shù)10 20個(gè)；在含有固相載體的緩沖液中加入游離的生長(zhǎng)序列溶液適量，生長(zhǎng)序列一端的生物素與固相載體表面的親和素穩(wěn)定地結(jié)合；通過(guò)離心或施加磁場(chǎng)將固相載體與過(guò)量的游離的生長(zhǎng)序列分離，固相載體經(jīng)洗滌 后存于緩沖液中備用；將含有固相載體緩沖液的溫度升高到根序列與引發(fā)序列雜合體的Tm以上，使引 發(fā)序列與根序列解離(也可采用改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度或酸堿度等方法)，脫離固相載體，在 保持該溫度的條件下進(jìn)行離心或施加磁場(chǎng)，吸取上清液，得到生物素_親和素1級(jí)復(fù)合物。......如此反復(fù)，得到固相載體表面“長(zhǎng)出”的生物素_親和素η級(jí)復(fù)合物。(2)生物素-親和素η級(jí)復(fù)合物用于免疫分析法的信號(hào)放大2. 1捕獲抗體固定于固相載體(以羧基化的聚苯乙烯微球?yàn)槔?針對(duì)某種抗原Ag的捕獲抗體Gnti1Ag)與羧基化的聚苯乙烯微球(Beads)共價(jià) 交聯(lián)的詳細(xì)操作程序請(qǐng)登錄Luminex公司網(wǎng)站:www. luminexcorp. com上的技術(shù)支持，得到 Beads與捕獲抗體的耦聯(lián)物antiiAg-Beads，為A液，同時(shí)記錄與Beads共價(jià)交聯(lián)加入一抗 的質(zhì)量為Ml。2. 2第二抗體的生物素標(biāo)記取質(zhì)量為Ml經(jīng)透析純化后的針對(duì)Ag的第二抗體，加入生物素的二甲基亞砜 (DMSO)溶液，避光反應(yīng)，透析去除未反應(yīng)的生物素，保存?zhèn)溆谩?. 3熒光染料標(biāo)記第二抗體取生物素標(biāo)記的第二抗體，加入親和素標(biāo)記的熒光染料，使生物素與親和素結(jié)合， 生成第二抗體_熒光染料，為C液。2. 4抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制用Ag的標(biāo)準(zhǔn)品配制一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，為B液。
2. 5免疫反應(yīng)及信號(hào)檢測(cè)將A、B、C液體混勻，37°C反應(yīng)30min，離心洗滌后得到圖6所示的復(fù)合物緩沖液 (此時(shí)可按常規(guī)做法檢測(cè)熒光信號(hào))；加入生物素-親和素η級(jí)復(fù)合物，使生物素與圖6固相載體上的親和素連接，離心 洗滌后再加入親和素標(biāo)記的熒光染料，離心洗滌后得到圖7所示的復(fù)合物后即可檢測(cè)經(jīng)放 大的熒光信號(hào)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)可有效提高免疫檢測(cè)的靈敏度。(b)基本上不改變也在不增加原來(lái)的免疫檢測(cè)試驗(yàn)操作程序。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1生物素-親和素1級(jí)復(fù)合物用于甲胎蛋白抗原免疫分析檢測(cè)1、生物素_親和素1級(jí)復(fù)合物的制備1. 1根序列固定于羧基修飾的磁顆粒0092]1. 1. 1 原料
0093]根序列5，NH2-(T15)GACCAATGCATGGTCCAGAC3，(SEQID NO 1)
0094]粒徑為1 μ m表面羧基化的磁微球；
0095]EDC (1-乙基-3- (3- 二甲胺基丙基)碳二亞胺)；
0096]
0097]
0098]
0099]
0100] 0101] 0102]
0103]
蕩器混勻
0104]
0105]
0106]
0107]
0108]
0109]
勻；
0110] 0111]
昆勻； 0112]
0113]
0114]
MES (嗎啉乙磺酸) 1. 1. 2操作步驟
01.將根序列寡核苷酸用雙蒸水溶解，濃度為0.OlmM ；
02.用振蕩器將磁微球混合均勻；
03.取50μ 1 (約6. 0 X IO6磁微球)，放入潔凈的Ep管中；
04.施加磁場(chǎng)沉淀磁微球，小心棄取上清液；
