專利名稱：：一種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：微囊藻毒素(microcystins,MC)是水華發(fā)生時(shí)水體中藍(lán)藻爆發(fā)性繁殖產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。MCs是一個(gè)結(jié)構(gòu)相似的環(huán)七肽家族，目前在淡水中已發(fā)現(xiàn)80多種不同的MCs(WHO，2004)，其中MC-LR是目前已知的毒性最強(qiáng)的、急性危害最大的一種淡水藍(lán)藻毒素(Sivonen,1996;韓志國(guó)等，2001)。MC-LR是一種肝毒素，這種毒素是肝癌的強(qiáng)烈促癌劑，能導(dǎo)致肝壞死、出血或凋亡(Liu等，2000)。近年來(lái)水華頻繁出現(xiàn)，面積逐年擴(kuò)散，我國(guó)太湖、滇池、巢湖、洪澤湖都時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重威脅著生態(tài)安全和人類的飲水安全，因此，對(duì)水體中微囊藻毒素進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)非常重要。如何建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的檢測(cè)手段，以便采取適當(dāng)措施減少危害，是目前迫切需要解決的問(wèn)題。傳統(tǒng)檢測(cè)方法中大多采用HPLC、LC/MS、GC等方法檢測(cè)水體中微囊藻毒素，這些方法不僅步驟復(fù)雜，儀器設(shè)備也較昂貴，并不不適合廣泛實(shí)時(shí)的應(yīng)用。而免疫分析法以其價(jià)格低廉，靈敏度高，可操作性強(qiáng)成為一項(xiàng)值得推廣應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)，免疫檢測(cè)是基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的檢測(cè)方法，在檢測(cè)水體中的微囊藻毒素方面，由于其檢測(cè)速度快，費(fèi)用低廉而適合大規(guī)模樣品的快速篩選；其高特異性高靈敏度對(duì)于預(yù)警檢測(cè)方面有很廣闊的應(yīng)用前景。免疫檢測(cè)整體上是一種理想的檢測(cè)方法，其關(guān)鍵在于獲得特異性和結(jié)合親和力良好的抗體，特別是單克隆抗體。微囊藻毒素這類小分子有機(jī)污染物，屬于半抗原物質(zhì)，其免疫原性很弱或者沒(méi)有免疫原性，即直接以其免疫動(dòng)物時(shí)，很難大量獲得或者根本不產(chǎn)生的抗體，必須要載入到大分子載體物質(zhì)中，才能成為完全抗原；即使獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的抗體后，這種抗體的大量生產(chǎn)制備也是一項(xiàng)昂貴費(fèi)時(shí)的工作，一言以蔽之，利用免疫檢測(cè)方法檢測(cè)水體中微囊藻毒素，目前為止抗體的大量制備仍然是一個(gè)難題。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展起來(lái)的重組抗體技術(shù)為這個(gè)難題的解決帶來(lái)了福音，重組抗體技術(shù)是將單克隆抗體的抗原活性識(shí)別區(qū)域的基因拼接起來(lái)，克隆到常用載體中轉(zhuǎn)化微生物，利用微生物生產(chǎn)單鏈抗體，這些單鏈抗體具備原單克隆抗體的抗原結(jié)合活性，McElhineyJ.等從人噬菌體體庫(kù)中篩選出一株抗MC-LR單鏈抗體，能夠檢測(cè)出低于世界衛(wèi)生組織所規(guī)定飲用水標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)值(l嗎/L)[9]，因此單鏈抗體的檢測(cè)靈敏性得到證實(shí)。而重組抗體技術(shù)生產(chǎn)單鏈抗體比傳統(tǒng)的單克隆抗體制備方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、周期短，因此是免疫檢測(cè)技術(shù)運(yùn)用中的一項(xiàng)理想的輔助技術(shù)，在抗微囊藻毒素的單鏈抗體制備中有廣闊的運(yùn)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)上述領(lǐng)域中的缺陷提供一種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用，為微囊藻毒素抗體制備提供了簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的途徑。一種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.l所示的序列。上述重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SeqIDNo.5所示。一種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示的序列。上述輕鏈可變區(qū)基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SeqlDNo.6所示。一種單鏈抗體的基因，其特征在于包括上述如SeqIDNo.l所示的重鏈可變區(qū)基因序列和如SeqIDNo.2所示的輕鏈可變區(qū)基因序列。上述單鏈抗體的基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示。上述單鏈抗體的基因序列編碼的多肽。上述多肽的氨基酸序列如SeqIDNo.4所示。包含所述單鏈抗體的基因序列的表達(dá)載體pET-MC。