專(zhuān)利名稱(chēng)：：結(jié)核抗體多抗原elisa檢測(cè)試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于結(jié)核病醫(yī)學(xué)免疫學(xué)檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及由LAM、38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白不同聯(lián)合作為檢測(cè)抗原組成的結(jié)核抗體多抗原ELISA檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：在全世界結(jié)核病依然是危害人類(lèi)健康的主要傳染病之一，1985年以來(lái)艾滋病的流行、結(jié)核感染的移民和部分人群生活貧困等原因使美國(guó)等歐美發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)核病發(fā)病率呈回升趨勢(shì)，尤其是結(jié)核菌耐藥問(wèn)題和非結(jié)核分枝桿菌病的發(fā)病率逐年上升使結(jié)核病治療更是雪上加霜。目前全世界有結(jié)核病人約2000萬(wàn)，每年新增結(jié)核病人8001000萬(wàn)，每年死亡人數(shù)約200萬(wàn)。中國(guó)的結(jié)核病疫情相當(dāng)嚴(yán)重，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二，僅次于印度。2000年第四次中國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查初步結(jié)果表明，中國(guó)有5.5億人感染了結(jié)核菌；現(xiàn)有肺結(jié)核病人451萬(wàn)，其中傳染性肺結(jié)核病人196萬(wàn)；每年死亡人數(shù)約13萬(wàn)，結(jié)核病死亡奔中國(guó)各種死亡原因中居第9位，在傳染病中居第一位。結(jié)核病也是AIDS感染者死亡的主要原因，根據(jù)1996年WHO統(tǒng)計(jì)每3個(gè)死亡的AIDS患者中就有一例死于合并結(jié)核，45-85%HIV死亡者是由于結(jié)核病診斷延誤所致。因此，結(jié)核病的早期診斷、早期治療對(duì)結(jié)核病疫情的控制具有極其重要的意義，并可提高HIV患者的存活率?？菇Y(jié)核抗體的檢測(cè)是應(yīng)用較廣泛的一種簡(jiǎn)便、快速、價(jià)廉的結(jié)核病輔助診斷手段，尤其是對(duì)于那些診斷困難的菌陰肺結(jié)核、兒童結(jié)核病或肺外結(jié)核病具有實(shí)用價(jià)值，但存在靈敏度和特異性不高的問(wèn)題。因此，建立一個(gè)敏感、特異、快速的血清學(xué)診斷試驗(yàn)可彌補(bǔ)目前診斷方法的不足。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)是常用的抗體檢測(cè)方法，雖操作步驟較多，需半天時(shí)間，但可半定量地檢測(cè)抗體水平，可根據(jù)其抗體升高的程度，明確診斷，或確定可疑對(duì)象進(jìn)行追蹤觀察；檢測(cè)靈敏度較高，可達(dá)70-80%;尤其是在體檢、大面積普查時(shí)，大批量樣本檢測(cè)更可顯示其優(yōu)越性，成本較低。目前已有的結(jié)核抗體ELISA檢測(cè)試劑盒主要由檢測(cè)抗原、酶聯(lián)抗人IgG抗體、底物、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反應(yīng)板所組成，所用包被抗原有的是結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)，由于PPD是結(jié)核菌培養(yǎng)濾液蛋白，含有許多分枝桿菌(包括致病性分枝桿菌、環(huán)境中非致病性分枝桿菌和卡介苗)共同的抗原，其檢測(cè)的特異性差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性；有的包被抗原采用結(jié)核菌胞膜抗原(見(jiàn)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN1072265A)，并采用酶聯(lián)葡萄球菌A蛋白的免疫反應(yīng)方法；還有的檢測(cè)抗原采用ESAT-6和CFP-10融合蛋白抗原(見(jiàn)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN1388378)，它們采用的均是單一檢測(cè)抗原。南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司研制的結(jié)核抗體檢測(cè)蛋白芯片試劑盒，該試劑盒以結(jié)核桿菌LAM、38kD和16kD蛋白為抗原，其靈敏度不高。另外它采用的是金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法，用硝酸纖維素膜為載體，將抗原固定在膜上，應(yīng)用膠體金顆粒標(biāo)記抗體，使抗原抗體反應(yīng)在膜上快速進(jìn)行，形成紅色的結(jié)合物，通過(guò)肉眼觀察結(jié)果，它雖簡(jiǎn)便、快速，但只能定性，不能定量，成本較高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為克服已有技術(shù)的不足，提供一種結(jié)核抗體多抗原ELISA檢測(cè)試劑盒及制備方法，采用多種具有互補(bǔ)性的重組蛋白抗原聯(lián)合作為結(jié)核病抗體檢測(cè)抗原，可提高結(jié)核抗體檢測(cè)的靈敏度和特異性。本發(fā)明提出的結(jié)核抗體多抗原ELISA檢測(cè)試劑盒，主要由檢測(cè)抗原、酶聯(lián)抗人IgG抗體、底物、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反應(yīng)板所組成的一盒體，其特征在于，所述檢測(cè)抗原采用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種脂阿拉伯甘露糖(LAM)、38kD和16kD三種與MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白之中的任意1種或1種以上結(jié)核分枝桿菌重組蛋白組合作為檢測(cè)抗原。本發(fā)明提出上述的試劑盒的制備方法，其特征在于包括(1)檢測(cè)抗原的制備采用基因工程技術(shù)克隆、表達(dá)產(chǎn)生，經(jīng)純化分別得到38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白抗原，從結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株中提純制備得到LAM;(2)用稀釋液分別稀釋所述各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白或糖抗原，使各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白或糖抗原的濃度均為lmg/ml，再將各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白或糖抗原稀釋溶液混勻后除菌濾過(guò)，分裝入一容器，lml/支，冷凍干燥備用；(3)試劑盒的裝配:所述將lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌各重組蛋白和糖抗原冷凍干燥管、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清各1支、30%過(guò)氧化氫1瓶、鄰苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反應(yīng)板1塊放入包裝盒密封后，置4'C避光保存。本發(fā)明的特點(diǎn)及技術(shù)效果本發(fā)明通過(guò)從結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株中提純制備糖抗原LAM及通過(guò)基因工程技術(shù)克隆、表達(dá)、純化結(jié)核分枝桿菌38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白，通過(guò)多種不同的聯(lián)合作為結(jié)核病抗體檢測(cè)的抗原，制i"^結(jié)核抗體多抗原ELISA檢測(cè)試劑盒，本試劑盒能用于半定量地檢測(cè)結(jié)核病人的抗體水平。本發(fā)明人研究證明應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌抗原組合1(LAM+38kD+16kD)檢測(cè)結(jié)核病人的靈敏度和特異性為67.8%、89.2%;抗原組合2(LAM+38kD+16kD+MPT63)檢測(cè)結(jié)核病人的靈敏度和特異性為69.7%、86.1%;抗原組合3(LAM+38kD+16kD+MPT63十CFP10-ESAT6)檢測(cè)結(jié)核病人的靈敏度和特異性為72.4%、83.6%;抗原組合4(LAM+38kD+l6kD+MTB48)檢測(cè)結(jié)核病人的靈敏度和特異性為69.2%、86.4%。PTO皮試陰性健康人中^^陽(yáng)性率很低(〈7.4%)，假陽(yáng)性主要出現(xiàn)在PPD皮試陽(yáng)性的結(jié)核感染者和卡介苗接種者中。菌陽(yáng)結(jié)核病人抗體的陽(yáng)性率很高(〉83%)。本發(fā)明的關(guān)鍵試劑-----結(jié)核分枝桿菌重組38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6蛋白抗原可大規(guī)模生產(chǎn)，且成本相對(duì)較低。該試劑盒可特異地檢測(cè)結(jié)核病患者血清、胸水等體液樣品中抗體，只需半天時(shí)間，本發(fā)明是由糖抗原和多種重組蛋白抗原組成的新型結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒，可用于檢測(cè)血清、胸水等體液樣品中特異的抗結(jié)核抗體，可用于結(jié)核病臨床血清學(xué)診斷。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提出的結(jié)核抗體多抗原ELISA檢測(cè)試劑盒及其制備方法結(jié)合實(shí)施例及附圖詳細(xì)說(shuō)明如下本發(fā)明提出的結(jié)核抗體多抗原ELISA檢測(cè)試劑盒，主要由檢測(cè)抗原、酶聯(lián)抗人IgG抗體、底物、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反應(yīng)板所組成的一盒體，其特征在于，所述檢測(cè)抗原采用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種脂阿拉伯甘露糖(LAM)、38kD和16kD三種與MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白之中的任意1種或1種以上結(jié)核分枝桿菌重組蛋白組合作為檢測(cè)抗原。所述的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種采用結(jié)核分枝桿菌。