專利名稱：：可溶性肝抗原t細(xì)胞抗原表位及由其制備的檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種T細(xì)胞抗原表位，尤其涉及一種自身免疫性肝炎可溶性肝抗原T細(xì)胞表位及由其制備成的檢測試劑盒，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：抗原表位免疫細(xì)胞通常難以識別整個抗原分子，而僅識別抗原大分子上的一個特定的部分，稱為表位(印itope)或抗原決定簇(antigenicdeterminant)。因而表位代表了抗原分子上的一個免疫活性區(qū)，負(fù)責(zé)與免疫細(xì)胞表面的抗原受體或游離的抗體分子相結(jié)合。嚴(yán)格說來，抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子。T、B細(xì)胞往往識別抗原分子上的不同表位。確定T細(xì)胞表位，對于研究疾病的發(fā)生過程和機(jī)理、提高疾病診斷能力、判斷治療效果以及研制新的治療方法等都具有重要意義。在已知抗原一級結(jié)構(gòu)的條件下，研究T細(xì)胞表位通常的策略是，根據(jù)抗原蛋白的氨基酸序列隨機(jī)合成或連續(xù)合成一個或幾個重疊氨基酸的一系列肽段，通過淋巴細(xì)胞功能實驗確定可以被T細(xì)胞識別的肽段。這種方法的優(yōu)點是鑒定的T細(xì)胞表位較可靠，且能發(fā)現(xiàn)一些不符合多肽結(jié)合基序(motif)的MHC結(jié)合抗原肽；缺點是盲目性大，浪費人力和物力，此外由于MHC分子高度的多態(tài)性也可能造成漏檢。因此，在合成肽段之前，如果對其與MHC分子結(jié)合的可能性進(jìn)行預(yù)測，先篩選出最有可能的一些抗原片段，這樣不僅可減少工作量、節(jié)省花費，而且還能提高實驗的成功率。在經(jīng)費有限的情況下，它成為確定T細(xì)胞表位的首選方法。而重疊肽技術(shù)與細(xì)胞功能分析方法相結(jié)合的方法不但可以直接篩查T細(xì)胞抗原表位，而且經(jīng)計算機(jī)預(yù)測的抗原表位同樣也需要用該方法進(jìn)行驗證。在諸多的細(xì)胞功能分析方法中，酶聯(lián)斑點免疫方法是最為靈敏的方法，可以用來檢測識別低頻率EPITOPE的特異性免疫細(xì)胞。自身免疫性肝炎(AIH)是迄今為止國內(nèi)外公認(rèn)比較難于確診的一種肝病，特別是在中國，由于病毒性肝炎患者巨多，常常掩蓋了AIH，許多AIH患者多年得不到確診和正確的治療，浪費大量財力物力，縮短了患者的生存期。AIH診斷的難點主要是缺乏特異性的診斷指標(biāo)，它最常見的抗核抗體在很多疾病中都會陽性，而對自身免疫性肝炎并不能提供確診的價值。而本專利研究的可溶性肝抗原(SLA)是近年來備受關(guān)注的AIH靶抗原之一，其對應(yīng)的自身抗體SLA/LP抗體具有確定診斷的價值。Wies等報告2000例肝病患者中僅有AIH和AIH重疊綜合癥患者中出現(xiàn)抗SLA/LP陽性，認(rèn)為其具有高度的AIH疾病特異性(100%)。經(jīng)研究證實SLA/LP兩者針對的是同一抗原性物質(zhì)，即分子量為50KD細(xì)胞溶質(zhì)分子UGA抑制物tRNA相關(guān)蛋白，此蛋白參與細(xì)胞硒蛋白(Selenprotein)的生物合成與調(diào)節(jié)，因此推測抗SLA/LP抗體可能對肝細(xì)胞有破壞作用。不容置疑，SLA/LP抗體與其相應(yīng)的靶抗原一道不失為詮釋AIH致病機(jī)制的有效途徑，并由其高度的特異性而為AIH特異性診斷指標(biāo)的開發(fā)提供了新的目標(biāo)。AIH患者自身抗體可在病情不同時期出現(xiàn)抗體滴度波動或抗體消失、重現(xiàn)等變化。這種變化在ANA或SMA均較為常見。在本研究中對SLA/LP抗體滴度與患者肝炎活動指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，未發(fā)現(xiàn)SLA/LP抗體滴度與AIH肝臟炎癥活動度的相關(guān)性；動態(tài)觀察AIH患者在發(fā)病初期、病情緩解期及復(fù)發(fā)期SLA/LP抗體滴度消長情況，發(fā)現(xiàn)SLA/LP抗體滴度并未隨病情的變化而變化?，F(xiàn)有技術(shù)對自身免疫性肝炎自身抗體方面的檢測均為體液免疫檢領(lǐng)"如ELISA、免疫印跡法等檢測手段，采用ELISA方法檢測SLA/LP抗體的敏感性差，只為16.7%，且檢測手段繁復(fù)?？梢姡琒LA/LP抗體雖然是診斷AIH的特異性指標(biāo)，但該抗體靈敏度較低，并且不反映AIH患者肝臟炎癥程度及疾病狀態(tài)。