專利名稱：抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法,更具體地說是 一種磁性納米顆粒與抗體偶聯(lián)和純化的方法，獲得的偶聯(lián)抗體適用于禽流感病毒等病原 微生物的富集，從而能從水中或者其它環(huán)境樣品中快速檢測出禽流感病毒，屬于檢驗檢 疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病。截止到 2008年4月(2003年始)，世界衛(wèi)生組織共報告高致病性人禽流感確診病例378例，分 別來自14個國家，死亡率高達63%。由于禽流感的高死亡率以及人類對禽流感病毒普 遍缺乏免疫力，研究禽流感病毒的任務(wù)十分艱巨。目前對于禽流感病毒的檢測已經(jīng)有許 多方法，例如病毒分離、RT-PCR、 ELISA、熒光RT-PCR等，但這些方法無疑都存在檢 出率的問題，如果樣品中病毒含量沒有達到該檢測方法的檢測下限，就檢測不出來，因 此本領(lǐng)域迫切需要一種富集禽流感病毒的方法，同時具有靈敏快速和設(shè)備簡單、成本低 廉的特點，以便更好更快的診斷、治療和預(yù)防禽流感。
納米技術(shù)是目前國際上基礎(chǔ)研究和高新技術(shù)發(fā)展中最具有前瞻性、帶動性的重點領(lǐng) 域之一。納米材料因具有獨特的物理化學性質(zhì)，其巨大的比表面積，特異的反應(yīng)活性和 納米效應(yīng)，使其大大異于傳統(tǒng)材料，在發(fā)展快速、高靈敏度、高準確性檢測技術(shù)和傳感 手段方面具有極大的潛力。我國在納米生物材料的設(shè)計、研發(fā)、表征和潛在應(yīng)用領(lǐng)域成
果層出不窮。研究并利用新型納米生物材料的特性，結(jié)合現(xiàn)有的檢測技術(shù)，實現(xiàn)口岸快 速、高特異、高敏感檢驗?zāi)康?，開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的病原富集、納米與生物活 性物質(zhì)標記及檢測技術(shù)，對占領(lǐng)納米材料應(yīng)用性研究領(lǐng)域的制高點具有重要的戰(zhàn)略意 義。
磁性納米顆粒是由Senyei A E在1978年首先研制出來的一種新型的納米功能材 料。它的內(nèi)部是一個磁核，因而在外部磁場的作用下，微球可以定向移動；外部是一層 高分子層，表面分布著許多活性基團，可以和細胞、蛋白質(zhì)、核酸、酶等生化試劑發(fā)生 偶聯(lián)，進而在磁場的作用下實現(xiàn)分離。磁性納米顆粒從誕生開始，它就受到了科研工作者的關(guān)注，并且在生化分析領(lǐng)域得到成功的應(yīng)用。利用磁性納米顆粒分離蛋白質(zhì)、酶、 抗體、細胞，所需設(shè)備簡單、操作簡便同時分離速度快，效率高，并且能保持樣品的生 物活性，因此近年來在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，磁性納米顆粒已被廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸 分析、細胞分離、酶的固定等多個領(lǐng)域。
將磁性納米顆粒包被上特異性抗體、受體、單鏈DNA，用于分離復(fù)雜樣品中的耙體， 取得巨大成功。與傳統(tǒng)的分離方法相比，把磁性納米顆粒用于復(fù)雜組分的生化樣品的分 離，能夠?qū)崿F(xiàn)分離和富集同時進行，大大提高了分離速度和富集效率，同時也使分析檢 測的靈敏度大大提高。目前，已經(jīng)有相關(guān)的文章報道了將磁性納米顆粒應(yīng)用于檢測環(huán)境 樣品中的痕量微生物或者某些活性化學物質(zhì)，取得了很好的效果。但在目前，納米材料 與蛋白質(zhì)偶聯(lián)是一個世界性難題。主要難點包括納米材料水溶性的問題；納米材料表面 基團的活化；抗體分子和納米材料的共價結(jié)合；偶聯(lián)條件必須能保證納米材料和抗體活 性不能受損；之外還要求偶聯(lián)后能有效去除未偶聯(lián)的抗體分子。
技術(shù)內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中 禽流感病毒的方法,通過反應(yīng)條件優(yōu)化，實現(xiàn)特異性抗體與磁性納米顆粒的偶聯(lián)，并對產(chǎn) 物純化方法進行研究，從而建立磁性納米顆粒與抗體偶聯(lián)與純化的方法。
本發(fā)明的要解決的另一個技術(shù)問題是將純化的磁性納米顆粒偶聯(lián)抗體用于禽流感 病毒等病原微生物的富集，并采用快速檢測方法對富集效果進行驗證，建立一種新的特 異性的禽流感病毒快速分離、富集的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，包括如下步驟