05.取消磁場(chǎng)，加入100μ 1雙蒸水，充分振蕩懸浮磁微球，施加磁場(chǎng)沉淀磁微球；
06.棄去上清液，取消磁場(chǎng)，用50μ 1 0. IM MES (ρΗ 4. 5)重新懸浮磁微球，并用振
07.取10μ 1根序列溶液加到上步驟中的磁微球懸液中，用振蕩器混勻；
08.按10mg/mL新鮮配制EDC溶液；
09.取2.5μ 1上步驟的EDC溶液加入磁微球懸液中，用振蕩器混勻；
10.避光，37°C靜置30分鐘；
11.施加磁場(chǎng)沉淀磁微球；
12.棄去上清液，取消磁場(chǎng)，用LOmL0. 1% SDS重新懸浮磁微球，并用振蕩器混
13.施加磁場(chǎng)沉淀磁微球；
14.棄去上清液，取消磁場(chǎng)，用100μ 1 TE (ρΗ 8.0)重新懸浮磁微球，并用振蕩器
15.將固定了根序列的磁微球避光保存在2-10°C環(huán)境中, 1. 2引發(fā)序列與根序列形成相對(duì)穩(wěn)定的雜合體 1. 2. 1原料
0115]引發(fā)序列3，CTGGTTACGTACCAGGTCTG(T10)-生物素5，(或表示為 5，-生物 素-tttttttttt gtctggaccatgcattggtc-3，，SEQ ID NO 2)；
0116]固定了根序列的磁微球混懸液。
0117]1.2. 2操作步驟
0118]01.將引發(fā)序列用TE (ρΗ 8.0)溶解，濃度為0. OlmM ；
0119]02.用振蕩器將磁微球混懸液混合均勻；
0120]03.取10 μ 1引發(fā)序列溶液加入50 μ 1磁微球混懸液中，混勻后室溫放置30min ；
0121]04.施加磁場(chǎng)，棄去上清液；
0122]05.取消磁場(chǎng)，加入Iml TE緩沖液洗滌磁微球；
0123]06.施加磁場(chǎng)，棄去上清液，反復(fù)幾次得到如圖1復(fù)合物的TE混懸液ΙΟΟμ 1。
0124]1.3連接親和素
0125]1.3. 1 原料
0126]市售親和素；
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步驟1. 2中制備復(fù)合物(圖1)的TE混懸液。1.3. 2操作步驟01.取10 μ 1市售親和素溶液加入圖1復(fù)合物的100 μ 1 TE混懸液中，混合均勻， 室溫靜置30min ；02.施加磁場(chǎng)，沉淀磁微球，棄去上清液；03.取消磁場(chǎng)，加入Iml TE緩沖液洗滌磁微球；04.施加磁場(chǎng)，棄去上清液，反復(fù)幾次得到如圖2復(fù)合物的TE混懸液100μ 1。1. 4生物素-親和素1級(jí)復(fù)合物的生成1.4. 1 原料生長(zhǎng)序列3’生物素-ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ-生物素 5’ (SEQ ID NO 3)；圖2復(fù)合物的TE混懸液。1.4. 2操作步驟01.將生長(zhǎng)序列用TE緩沖液配制成終濃度為10 μ M ；02.取10 μ 1生長(zhǎng)序列溶液加入圖2復(fù)合物的TE混懸液100 μ 1中，混合均勻，室 溫靜置30min ；03.施加磁場(chǎng)，沉淀磁微球，棄去上清液；04.取消磁場(chǎng)，加入Iml TE緩沖液洗滌磁微球；05.施加磁場(chǎng)，棄去上清液，反復(fù)幾次得到如圖3復(fù)合物的TE混懸液100 μ 1 ；06.施加磁場(chǎng)，沉淀磁微球，棄去上清液；07.取消磁場(chǎng)，加入100 μ 1純水，混合均勻，提高溫度至50°C，靜置5min ；08.施加磁場(chǎng)，沉淀磁微球，吸取上清液，得到生物素-親和素1級(jí)復(fù)合物，2_8°C保 存?zhèn)溆谩?、生物素_親和素1級(jí)復(fù)合物用于免疫分析法的信號(hào)放大此處以Luminex流式熒光法檢測(cè)甲胎蛋白抗原為例說(shuō)明本專(zhuān)利放大檢測(cè)信號(hào)提 高靈敏度的有效性。根據(jù)基本原理的闡述，生物素-親和素1級(jí)復(fù)合物用于免疫分析，對(duì)信號(hào)的放大倍 數(shù)理論上應(yīng)是常規(guī)信號(hào)檢測(cè)方法的3倍，為此用2種方法分別平行檢測(cè)同樣濃度的甲胎蛋 白抗原5次，求各自的平均數(shù)，觀察2個(gè)平均數(shù)的比值是否接近于3。2. 1常規(guī)方法檢測(cè)甲胎蛋白抗原2. 