由此，我們將探索的思路集中在對SLA特異性T細(xì)胞免疫研究方面。在自身免疫性肝炎研究領(lǐng)域現(xiàn)有的篩查T細(xì)胞抗原表位的技術(shù)方案為采用合成全序列肽段結(jié)合T細(xì)胞增殖試驗，即在肽段的剌激下，觀察細(xì)胞的增殖指數(shù)。其主要操作如下1、合成覆蓋目標(biāo)蛋白的全序列的重疊肽段，每相鄰兩條肽段有部分相同的氨基酸序列。2、分離研究對象的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，在一定細(xì)胞濃度下，細(xì)胞接受不同肽段的剌激，共培養(yǎng)7天，以期待細(xì)胞增殖，氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入率測定T細(xì)胞的增殖水平。將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾紙上，用P液閃儀檢測，用增殖指數(shù)來判定細(xì)胞受剌激后的增殖情況。借以判定蛋白上有效的肽段。該方案存在以下缺點1、試驗時間長，增加了污染假陽性的幾率；2、細(xì)胞用量大，增加了實驗成本；3、實驗過程中未體現(xiàn)實驗的重復(fù)性；4、實驗不能同時提示細(xì)胞受剌激后細(xì)胞因子分泌情況；5、實驗中需要放射性同位素，不環(huán)保；6、敏感性較差。綜上所述，目前存在的主要技術(shù)問題自身免疫性肝炎缺乏高特異性的診斷方式和指標(biāo)。目前診斷AIH的方法都是基于體液免疫的，缺乏細(xì)胞免疫研究在臨床的應(yīng)用。針對SLA這種疾病靶抗原的T細(xì)胞免疫國內(nèi)沒有研究。4.在觀察T細(xì)胞功能方面采用的方法靈敏度較差。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供自身免疫性肝炎可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，使人們可以從另一個角度(細(xì)胞免疫)認(rèn)識這種疾病的規(guī)律，并且利用本發(fā)明提供的抗原表位制備成檢測自身免疫性肝炎的試劑盒，具有很高的敏感性和特異性。本發(fā)明另一發(fā)明目的是提供由該可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位制備的檢測自身免疫性肝炎的試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示。上述抗原表位中的一種或幾種的組合在制備檢測自身免疫性肝炎試劑盒中的應(yīng)用?！N檢測自身免疫性肝炎試劑盒，其含有上述的可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位中的一種或多種的組合。上述的表位在制備試劑盒中為人工合成多肽。4上述檢測自身免疫性肝炎試劑盒，該試劑盒還包括96孔PVDF膜覆蓋的ELISPOT板、IFN-Y包被抗體、生物素標(biāo)記的IFN-Y檢測抗體、親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶、酶促反應(yīng)底物、含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液、植物血凝素(PHA)作為陽性對照和2PBS。上述的一種檢測自身免疫性肝炎試劑盒，其中，可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位組合終濃度為10iig/ml。上述抗原表位的制備方法為首先設(shè)計二維肽庫，經(jīng)肽庫反應(yīng)預(yù)測可能反應(yīng)的單肽，然后進(jìn)行單肽剌激PBMC進(jìn)行確證實驗；酶聯(lián)免疫斑點法觀察研究對象PBMC受SLA肽庫/單肽剌激后IFN-Y分泌情況。本發(fā)明技術(shù)方案的有益效果為經(jīng)本發(fā)明制備得到的SLA7條抗原表位，剌激外周血單個核細(xì)胞，結(jié)合ELISP0T方法，制備的試劑盒在檢測自身免疫性肝炎(AIH)的時候(1)可以提高AIH的陽性率和確診率，因為這一指標(biāo)對AIH檢測特異性非常高；現(xiàn)有技術(shù)敏感性只能達(dá)到16.7%，而本發(fā)明的敏感性可達(dá)到53.66%;并且本發(fā)明試劑盒的特異性高達(dá)98.57%。(2)有助于鑒別自身免疫性肝炎還是其他肝病引起的自身免疫反應(yīng)，尤其是在我國最常見的乙型肝炎和丙型肝炎，也經(jīng)常出現(xiàn)自身抗體，但是鑒別這兩種情況非常關(guān)鍵，因為乙型丙型肝炎與AIH采用完全不同的治療思路。本發(fā)明SLA特異性抗原表位的認(rèn)識和檢測可以協(xié)助臨床做出明確的鑒別，有效的減少誤診誤治。