(1) 將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合，室溫反應(yīng)2小時，得 到含有偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液；
(2) 純化偶聯(lián)產(chǎn)物，去除未反應(yīng)的抗體；
(3) 偶聯(lián)產(chǎn)物和待測溶液反應(yīng)后，用磁鐵富集；
(4) 富集產(chǎn)物的檢測。
所述步驟(1)將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合，得到含有 偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液，是指將磁性納米顆粒、偶聯(lián)劑和
禽流感病毒多克隆抗體按l-2pmol: l-6mg: 0.625-5mg的比例混合。所述"磁性納米顆粒"是指超順磁性的磁性納米顆粒。
本發(fā)明所指的"偶聯(lián)劑"是指可以使抗體和磁性納米顆粒進行共價結(jié)合的試劑。由于 抗體的結(jié)構(gòu)特征和磁性納米顆粒被修飾羧基的原因，選擇的偶聯(lián)劑應(yīng)符合下列條件的一 種能活化羧基，使活化的羧基與抗體上的氨基反應(yīng)，形成肽鍵。本發(fā)明使用的偶聯(lián)劑
為乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)或N-羥基硫代琥珀酰亞胺 (Siilfo-NHS)或二者混合。優(yōu)選為單獨使用乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽 酸鹽(EDC)。
所述的"禽流感病毒多克隆抗體"是指通過禽流感病毒抗原于哺乳動物皮下注射，進 行多次免疫后，收集被免疫動物的血清，并經(jīng)純化得到禽流感病毒多克隆抗體。
所述歩驟(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物的方法一為分子篩法純化，分子篩為sephadexG100。 所述步驟(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物的方法二為離心法純化，離心條件為4°C， 3000-12000r/min，離心10-20 min，離心后棄掉上清，所得沉淀即為偶聯(lián)抗體的磁性納 米顆粒。
所述歩驟(4)檢測富集產(chǎn)物的方法為用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒進行檢
本發(fā)明通過對磁性納米顆粒和抗體分子特性的研究，通過選擇合適的偶聯(lián)劑品種和 濃度，可以將水溶性的磁性納米顆粒與特異性的抗體進行共價偶聯(lián)，得到生物功能化的 磁性納米顆粒，這種生物功能化磁性納米顆粒與溶液中的病毒通過免疫特異性結(jié)合，再 通過磁鐵富集所需要的病毒。本發(fā)明對各種偶聯(lián)條件進行優(yōu)化，建立了制備和純化具有 免疫活性的抗體偶聯(lián)磁性納米顆粒的方法，為進一步開發(fā)相關(guān)檢測試劑奠定了基礎(chǔ)。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種新的富集禽流感病毒的方法，它分離速度快、效率高，并 且所需的設(shè)備簡單、成本低廉。
本發(fā)明的優(yōu)點是
(1) 本發(fā)明提供的方法不損失病毒活性；
(2) 本發(fā)明提供的方法速度快、效率高；
(3) 本發(fā)明提供的方法靈敏度高、特異性強。
(4) 本發(fā)明提供的方法快速、簡便，而且設(shè)備簡單、成本低廉。


圖1用熒光RT-PCR法檢測富集前、后的病毒含量檢測結(jié)果。圖2用熒光RT-PCR法檢測富集前、后的病毒含量檢測結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1:磁性納米顆粒和禽流感病毒多克隆抗體的偶聯(lián)、純化，禽流感病毒的富
集和檢測 1、材料
pH8.0的硼酸緩沖液0.05 M硼砂30% (V/V)， 0.2 M硼酸70% (V/V)， pH值 為8。
磁性納米顆粒(購自天津倍思樂公司產(chǎn)品)，EDC (乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 酰二亞胺鹽酸鹽)，Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)，乙醇胺，1M甘氨酸，0.02 M NaH2P04， O.lMNaCl， 1%疊氮鈉(質(zhì)量百分比)，Sephadex G100 (購自BIO-RAD產(chǎn) 品)，DEAE Sepharose Fast Flow (購自Pharmacia公司)。
