專利名稱：：圓窗膜離體通透性試驗裝置的制作方法
技術領域：
：本實用新型涉及一種圓窗膜的試驗裝置，利用該裝置能在離體狀態(tài)下檢測圓窗膜對藥物的通透性，從而為研究內耳藥物新劑型提供實驗基礎。
背景技術：
：內耳包括耳蝸與前庭，結構精細，含有聽覺與平衡覺的感覺神經末梢。內耳系統(tǒng)疾病的臨床發(fā)病率約占耳科疾病的1/3，藥物治療為首要的治療方法，例如使用激素(甲基強的松龍、地塞米松)或神經營養(yǎng)劑治療突發(fā)性感音神經性耳聾，用氨基糖甙類抗生素進行化學性迷路切除治療頑固性外周性眩暈，用激素、神經營養(yǎng)劑等治療耳鳴。在某些內耳手術過程中或術后也需要使用激素或神經營養(yǎng)劑保護內耳功能，例如鐙骨切除術、電子耳蝸植入術。由于血-迷路屏障的存在，通過口服或靜脈(全身給藥)給入體內的藥物到達內耳組織會受到障礙。為了在內耳達到有效的治療濃度而提高全身給藥劑量將會增加肝腎的代謝負擔以及加大對其他器官產生毒副作用的可能性。近年來，經圓窗膜局部給藥治療內耳疾病的方法以其直接性及對身體低毒性的優(yōu)點而成為耳科學研究的熱點[1-5]。圓窗膜具有生物半透膜性質，被引入中耳鼓室的藥物可以經圓窗膜直接滲透到內耳。這種給藥方法跨越了血-迷路屏障，藥物的使用劑量小，而到達內耳的濃度較高，從而在全身血藥濃度幾乎為零的情況下實現(xiàn)內耳有效的藥物濃度，對身體其他器官不會產生毒副作用[6]。目前共有四種方法將藥物引入圓窗附近，以維持藥物在內耳的穩(wěn)定作用濃度與作用時間半植入式微管(MircoCath)、微型虹吸管(MicroWick)、固態(tài)載藥材料(如明膠)以及經鼓膜注射緩釋制劑[7-9]。其中經鼓膜注射緩釋劑最具微創(chuàng)性，該技術以現(xiàn)代藥劑學的發(fā)展為基礎，研制用以治療內耳疾病的緩釋制劑，如脂質體、微囊等，具有良好的應用前景。在內耳給藥的臨床前期研究中，圓窗膜對藥物的通透性為首要的觀察指標。由于圓窗膜結構精細，取材困難，因此絕大多數(shù)圓窗膜通透試驗為在體的動物試驗[10-12]。該方法的缺點是代價較高并且干擾因素較多在體動物實驗需要通過外科手術將藥物給入中耳腔，動物的個體差異以及給藥的操作方式是造成結果變異性的較大原因；約有半數(shù)的動物有假性圓窗膜，直接阻礙藥物與圓窗膜的接觸;另外，為了檢測外淋巴內的藥物濃度，抽取外淋巴液的方法也需要通過外科手術，如耳蝸底回外淋巴抽取術，約有一半的外淋巴在取材過程中被腦脊液稀釋；盡管目前Dr.Salt和Dr.Plontke提出從蝸尖所取得的外淋巴液中腦脊液的含量大大減少，然而該方法的手術路徑相對復雜；此外，在體動物的外淋巴含量極少(豚鼠鼓階外淋巴約為4微升)，對檢測技術也有相當高的要求[13,14]。因此，為了降低圓窗膜通透性試驗的成本以及減小復雜的在體實驗操作所帶來的結果變異性，離體圓窗膜藥物通透性試驗是值得探討與摸索的方法。目前，常規(guī)應用于透膜藥學試驗的裝置有Franz擴散池，該裝置由供給室與接受室兩部分組成(圖1)，取自活體動物的生物膜組織(如皮膚或角膜)可直接夾于Franz擴散池的兩室之間。實驗時接受室注滿相應的體液成份(如生理鹽水或房水)，受試藥物給入供給室；透過生物膜的藥物進入接受室后，可以抽取液體檢測藥物濃度，得到透膜的時-藥曲線。由于動物的圓窗膜面積極小(豚鼠圓窗膜平均l-2mm2)且菲薄，離體試驗裝置的設計難度大于透皮或透角膜試驗的Franz擴散池。搜索近15年的文獻中，僅有Witte和Kasperbauer(2000)設計了離體圓窗試驗裝置以研究圓窗膜對轉化生長因子Alpha的通透性(圖2)[15]。該裝置用環(huán)氧樹脂連接兩側塑料試管(分別用作中耳腔與鼓階外淋巴腔)與中間帶孔的塑料板，完整的圓窗膜連同圓窗龕取材于豚鼠，并被粘于培養(yǎng)皿的中心孔處，構成藥物通透兩室的膜性屏障；實驗時兩室分別給予4ml液體。該裝置的不足之處在于塑料試管與培養(yǎng)皿壁存在吸附藥物分子的可能性；連接材料環(huán)氧樹脂對生物活性組織如圓窗膜可能有毒性作用；接受室與供給室給予同體積的液體，不符合生理情況下圓窗膜給藥的體積與內耳容積的比例。