1.1 原料市售“甲胎蛋白定量檢測(cè)試劑盒(流式熒光免疫法)”。2. 1. 2操作(反應(yīng)原理如圖6所示)01.將試劑盒中16ng/ml的校準(zhǔn)品復(fù)溶；02.分別吸取5次，每次20 μ 1，置于5個(gè)EP管中；03.按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作，獲取這5個(gè)平行樣的熒光信號(hào)，結(jié)果見(jiàn)下表表1 :16ng/ml的校準(zhǔn)品的熒光信號(hào)值 2. 2生物素_親和素1級(jí)復(fù)合物配合常規(guī)方法檢測(cè)甲胎蛋白抗原2. 2.1 原料使用上述同一試劑盒；生物素-親和素1級(jí)復(fù)合物純水溶液。2. 2. 2操作(反應(yīng)原理如圖7所示)01.分別吸取上述復(fù)溶的同一校準(zhǔn)品溶液5次，每次20 μ 1，置于5個(gè)EP管中；02.按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作至反應(yīng)結(jié)束，不要上機(jī)檢測(cè)熒光信號(hào)；03.將5個(gè)EP管離心，棄去上清液；04.用試劑盒提供的反應(yīng)緩沖液配合離心操作洗滌如圖6所示的復(fù)合物2次后，加 入反應(yīng)緩沖液100 μ 1，振蕩，使復(fù)合物懸??；05.復(fù)合物懸浮液中加入10 μ 1生物素-親和素1級(jí)復(fù)合物溶液，混合均勻，37°C 靜置30min ；06.重復(fù) “03，04” 的操作;07.加入標(biāo)記了藻紅蛋白(PE)的鏈親和素，混合均勻，37°C靜置30min，得到如圖 7所示的復(fù)合物；08.上機(jī)檢測(cè)熒光信號(hào)，結(jié)果見(jiàn)下表表2 生物素-親和素1級(jí)復(fù)合物配合常規(guī)方法檢測(cè)16ng/ml的校準(zhǔn)品的熒光信 號(hào)值 2種方法熒光信號(hào)的比值約為3. 82，這提示對(duì)于1個(gè)反應(yīng)單元(圖6、7所示)， 常規(guī)方法下只有1個(gè)熒光染料分子報(bào)告信號(hào)，而使用了生物素-親和素1級(jí)復(fù)合物后，加原 來(lái)的1個(gè)共有4個(gè)熒光染料分子報(bào)告信號(hào)，所以比值應(yīng)接近4，因此本專(zhuān)利方法能夠有效放 大免疫分析方法的信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。實(shí)施例2 生物素_親和素8級(jí)復(fù)合物用于甲胎蛋白抗原免疫分析檢測(cè)1、生物素_親和素8級(jí)復(fù)合物的制備參照實(shí)施例1中生物素-親和素1級(jí)復(fù)合物的制備方法和附圖1-5，增加循環(huán)反應(yīng) 的次數(shù)得到生物素_親和素8級(jí)復(fù)合物溶液。2、生物素_親和素8級(jí)復(fù)合物用于免疫分析法的信號(hào)放大仍以Luminex流式熒光法檢測(cè)甲胎蛋白抗原為例說(shuō)明本專(zhuān)利放大檢測(cè)信號(hào)提高 靈敏度的有效性，本實(shí)施例仍以實(shí)施例1中16ng/ml的校準(zhǔn)品為樣品。
根據(jù)基本原理的闡述，生物素_親和素8級(jí)復(fù)合物用于免疫分析，對(duì)信號(hào)的放大倍 數(shù)理論上應(yīng)是常規(guī)信號(hào)檢測(cè)方法的38倍，即6561倍。為此用常規(guī)方法平行檢測(cè)16ng/ml的甲胎蛋白校準(zhǔn)品5次，求熒光信號(hào)的平均數(shù)； 將16ng/ml的甲胎蛋白校準(zhǔn)品用試劑盒提供的反應(yīng)緩沖液稀釋1000倍后(即16pg/ml)， 再用生物素_親和素8級(jí)復(fù)合物配合常規(guī)方法，平行檢測(cè)16pg/ml的甲胎蛋白校準(zhǔn)品5次， 求熒光信號(hào)的平均數(shù)。原料、操作步驟與實(shí)施例1中的相應(yīng)部分完全一致，結(jié)果見(jiàn)表3、4。表3 常規(guī)方法檢測(cè)16ng/ml的校準(zhǔn)品的熒光信號(hào)值 表4 生物素-親和素8級(jí)復(fù)合物配合常規(guī)方法檢測(cè)16pg/ml的校準(zhǔn)品的熒光信