擴(kuò)增上述重鏈基因序列的簡(jiǎn)并引物和特異性引物，簡(jiǎn)并引物HFR1:5'-SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG-3,特異性正向引物VH-B:5'-GGGAATTCCATATGGAGGTTAAGCTGCAGGAGTC-3'，特異性正向弓l物Vh-F:5'-CCGCTACCACCCCCTCCAGATCCGCCACCTCCTGAGGAGACGGTGACCGT-3';擴(kuò)增上述輕鏈基因序列的簡(jiǎn)并引物和特異性引物，簡(jiǎn)并引物L(fēng)FR:5'-GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3，特異性正向引物VL-B:5'-CTGGAGGGGGTGGTAGCGGTGGAGGCGGGAGTGATATTGTGATGACACAGTC隱3',特異性反向引物VL-F:5'-GGTCTCGAGTTACCGTTTGATTTCCAGCTTGG-3'。上述多肽作為單鏈抗體在檢測(cè)及定量微囊藻毒素中的應(yīng)用。本發(fā)明采用根據(jù)鼠源單克隆抗體的保守區(qū)基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引HFR1/LFR，以一株表達(dá)抗MC-LR的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞G5的總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR分別擴(kuò)增出1500bp和900bp的兩個(gè)基因片段(圖l)。測(cè)序后，序列分析表明，擴(kuò)增的大片段為1473bp，如SeqIDNo.7所示，為單克隆抗體重鏈的DNA序列，包括部分重鏈可變區(qū)(VH)，完整的CH1、CH2、CH3三個(gè)恒定區(qū)和3'端非編碼區(qū)，其中VH大小為363bp，編碼121個(gè)氨基酸；擴(kuò)增到較小的片段為880bp如SeqIDNo.8所示，為輕鏈DNA序列，包括部分輕鏈可變區(qū)(VJ，完整的恒定區(qū)和3'非編碼區(qū)，其中V,.,大小為336bp，編碼112個(gè)氨基酸。Vh和Vl符合小鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因特征，均含有4個(gè)框架區(qū)(FR)、3個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)及抗體特征性的2個(gè)半胱氨酸殘基，且基因內(nèi)無(wú)終止密碼子，表明所克隆的序列為鼠源抗體的基因序歹ll(Martin,A.C.R.AccessingtheKabatAntibodySequenceDatabasebyComputer.PiOrE/AAS:c'/wre，F(xiàn)w"ctowadGe朋"c、1996,25:130-133);根據(jù)擴(kuò)增得到的片段設(shè)計(jì)特異性引物VH-B/VH-F，VL-B/VL-F擴(kuò)增出該單克隆抗體重鏈可變區(qū)Vh的基因其序列如SeqIDNo.l所示及輕鏈可變區(qū)V,」的基因其序列如SeqIDNo.2所示。本發(fā)明獲得的上述輕鏈、重鏈可變區(qū)基因序列所編碼的多肽具有單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列，可作為^鏈抗體或者多價(jià)抗體的組成部分，用于免疫檢測(cè)或者抗原物質(zhì)的定量。本發(fā)明獲得的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列可重組成一條單鏈抗體基因，也可以與其他抗體的可變區(qū)基閑重組成多價(jià)抗體基閑，本發(fā)明中采用重疊延伸PCR擴(kuò)增法將SeqIDNo.l與SeqIDNo.2拼接起來(lái)得到單鏈抗體scFv基因，其中將兩條基因序列拼接起來(lái)的過(guò)渡基因是p丄選的，輕鏈與重鏈的前后順序也沒(méi)有特別的要求。本發(fā)明優(yōu)選采用Huston等(HustonJS,LeuinsonD,Mudgett-HonterM,etal.Proteinengineeringofanantibodybindingsites:recoveryofspecificactivityinananti-digoxinsinglechainFvanalogueproducedinEscherichiacoli.尸racAto/.4c"<i5t/，7988,85(16):5879-5883)根據(jù)Fab片段X線晶體衍射分析資料設(shè)計(jì)出的具有剛性結(jié)構(gòu)的15肽(Gly4Ser)3作為輕鏈與重鏈的連接肽，將15肽(Gly4Ser)3的基因序列設(shè)計(jì)到重鏈特異性引物VH-F的3'端，輕鏈特異性引物VtB的5'端，通過(guò)重疊延伸PCR引入連接肽基因序列，獲得如SeqlDNo.3所示序列的單鏈抗體基因，其核苷酸序列結(jié)構(gòu)為5'-VH-linkcr-VL-3'(圖6)。重組獲得scFv基因序列可編碼包含有單克隆抗體的輕鏈與重鏈的抗原結(jié)合區(qū)域蛋白質(zhì)的氨基酸序列。本發(fā)明將獲得重組scFv基因序列SeqIDNo.3構(gòu)建到載體pET-28a(+)中獲得表達(dá)載體pET-MC,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌OrigamiTM2，獲得的重組子命名為pScFv，pScFv表達(dá)的蛋白經(jīng)純化后在SDS-PAGE電泳膠上顯示出一條大小約為30KD的蛋白；經(jīng)過(guò)Westernblot檢測(cè)，結(jié)果分析表明，鼠抗His抗體能與此30KD的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行特異結(jié)合反應(yīng)，而與其它條帶均無(wú)結(jié)合反應(yīng)圖3B，證明此蛋白即為目的單鏈抗體蛋白。