所述的試劑盒的制備方法，其特征在于包括(1)檢測(cè)抗原的制備采用基因工程技術(shù)克隆、表達(dá)產(chǎn)生，經(jīng)純化分別得到38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白抗原，從結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株中提純制備得到LAM;(2)用稀釋液(為常規(guī)的稀釋液，例如0.5M氯化鈉一20mM磷酸氫二鈉一2X甘露醇，pH7.4，或磷酸鹽緩沖液、生理鹽水)分別稀釋所述各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白或糖抗原，使各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白或糖抗原的濃度均為lmg/ml，再將各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白或糖抗原稀釋溶液混勻后除菌濾過(guò)，分裝入一容器，lml/支，冷凍干燥備用；(3H式劑盒的裝配:上述將lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌各重組蛋白和糖抗原冷凍干燥管、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清各1支、30%過(guò)氧化氫1瓶、鄰苯二胺1支(每種組分的量可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用確定)、聚苯乙烯微孔反應(yīng)板1塊放入包裝盒密封后，置4。C避光保存。上述步驟(1)的多種結(jié)核分枝桿菌抗原可采用基因工程技術(shù)將其中的兩種或兩種以上蛋白抗原融合表達(dá)產(chǎn)生。上述步驟(2)的各結(jié)核分枝桿菌抗原可采用分別單獨(dú)配制或混合配制。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒應(yīng)用時(shí)結(jié)核分枝桿菌LAM、38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白作為結(jié)核病抗體多抗原ELISA檢測(cè)試劑盒的抗原，LAM包被在酶聯(lián)板上的濃度為0.01ug-O.g，38kD、16kD、MPT63、MTB48和CFP10-ESAT6重組蛋白包被在酶聯(lián)板上的濃度為0.5yg-2ug;本發(fā)明的上述結(jié)核抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的使用方法(1)抗原包被用包被緩沖液將LAM抗原稀釋至O.1yg-2iig/ml，重組蛋白抗原稀釋至5—20ug/ml，每孔加IOOul。每板留l個(gè)孔，只加包被緩沖液，作為空白對(duì)照。置4'C過(guò)夜。次日用PBST洗板3—5次，3—5分鐘/次。(2)封閉:每孔加PBST—l^BSA200u1，置37。C孵育1小時(shí)。用PBST洗板3—5次，3—5分鐘/次。(3)加待檢樣品用PBST—1。/。BSA稀釋待檢樣品，充分混勻后，每孔加100"1，做2—3個(gè)平行孔；同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照，置37'C孵育40-60分鐘。用PBST洗板3—5次，3—5分鐘/次。(4)加酶標(biāo)二抗用PBST—1XBSA新鮮稀釋酶標(biāo)第二抗體，充分混勻后，每孔加100yl，置37。C孵育40-60分鐘。用PBST洗板3—5次，3—5分鐘/次。(5)加底物液顯色每孔加100iil新鮮配制的底物溶液，置室溫顯色510分鐘。(6)終止反應(yīng)每孔加50—100ixl2M硫酸。(7)酶標(biāo)儀讀數(shù)以空白對(duì)照孔調(diào)零后，測(cè)各孔OD值，若大于或等于規(guī)定的陽(yáng)性O(shè)D值即為陽(yáng)性。本發(fā)明的多種檢測(cè)抗原的制備實(shí)施例及檢測(cè)試劑盒實(shí)施例分別說(shuō)明如下一、38kD重組蛋白可采用已有的商品，也可通過(guò)以下基因工程技術(shù)制備1、引物設(shè)計(jì)與合成上游引物(含限制性?xún)?nèi)切酶NdeI位點(diǎn))5'—GGTATTCCA/TATGTGTGGCTCGAAACCACCGAGC—3'下游引物(含限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI位點(diǎn))5'—GCAGTGACG/AATTCCTGGAAATCGTCGCGATCAAC—3'擴(kuò)增片段1079bp2、PCR擴(kuò)增38kD基因用上下游引物，在TaqplusIDNA聚合酶的作用下，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴(kuò)增38kD基因。PCR反應(yīng)程序95°C5min;94°Clmin，66°Clmin，72°C2min，循環(huán)30次；最后72。C延伸7min。于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定1079bp的擴(kuò)增DNA片段。3、回收目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在長(zhǎng)波紫外線照射下，用干凈的手術(shù)刀片在膠上切下要回收DNA的瓊脂塊，放入無(wú)菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說(shuō)明書(shū)回收目的基因片段，具體方法如下向管中加入等體積的溶膠液(約0.4ml)，直至瓊脂糖完全融化；向管中加入0.6ml瓊脂糖DNA純化樹(shù)脂，充分混勻；將注射器插入微量離心柱擰緊，拔出注射器活塞，將樹(shù)脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；從微量離心柱上拔掉注射器，拔出注射劑活塞，將注射器插入微量離心柱擰緊，將2mll型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；取下微量離心柱，將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入15(H4II型柱子清洗液，離心1200rpm2-3min以清洗和干燥樹(shù)脂；將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入40WTE緩沖液，靜置一分鐘，12，000rpm離心20s;回收DNA洗脫液，定量，濃度約為50ng/W。貯存于-2(TC備用。4.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI、￡coRI雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET24b質(zhì)粒DNA，于1%瓊脂糖凝膠電泳，切取1058bp的38kD基因片段和5265bp的pET24b質(zhì)粒DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量后，38kD基因片段與pET24b質(zhì)粒DNA片段按2:1的摩爾比混合，10ul反應(yīng)體系如下2X連接緩沖液pET24b載體1H1PCR產(chǎn)物L(fēng)DNA連接酶無(wú)菌水補(bǔ)至10W混勻后置于16'C連接過(guò)夜，75'C滅活10min，冰浴后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。5.大腸桿菌DH5ct和大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取大腸桿菌DH5a(或BL21)單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)液中，置37'C振蕩培養(yǎng)箱中于200rpm培養(yǎng)過(guò)夜；次晨按1/100轉(zhuǎn)種于100mlLB培養(yǎng)液中，置37"C振蕩培養(yǎng)箱中于200rpm繼續(xù)培養(yǎng)2-3h，待菌濃度0D冊(cè)。為0.6~0.8時(shí)，放入用冰預(yù)冷的大離心管中，4°C、4000rpm、離心10min，棄上清；20ml冰預(yù)冷的0.lmol/LCaC12重懸菌沉淀，冰浴30min;于4°C、6000rpm、離心10min，棄上清；用4ml0.lmol/LCaC12重懸菌沉淀，置4'C冰箱放置過(guò)夜；次晨加入lml無(wú)菌甘油，吹打混合均勻，每100ri分裝于一個(gè)1.5ml的離心管中，置-70'C保存?zhèn)溆谩?.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化次日取目的基因片段與載體pET24b連接產(chǎn)物5W加入含有100W大腸桿菌DH5ct感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，冰浴O.5h;放入42'C水浴箱熱休克90s，迅速取出冰浴2min;加入LB培養(yǎng)液400W，37。C恒溫?fù)u床培養(yǎng)lh;加入X-Gal60W，IPTG4W，混勻，取出200—400W涂布于含有50ug/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37'C恒溫培養(yǎng)箱培育14h。7.質(zhì)粒的提取根據(jù)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取白色菌落6個(gè)，分別接種于5ml含有50ug/ml硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；根據(jù)《分子克隆》堿裂解方法，小量提取質(zhì)粒。'(1)質(zhì)粒小量提取試劑的配制溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTrisCL(pH8.0)10ramol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895X104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘；儲(chǔ)存于4°C備用。溶液n溶液in0.2ramol/LNa0H，1%SDS臨用前配制5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml去離子水28.5ml貯存于4'C,備用。(2)小量提取質(zhì)粒分別取約3.0ml菌液置離心管中，于12,000rpm離心1min，棄上清；細(xì)菌沉淀重懸于200Pl溶液I中，冰浴10min;加400W新配制的溶液II，冰浴5niin;加300W溶液III，冰浴10niin;于4'C12,000rpm離心10min;上清液移入干凈的離心管中，加等體積酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍體積的無(wú)水乙醇充分混合，于-20'C放置2h沉淀DNA;于4。C12,000rpm離心10min，棄上清；用lml70%乙醇洗滌沉淀一次，室溫充分干燥；將沉淀溶于TE緩沖液中，加入無(wú)DNA酶的胰RNA酶，使其終濃度為20化/rnl，于37。C水浴30min，消化RNA;取2W進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、定量，置一2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.