號(hào)值 2種方法熒光信號(hào)平均值的比值約為2. 4，因后者測(cè)的樣本的濃度為前者的 1/1000，所以將2. 4X1000 = 2400，雖與理論值有較大的差距，但還是大幅提高的檢測(cè)的靈敏度。實(shí)施例3 生物素_親和素8級(jí)復(fù)合物用于甲胎蛋白抗原免疫分析檢測(cè)重復(fù)實(shí)施例1和2，不同點(diǎn)在于，制備生物素_親和素2級(jí)復(fù)合物、生物素_親和 素3級(jí)復(fù)合物、生物素-親和素4級(jí)復(fù)合物、生物素-親和素5級(jí)復(fù)合物、生物素-親和素 6級(jí)復(fù)合物、和生物素_親和素7級(jí)復(fù)合物。并測(cè)試各級(jí)復(fù)合物的檢測(cè)靈敏度。結(jié)果如表5所示。表5各級(jí)復(fù)合物的檢測(cè)靈敏度
12
上述結(jié)果表明，本發(fā)明的2級(jí)復(fù)合物可以提高靈敏度約15倍，而4級(jí)復(fù)合物可以 提高靈敏度約100倍，而6級(jí)復(fù)合物可以提高靈敏度約1000倍。隨著η級(jí)數(shù)的增加，雖與 理論值有較大的差距，但仍可大幅提高的檢測(cè)的靈敏度。實(shí)施例4-5 不同序列長(zhǎng)度的根序列重復(fù)實(shí)施例1和2，制備η = 4的4級(jí)復(fù)合物。不同點(diǎn)在于用5’ NH2-(T13) GACCAATGCATGGTCCAGA3，(SEQ ID NO 4)或 5，NH2-(T2tl) GACCAATGCATGGTCCAGAC3，(SEQ ID NO 5)分別替換SEQ ID NO 1所示的根序列。測(cè)試結(jié)果表明，實(shí)施例4和5的二種4級(jí)復(fù)合物可以提高靈敏度約100倍和105倍。實(shí)施例6-7 不同序列長(zhǎng)度的引發(fā)序列重復(fù)實(shí)施例1和2，制備η = 3的3級(jí)復(fù)合物。不同點(diǎn)在于用5’-生物 素-ttttttttt gtctggaccatgcattggt-3，(SEQ ID NO 6)或 5，-生物素-tttttttttttttt gtctggaccatgcattggtc-3，(SEQ ID NO 7)分別替換 SEQ IDNO :2 所示的引發(fā)序列。測(cè)試結(jié)果表明，實(shí)施例6和7的二種3級(jí)復(fù)合物可以提高靈敏度約38倍和42倍。實(shí)施例8 不同序列長(zhǎng)度的生長(zhǎng)序列重復(fù)實(shí)施例1和2，制備η = 4的4級(jí)復(fù)合物。不同點(diǎn)在于用tttttttttttt (SEQ ID NO 8)替換SEQ ID NO 3所示的生長(zhǎng)序列。測(cè)試結(jié)果表明，所制備的4級(jí)復(fù)合物可以提高靈敏度約100倍。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表<110>上海透景生命科技有限公司<120> 一種提高免疫檢測(cè)靈敏度的方法<130>088288 <160>8
<170>PatentIn version 3.2 <210>1 <211>35 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>根序列 <400>1
tttttttttt tttttgacca atgcatggtc cagac35
<210>2 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>引發(fā)序列 <400>2
tttttttttt gtctggacca tgcattggtc30
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>生長(zhǎng)序列 <400>3
tttttttttt ttttt15
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>根序列 <400>4
tttttttttt tttgaccaat gcatggtcca ga32
10
CN
39
45