本發(fā)明還通過(guò)ELISA方法檢測(cè)本爭(zhēng)鏈抗體與MC-BSA之間特異識(shí)別能力,其中，MC-BSA為偶聯(lián)在BSA分子上的MC-LR。測(cè)定結(jié)果表1顯示scFv抗體與MC-BSA呈陽(yáng)性反應(yīng)，相比，對(duì)照呈陰性反應(yīng)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明該蛋白具有與抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的能力，且結(jié)合的強(qiáng)度與所加的單鏈抗體的濃度呈JT.相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明獲得的重組單鏈抗體基因可以在大腸桿菌中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物可以代替單克隆抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)反應(yīng)以檢測(cè)或監(jiān)控水體中的微囊藻毒素，解決了難以大量快速獲得單克隆抗體的問(wèn)題。本發(fā)明的單鏈抗體基因序列編碼的多肽包含抗微囊藻毒素單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列，其中連接輕鏈與重鏈的過(guò)渡肽是可選的，本發(fā)明獲得的單鏈抗體基因序列SeqIDNo.3編碼的多肽序列如SeqIDNo.4所示，SeqIDNo.4所示的序列符合小鼠免疫球蛋白可變區(qū)的特征，含有重鏈部分的4個(gè)框架區(qū)(FR)、3個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)及抗體特征性的2個(gè)半胱氨酸殘基以及輕鏈部分的4個(gè)框架區(qū)(FR)、3個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)及抗體特征性的2個(gè)半胱氨酸殘基(圖4)。該氨基酸序列可代替抗微囊藻毒素的單克隆抗休用于免疫檢測(cè)反應(yīng)中以檢測(cè)水體中的微囊藻毒素。本發(fā)明獲得的單鏈抗體基因可作為構(gòu)建多價(jià)抗體的組成單元，即可應(yīng)用于制備多價(jià)(具有三個(gè)或更多個(gè)功能性抗原結(jié)合部位的基因工程抗體)高親和力的抗體。其利用微生物大量表達(dá)的單鏈抗體蛋白可用于水體中微囊藻毒素的批量檢測(cè)與監(jiān)控。說(shuō)明書附圖圖1重鏈和輕鏈基因序列的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，M:DL2000plusmarker;1:重鏈基因的PCR擴(kuò)增；2:輕鏈基因的PCR擴(kuò)增。圖2Vh和Vl的併接。M:DL2000plusmarker;1:VH和VL的拼接產(chǎn)物圖3A抗微囊藻毒素scFv的SDS-PAGE，圖3B抗微囊藻毒素scFv的Westernblot結(jié)果。M:蛋白Marker;1與5:轉(zhuǎn)化pET-28a的Origammi2菌液2與4:轉(zhuǎn)pET-M的Origami2菌液；3與6:回收的scFv。圖4單鏈抗體基因序列編碼的氨基酸序列。圖5抗微囊藻毒素scFv蛋白與純化回收的scFv蛋白，M:蛋白Marker;1:轉(zhuǎn)化pET-MC的Origami2粗菌液；2、3、4、5分別為NTA-0、NTA-20、NTA-40和NTA-60;6:回收的scFv。圖6為scFv表達(dá)載體的簡(jiǎn)單示意圖。具體實(shí)施方式1材料和方法分泌抗微囊藻毒素(MC-LR)抗體的雜交瘤細(xì)胞株G5由中閨疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所提供?？寺≥d體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司；表達(dá)載體pET-28a(+)和JM109(保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所本專利的發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室，公眾可獲得)。Origami2購(gòu)自Novagen公司。RNAisoReagent、ExTaq、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs和RNA酶抑制劑購(gòu)自Promega公司；微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品為美國(guó)Beacon公司產(chǎn)品；MC-BSA抗原的合成由北京博奧森生物技術(shù)有限公司完成；鼠抗His抗體和羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自天根公司；BCA法蛋白濃度定量試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。2引物設(shè)計(jì)引物名稱引物序列Anchor5'-GCGAGCTCCGCGGCCGCG-3';，HFR15'-SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG-3';LFR5'-GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3';線部分為AWeI位點(diǎn))；(GAGACGGTGACCGT墨3';VL-B5'-CTGGAGGGGGTGGTAGCGGTGGAGCiCGGGAGTGATATTGTGATGACACAGTC-3';VL-F5'-GGTCTCGAGTTACCGTTTGATTTCCAGCTTGG-3'(劃線部_分為屈oI〗立點(diǎn))_簡(jiǎn)并引物HFR1與LFR:根據(jù)鼠源免疫球蛋白基因的保守區(qū)基因序列設(shè)計(jì)(ZhongdeWang,MurisikuRaifu,MeredithHoward,LaurieSmith,etal.UniversalPCRamplificationofmouseimmunoglobulingenevariableregions:thedesignofdegenerateprimersandanassessmentoftheeffectofDNApolymerase3Xto5Xexonucleaseactivity.JournalofImmunologicalMethods233—2000.167—177)，分別以HFR1、Anchor和LFR、Anchor擴(kuò)增抗體的重鏈基因IgH和輕鏈基邸gL。