鑒定重組質(zhì)粒(1)PCR擴(kuò)增鑒定以挑選的菌落質(zhì)粒DNA為模板，以上游和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pET24b-38kD。(2)酶切鑒定取重組質(zhì)粒514，分別用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI、fcoRI雙酶切3h;于1%瓊脂糖凝膠中電泳。以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)及擴(kuò)增產(chǎn)物為對(duì)照，酶切后的片斷與擴(kuò)增片斷一致。(3)序列測(cè)定直接挑選一個(gè)克隆送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與報(bào)道的基因組序列一致。9.pET24b-38kD工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將pET24b-38kD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆轉(zhuǎn)種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37'C恒溫振蕩器培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1%轉(zhuǎn)種到10inl含50Pg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37。C恒溫振蕩器培養(yǎng)至0D6。。為0.6左右時(shí)，加入IPTG，誘導(dǎo)4hr。將1X載樣緩沖液分別加入來(lái)自lml菌液的沉淀樣本，混懸后，置IO(TC沸水浴5min，于12000rpm離心10min，取上清液40W分別進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件為積層膠恒流lOmA，分離膠恒壓15mA，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部，停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色6h;用脫色液脫色至條帶清晰。與對(duì)照菌pET24b-BL21(DE3)相比，pET24b-38kD-BL21(DE3)沉淀部分在相對(duì)分子質(zhì)量38kD位置附近有濃重的表達(dá)條帶出現(xiàn)，誘導(dǎo)3—4小時(shí)表達(dá)量最多。10.38kD重組蛋白的純化將誘導(dǎo)菌超聲破碎后，采用Novagen公司生產(chǎn)的His.Bind蛋白純化試劑盒按試劑盒說(shuō)明書(shū)在變性條件下純化38kD蛋白，SDS-PAGE電泳可見(jiàn)純化的38kD蛋白呈一條帶，未見(jiàn)其他雜蛋白。二、16kD蛋白可采用己有的商品，也可通過(guò)以下基因工程技術(shù)制備16kD蛋白1、引物設(shè)計(jì)與合成上游引物(5'端含限制性?xún)?nèi)切酶NdeI)5，—CATATGGCCACCACCCTTCCCGTTCA—3'下游引物(5'端含限制性?xún)?nèi)切酶XhoI)5'—CTCGAGGTTGGTGGACCGGATCTGAA-3'擴(kuò)增片段444bp2、PCR擴(kuò)增16kD基因用上下游引物，在TaqplusIDNA聚合酶的作用下，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴(kuò)增16kD基因。PCR反應(yīng)程序:95°C5min;94°C30sec，60。C40sec，72°Clmin，循環(huán)32次；最后72。C延伸7min。于1。/。瓊脂糖凝膠電泳鑒定444bp的擴(kuò)增DNA片段。3、回收目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在長(zhǎng)波紫外線照射下，用干凈的手術(shù)刀片在膠上切下要回收DNA的瓊脂塊，放入無(wú)菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說(shuō)明書(shū)回收目的基因片段，具體方法如下向管中加入等體積的溶膠液(約0.4ml)，直至瓊脂糖完全融化；向管中加入0.6ml瓊脂糖DNA純化樹(shù)脂，充分混勻；將注射器插入微量離心柱擰緊，拔出注射器活塞，將樹(shù)脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；從微量離心柱上拔掉注射器，拔出注射劑活塞，將注射器插入微量離心柱擰緊，將2mll型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；取下微量離心柱，將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入150WII型柱子清洗液，離心1200rpm2-3miri以清洗和干燥樹(shù)脂；將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入4(U4TE緩沖液，靜置一分鐘，12，000rpm離心20s;回收DNA洗脫液，定量，濃度約為50ngA4。貯存于-20°C備用。4.目的基因與pGEM-T載體連接參照Promega公司pGEM-TvectorSystem-I產(chǎn)品說(shuō)明，將純化后PCR產(chǎn)物(50ng)與克隆載體pGEM-T連接，目的基因片段與載體片斷按摩爾比3:1混合，10μl反應(yīng)體系如下2X連接緩沖液5μlpGEM-T載體1μlPCR產(chǎn)物3μlT4DNA連接酶1μl無(wú)菌水補(bǔ)至10μl混勻后置于4'C冰箱反應(yīng)12h，75°C滅活10min，冰浴后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。5.大腸桿菌DH5a和大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取大腸桿菌DH5a(或BL21)單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)液中，置37°C振蕩培養(yǎng)箱中于200rpm培養(yǎng)過(guò)夜；次晨按1/100轉(zhuǎn)種于100mlLB培養(yǎng)液中，置37°C振蕩培養(yǎng)箱中于200rpm繼續(xù)培養(yǎng)2-3h，待菌濃度0De500為0.6~0.8時(shí)，放入用冰預(yù)冷的大離心管中，4°C、4000rpm、離心10min，棄上清；20ml冰預(yù)冷的0.lmol/LCaQ2重懸菌沉淀，冰浴30min;于4°C、6000rpm、離心10min，棄上清；用4ml0.lmol/LCaC12重懸菌沉淀，置4°C冰箱放置過(guò)夜；次晨加入lml無(wú)菌甘油，吹打混合均勻，每100W分裝于一個(gè)1.5ml的離心管中，置-70°C保存?zhèn)溆谩?.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將目的基因片段與PGEM-T的連接產(chǎn)物加入含有100μl大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，冰浴0.5h;放入42°C水浴箱熱休克90s,迅速取出冰浴2min;加入LB培養(yǎng)液400W，37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)1h;加入X-Gal60μl，IPTG4μl，混勻，取出200一400μl涂布于含有60ug/ml氨芐青霉素的LB平板上。倒置平板，放37°C恒溫培養(yǎng)箱培育14h。7.質(zhì)粒的提取根據(jù)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取白色菌落6個(gè)，分別接種于5ml含有60Pg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；根據(jù)《分子克隆》堿裂解方法，小量提取質(zhì)粒。(1)質(zhì)粒小量提取試劑的配制溶液I:50mraol/L葡萄糖25,1/LTrisCL(pH8.0)10畫(huà)1/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895X104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘；儲(chǔ)存于4°C備用。溶液II:0.2mmol/LNaOH，1%SDS臨用前配制溶液III:5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml去離子水28.5ml貯存于4匸，備用。(2)小量提取質(zhì)粒分別取約3.0ml菌液置離心管中，于12，000rpm離心1min，棄上清；細(xì)菌沉淀重懸于20041溶液I中，冰浴10min;加400W新配制的溶液II，冰浴5min;加300rt溶液m，冰浴IOmin;于4'C12，OOOrpm離心10min;上清液移入干凈的離心管中，加等體積酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍體積的無(wú)水乙醇充分混合，于-20'C放置2h沉淀DNA;于4。C12，OOOrpra離心10min，棄上清；用lml70%乙醇洗滌沉淀一次，室溫充分干燥；將沉淀溶于20WTE緩沖液中，加入無(wú)DNA酶的胰RNA酶，使其終濃度為20Pg/ni1，于37。C水浴30min，消化脂A;取進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、定量，置一20。C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.鑒定重組質(zhì)粒(2)PCR擴(kuò)增鑒定以挑選的菌落質(zhì)粒DNA為模板，以引物P16a、P16b進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為PGEM-16kDa。(2)酶切鑒定取重組質(zhì)粒5W，分別用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI、EcoRI雙酶切3h;于1%瓊脂糖凝膠中電泳。以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)及擴(kuò)增產(chǎn)物為對(duì)照，酶切后的片斷與擴(kuò)增片斷一致。(3)序列測(cè)定直接挑選一個(gè)克隆送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與報(bào)道的基因組序列一致。9.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI、iboRI雙酶切pGEM-16kDa重組質(zhì)粒DNA和表達(dá)載體pET24b質(zhì)粒DNA，于1%瓊脂糖凝膠電泳，切取444bp的Rvl009基因片段和5265bp的pET24b質(zhì)粒DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量后，16kDa基因片段與pET24b質(zhì)粒DNA片段按2:1的摩爾比混合，在T4DNA連接酶催化下，于16'C連接過(guò)夜，次日取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，置37'C恒溫箱孵育14h。