[0207 [0208 [0209 [0210 [0211 [0212 [0213 [0214 [0215 [0216 [0217 [0218 [0219 [0220 [0221 [0222 [0223 [0224 [0225 [0226 [0227 [0228 [0229 [0230 [0231 [0232 [0233 [0234 [0235 [0236 [0237 [023 [02 [02 [02 [02 [02 [02 [02
14<210>5 <211>40 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>根序列 <400>5
tttttttttt tttttttttt gaccaatgca tggtccagac40
<210>6 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>引發(fā)序列 <400>6
tttttttttg tctggaccat gcattggt28
<210>7
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>引發(fā)序列 <400>7
tttttttttt ttttgtctgg accatgcatt ggtc34
<210>8
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>生長(zhǎng)序列 <400>8
tttttttttt tt 12
O
CN
7
8
[02' [02' [02' [02' [0250 [0251 [0252 [0253 [0254 [0255 [0256 [0257 [0258 [0259 [0260 [0261 [0262 [0263 [0264 [0265 [0266 [0267 [0268 [0269 [0270 [0271 [0272 [0273 [0274 [0275 [0276 [0277 [0278 [0279 [0280 [0
73
74
75 276
77
278
27
280
28權(quán)利要求
一種生物素 親和素的復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物包括(a)固相載體；(b)根序列，所述的根序列是固定于所述固相載體表面上的寡核苷酸單鏈；(c)引發(fā)序列，所述的引發(fā)序列是互補(bǔ)結(jié)合于所述根序列的、并且在一端標(biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈；(d)第n級(jí)親和素，其中n為1 20的正整數(shù)；并且當(dāng)n為1時(shí)，則第1級(jí)親和素結(jié)合于所述引發(fā)序列上的生物素；和(e)生長(zhǎng)序列，所述的生長(zhǎng)序列是兩端標(biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，所述生長(zhǎng)序列中位于一端的生物素與第n級(jí)親和素結(jié)合，而位于另一端的生物素與第n+1級(jí)親和素結(jié)合或處于未結(jié)合狀態(tài)，其中n為1 20的正整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其特征在于，所述的固相載體是微球，更佳地為磁性微球。
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其特征在于，η為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13， 14，15，16，17，18，或19。
4.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其特征在于，所述的根序列的長(zhǎng)度為20-60個(gè)堿基，更 佳地為25-50個(gè)堿基。
5.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其特征在于，所述的引發(fā)序列的長(zhǎng)度為10-50個(gè)堿基， 更佳地為15-40個(gè)堿基。
6.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其特征在于，所述的生長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度為8-30個(gè)堿基，更 佳地為10-20個(gè)堿基。