(3)本發(fā)明試劑盒檢測指標(biāo)可以作為臨床治療效果的觀察指標(biāo)，產(chǎn)生良好療效者，SLA抗原表位的反應(yīng)與療效不佳者有明顯區(qū)別。(4)由于SLA抗體具有高度疾病特異性(99%100%)，因此，本發(fā)明所提供的SLA抗原表位的認(rèn)識是研究自身免疫性肝炎發(fā)病機(jī)理的一個極好突破口。(5)本發(fā)明采用SLA抗原表位制備的檢測試劑盒用于檢測AIH的方法為細(xì)胞學(xué)檢測?，F(xiàn)有技術(shù)對AIH的檢測一般采用體液檢測，本領(lǐng)域技術(shù)人員長期以來一直無法正確認(rèn)識細(xì)胞免疫在AIH診斷中的作用，特別是忽視了SLA特異性T細(xì)胞反應(yīng)與臨床診斷之間有可能存在的關(guān)系，并一直認(rèn)為SLA可溶性抗原表位的合成是非常繁復(fù)的過程，制備過程中需要用到放射性物質(zhì)，最終制備出可溶性抗原表位的幾率極小，且功能性不強(qiáng)。本發(fā)明正是針對這種技術(shù)偏見做出的，經(jīng)過實驗設(shè)計出合理、簡便快速的合成方法，最終得到的7條肽段制備檢測試劑盒檢測敏感度和特異度均有大幅度提升。圖1為本發(fā)明合成的54條SLA序列肽pl-p54的ELISPOT反應(yīng)結(jié)果圖。具體實施例方式實施例11、SLA合成肽的制備采用重疊肽技術(shù)合成SLA序列肽，從人類基因文庫中調(diào)取SLA蛋白基因序列，及其所對應(yīng)的SLA蛋白氨基酸序列(NP722547，441個氨基酸)。設(shè)計重疊肽段每條肽段長20個氨基酸，重疊12個氨基酸，共合成SLA序列肽54條，合成肽純度>75%。各肽段氨基酸序列如表1所示。表lNo.氨基酸位置肽序列11-20MDSNNFLGNCGVGEREGRVA29-28NCGVGEREGRVASALVARRH317-36GRVASALVARRHYRFIHGIG425-44ARRHYRFIHGIGRSGDISAV533-52HGIGRSGDISAVQPKAAGSS641-60ISAVQPKAAGSSLLNKITNS749-68AGSSLLNKITNSLVLDIIKL857-76ITNSLVLDIIKLAGVHTVAN965-84IIKLAGVHTVANCFVVPMAT1073-92TVANCFVVPMATGMSLTLCF1181-100PMATGMSLTLCFLTLRHKRP1289-108TLCFLTLRHKRPKAKYIIWP1397-116HKRPKAKYIIWPRIDQKSCF14105-124IIWPRIDQKSCFKSMITAGF15113-132KSCFKSMITAGFEPVVIENV16121-140TAGFEPVVIENVLEGDELRT17129-148IENVLEGDELRTDLKAVEAK18137-156ELRTDLKAVEAKVQELGPDC19145-164VEAKVQELGPDCILCIHSTT20153-172GPDCILCIHSTTSCFAPRVP6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2、設(shè)計肽庫(p印tidePool):采用二維肽庫設(shè)計。設(shè)計肽庫如下每條肽分別在橫向、縱向肽庫中各出現(xiàn)一次。通過反應(yīng)的橫向肽庫與縱向肽庫的交叉，預(yù)測陽性反應(yīng)單肽。共形成肽庫15個，縱向肽庫8個，橫向肽庫7個。每個肽庫中任何一條單肽的濃度為20g/ml。經(jīng)肽庫反應(yīng)預(yù)測可能反應(yīng)的單肽，然后進(jìn)行單肽剌激PBMC進(jìn)行確證實驗。如表2所示；表2二維肽庫設(shè)計<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme-linkedi匪nospotassays,E1JSP0T)觀察研究對象PBMC受SLA肽庫/單肽剌激后IFN-y分泌情況。ELISP0T實驗流程如下第一日包被ELISP0T板1:100比例將包被抗體(1-D1K)稀釋于高壓滅菌的PBS中，K17.4。在生物安全柜中打開ELISP0T板，每孔加入50ii1稀釋的包被抗體，fC過夜。細(xì)胞復(fù)蘇與計數(shù)取入選對象凍存在液氮中的PBMC，迅速投入37t:水浴箱中，輕輕晃動，待凍存管中的液體達(dá)到半冰狀態(tài)，移出水浴箱，迅速擦干管外水滴，將管內(nèi)液體移到預(yù)加溫的9ml牛血清中，離心1500rpmX5分鐘，棄上清，彈起管底細(xì)胞團(tuán)，向管中加入預(yù)加溫的含有10%胎牛血清RPMI-164010ml，離心1500rpmX5分鐘，彈起管底細(xì)胞團(tuán)，加入含有10%胎牛血清的RPMI5ml，取lOiU與lOiU2%的臺酚蘭染色液混合，計數(shù)細(xì)胞數(shù)及存活率。