挑選5個(gè)克隆分別轉(zhuǎn)種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37'C恒溫振蕩器培夢(mèng)過(guò)夜，用堿裂解法提取質(zhì)粒。10.重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定分別用牙簽隨機(jī)調(diào)取6個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，采用PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定方法挑選重組子；鑒定正確的陽(yáng)性克隆命名為pET24b-16kDa。11.pET24b-16kDa工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將pET24b-16kDa質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆轉(zhuǎn)種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37'C恒溫振蕩器培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1%轉(zhuǎn)種到10ml含504g/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37"恒溫振蕩器培養(yǎng)至OD卿為0.6—0.8時(shí)，加入IPTG，誘導(dǎo)3—4hr。將1X載樣緩沖液150W加入來(lái)自lml菌液的沉淀樣本，混懸后，置100。C沸水浴5riiin，于12000rpm離心10min，取上清液40W進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件為積層膠恒流10mA,分離膠恒壓15mA，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部，停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色6h;用脫色液脫色至條帶清晰。與對(duì)照菌pET24b-BL21(DE3)相比，pET24b-16kDa-BL21(DE3)菌體在相對(duì)分子質(zhì)量16kDa位置附近有濃重的表達(dá)條帶出現(xiàn),誘導(dǎo)3-4小時(shí)表達(dá)量最多。12.16kDa重組蛋白的純化將誘導(dǎo)菌超聲破碎后，采用Novagen公司生產(chǎn)的His.Bind蛋白純化試劑盒按試劑盒-說(shuō)明書(shū)純化16kDa蛋白，SDS-PAGE電泳可見(jiàn)純化的16kDa蛋白呈一條帶，未見(jiàn)其他雜蛋白。三、通過(guò)基因工程技術(shù)制備MPT63蛋白1、引物設(shè)計(jì)與合成上游引物(5，端含限制性?xún)?nèi)切酶NheI)5，—GCTAGCGCCTATCCCATCACCGGA—3'下游引物(5'端含限制性?xún)?nèi)切酶XhoI)5'—CTCGAGCGGCTCCCAAATCAGCAG—3'擴(kuò)增片段402bp2、PCR擴(kuò)增MPT63基因用上下游引物，在TaqplusIDNA聚合酶的作用下，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴(kuò)增MPT63基因。PCR反應(yīng)程序95°C5min;94°C30sec，60°C30sec，72°C60sec，循環(huán)30次；最后72'C延伸7min。于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定402bp的擴(kuò)增DNA片段。3、回收目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在長(zhǎng)波紫外線照射下，用干凈的手術(shù)刀片在膠上切下要回收DNA的瓊脂塊，放入無(wú)菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說(shuō)明書(shū)回收目的基因片段，具體方法如下向管中加入等體積的溶膠液(約0.4ml)，直至瓊脂糖完全融化；向管中加入0.6ml瓊脂糖DNA純化樹(shù)脂，充分混勻；將注射器插入微量離心柱擰緊，拔出注射器活塞，將樹(shù)脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；從微量離心柱上拔掉注射器，拔出注射劑活塞，將注射器插入微量離心柱擰緊，將2mll型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；取下微量離心柱，將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入150WII型柱子清洗液，離心1200rpm2-3min以清洗和干燥樹(shù)脂；將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入40riTE緩沖液，靜置一分鐘，12,000rpm離心20s;回收DNA洗脫液，定量，濃度約為50ng/ri。貯存于-2(TC備用。4、目的基因與pGEM-T載體連接參照Promega公司pGEM-TvectorSystem-I產(chǎn)品說(shuō)明，將純化后PCR產(chǎn)物(50ng)與克隆載體pGEM-T連接，目的基因片段與載體片斷按摩爾比3:1混合，10ul反應(yīng)體系如下2X連接緩沖液pGEM-T載體114PCR產(chǎn)物L(fēng)DNA連接酶無(wú)菌水補(bǔ)至10W混勻后置于4'C冰箱反應(yīng)12h，75。C滅活10min，冰浴后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。5.大腸桿菌DH5a和大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取大腸桿菌DH5a(或BL21)單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)液中，置37'C振蕩培養(yǎng)箱中于200rpm培養(yǎng)過(guò)夜；次晨按1/100轉(zhuǎn)種于100mlLB培養(yǎng)液中，置37。C振蕩培養(yǎng)箱中于200rpm繼續(xù)培養(yǎng)2-3h，待菌濃度0D6。。為0.60.8時(shí)，放入用冰預(yù)冷的大離心管中，4'C、4000rpm、離心10min，棄上清；20ml冰預(yù)冷的0.lmol/LCaC12重懸菌沉淀，冰浴30min;于4°C、6000rpm、離心10min，棄上清；'用4ml0.lmol/LCaC12重懸菌沉淀，置4'C冰箱放置過(guò)夜；次晨加入lml無(wú)菌甘油，吹打混合均勻，每分裝于一個(gè)1.5ml的離心管中，置-7(TC保存?zhèn)溆谩?.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將目的基因片段與PGEM-T的連接產(chǎn)物加入含有100W大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，冰浴0.5h;放入42。C水浴箱熱休克90s，迅速取出冰浴2min;加入LB培養(yǎng)液400W，37。C恒溫?fù)u床培養(yǎng)1h;加入X-Gal60W，IPTG4W，混勻，取出200一400W涂布于含有60ug/ml氨芐青霉素的LB平板上。倒置平板，放37T:恒溫培養(yǎng)箱培育14h。7.質(zhì)粒的提取根據(jù)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取白色菌落6個(gè)，分別接種于5ml含有60|ig/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；根據(jù)《分子克隆》堿裂解方法，小量提取質(zhì)粒。(1)質(zhì)粒小量提取試劑的配制溶液I:50mmol/L葡萄糖25,1/LTrisCL(pH8.0)10畫(huà)1/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895X104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘；儲(chǔ)存于4'C備用。溶液II:0.2mmol/LNaOH，1%SDS臨用前配制溶液III:5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml去離子水28.5ml貯存于4'C，備用。(2)小量提取質(zhì)粒分別取約3.0ml菌液置離心管中，于12,000rpm離心lrain，棄上清；細(xì)菌沉淀重懸于200W溶液I中，冰浴10min;加400W新配制的溶液II，冰浴5min;加300W溶液III，冰浴10min;于4。C12,OOOrpm離心10min;上清液移入干凈的離心管中，加等體積酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍體積的無(wú)水乙醇充分混合，于-2(TC放置2h沉淀DNA;于4。C12,OOOrpm離心10min，棄上清；用lml70%乙醇洗滌沉淀一次，室溫充分干燥；將沉淀溶于20WTE緩沖液中，加入無(wú)DNA酶的胰RNA酶，使其終濃度為20!^g/ml,于37。C水浴30min，消化RNA;取進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、定量，置一20。C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.鑒定重組質(zhì)粒(3)PCR擴(kuò)增鑒定以挑選的菌落質(zhì)粒DNA為模板，以上游和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為PGEM-MPT63。(2)酶切鑒定取重組質(zhì)粒5ri，分別用限制性?xún)?nèi)切酶NheI、XhoI雙酶切3h;于1%瓊脂糖凝膠中電泳。以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)及擴(kuò)增產(chǎn)物為對(duì)照，酶切后的片斷與擴(kuò)增片斷一致。_(3)序列測(cè)定直接挑選一個(gè)克隆送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與報(bào)道的基因組序列一致。9.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性?xún)?nèi)切酶NheI、XhoI雙酶切pGEM-MPT63重組質(zhì)粒DNA和表達(dá)載體pET24b質(zhì)粒DNA，于1%瓊脂糖凝膠電泳，切取402bp的MPT63基因片段和5235bp的pET24b質(zhì)粒DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量后，MPT63基因片段與pET24b質(zhì)粒DNA片段按2:1的摩爾比混合，在LDNA連接酶催化下，于16。C連接過(guò)夜，次日取連接產(chǎn)物5W轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，置37'C恒溫箱孵育14h。