7.—種生物素-親和素的復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物包括(i)引發(fā)序列，所述的引發(fā)序列是在一端標(biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈；( )第η級(jí)親和素，其中η為1_20的正整數(shù)；并且當(dāng)η為1時(shí)，則第1級(jí)親和素結(jié)合 于所述引發(fā)序列上的生物素；和(iii)生長(zhǎng)序列，所述的生長(zhǎng)序列是兩端標(biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，所述生長(zhǎng)序列 中位于一端的生物素與第η級(jí)親和素結(jié)合，而位于另一端的生物素與第η+1級(jí)親和素結(jié)合 或處于未結(jié)合狀態(tài)，其中η為1-20的正整數(shù)。
8.一種免疫檢測(cè)分析方法，其特征在于，在權(quán)利要求1或7所述的生物素-親和素的復(fù) 合物存在下進(jìn)行免疫分析檢測(cè)。
9.一種權(quán)利要求1或7所述的生物素-親和素的復(fù)合物的用途，其特征在于，用于制備 提高免疫檢測(cè)靈敏度的靈敏度增強(qiáng)劑。
10.一種制備的生物素-親和素的復(fù)合物的方法，包括步驟(a)將用作根序列的第一寡核苷酸單鏈固定于固相載體，(b)將用作引發(fā)序列的第二寡核苷酸單鏈與所述根序列接觸，所述的第二寡核苷酸單 鏈?zhǔn)窃谝欢藰?biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，從而形成相對(duì)穩(wěn)定的“根序列_引發(fā)序列”雜合 體，其中所述的引發(fā)序列互補(bǔ)結(jié)合于所述的根序列；隨后去除過(guò)量的引發(fā)序列；(c)將親和素與所述引發(fā)序列上的生物素接觸并結(jié)合；隨后去除過(guò)量的、未結(jié)合的親 和素，從而獲得第1級(jí)生物素_親和素的復(fù)合物；或者所述步驟(c)還包括重復(fù)以下步驟(cl)_(c2)共1至n-1次，從而獲得第η級(jí)生物素_親和素的復(fù)合物，其中，η為2-20的正整數(shù)(cl)將用作生長(zhǎng)序列的第三寡核苷酸單鏈與上一步驟獲得的生物素_親和素的復(fù)合 物接觸，其中所述第三寡核苷酸單鏈?zhǔn)莾啥藰?biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，從而使得所述 生長(zhǎng)序列中位于一端的生物素與上一步驟中形成的結(jié)合狀態(tài)的親和素形成結(jié)合；隨后去除 過(guò)量的、未結(jié)合的生長(zhǎng)序列；(c2)將親和素與步驟(cl)中所述生長(zhǎng)序列另一端的生物素接觸并結(jié)合；隨后去除過(guò) 量的、未結(jié)合的親和素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高免疫檢測(cè)靈敏度的方法。具體地，本發(fā)明提供了一種生物素-親和素的復(fù)合物，所述復(fù)合物包括(i)引發(fā)序列；(ii)第n級(jí)親和素，其中n為1-20的正整數(shù)；并且當(dāng)n為1時(shí)，則第1級(jí)親和素結(jié)合于所述引發(fā)序列上的生物素；和(iii)生長(zhǎng)序列，所述的生長(zhǎng)序列是兩端標(biāo)記有生物素的寡核苷酸單鏈，所述生長(zhǎng)序列中位于一端的生物素與第n級(jí)親和素結(jié)合，而位于另一端的生物素與第n+1級(jí)親和素結(jié)合或處于未結(jié)合狀態(tài)，其中n為1-20的正整數(shù)。本發(fā)明的復(fù)合物可有效提高免疫檢測(cè)的靈敏度，并且可以基本上不改變也不增加原有的免疫檢測(cè)試驗(yàn)操作程序。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101929997SQ200810207959
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者周偉, 周雪雷, 姚見(jiàn)兒, 張曉峰, 李久彤, 白艷軍 申請(qǐng)人:上海透景生命科技有限公司