禽流感病毒抗原(購自哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室)。
弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(購自北京市生物制品檢定所)。
TRIZOL試劑(INVIOTROGEN)。
禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒(購自深圳匹基公司產(chǎn)品)。 禽流感病毒多克隆抗體(6.25mg/ml)，自制；其制備方法為用禽流感病毒抗原分4 次免疫新西蘭大白兔，第1次免疫取2.0mL (250 pg/mL)禽流感病毒抗原與等體積 弗氏完全佐劑，充分研磨至完全乳化，兔頸背部皮下多點注射；間隔3周后進行第2次 免疫取2.0mL (150 pg/mL)禽流感病毒抗原與等體積弗氏不完全佐劑，充分研磨至 完全乳化，兔頸背部皮下多點注射；間隔3周后進行第3次免疫取2.0mL(150pg/mL) 布氏桿菌可溶性抗原，兔耳靜脈注射。20天后，頸動脈放血收獲抗血清。
取20ml上述血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH4) 2304飽和溶液10ml，使 成20% (NH4) 2S04溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。 4°C, 3000r/min離 心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。在上清液中再加(NH4) 2S04飽和溶液30ml， 使成50% (NH4) 2S04溶液，充分混合，靜置30min。 4°C， 3000r/min離心20min，棄 上清。于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH4) 2S04飽和溶液10ml，使成 33% (NH4) 2S04溶液，充分混合后，靜置30min。 4°C， 3000r/min離心20min，棄上 清，以除去白蛋白。用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。4。C冰箱中透析除鹽，在 常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4。C透析24h，中間換液5次。4°C， 3000r/min離心10min去沉淀，上清液即為粗提禽流感病毒多克隆抗體。 粗提禽流感病毒多克隆抗體的離子交換樹脂純化
1) 取體積分數(shù)為20%酒精浸泡的DEAE Sepharose Fast Flow填料20mL裝填柱子(112 cmx20 cmMillipore,購自BIO-RAD公司)，先用200 mL純水以1.5 mL/min洗柱，再 用100 mL的Buffer A( 10 mmol/LTris-HClpH 8.0)以1.5 mL/min平衡柱子。
2) 將初純后所得的禽流感病毒多克隆抗體樣品利用透析袋更換成Buffer A緩沖液， 以1.0 mL/min流速上樣，同時開啟紫外檢測儀，開始記錄。
3) 上樣完畢后,首先用Buffer A洗脫,洗脫速度為1.0 mL/min ，并收集洗脫峰后；隨 后用含有0.1 mol/LNaCl Buffer A溶液進行等梯度洗脫，收集洗脫峰1，標記為P1， PI 樣品即為純化的禽流感病毒多克隆抗體，于4"冰箱保存。
2.方法
(1) 磁性納米顆粒和抗體的偶聯(lián)濃度為0.01 M的磁性納米顆?；鞈乙喝?00 ^ 加硼酸緩沖液補至800 pl，加入EDC 2mg和Sulfo-NHS 4mg，室溫反應(yīng)15分鐘。然后 加入10 ^乙醇胺淬滅EDC 。加100 ^禽流感病毒多克隆抗體(6.25 mg/ml)，室溫反 應(yīng)2小時。加100 ^ 1 M甘氨酸，封閉磁性納米顆粒上的未反應(yīng)的羧基。最后加入10 (^11%疊氮鈉，放到2'C冰箱中保存。
(2) 分離未偶聯(lián)的磁性納米顆粒和抗體(用Sephadex G100分子篩分離)取10 g SephadexG100干粉，加入適量0.1 MNaCl， 100。C加熱3小時，冷卻至室溫后，裝入層 析柱中。調(diào)整好流速后，用200mlNaH2PO4洗脫。使用紫外檢測器檢測洗脫液的280 nm 吸收值。收集各個組分，最前面的組分應(yīng)為所需磁性納米顆粒和抗體的偶聯(lián)產(chǎn)物。
(3) 偶聯(lián)產(chǎn)物富集禽流感病毒
① 抗原抗體反應(yīng)取n個(11=稀釋的禽流感病毒抗原個數(shù))1.5ml離心管分別加入 按比例稀釋的禽流感病毒抗原各1000pl，再在每管中各加入10(Vl偶聯(lián)有抗體的磁性納 米顆?；鞈乙海w上蓋子，室溫下渦旋充分混合或振蕩混合，37'C培養(yǎng)箱中濕盒孵育60 分鐘；