挑選5個(gè)克隆分別轉(zhuǎn)種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37。C恒溫振蕩器培養(yǎng)過(guò)夜，用堿裂解法提取質(zhì)粒。10.重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定分別用牙簽隨機(jī)調(diào)取6個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，采用PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定方法挑選重組子；鑒定正確的陽(yáng)性克隆命名為pET24b-MPT63。11.pET24b-MPT63工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將pET24b-MPT63質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆轉(zhuǎn)種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37'C恒溫振蕩器培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1%轉(zhuǎn)種到10ml含504g/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37。C恒溫振蕩器培養(yǎng)至OD6。。為0.6左右時(shí)，加入IPTG，誘導(dǎo)4hr。將誘導(dǎo)菌超聲破碎后的上清、沉淀部分分別進(jìn)行SDS—PAGE分析。將1X載樣緩沖液150W分別加入來(lái)自lml菌液的上清、沉淀樣本，混懸后，置10(TC沸水浴5min,于12000rpm離心10min，取上清液40ri分別進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件為積層膠恒流10mA，分離膠恒壓15mA，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部，停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色6h;用脫色液脫色至條帶清晰。與對(duì)照菌pET24b-BL21(DE3)相比，pET24b-MPT63-BL21(DE3)上清液在相對(duì)分子質(zhì)量16—18kDa位置附近有濃重的表達(dá)條帶出現(xiàn)，誘導(dǎo)4小時(shí)表達(dá)量最多；而pET24b-MPT63-BL21(DE3)沉淀部分只見(jiàn)少量特異蛋白表達(dá)帶，MPT63工程菌是以細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白的形式表達(dá)。12.MPT63重組蛋白的純化將誘導(dǎo)菌超聲破碎后，采用Novagen公司生產(chǎn)的His.Bind蛋白純化試劑盒按試劑盒說(shuō)明書(shū)純化MPT63蛋白，SDS-PAGE電泳可見(jiàn)純化的MPT63蛋白呈一條帶，未見(jiàn)其他雜蛋白。四、通過(guò)基因工程技術(shù)制備CFP10—ESAT6融合蛋白1、引物設(shè)計(jì)與合成cfp10引物設(shè)計(jì)Pl(上游)5'-CCGGATCCATGGCAGAGATGAAGAC-3，P2(下游)5，-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACC—GAAGCCCATTTGCGAGGACAGCGCCT-3，擴(kuò)增片段353bpesat6引物設(shè)計(jì)P3(上游)5，-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGG-3，P4(下游)5'-CCAAGCTTTGCGAACATCCCAGTGA-3'擴(kuò)增片段338bp2、PCR擴(kuò)增cfp10和esat6基因分別用P1、P2和P3、P4引物，在TaqplusIDNA聚合酶的作用下，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴(kuò)增CFP10和ESAT6基因。PCR反應(yīng)程序95°C5min;94°C20sec，60°C20sec，72°C2min，循環(huán)25次；最后72。C延伸7min。于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定353bp(cfp10)、338bp(esat6)的擴(kuò)增DNA片段；回收這2個(gè)片段，分別取lul回收片段作為模板，以Pl和P4為引物擴(kuò)增，于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定681bp的擴(kuò)增DNA片段。3、回收目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，用干凈的手術(shù)刀片在膠上切下要回收DNA的瓊脂塊，放入無(wú)菌的印pendrof管中。判定DNA片段位置時(shí)，使用長(zhǎng)波紫外線，照射時(shí)間盡可能短。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說(shuō)明書(shū)，具體方法如下向管中加入等體積的溶膠液(約0.4ml)，(可在55-65'C水浴中加熱5-15min).直至瓊脂糖完全融化；向管中加入0.6ml瓊脂糖DNA純化樹(shù)脂，充分混勻；將注射器插入微量離心柱擰緊，拔出注射器活塞，將樹(shù)脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；從微量離心柱上拔掉注射器，拔出注射劑活塞，將注射器插入微量離心柱擰緊，將2mlI型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；取下微量離心柱，將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml印pendrof管擰緊，向離心柱中加入150WII型柱子清洗液，離心1200rpm2-3min以清洗和干燥樹(shù)脂；將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml印pemirof管擰緊，向離心柱中加入40WTE緩沖液，靜置一分鐘，12，000rpm離心20s;回收DNA洗脫液，定量，濃度約為50ng/W。貯存于-2(TC備用。4.目的基因與pGEM-T載體連接參照Promega公司pGEM-TvectorSystem-I產(chǎn)品說(shuō)明，將純化后PCR產(chǎn)物(50ng)與克隆載體pGEM-T連接，目的基因片段與載體片斷按摩爾比3:1混合，10ul反應(yīng)體系如下2X連接緩沖液(RapidligationBuffer)5l4pGEM-T載體(pGEM-Tvector).1^1PCR產(chǎn)物(PCRproduct)0.T4DNA連接酶(T4DNAligase)141無(wú)菌水(dH20)補(bǔ)足1014混勻后置于4'C冰箱反應(yīng)12h，或者室溫反應(yīng)2h。75'C滅活10min，冰浴后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。5.大腸桿菌DH5a和大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取大腸桿菌DH5a(或BL21)單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)液中，37°C，200rpm，培養(yǎng)過(guò)夜；次晨按1/100轉(zhuǎn)種于100mlLB培養(yǎng)液中，37°C，繼續(xù)培養(yǎng)2-3h，待菌濃度0De。。為0.60.8時(shí)，放入用冰預(yù)冷的大離心管中，4'C、4000rpm、離心10min，棄上清；20ml冰預(yù)冷的O.lmol/LCaC12重懸菌沉淀，冰浴30min;4°C、6000rpm、離心10min，棄上清；4ml0.lmol/LCaC12重懸菌沉淀，4。C冰箱放置過(guò)夜；次晨加入1ml無(wú)菌甘油，吹打混合均勻，10(^l分裝1.5ml印pendrof管，-70'C保存?zhèn)溆谩?.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將目的基因片段與PGEM-T的連接產(chǎn)物各分別加入含有100W大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，冰浴O.5h;放入42'C水浴箱熱休克90s,迅速取出冰浴2min;加入LB培養(yǎng)液400ri，37。C恒溫?fù)u床培養(yǎng)lh;加入X-Gal6(￥1，IPTG4W，混勻，取出200—400W涂布于含有氨芐青霉素(60ug/ml)的LB平板。倒置平板，放37t:恒溫培養(yǎng)箱培育14h。7.質(zhì)粒的提取根據(jù)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取白色菌落6個(gè)，分別接種于5ml含有氨芐青霉素60Pg/ml的LB培養(yǎng)基，；yrc振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取3mi菌沉淀，根據(jù)《分子克隆》的堿裂解方法，小量提取質(zhì)粒。(1)質(zhì)粒小量提取試劑的配制溶液I:50mmol/L葡萄糖25歸1/LTrisCL(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895X104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘；儲(chǔ)存于4°C備用。溶液II:0.2mmol/LNaOH，1%SDS臨用前配溶液III:5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml去離子水28.5ml貯存于4'C，備用。(2)小量提取質(zhì)粒分別取約3.0ml菌液置試管中，12,000rpm離心1min,棄上清；菌體重懸于200|4溶液I中，冰浴10min;加400W新配制的溶液II，冰浴5min;加300W溶液III，冰浴10min;4'C12,OOOrpm離心10min;上清移入干凈的管中，加等體積酚、氯仿及氯仿各抽提一次；2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀雙鏈DNA，充分混合，-20'C放置2h;4'C12，000rpm離心10min，棄上清；用lml70y。乙醇洗滌沉淀一次，室溫充分干燥；將沉淀溶于20|4TE中，加入無(wú)DNA酶的胰RM酶，使其終濃度為2(^g/ml，37。C水浴30min，消化RNA;取2rt進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、定量，一20。C儲(chǔ)存，備用。8.鑒定重組質(zhì)粒(4)PCR擴(kuò)增鑒定以挑選的菌落質(zhì)粒DNA為模板，以P1、P4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為PGEM-CFP10-ESAT6。(2)酶切鑒定取重組質(zhì)粒5W，分別用限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切2h;1%瓊脂糖凝膠電泳。