其余細(xì)胞液放置37t:孵育箱中過夜。第二日棄去ELISP0T板中液體，用滅菌PBS洗板6次，每孔200ii1;每孔加入含有10%胎牛血清的RPMI200ii1封閉，室溫孵育1小時。細(xì)胞準(zhǔn)備將37t:C02孵箱中過夜的細(xì)胞取出，混勻，再次計數(shù)，計算細(xì)胞存活率；1500rpmX5分鐘水平離心，棄去上清，輕輕彈起管底細(xì)胞團(tuán)，加入適量R20液，將細(xì)胞濃度調(diào)整到4X106/ml，每孔加入細(xì)胞懸液50iil，再加入50ia的SLA肽，混勻。每例患者設(shè)一孔陽性對照，1-2孔陰性對照，植物血凝素PHA作為陽性對照，終濃度10ug/ml，陰性對照內(nèi)用RPMI-1640代替SLA肽，其余所加試劑與其他實驗孔相同。平移ELISPOT板置37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。第三日傾去ELISP0T板孔中細(xì)胞培養(yǎng)液，用含有0.05%TWEEN20的PBS洗板6次，每孔200iU，每次洗板，棄去洗液后在潔凈的紙巾上輕叩ELISPOT板，除去殘余液體。按說明書要求比例稀釋檢測抗體，每孔加入稀釋檢測抗體501，室溫孵育2-4小時。棄去板中液體，洗板同上步，洗板6次，按說明書書要求比例加入稀釋的生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶50ii1，室溫孵育45-60分鐘。洗板同上步。按水顯色液(a:b):9.6:0.4:o.i:o.i的比例配制顯色液，每孔加入顯色液100iU，待反應(yīng)斑點不再增加、顏色不再變深，自來水洗板終止反應(yīng)。避光處自然晾干ELISPOT板，讀板機(jī)統(tǒng)一條件下讀板。4、通過肽庫篩選出的單肽再次經(jīng)過ELISP0T驗證，使制備結(jié)果具有重復(fù)性及嚴(yán)謹(jǐn)性。54條SLA肽段中陽性頻率大于25%的肽段包括肽3aal7_36(28.57%)、月太4aa25-44(64.29%)、月太9aa65_84(28.57%)、月太11aa81_100(42.86%)、月太12aa89-108(64.28)、肽20aal53-172(28.57%)，肽44aa345-364(35.71%)，其中肽3與肽4、肽11與肽12為重疊肽。54條SLA肽段中平均反應(yīng)強(qiáng)度大于60SFU(斑點形成單位)/106PBMCs的肽段包括肽3(SEQIDNo.l)、肽4(SEQIDNo.2)、肽9(SEQIDNo.3)、肽11(SEQIDNo.4)、月太20(SEQIDNo.5)、肽44(SEQIDNo.6)、肽52(SEQIDNo.7)。其中肽3、肽4、肽9、肽10、肽11、肽20、肽44反應(yīng)強(qiáng)度與反應(yīng)頻率較為一致。而肽段12反應(yīng)的陽性頻率較高而反應(yīng)強(qiáng)度稍弱，肽段52反應(yīng)強(qiáng)度較強(qiáng)而反應(yīng)的陽性頻率較低，如圖1所示。實驗同時驗證上述SLA肽段可剌激T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y，證明SLA借助Thl類細(xì)胞因子途徑發(fā)揮免疫作用。進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SLA誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度及寬度與AIH患者的肝臟驗證活動程度有正相關(guān)關(guān)系，這對研究AIH尚不明了的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。實施例2制備檢測自身免疫性肝炎的試劑盒試劑盒制備所需材料96孔PVDF膜覆蓋的ELISPOT板1、IFN-Y包被抗體2、生物素標(biāo)記的IFN-Y檢測抗體3、SLA肽段組合(終濃度10yg/ml)由SEQIDNo.1至SEQIDNo.7組成。本發(fā)明具體實施方式為本發(fā)明最佳實施方式，試劑盒由7條肽段(SEQIDNo.1至SEQIDNo.7)組合，本發(fā)明所述7條肽段中的一條或多條(非七條)組合也是可以實現(xiàn)最終的檢測結(jié)果的，但是較之7條肽段的組合方式所用實驗試劑和離體全血量均需增加，因此本實施例為最佳實施方式，本發(fā)明并不受此限制。