② 磁鐵富集將離心管從37'C培養(yǎng)箱中取出置于磁分離架上，室溫靜置45分鐘。 小心地吸出上清液。從磁分離架上取出離心管，加入20(^1PBS (0.02M， pH7.2)，渦旋 混合，即得到富集后的樣品。
(4) 富集產(chǎn)物的檢測將上述富集后的樣品以及上清液用TRIZOL試劑提取RNA, 用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒進行檢測，具體方法詳見《H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》GB/T 19438.2-2004。 3.結(jié)果
如圖1所示，Ct值越低病毒含量越高，Ct值越高病毒含量越低。用偶聯(lián)抗體的磁性 納米顆粒富集后的病毒含量(上面的曲線A)明顯比用未偶聯(lián)抗體的磁性納米顆粒富集 后的病毒含量(中間的曲線B)以及富集前(下面的曲線C)的病毒含量高。
實施例2:磁性納米顆粒和禽流感病毒多克隆抗體的偶聯(lián)、純化，禽流感病毒的富 集和檢測
1. 材料
pH8.0的硼酸緩沖液0.05 M硼砂30% (V/V)， 0.2 M硼酸70% (V/V)，溶解后 pH為8。
磁性納米顆粒(購自天津倍思樂公司產(chǎn)品)，EDC (乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 酰二亞胺鹽酸鹽)，乙醇胺，1M甘氨酸，0.02MNaH2PO4， O.lMNaCl， 1%疊氮鈉(質(zhì) 量百分比)，DEAE Sepharose Fast Flow (購自Pharmacia公司)。
禽流感病毒多克隆抗體(6.25mg/ml)，同實施例1的制備方法。 禽流感病毒抗原(購自哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室)。 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(購自北京市生物制品檢定所)。 TRIZOL試劑(INVIOTROGEN)。
禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒(購自深圳匹基公司產(chǎn)品)。
2. 方法
(1 )磁性納米顆粒和抗體的偶聯(lián)取濃度為0.01 M磁性納米顆?；鞈乙?00 Ml和 800 禽流感病毒多克隆抗體(6.25 mg/ml)，加入EDC 2mg室溫反應(yīng)2小時。力n 100 pllM甘氨酸，封閉磁性納米顆粒上的未反應(yīng)的羧基。最后加入10pl 1%疊氮鈉，放 到2T:冰箱中保存。
(2) 分離未偶聯(lián)的磁性納米顆粒和抗體將偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物離心，離心條件為 4。C， 3000-12000r/min，離心10-20 min，離心后輕輕棄掉上清，所得沉淀即為偶聯(lián)抗體 的磁性納米顆粒，然后將沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS， 0.02M， pH7.2)懸浮備用。
(3) 偶聯(lián)產(chǎn)物富集禽流感病毒
①抗原抗體反應(yīng)取n個(n-稀釋的禽流感病毒抗原個數(shù))1.5ml離心管分別加入 按比例稀釋的禽流感病毒抗原各1000|^1，再在每管中各加入ioow偶聯(lián)有抗體的磁性納米顆?；鞈乙?，蓋上蓋子，室溫下渦旋充分混合或振蕩混合，37'C培養(yǎng)箱中濕盒孵育60 分鐘；
②磁鐵富集將離心管從37i:培養(yǎng)箱中取出置于磁分離架上，室溫靜置45分鐘。 小心地吸出上清液。從磁分離架上取出離心管，加入200^1 PBS (0.02M， pH7.2)，渦旋 混合，即得到富集后的樣品。
4)富集產(chǎn)物的檢測將上述富集后的樣品以及上清液用TRIZOL試劑提取RNA， 用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒進行檢測，具體方法詳見《H5亞型禽流感病毒 熒光RT-PCR檢測方法》GB/T 19438.2-2004。
3.結(jié)果
如圖2所示，Ct值越低病毒含量越高，Ct值越高病毒含量越低。用偶聯(lián)抗體的磁性 納米顆粒富集后的病毒含量(上面的曲線A)明顯比用未偶聯(lián)抗體的磁性納米顆粒富集 后的病毒含量(中間的曲線B)以及富集前(下面的曲線C)的病毒含量高。
權(quán)利要求