特異性引物VH-B/V-F、Vl-B/Vl-F，其中Vu-B/Vu-F是根據(jù)擴(kuò)增出的抗體重鏈基因IgH的測(cè)序序列設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)，用于擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因序列。VrB/VrF是根據(jù)擴(kuò)增出的抗體輕鏈基因IgL的測(cè)序序列設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)，用于擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)基因序列。另外在Vh-F的3'端，V^B的5'端設(shè)計(jì)了連接肽的基因序歹!)，用于重疊延伸PCR中引入連接肽的基因Huston等(HustonJS，LeuinsonD,Mudgett-HonterM,etal.Proteinengineeringofanantibodybindingsites:recoveryofspecificactivityinananti-digoxinsinglechainFvanalogueproducedinEscherichiacoli.PracA^/Jcad5W,7988,85(16):5879-5883)根據(jù)Fab片段X線晶體衍射分析資料設(shè)計(jì)出的具有剛性結(jié)構(gòu)的15肽(Gly4Ser)3的基因序列。以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)施例1單克隆抗體重鏈及輕鏈基因序列的擴(kuò)增步驟l雜交瘤細(xì)胞總RNA的提取采用RNAisoReagent試劑盒提取細(xì)胞總RNA。步驟2反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈以提取的總RNA為模板，用引物IgR進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為總RNA3.0pl，5x反轉(zhuǎn)錄buffer2.0jil，dNTPs(2.5mMeach)2|il，HPRI(40u/pl)0.5pl，M陽(yáng)MLV0.5|il，IgR0,5pl，DEPC-H201.5|il。反應(yīng)條件為室溫10min，42t:水浴lh，在冰水中冷卻2min后，保存于-20。C。歩驟3抗體重鏈及輕鏈基因序列的PCR擴(kuò)增分別以HFR1、Anchor和LFR、Anchor擴(kuò)增抗體的重鏈和輕鏈基因。反應(yīng)體系為25pi:10xPCRbuffer2.5(xl，2.5mMdNTPs2|^I，20|iM的上下游引物各1pl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5|_d，普通Taq0.5pl，ddH20定容至25pl。反應(yīng)條件為94°C5min;94°C30s，60°C1min，72°C1min;2個(gè)循環(huán)；94°C30s，59°C1min，72°C1min;2個(gè)循環(huán)；94°C30s，58°C1min，72°C1min;2個(gè)循環(huán)；94°C30s，57°Clmin，72°C1min;30個(gè)循環(huán)；72。C10min。1。/。的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物圖1，分別在相應(yīng)的長(zhǎng)度處切下目的片段，用膠回收試劑盒回收目的片段，測(cè)序后序列分析表明，擴(kuò)增的大片段1473bp，如SeqlDNo.7所示，為抗體重鏈的DNA序列，其包括部分重鏈可變區(qū)(VH)，完整的CH1、CH2、CH3三個(gè)恒定區(qū)和3'端非編碼區(qū)，其中VH大小為363bp，編碼121個(gè)氨基酸；擴(kuò)增到較小的片段為880bp如SeqIDNo.8所示為輕鏈DNA序列，其包括部分輕鏈可變區(qū)(VL)，完整的恒定區(qū)和3'非編碼區(qū)，其中V^大小為336bp，編碼112個(gè)氨基酸。Vh和Vl符合小鼠免疫球蛋白可変區(qū)基因特征，均含有4個(gè)框架區(qū)(FR)、3個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)及抗體特征性的2個(gè)半胱氨酸殘基，且基因內(nèi)無(wú)終止密碼子，表明所克隆的序列為小鼠抗體基因序列抗體重鏈和輕鏈基因分別命名為IgH和IgL。步驟4擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)V^基因特異性引物對(duì)VH-B/VH-F與VL-B/VL-F分別擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)基因VH如SeqIDNo.l所示和輕鏈可變區(qū)基因VL如SeqIDNo.2所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。實(shí)施例2重疊延伸PCR獲得單鏈抗體sefV基因序列采用重疊延伸拼接法將PCR擴(kuò)增獲得的Vh和VL拼接為scFv基因片段。