設(shè)置DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)及擴(kuò)增產(chǎn)物為參照，觀察酶切后片斷是否與擴(kuò)增目的片斷一致。(3)序列測(cè)定直接挑選一個(gè)克隆送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與報(bào)道的基因組序列一致。9.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI及HindIII雙酶切pGEM-CFP10-ESAT6重組質(zhì)粒DNA和表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，切取630bpCFP10-ESAT6基因片段和5.344kb片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量后，基因片段與載體DNA按2:1的摩爾比混合，在T4DNA連接酶催化下，16'C連接過(guò)夜，次日取連接產(chǎn)物5W轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，37'C恒溫箱孵育14h。挑選3-5個(gè)克隆分別轉(zhuǎn)種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37'C恒溫振蕩器培養(yǎng)過(guò)夜，用堿裂解法提取質(zhì)粒。10.重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定分別用牙簽隨機(jī)調(diào)取6—7個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，采用PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定方法挑選重組子；鑒定正確的陽(yáng)性克隆命名為pET28a-CFP10-ESAT6。11、pET28a-CFP10-ESAT6工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將pET28a-CFP10-ESAT6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆轉(zhuǎn)種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37'C恒溫振蕩器培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1%轉(zhuǎn)種到10ml含50化/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37'C恒溫振蕩器培養(yǎng)至OD卿值為0.6—0.8時(shí)，加入IPTG，誘導(dǎo)3—4hr。將1X載樣緩沖液150ri加入來(lái)自lml菌液的沉淀樣本，吹打混勻，IO(TC沸水浴5min，12000g離心10min，取上清40W進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件為積層膠恒流10mA，分離膠恒壓15mA，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部，停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色6h;脫色液脫色至條帶清晰，觀察是否有目的蛋白表達(dá)條帶。應(yīng)用O.l、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2raM濃度的IPTG誘導(dǎo)，pET28a-CFP10-ESAT6大腸桿菌工程菌的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯區(qū)別,。與對(duì)照菌pET28a-BL21(DE3)相比，pET28a-CFP10-ESAT6-BL21(DE3)菌體在相對(duì)分子質(zhì)量28kDa位置附近有濃重的表達(dá)條帶出現(xiàn)，誘導(dǎo)3-4小時(shí)時(shí)表達(dá)量最多，經(jīng)激光密度掃描測(cè)定占菌體總蛋白的40%左右。將誘導(dǎo)菌超聲破碎后的上清液和沉淀部分進(jìn)行SDS-PAGE分析，重組蛋白均出現(xiàn)在破碎的上清中，沉淀極少，說(shuō)明該重組蛋白主要以可溶形式表達(dá)。12.CFP10-ESAT6重組蛋白的純化由于重組蛋白末端攜帶6X組氨酸，它可通過(guò)形成配位鍵而與金屬螯合親和層析柱上固定化的某些二價(jià)金屬離子(如鎳)結(jié)合，按試劑盒說(shuō)明書(shū)直接純化重組蛋白，蛋白純度達(dá)90%以上。五、通過(guò)基因工程技術(shù)制備MTB48蛋白1、引物設(shè)計(jì)與合成上游引物(5，端含限制性?xún)?nèi)切酶NheI)5'—CCCAAGCTTCTTCGACTCCTTACTGTCCT—3'下游引物(5，端含限制性?xún)?nèi)切酶HindIII)5'—GCTAGCCAGTCGCAGACGTGACG—3'擴(kuò)增片段1.4kb2、PCR擴(kuò)增MTB48基因用上下游引物，在TaqplusIDNA聚合酶的作用下，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴(kuò)增mtb48基因。PCR反應(yīng)程序95°C5min;94°C20see,60°C20sec，72°C2min，循環(huán)32次；最后72。C延伸7min。于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定1.4kb的擴(kuò)增DNA片段。3、回收目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在長(zhǎng)波紫外線照射下，用干凈的手術(shù)刀片在膠上切下要回收DNA的瓊脂i央，放入無(wú)菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說(shuō)明書(shū)回收目的基因片段，具體方法如下向管中加入等體積的溶膠液(約0.4ml)，直至瓊脂糖完全融化；向管中加入0.6ml瓊脂糖DNA純化樹(shù)脂，充分混勻；將注射器插入微量離心柱擰緊，拔出注射器活塞，將樹(shù)脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；從微量離心柱上拔掉注射器，拔出注射劑活塞，將注射器插入微量離心柱擰緊，將2mll型柱子清^fe液加入注射筒，用注射器活塞緩慢用力向下壓，排出所有的液體和氣體；取下微量離心柱，將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入150WII型柱子清i5fe液，離心1200rpm2-3min以清洗和干燥樹(shù)脂；將微量離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管擰緊，向離心柱中加入40WTE緩沖液，靜置一分鐘，12，000rpm離心20s;回收DNA洗脫液，定量，濃度約為50ng/ri。貯存于-2(TC備用。4、目的基因與pGEM-T載體連接.參照P環(huán)ega公司pGEM-TvectorSystem-I產(chǎn)品說(shuō)明，將純化后PCR產(chǎn)物(50ng)與克隆載體pG.EM-T連接，目的基因片段與載體片斷按摩爾比3:1混合，10ul反應(yīng)體系如下2X連接緩沖液51^1pGEM-T載體1WPCR產(chǎn)物0.丁4DNA連接酶lrt無(wú)菌水補(bǔ)至10W混勻后置于4'C冰箱反應(yīng)12h，75'C滅活10min，冰浴后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。5.大腸桿菌DH5a和大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取大腸桿菌DH5a(或BL21)單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)液中，置37'C振蕩培養(yǎng)箱中于200rpm培養(yǎng)過(guò)夜；次晨按1/100轉(zhuǎn)種于100mlLB培養(yǎng)液中，置37'C振蕩培養(yǎng)箱中于200rpm繼續(xù)培養(yǎng)2-3h，待菌濃度OD卿為0.60.8時(shí)，放入用冰預(yù)冷的大離心管中，4'C、4000rpm、離心10min，棄上清；20ml冰預(yù)冷的0.lmol/LCaC12重懸菌沉淀，冰浴30min;于4'C、6000rpm、離心10min，棄上清；用4ml0.lmol/LCaC12重懸菌沉淀，置4'C冰箱放置過(guò)夜；次晨加入lml無(wú)菌甘油，吹打混合均勻，每100W分裝于一個(gè)1.5ml的離心管中，置-7(TC保存?zhèn)溆谩?.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將目的基因片段與PGEM-T的連接產(chǎn)物5ri加入含有大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，冰浴0.5h;放入42'C水浴箱熱休克'90s,迅速取出冰浴2min;加入LB培養(yǎng)液400W，37。C恒溫?fù)u床培養(yǎng)1h;加入X-Gal60W，IPTG化l,混勻，取出200一400W涂布于含有60ug/ml氨芐青霉素的LB平板上。倒置平板，放37。C恒溫培養(yǎng)箱培育14h。7.質(zhì)粒的提取根據(jù)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取白色菌落6個(gè)，分別接種于5ml含有60Pg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；根據(jù)《分子克隆》堿裂解方法，小量提取質(zhì)粒。(1)質(zhì)粒小量提取試劑的配制溶液I:50mmol/L葡萄糖25腸1/LTrisCL(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895X104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘；儲(chǔ)存于4'C備用o溶液II:0.2mmol/LNaOH，1%SDS臨用前配制溶液III:5mol/L乙酸鉀60ml.冰乙酸11.5ml去離子水28.5ml貯存于4'C，備用。(2)小量提取質(zhì)粒分別取約3.0ml菌液置離心管中，于12,000rpm離心1rain，棄上清；細(xì)菌沉淀重懸于20014溶液I中，冰浴10min;加400W新配制的溶液II，冰浴5min;加300W溶液m，冰浴10min;于4。C12，OOOrpm離心10min;上清液移入干凈的離心管中，加等體積酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍體積的無(wú)水乙醇充分混合，于-2(TC放置2h沉淀DNA;于4。C12,000rpm離心10min,棄上清；用lml70%乙醇洗滌沉淀一次，室溫充分干燥；將沉淀溶于20WTE緩沖液中，加入無(wú)DNA酶的胰RNA酶，使其終濃度為20化/ml，于37。C水浴30min，消化RNA;取進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、定量，置一2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.