1. 抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，包括如下步驟(1)將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合，室溫反應(yīng)2小時，得到含有偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液；(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物，去除未反應(yīng)的抗體和磁性納米顆粒；(3)偶聯(lián)產(chǎn)物和待測溶液反應(yīng)后，用磁鐵富集；(4)富集產(chǎn)物的檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步驟(1)將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合， 得到含有偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液，是指將磁性納米顆粒、 偶聯(lián)劑和禽流感病毒多克隆抗體按l-2pmol: l-6mg: 0.625-5mg的比例混合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，其特征在于所述磁性納米顆粒為超順磁性的磁性納米顆粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，其特征在于所述偶聯(lián)劑為乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽或N-羥基硫代琥珀酰亞胺或者上述二者任意混合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，其特征在于所述偶聯(lián)劑為乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步驟(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物的方法為分子篩法純化，分子篩為sephadex G亂
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步驟(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物的方法為離心法純化，離心條件為4°C， 3000-12000r/min,離心10-20 min,離心后棄掉上清，所得沉淀即為偶聯(lián)抗體的磁性納 米顆粒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述禽流感病毒多克隆抗體為禽流感病毒抗原于哺乳動物皮下注射，進行 免疫后，收集被免疫動物的血清并經(jīng)純化得到的禽流感病毒多克隆抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步驟(4)檢測富集產(chǎn)物的方法為用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒進行檢測.
全文摘要
本發(fā)明公開了抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，屬于檢驗檢疫領(lǐng)域。抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，包括如下步驟(1)將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合，室溫反應(yīng)2小時，得到含有偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液；(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物，去除未反應(yīng)的抗體；(3)偶聯(lián)產(chǎn)物和待測溶液反應(yīng)后，用磁鐵富集；(4)富集產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明提供的方法不損失病毒活性；本發(fā)明提供的方法速度快、效率高；本發(fā)明提供的方法靈敏度高、特異性強。本發(fā)明提供的方法快速、簡便，而且設(shè)備簡單、成本低廉。
文檔編號G01N33/577GK101435824SQ20081023967
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者于維正, 潔 任, 丹 吳, 張向東, 柏亞鐸, 琳 汪, 王孔江, 賴平安, 亮 辛, 高志強 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局