具體過(guò)程如下將回收的純序列Vh和Vt稀釋100倍后各加1^到PCR反應(yīng)管中，體系(2xbuffer12.5pl，2.5mMdNTP2.5|il，VH1VL1pl，pri腦tarTaq0.25pi,ddH20補(bǔ)充到24^1)。PCR反應(yīng)擴(kuò)增7個(gè)循環(huán)(94。C30s，52°C1min，72°C1min)，然后補(bǔ)加VH-B和Vl-F各0.5^，再以同樣的反應(yīng)條件擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，得到大小約為750bp的片段(圖2)，與預(yù)期大小相符。將片段回收后與pET-28a(+)載體用AWeI和屈oI分別酶切、連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。經(jīng)酶切和PCR驗(yàn)證篩選出的陽(yáng)性重組子命名為pET-MC(圖6)，陽(yáng)性重組子的測(cè)序結(jié)果表明，scFv基因全長(zhǎng)744bp，包括預(yù)期的Vh、V^和Linker序列(GGGGS)3，且閱讀框架正確。實(shí)施例3scFv的表達(dá)及WesternBlot分析將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-MC和對(duì)照質(zhì)粒pET-28a(+)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami2(DE3)，分別挑取含有重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒的單菌落于3mlLB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過(guò)夜，然后1:100稀釋到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD6(k)達(dá)0.41.0，分別加入IPTG至終濃度為1mM，0.5mM和0.1mM,然后于37'C誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。然后以12%的SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的菌株特異性表達(dá)出一條大小約為30kD的蛋白(圖3A)，而轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的菌株蛋白粗提液中沒(méi)有相應(yīng)的蛋白條帶。初步證明該蛋白即為目的蛋白。為了證明該蛋白為所要表達(dá)的目的蛋白，用His單克隆抗體和羊抗鼠IgG-HRP進(jìn)行WesternBlot分析。SDS-PAGE電泳完畢后，將凝膠取下，用清水漂洗后放入轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡，同時(shí)剪裁PVDF膜(先用甲醇浸泡1min)和濾紙一同在電轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡。在電轉(zhuǎn)夾上依次放置濾紙--凝膠--PVDF膜--濾紙，除凈各層間氣泡。凝膠側(cè)接負(fù)極，纖維膜側(cè)接正極，恒壓80V電轉(zhuǎn)23小時(shí)。取下PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗，加入封閉液室溫封閉1小時(shí)。加入抗His單克隆抗體室溫孵育l小時(shí)。TBST洗膜三次，每次510分鐘，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，室溫孵育l小時(shí)。洗膜同上，加入TMBG,3，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物顯色，待顯色到理想程度時(shí)用清水沖洗，終止反應(yīng)，涼干纖維膜，照相或放在陰涼避光處保存?zhèn)溆谩esternBlot分析結(jié)果顯示，鼠抗His抗體僅與此30kD的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)，而與其他條帶均無(wú)反應(yīng)(圖3B)，證明此蛋白即為目的蛋白。實(shí)施例4scFv的純化及抗原結(jié)合活性測(cè)定純化-從平板上挑取轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的單克隆，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)過(guò)夜，次曰將過(guò)夜培養(yǎng)物按1:100的比例轉(zhuǎn)接到500mlLB液體基中，繼續(xù)37'C搖床培養(yǎng)2~3小時(shí)至OD6oo達(dá)0.41.0，力nO.lmM的IPTG,于15。C過(guò)夜培養(yǎng)，進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。室溫4000rpm離心10min，收集菌體，重懸于1/20細(xì)胞生長(zhǎng)體積的NTA-0Buffer將細(xì)胞懸浮，加入溶菌酶至1mg/ml，混勻，冰上放置40min，超盧破碎細(xì)胞。加入10%TritonX-100，使其終濃度為0.05%,充分混勻，冰上放置15min,冰上超聲破碎細(xì)胞。15000rpm4'C離心15min，收集上清和沉淀，可溶性表達(dá)的目的蛋白即存在于上清中。將NTA樹(shù)脂裝入層析柱，用10倍體積的NTA-OBuffer平衡。將上述樣品加到NTA層析柱中，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。用5倍NTA體積的NTA-0Buffer洗柱，以出去非特異結(jié)合的蛋白。分別用5倍NTA體積的NTA-20,NTA-40,NTA-60，NTA-80,NTA-100，NTA-200Buffer洗脫，收集洗脫液，每管收集一個(gè)NTA體積。