4、親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶5、酶促反應(yīng)底物6、含10X胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液7、植物血凝素(PHA)作為陽性對照8、PBSPH7.210實施例3檢測實驗(1)將混合的7條肽段(SEQIDNo.1至SEQIDNo.7)作為剌激外周血PBMC分泌IFN-r的剌激物；(2)采用ELISPOT方法檢測。這里的ELISPOT檢測的具體步驟與實施例1中完全一致。檢測對象自身免疫性肝炎41例原發(fā)性膽汁性肝硬化患者20例病毒性肝炎患者，其中包括丙型肝炎IO例，乙型肝炎20例正常對照20例檢測結(jié)果41例AIH患者中22例(53.66%)呈現(xiàn)對SLA抗原表位混合肽段剌激呈陽性；20例PBC患者中1例(5%)對SLA抗原表位混合肽段呈現(xiàn)弱陽性反應(yīng)；乙型肝炎與丙型肝炎患者無一例對SLA抗原表位肽池剌激起反應(yīng)；無一例正常對照對肽池的剌激起反應(yīng)。檢測結(jié)果見表3。表3SLA抗原表位組合肽對AIH的檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>檢測AIH的靈敏度可達(dá)53.66%，特異度可達(dá)98.57%，較SLA/LP抗體檢測指標(biāo)對AIH的靈敏度16.7%明顯提高，并且保證了高度的特異度。因此其可作為AIH的檢測指標(biāo)。對比例利用現(xiàn)有技術(shù)對上述受檢者進(jìn)行檢測檢測對象(同實施例3):自身免疫性肝炎41例原發(fā)性膽汁性肝硬化患者20例病毒性肝炎患者，其中包括丙型肝炎IO例，乙型肝炎20例正常對照20例檢測方法1、免疫條帶法檢測SLA/LP抗體將基因重組表達(dá)抗原包被于硝酸纖維薄膜上檢測抗SLA/LP抗體。(試劑購自德國歐蒙公司)。實驗流程如下將血清1:100稀釋，取50iU加入樣本反應(yīng)區(qū)，室溫平搖30min，洗膜后加酶標(biāo)記抗人IgG，室溫平搖30min，洗膜后加底物至加樣板反應(yīng)區(qū)，顯色10min，流水終止反應(yīng)，用標(biāo)準(zhǔn)對照條帶圖觀察特定區(qū)域條帶，見清晰的強(qiáng)著色帶判斷為陽性結(jié)果。2.ELISA方法檢測抗SLA/LP抗體試劑來源ELISA檢測試劑盒購置德國歐蒙公司。實驗流程①標(biāo)本準(zhǔn)備取患者血清常溫溶化，吸取5iU，PBS1:100稀釋。②加樣取預(yù)包被的酶聯(lián)板，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照品、陽性對照品及稀釋的血清樣本100ii1/孔，室溫孵育30分鐘。③洗板棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用300ill/孔PBS洗滌酶標(biāo)板，靜置30秒，洗滌3次。④每孔加酶結(jié)合物100ii1，室溫孵育30分鐘。⑤洗板，方法同2。⑥加底物100ii1/孔，室溫孵育15分鐘⑦加反應(yīng)終止液100ii1/孑L⑧測定用酶標(biāo)儀對空白孔調(diào)零，單波長450nm讀取各孔0D值。⑨結(jié)果判定CUTOFF值為20RU/ML。上述兩種方法均為現(xiàn)有技術(shù)的體液免疫檢測，在120例自身免疫性肝炎患者中共發(fā)現(xiàn)SLA/LP抗體陽性患者20例，SLA/LP抗體在自身免疫性肝炎患者中的陽性率為16.7%，而在原發(fā)膽汁性肝硬化及病毒性肝炎患者中未見該抗體檢出。該抗體對AIH檢測的靈敏度僅為16.7%。而實施例3中，本發(fā)明檢測AIH的靈敏度可達(dá)53.66%，特異度可達(dá)98.57%。因此具有顯著的進(jìn)步。序列表〈110〉首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院〈120〉可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位及由其制備的檢測試劑盒〈130〉〈160>7〈170>PatentInversion3.5〈210>1〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈400〉1AlaArgArgHisTyrArgPhelieHisGlylieGlyArgSerGlyAsp151015lieSerAlaVal20〈210>2〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈400>2lielieLysLeuAlaGlyValHisThrValAlaAshCysPheValVal151015ProMetAlaThr20〈210>3〈211〉20〈212〉PRT〈213>人工序列〈400>3ProMetAlaThrGlyMetSerLeuThrLeuCysPheLeuThrLeuArg151015HisLysArgPro20〈210>4〈211>20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400>4ThrLeuCysPheLeuThrLeuArgHisLysArgProLysAlaLysTyr151015lielieTrpPro20〈210>5<211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈400〉5GlyProAspCyslieLeuCyslieHisSerThrThrSerCysPheAla151015ProArgValPro20〈210〉6〈211>20<212>PRT〈213>人工序列〈400〉6ValValProLeuGlySerMetGinThrValSerGlyTyrThrPheArg151015GlyPheMetSer20<210>7〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列<400>7SerAspAspAsnTyrAspLysThrGluAspValAsplieGluGluMet151015AlaLeuLysLeu20權(quán)利要求一種可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。2.—種可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。3.—種可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示。4.一種可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.4所示。5.—種可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.5所示。6.—種可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.6所示。7.—種可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示。8.權(quán)利要求1至7中任意一項所述抗原表位或其組合在制備檢測自身免疫性肝炎試劑盒中的應(yīng)用。9.一種檢測自身免疫性肝炎試劑盒，其特征在于，其含有權(quán)利要求1至7中所述的可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位中的一種或幾種的組合，可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位終濃度為10iig/ml。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測自身免疫性肝炎試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括96孔PVDF膜覆蓋的ELISP0T板、IFN-y包被抗體、生物素標(biāo)記的IFN-y檢測抗體、親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶、酶促反應(yīng)底物、含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液、植物血凝素作為陽性對照和2PBS。全文摘要本發(fā)明公開了自身免疫性肝炎的可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示。T細(xì)胞抗原表位的認(rèn)識和確定擴(kuò)展了對這種疾病的認(rèn)識角度；該抗原表位中的一種或多種的組合可用于制備檢測自身免疫性肝炎試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明所述的可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位制備的試劑盒檢測的敏感性和特異性均高于現(xiàn)有檢測試劑盒水平。本發(fā)明所得到的可溶性肝抗原T細(xì)胞抗原表位方法簡便準(zhǔn)確，利用該表位制備的試劑盒成本低廉，且效果顯著，具有很好的應(yīng)用價值和市場價值。文檔編號G01N33/68GK101759780SQ20081024075公開日2010年6月30日申請日期2008年12月24日優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日發(fā)明者馮霞,劉妍,張永宏,檀玉芬,趙艷,閆惠平,馬筠申請人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院