鑒定重組質(zhì)粒(5)PCR擴(kuò)增鑒定以挑選的菌落質(zhì)粒DNA為模板，以上游和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，設(shè)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為參照，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為PGEM-MTB48。(2)酶切鑒定取重組質(zhì)粒514，分別用限制性?xún)?nèi)切酶NheI、HindIII雙酶切2h;于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳。以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)及擴(kuò)增產(chǎn)物為對(duì)照，酶切后的片斷與擴(kuò)增片斷一致。(3)序列測(cè)定直接挑選一個(gè)克隆送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與報(bào)道的基因組序列一致。9.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建'用限制性?xún)?nèi)切酶NheI和HindIII雙酶切pGEM-MTB48重組質(zhì)粒DNA,1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收1.4kb基因片段。同樣方法酶切表達(dá)載體pET24b質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收5.3kb片段。用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化兩個(gè)回收產(chǎn)物。定量后，基因片段與載體DNA按2:1的摩爾比混合，在T4DNA連接酶催化下，16'C連接過(guò)夜，次日取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡co/y2W5"感受態(tài)細(xì)胞，37'C恒溫箱培育14h。挑選克隆3-5個(gè)分別轉(zhuǎn)種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37。C恒溫振蕩器培養(yǎng)過(guò)夜，用堿裂解法提取質(zhì)粒。10.重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定分別用牙簽隨機(jī)調(diào)取6個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，采用PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定方法挑選重組子；鑒定正確的陽(yáng)性克隆命名為pET24b-MTB48。11.pET24b-MTB48工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將pET24b-MTB48質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆轉(zhuǎn)種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37'C恒溫振蕩器培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1%轉(zhuǎn)種到10ml含50Pg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，置37'C恒溫振蕩器培養(yǎng)至0De。。為0.8~1.0左右時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)4一5hr。以空載體pET24b菌株菌株和工程菌誘導(dǎo)前菌液作為対照樣本，離心，收集菌體，備用。將誘導(dǎo)菌超聲破碎后的上清、沉淀部分分別進(jìn)行SDS—PAGE分析。將1X載樣緩沖液分別加入來(lái)自lml菌液的上清、沉淀樣本，混懸后，置100'C沸水浴5min，于12000rpm離心10min，取上清液40ri分別進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件為積層膠恒流10mA，分離膠恒壓15mA，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部，停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色6h;用脫色液脫色至條帶清晰。與對(duì)照菌pET24b-BL21(DE3)相比，pET24b-MTB48-BL21(DE3)沉淀部分在相對(duì)分子質(zhì)量約50kDa位置附近有濃重的表達(dá)條帶出現(xiàn),誘導(dǎo)4-5小時(shí)表達(dá)量最多；而pET24b-MTB48-BL21(DE3)上清液部分只見(jiàn)少量特異蛋白表達(dá)帶，MTB48工程菌是以包涵體形式表達(dá)。12.MTB48重組蛋白的純化由于重組蛋白末端攜帶6X組氨酸，它可通過(guò)形成配位鍵而與金屬螯合親和層析柱上固定化的某些二價(jià)金屬離子(如鎳)結(jié)合，使重組蛋白直接純化。MTB48蛋白以不可溶形式表達(dá)，因此選擇含尿素的變性條件下純化。將誘導(dǎo)菌超聲破碎后，采用Novagen公司生產(chǎn)的His.Bind蛋白純化試劑盒按試劑盒說(shuō)明書(shū)純化MTB48蛋白，SDS-PAGE電泳可見(jiàn)純化的MTB48蛋白呈一條帶，未見(jiàn)其他雜蛋白。六、結(jié)核分枝桿菌LAM可采用已有商品，也可采用以下方法的制備1.結(jié)核分枝桿菌H37Rv0.5克加蒸餾水15ml，80'C滅活2h;2.超聲粉碎，12000rpm離心30min，取上清；3.加等體積的苯酚顛倒混勻，在68-70'C水浴中使成勻相，或冷卻后于8000卬m離心10min，取出水相；4.再加等體積的蒸餾水于酚相中萃取l次；5.合并2次水相，離心去除沉淀；6.回收所得即為脂多糖，低溫貯存?zhèn)溆?。七、結(jié)核病抗體檢測(cè)試劑盒的抗原的制備和貯存1.稀釋液(O.5M氯化鈉一20mM磷酸氫二鈉一2%甘露醇，pH7.4)的配制稱(chēng)取29.22g氯化鈉、7.1628g磷酸氫二鈉于700ml蒸餾水中，加入20g甘露醇，在磁力攪拌器上攪拌，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4，加雙蒸餾水定容至1000ml。2.用稀釋液稀釋選用的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白和糖抗原，使其濃度為lmg/ml;3.混勻后除菌濾過(guò)，分裝入一容器，lml/支，冷凍干燥，置4'C避光保存?zhèn)溆?。八、檢測(cè)試劑盒中的酶聯(lián)抗人IgG抗體、底物、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反應(yīng)板，均可采用常規(guī)公知技術(shù)制備或直接選用已知的商□以下結(jié)合具體本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，各實(shí)施例中的抗原原料均可通過(guò)上述制備方法獲得，但不應(yīng)構(gòu)成對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。實(shí)施例i(1)檢測(cè)抗原的制備用稀釋液(O.5M氯化鈉一20mM磷酸氫二鈉一2X甘露醇，pH7.4)分別稀釋結(jié)核分枝桿菌LAM、38kD、16kD重組蛋白，使各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的濃度均為lmg/ml，再將各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白稀釋溶液混勻后除菌濾過(guò)，分裝入一容器，lml/支，冷凍干燥備用；(2)試劑盒的裝配將lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌L雇、38kD、16kD重組蛋白凍干管、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清各1支、30%過(guò)氧化氫1小瓶、鄰苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反應(yīng)板1塊放入包裝盒密封后，置4'C避光保存。實(shí)施例2(1)檢測(cè)抗原的制備用稀釋液(磷酸鹽緩沖液)分別稀釋結(jié)核分枝桿菌LAM、38kD、16kD、MPT63重組蛋白，使各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的濃度均為lmg/ml，再將各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白稀釋溶液混勻后除菌濾過(guò)，分裝入一容器，lml/支，冷凍干燥備用；(2)試劑盒的裝配將lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌LAM、38kD、16kD、MPT63重組蛋白凍干管、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的坑人IgG抗體、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清各1支、30%過(guò)氧化氫1小瓶、鄰苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反應(yīng)板1塊放入包裝盒密封后，置4'C避光保存。實(shí)施例3(1)檢測(cè)抗原的制備用稀釋液(生理鹽水)分別稀釋結(jié)核分枝桿菌LAM、38kD、16kD、MPT63、CFP10-ESAT6重組蛋白，使各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的濃度均為lmg/ml，再將各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白稀釋溶液混勻后除菌濾過(guò)，分裝入一容器，lml/支，冷凍干燥備用；(2)試劑盒的裝配將lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌LAM、38kD、16kD、MPT63、CFP10-ESAT6重組蛋白凍干管、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清各1支、30%過(guò)氧化氫1小瓶、鄰苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反應(yīng)板l塊放入包裝盒密封后，置4'C避光保存。