目的蛋白洗脫后用0.5M的NaOH溶液洗柱，以除去少量聚集在柱上的目的蛋白和其他非蛋白的雜質(zhì)。SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白在洗脫液中的分布情況。用BCA法測(cè)定蛋白濃度。活性測(cè)定在96孔酶標(biāo)板中，每孔加入100nL0.5ng/mL的MC-BSA，經(jīng)37。C孵育2h，PBST洗滌4-6次，用2。/。的脫脂奶粉封閉lh。上述包被的酶標(biāo)板經(jīng)洗板后，分別加入10(VL倍比稀釋的純化蛋白提取液，經(jīng)37。C孵育2h，洗板后，加入10(HiLl:1500稀釋的鼠抗His抗體，再經(jīng)37"C孵育2h,洗板后，再加入100nLl:2500稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，37'C孵育2h，洗板后加底物TMB于37'C顯色，用2mol/L的硫酸終止顯色，并在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光值。以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的菌株粗提液作陰性對(duì)照，抗MC-LR單克隆抗體為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。測(cè)定結(jié)果(表l)顯示scFv抗體與MC-BSA呈陽(yáng)性反應(yīng)，而且隨scFv抗體濃度的降低，反應(yīng)在450nm處的吸光值逐漸下降，相比，對(duì)照呈陰性反應(yīng)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明該單鏈抗體可以與微囊藻毒素發(fā)生特異性#入-口口o表1scFv的ELISA反應(yīng)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>S卿ENCELISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所<120>—種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用<130>P08566/NC<160〉8<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉363〈212〉DNA<213〉重鏈可變區(qū)基因ra<400〉1tgc兆gagtctggggg鄉(xiāng)ctt兆tg犯gcctgg鄉(xiāng)gtccctg肌actc60tcctgtgcagcctctggattcactttcagt犯ctatgccatgtctt鵬ttCgCCELgELCt120cc兆8gaag3ggCtgg3gtgggtcgcatccgtgggggcacctactatcca180agggccgattcaccatctcc3gagataatggcaggaacatcctgtacctg240300tacggtagtagctacgtatccttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcc360tea363<210〉2<211〉336<212〉DNA<213〉輕鏈可變區(qū)基因VL<400〉2gdtsttgtgatgacacagtctcctgcttcctt兆ctgtstctctggggcagagggccscc6Gatctc3tgcagggccagc肌朋gtgtcagtgcatctgactgcactggtsc120ceigg6icagccctcatctatcttgcatcc朋cctgg肌tct180ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctggg織gacttcaccctcaacatccat240cctgtgg鄉(xiāng)鄉(xiāng)卿atgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgtgg300acgttcggtggctggaaatc336<210〉3〈211〉744〈212〉DNA<213〉單鏈抗體scFv基因的核苷酸序列〈400〉3卿gtt卿ctgc鄉(xiāng)agtctggggg娜cttagtgaagcctggagggtccctgaaactc60tcctgtgcagcctctggattcactttcagtaactatgccatgtcttgggttcgccagsct120ccag卿卿ggctggagtgggtcgcatccattagtagtggtgg鵬cacctactatcca180gacagtgt朋鄉(xiāng)gccgat,tcaccatctccgC3gg肌C3tcctgtacc:tg240gtctg兆gt:cgccatgtttt3CtgtgC犯gaccctattac300tacggt3gtagctacgtatccttcgatgtctggggcgc鄰ggaccacggtcaccgtctcc360tc郷aggtggcggatctgga鵬ggtggtagcggtggaggcgggaigtg3tattgtgatg420acacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggc聊gggccaccEitctcatgcagg480gccagc肌肌gt.gtcagtgcactggtaccaacagaaagca540ggacagccscccaaactcctcatctatcttgcatcc肌cctggaatctggggtccctgcc600郷Ucagtggcagtgggtcttcaccctcaacatccatcc660gaagatgctgctgtcagcac兆tagggagcttccgtggacgUcggt卿720ggcaccaagcacgg744<210〉4<211>248<212〉PRT<213〉單鏈抗體scFv的氨基酸序列<400>4GluValLysLeuGinGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinThrProGluLysArgLeuGluTrpVal:354045AlaSerlieSerSerGlyGlyGlyThrTyrTyrProAspSerValLys505560GlyArgPheThrlieSerArgAspAsnGlyArgAsnlieLeuTyrLeu65707580GinMetSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaMetPheTyrCysAla859095ArgProTyrTyrTyrGlySerSerTyrValSerPheAspValTrpGly100105110AiaGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGly115120125GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAsplieValMetThrGinSerPro130135140AlaSerLeuAlaValSerLeuGlyGinArgAlaThrlieSerCysArg145150155160AlaSerLysSerValSerAlaSerAspTyrSerTyrMetHisTrpTyr165170175GinGinLysAlaGlyGinProProLysLeuLeulieTyrLeuAlaSer180185190AsnLeuGluSerGlyValProAlaArgPheSerGlySerGlySerGly195200205ThrAspPheThrLeuAsn丄丄eHisProValGluGluGluAspAlaAla210215220ThrTyrTyrCysGinHisSerArgGluLeuProT卬ThrPheGlyGly225230235240GlyThrLysLeuGlu245lieLysArg〈210>5<211〉121<212〉PRT<213>VH編碼的氨基酸序列<400〉5GluValLysL.euGinGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPhe丁hrPheSerAsnTyr202530AlaMetSerTrpValGinThrProGluLysArgLeuGluTrpVsl354045AlaSerlieSerSerGlyGlyGlyThrTyrTyrProAspSerValLys505560GlyArgPheThrlieSerArgAspAsnGlyArgAsnlieLeuTyrLeu65707580GinMetSerSerLeu85ArgSerGluAspThr90AlaMetPheTyrCysAla95ArgProTyrTyrTyrG]ySerSerTyrValSerPheAspValTrpGly100105110八laGlyThrThrValTh-rValSerSer115120<2i0〉6<211〉112<212〉PRT<213>VL編碼l的氨基酸序列<400〉6AsplieValMetThrGinSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly151015GinArgAlaThrI丄eSerCysArgAlaSerLysSerValSerAlaSer202530AspTyrSerTyrMetHisTrpTyrGinGinLysAlaGlyGinProPro354045LysLeuLeulieTyrLeuAlaSerAsnGluSerGlyValProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrA印PheThrLeuAsnlieHis65707580ProValGluGluGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGinHisSerArg859095GluLeuProTrpThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlulieLysArg100105110<210〉8<211〉1473<212>DNA<213〉重鏈基因IgH基因部分核苷酸序列<400>8tgcaggagtctggggg郷cttagtgaagcctggagggtccctg肌actc60tcctgtgcagcctctggattcactttcagtsactatgccatgtcttgggttcgccsgact120ggctgg恥tgggtcgcatccattagtagtggtgggggcscctactatcca180鄉(xiāng)gccgattcaccatctccgcagga^catcctgtacctg240caaatgagcagtct.g郷tctg郷scacggccatgtttt3ctgtgcaagaccctattac300tacggtagtagct￡tcgtaXccttcgatgtxtggggcgc兆ggaccacggtcaccgtct.cc360tcagccaaaaC33C￡lgCCCCatcggtctatccactggcccctgtgtgtgg420ggctcctcggtgactctaggatgcctggtctccctgagccagtgaccttg480acctggaactctggatccctgtccagtggtgtgcacacctt,cccagctgt.cctgcagtct540gacctctacaccctcagcagctcagtgactgtaacctcgagcacctggcccagccagtcc600atcacctgca3tgtggCCC3cccggcaagc3gC3CC33gg犯ttgagccc660ctgt.cctcca"tgcaaatgcccctcttgggt720gga_ccatccgtcttcatcttccctcc肌agatcaaggatgtactcatgatctccctgagc780CCC3t3gtC3catgtgt船agcgaggatga_cccaga_tgtccagatcagc840tggUtgtgaacaacgtggagctcagacacagaggattac900肌cagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactgg3tg3gtggC960^gg鄧ttcaaatgc犯ggtgacctcccagcgcccatcgagagaaccatc1020卿ggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctcc1080cactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagac1140stttacgtggca^cggga肌C3Ctg犯CC3120gtcctggactctgatggttcttacttcatgta_ca_gc^gctg柳gtgg3a犯ga^ga^c1260tgggtgg咖ctcctgttcagtggtccacgc犯tc3ccac1320gcttctcccggsctccgggt幼3tg3gCtCaaactctcag1380gtccaB3g3gtcatctccatgcttcccttggcacccagca14403tgCCtggg3ccatgtaaaaaaa1473<210〉8<211>880<212〉DNA<213〉輕鏈基因IgL基因部分核苷酸序列<400〉8tcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggcceicc60atctcatgcagggccagcaaaagtgtc兆tgcatctgactgcactggtac120c犯cag肌agcsggac8gcc3CCC肌3CtCctcatctatcttgcatccaacctggaatct180ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtCtggg3C3gacttcaccctcaacatccat240cctgtggaggag卵卿tgctactgtcagcgcttccgtgg300崎ttcggtggaggcaccaagctggaaatc肌acgggctgatgctgcaccaactgtatcc360atcttcccaccatccagtgatctggaggtgcctcagtcgtg"tgcttcttg420犯c肌cttct3CCCC犯3g3catcaatgtcttgatggcagtg朋cgacaa480犯tggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagc540agcaccctca^cgttgaccaa卿Cg兆t3tctgtgaggcc600csitc朋cttcacccattgtcaagagcttcagtgtt卿gs660ca^ggtcctgagacgcc3ccaccagctccccagctccatcctatcttcccttctaaggt720cttggaggcttccccacetagcgacctaccactgttgcggtgctccaaacctcctccccac780ctccttctcctcctcctccctttccttggcttttatcatgctaatatttg840gagtctttgc880權(quán)利要求1.一種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。2.權(quán)利要求1所述的重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SeqIDNo.5所示。3.—種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)基因，其核苷酸序列如SeqlDNo.2所示。4.權(quán)利要求3所述的輕鏈可變區(qū)基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SeqlDNo.6所示。5.—種單鏈抗體的基因，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的如SeqIDNo.l所示的重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列和權(quán)利要求3所述的如SeqIDNo.2所示的輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單鏈抗體的基因，其核苷酸序列如SeqlDNo.3所示。7.權(quán)利要求5所述的單鏈抗體的基因編碼的多肽。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽，其氨基酸序列如SeqlDNo.4所示。9.包含權(quán)利要求6所述的單鏈抗體的基因序列的表達(dá)載體pET-MC。10.權(quán)利要求2、4、7所述的多肽作為單鏈抗體在檢測(cè)及定量微囊藻毒素中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及“一種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的重鏈與輕鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用”，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明提供一種抗微囊藻毒素的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因，并將兩條基因重組后獲得單鏈抗體基因，將該單鏈抗體基因構(gòu)建載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，其表達(dá)產(chǎn)物具有抗原識(shí)別活性，能用于水體中微囊藻毒素的檢測(cè)與監(jiān)控。文檔編號(hào)G01N33/577GK101429507SQ20081024030公開(kāi)日2009年5月13日申請(qǐng)日期2008年12月18日優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日發(fā)明者吳雅欣,周洪杰,宋麗敏,維張,敏林,潘家榮,許園園申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所