專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑(盒)及氨基酸的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度
的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基酸含量的測定在醫(yī)學/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測定項目。 現(xiàn)有的測定方法有色譜法、電化學法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計等方法，這 些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備成本較高等缺點。 氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出1 7種氨基酸(儀器 價格昂貴，不能普遍使用)，對于醫(yī)學/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說，多數(shù)情況下，都是 很多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示， 只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基 酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能 衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分解加速的疾病，遺傳性疾病所導致的代謝異常 均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法 簡便、成本低的特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction) 技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基 酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，采用 該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行氨基酸濃度測定， 而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明氨基酸濃度測定方法如下 氨基酸+水+氧氨某酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫
氨+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氡酶丙氨酸+水+輔酶
這種方法應用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC 1. 4. 3. 3)酶 (偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 1)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。氨 基酸氧化酶作為作用酶，功能為將氨基酸酶解產(chǎn)生氨。丙氨酸脫氫酶作為循環(huán)酶丙氨酸脫 氫酶的酶促作用使氨變回丙氨酸(一種氨基酸)，使丙氨酸(氨基酸)不斷地被重復循環(huán)利 用。丙氨酸脫氫酶又作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型 輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度， 通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算氨基酸的濃度大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨基酸診斷/測定試劑(盒)較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L
' 6000U/L 8000U/L
丙酮酸 12mmol/L 本發(fā)明的氨基酸診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。
還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的 位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨基酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L
丙氨酸脫氫酶 8000U/L
丙酮酸 12,1/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方
向為負反應(下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實施例二











本實施例的氨基酸診斷 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
丙酮酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
測定試劑為雙試劑，包括
鹽酸緩沖液 100mmol/L 50mmol/L
0. 25,1/L 12mmol/L
鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 500,1/L 6000U/L 8000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
實施例三 本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 丙酮酸 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100,1/L 50mmol/L 0. 25,1/L 12mmol/L
100,1/L 500,1/L
丙氨酸脫氫酶 8000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定氨基酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起
始吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑
2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左
右，檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0009 ;吸光度時間反應曲線應呈下 降曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達40mmol/L ;試劑測試的不準確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 08±0. 04 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā) 明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權(quán)利要求
一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸濃度測定方法，其方法如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫氨+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶丙氨酸+水+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出氨基酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶<formula>formula see original document page 2</formula>丙酮酸試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸組成雙劑試劑； 試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化 酶、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸在試劑1或試劑 2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫 酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸 脫氫酶、丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號G01N33/48GK101750338SQ20081023568
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司