實(shí)施例4(1)檢測(cè)抗原的制備用稀釋液(O.5M氯化鈉一20mM磷酸氫二鈉一2%甘露醇，pH7.4)分別稀釋結(jié)核分枝桿菌LAM、38kD、16kD、'MTB48重組蛋白，使各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的濃度均為lmg/ml，再將各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白稀釋溶液混勻后除菌濾過(guò)，分裝入一容器，lml/支，冷凍干燥備用；(2)試劑盒的裝配將lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌LAM、38kD、16kD、MTB48重組蛋白凍干管、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清各1支、30%過(guò)氧化氫1小瓶、鄰苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反應(yīng)板1塊放入包裝盒密封后，置4'C避光保存。上述各實(shí)施例的應(yīng)用(1)抗原包被用包被緩沖液將LAM抗原稀釋至1ug/ml，重組蛋白抗原稀釋至IOwg/ml，每孔加100ul。每板留l個(gè)孔，只加包被緩沖液，作為空白對(duì)照。置4'C過(guò)夜。次日用PBST洗板3次，3分鐘/次。(2)封閉每孔加PBST—l%BSA200u1，置37。C孵育1小時(shí)。用PBST洗板3次，3分鐘/次。(3)加待檢樣品用PBST—1^BSA稀釋待檢樣品，充分混勻后，每孔加100iil，做2個(gè)平行孔；同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照，置37'C孵育40分鐘。用PBST洗板3次，3分鐘/次。(4)加酶標(biāo)二抗用PBST—1XBSA新鮮稀釋酶標(biāo)第二抗體，充分混勻后，每孔加100nl，置37'C孵育40分鐘。用PBST洗板3次，3分鐘/次。(5)加底物液顯色每孔加100lil新鮮配制的底物溶液，置室溫顯色10分鐘。(.6)終止反應(yīng)每孔加50ul2M硫酸。'(7)酶標(biāo)儀讀數(shù)以空白對(duì)照孔調(diào)零后，測(cè)各孔OD值，若大于或等于規(guī)定的陽(yáng)性O(shè)D值即為陽(yáng)性。結(jié)果見(jiàn)表l。表1應(yīng)用結(jié)核多抗原ELISA方法檢測(cè)正常人和結(jié)核病人血清中抗結(jié)核抗體分組抗結(jié)核抗體陽(yáng)性率％實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4應(yīng)用1正常人PPD陰性3.2(3/95)3.2(3/95)5.3(5/95)3.2(3/95)BCG接種陽(yáng)轉(zhuǎn)15.5(15/97)23.7(23/97)27.8(27/97)20.6(20/97)健康人9.33(18/193)13.5(26/193)16.6(32/193)12.4(24/193)結(jié)核病人菌陰60.2(65/108)63.9(69/108)68.5(74/108)62.0(67/108)菌陽(yáng)83.5(86/103)84.5(87/103)85.4(88/103)85.4(88/103)結(jié)核病人71.6(151/211)73.9(156/211)76.8(162/211)73.5(155/211)應(yīng)用2正常人PPD陰性8.8(3/34)14.7(5/34)17.6(6/34)11.8(4/34)BCG接種陽(yáng)轉(zhuǎn)14.7(5/34)14.7(5/34)14.7(5/34)14.7(5/34)健康人11.8(8/68)14.7(10/68)20.6(11/68)14.7(10/68)結(jié)核病人菌陰62.5(15/24)62.5(15/24)71.8(17/24)62.5(15/24)菌陽(yáng)87.5(14/16)87.5(14/16)87.5(14/16)93.8(15/16)結(jié)核病人71.2(42/59)71.2(42/59)76.3(45/59)72.9(43/59)應(yīng)用3正常人PPD陰性2.9(1/34)2.9(1/34)2.9(1/34)2.9(1/34)PPD陽(yáng)性18.2(12/66)19.7(13/66)22.7(15/66)21.2(14/66)'健康人13(13/100)14(14/100)16(16/100)15(15/100)結(jié)核病人菌陰56.4(53/94)58.5(55/94)59.6(56/94)56.4(53/94)菌陽(yáng)77.8(7/9)77.8(7/9)77.8(7/9)77.8(7/9)結(jié)核病人58.3(60/103)60.2(62/103)61.2(63/103)58.3(60/103)應(yīng)用4結(jié)核性胸水74.3(26/35)77.1(27/35)82.9(29/35)77.1(27/35)實(shí)施例1:LAM+38kD+16kD;實(shí)施例2:LAM+38kD+16kD+MPT63;實(shí)施例3:LAM+38kD+16kD+MPT63+CFP10-ESAT6實(shí)施例4:LAM+38kD+16kD+MTB48上述各實(shí)施例效果總結(jié):本發(fā)明選擇靈敏度高、特異性較強(qiáng)、并具有互補(bǔ)性的結(jié)核分枝桿菌多糖LAM及重組蛋白38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6按自有的方法制備后，以不同組合聯(lián)合作為結(jié)核病抗體檢測(cè)試劑盒的抗原。通過(guò)ELISA方法評(píng)價(jià)四種不同抗原組合的試劑盒檢測(cè)360例正常人和373例結(jié)核病人血清中抗結(jié)核抗體的靈敏度和特異性。以6種抗原檢測(cè)正常人抗體0D492的平均值(X)+250為陽(yáng)性界限值，下列四種抗原組合檢測(cè)健康人和結(jié)核病人血清中抗結(jié)核抗體的陽(yáng)性率見(jiàn)表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例1(LAM+38kD+16kD);實(shí)施例2(LAM+38kD+16kD+MPT63);實(shí)施例3(L雄+38kD+16kD+MPT63+CFP10-ESAT6);抗原組合4(L認(rèn)+38kD+16kD+MTB48)。從表1可看出，實(shí)施例1檢測(cè)結(jié)核病人的靈敏度和特異性為67.8%、89.2%;實(shí)施例2檢測(cè)結(jié)核病人的靈敏度和特異性為69.7%、86.1%;實(shí)施例3檢測(cè)結(jié)核病人的靈敏度和特異性為72.4%、83.6%;實(shí)施例4檢測(cè)結(jié)核病人的靈敏度和特異性為69.2%、86.4%。雖然PPD皮試陽(yáng)性和陰性健康人之間抗體水平差異并無(wú)顯著性，但在PPD皮試陰性健康人中假陽(yáng)性率很低，假陽(yáng)性主要出現(xiàn)在PPD皮試陽(yáng)性的結(jié)核感染者和卡介苗接種者中。雖然菌陽(yáng)和菌陰兩組結(jié)核病人之間抗體水平差異無(wú)顯著性，但菌陽(yáng)病人抗體的陽(yáng)性率顯著高于菌陰病人，菌陽(yáng)病人的抗體水平也略高于菌陰病人。權(quán)利要求1、一種結(jié)核抗體多抗原ELISA檢測(cè)試劑盒，主要由檢測(cè)抗原、酶聯(lián)抗人IgG抗體、底物、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反應(yīng)板所組成的一盒體，其特征在于，所述檢測(cè)抗原采用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種脂阿拉伯甘露糖(LAM)、38kD和16kD三種與MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白之中的任意1種或1種以上結(jié)核分枝桿菌重組蛋白組合作為檢測(cè)抗原。2、如權(quán)利要求1所述的的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種采用結(jié)核分枝桿菌。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于包括(1)檢測(cè)抗原的制備采用基因工程技術(shù)克隆、表達(dá)產(chǎn)生，經(jīng)純化分別得到38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白抗原，從結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株中提純制備得到LAM;(2)用稀釋液分別稀釋所述各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白或糖抗原，使各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白或糖抗原的濃度均為lmg/ml，再將各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白或糖抗原稀釋溶液混勻后除菌濾過(guò)，分裝入一容器，lral/支，冷凍干燥備用；(3)試劑盒的裝配上述將lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌各重組蛋白和糖抗原冷凍干燥管、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清各1支、30%過(guò)氧化氫1瓶、鄰苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反應(yīng)板1塊放入包裝盒密封后，置4'C避光保存。4、如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述多種結(jié)核分枝桿菌抗原是采用基因工程技術(shù)將其中的兩種或兩種以上蛋白抗原融合表達(dá)產(chǎn)生。5、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述結(jié)核分枝桿菌抗原采用分別單獨(dú)配制或混合配制。全文摘要本發(fā)明涉及結(jié)核抗體多抗原ELISA檢測(cè)試劑盒及制備方法，屬結(jié)核病醫(yī)學(xué)免疫學(xué)診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明主要由檢測(cè)抗原、酶聯(lián)抗人IgG抗體、底物、結(jié)核病人陽(yáng)性對(duì)照血清、正常人對(duì)照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反應(yīng)板所組成的一盒體，所述檢測(cè)抗原采用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種脂阿拉伯甘露糖(LAM)、38kD和16kD三種與MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重組蛋白之中的任意1種或1種以上結(jié)核分枝桿菌重組蛋白組合作為檢測(cè)抗原。本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌靈敏度高、特異性強(qiáng)、并具有互補(bǔ)性；可用于檢測(cè)血清、胸水等體液樣品中特異的抗結(jié)核抗體，輔助結(jié)核病的診斷和鑒別診斷。文檔編號(hào)G01N33/531GK101382548SQ20081022402公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者吳雪瓊,張俊仙,張翠英,娟李,李洪敏,李邦印,艷梁,陽(yáng)幼榮申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第二附屬醫(yī)院