參考文獻1.KanzakiJ,OuchiT，TsuchihashiN.Steroid-responsivesensorineuralhearingloss:combinationtherapywithprednisoloneand《airei-to.ORLJOtorhinolaryngolRelatSpec1993;55:24-29.PMID:84415202.SheaJr，GeX.DexamethasoneperfusionofthelabyrinthplusintravenousdexamethasoneforMeniere'sdisease.OtolaryngolClinNorthAm1996;29:353-358.PMID:88609333.LammK,ArnoldW.Theeffectofprednisoloneandnon-steroidalanti-inflammatoryagentsonthenormalandnoise-damagedguineapiginnerear.HearRes1998;115:149-161.PMID:94727444.NiedermeyerHP，ZahneisenQLuppaP，BuschR,ArnoldW.Cortisollevelsinthehumanperilymphafterintravenousadministrationofprednisolone.AudiolNe畫tol2003;8:316-321.PMID:145661025.YeQ,TilleinJ，HartmannR,GstoettnerW，KieferJ.Applicationofacorticosteroid(Triamcinolon)protectsinnerearfunctionaftersurgicalintervention.EarHear2007;28:361-369.PMID:174859856.GoycooleaMV,L皿dmanL.Roundwindowmembrane.Structureflinctionandpermeability:areview.MicroscResTech1997;36:201-211.PMID:9080410JacksonLE,SilversteinH.Chemicalperfusionoftheinnerear.Otolary，lClinNorthAm2002;35:639-653.PMID:124868457.Jackson￡E，SilversteinH.Chemicalperfusionoftheinnerear.OtolaryngolClinNorthAm2002;35:639-653.PMID:124868458.BaloughBJ,HofferME,WesterD,O'LearyMJ,BrookerCR,GotoM.KineticsofgentamicinuptakeintheinnerearofChinchillalangieraftermiddle-earadministrationinasustained-releasevehicle.OtolaryngolHeadNeckSurg1998;119:427-431.PMID:98070649.SheppardWM,WanamakerHH,PackA,YamamotoS,SlepeckyN.Directroundwindowapplicationofgentamicinwithvaryingdeliveryvehicles:acomparisonofototoxicity.OtolaryngolHeadNeckSurg2004;131:890-896.PMID:1557778610.ChandrasekharSS.Intratympanicdexametkasoneforsuddensensorineuralhearingloss:clinicalandlaboratoryevaluation.OtolNeurotol2001;22:18-23.PMID:1131471011.WeeS,GombotzWR.Proteinreleasefromalginatematrices.AdvancedDrugDeliveryReviews1998;31:267-285.PMID:1083762912.KatoY，OnishiH,MadiidaY.Applicationofchitinandchitosanderivativesinthepharmaceuticalfield.CurrPharmBiotechnol2003;4:303-309.PMID:1452942013.SaltAN,HaleSA，PlonkteSK.Perilymphsamplingfromthecochlearapex:areliablemethodtoobtainhigherpurityperilymphsamplesfromscalatympani.JNeurosciMethods2006;153:121-129.PMID:1631085614.SaltAN，MaY.Quantificationofsoluteentryintocochlearperilymphthroughtheroundwindowmembrane.HearRes2001;154:88-97.PMID:1142321915.WitteMC，KasperbauerJL.Roundwindowmembranepermeabilitytotransforminggrowthfactor-a:Aninvitrostudy.OtolaryngolHeadNeckSurgery2000;123(1Pt1):91-96.PMID:10889488
發(fā)明內容為了在體外模擬動物實驗中透圓窗膜給藥的生理環(huán)境，本實用新型提供一種圓窗膜通透試驗裝置(圖3)，該裝置不僅能夠提供仿生狀態(tài)下的圓窗膜通透試驗環(huán)境，而且還能夠重復使用，節(jié)約實驗成本。本實用新型要解決的技術問題是模擬生理狀態(tài)下圓窗膜兩側的中耳腔及內耳的立體環(huán)境關系；保持新鮮離體圓窗膜的生理活性；確保各實驗組件之間的可靠連接；為藥學檢測提供采樣通道。本實用新型解決其技術問題所采用的技術方案是提供一種圓窗膜的離體通透試驗裝置，該圓窗膜的離體通透試驗裝由圓窗膜、供給室、接受室及中間帶孔的圓片組成，供給室代表中耳腔，接受室代表鼓階外淋巴腔，圓片位于兩室之間，圓窗膜位于圓片中央孔，各組件順序封接,模擬生理環(huán)境下的鼓室與內耳的關系。按照本實用新型，供給室和接受室的內徑都為lcm，接口處為磨砂玻璃；供給室高lcm，接受室高1.5cm;接受室與取樣管形成連通器，取樣管內徑2mrn，高度略高于接受室，接受室的容積為1.2ml。按照本實用新型，圓片中央的孔為漏斗形，大口朝向接受室，即內耳側，小口朝向供給室，即鼓室側；圓窗膜位于中央孔的鼓室側。該漏斗形的小孔能夠避免氣泡存留o按照本實用新型，每個組件的連接使用無毒且防水的牙科水泥。組件的連接過程分步進行,并在每一步驟完成后進行質量控制，以確保組件間連接的可靠性。本實用新型的有益效果是使用對藥物影響低的玻璃組件及無毒性的連接材料構建適合圓窗膜的離體試驗裝置，可模擬生理狀態(tài)下的透圓窗膜給藥的環(huán)境，能節(jié)約實驗成本并提高結果的可靠性，為內耳局部靶向給藥研究提供方便可靠的基礎實驗條件。圖1Franz擴散池，該Franz擴散池用于體外透皮試驗和離體角膜通透試驗，由供給室與接受室組成，取自活體動物的生物膜組織可直接夾于兩室之間；圖2Witte和Kasperbauer所設計的離體圓窗膜試驗裝置，該離體圓窗膜試驗裝置所用的材料主要為聚乙烯培養(yǎng)皿和試管；圖3圓窗膜離體實驗裝置示意圖4;圖4亞甲基藍累積釋放曲線；圖5地塞米松試劑的累積釋放曲線。具體實施方式設計由玻璃材料構成的供給室1、接受室4及中間帶孔的聚苯乙烯圓片2。供給室1代表中耳腔，接受室4代表鼓階外淋巴腔，這兩個組件由手工定制而成，其大小根據Franz擴散池的比例縮小而來，并根據玻璃工的手藝進行適當調整。兩室的內徑都為lcm，接口處為磨砂玻璃。供給室1高lcm，接受室4高1.5cm;接受室4與取樣管3形成連通器，取樣管3內徑2mm，高度略高于接受室4，取樣管3為藥學檢測提供采樣通道。接受室4的容積為1.2ml。聚苯乙烯圓片2附有圓窗膜，聚苯乙烯圓片2取材于培養(yǎng)皿，中央的孔為漏斗形，由金剛砂鉆頭磨成，大口朝向接受室4，即內耳側，小口朝向供給室l，即鼓室側；漏斗形的小孔能夠避免氣泡存留。圓窗膜取材于新鮮處死的豚鼠聽泡，該過程用手術鉆在顯微鏡下小心操作完成，并檢査分離假性圓窗膜，然后短期保存于4'C林格氏液中，整個實驗時間不超過24小時，確保圓窗膜的生理活性。裝置的連接使用無毒且防水的牙科水泥，連接過程分步進行，并在每一步驟完成后進行質量控制，排除有滲漏的裝置。其具體操作如下顯微鏡下用小棉球將圓窗龕表面拭干，用牙科水泥將圓窗龕(內耳側)的骨壁封接于聚乙烯片小圓孔(中耳側)周圍，即圓窗膜位于中央孔的鼓室側。約三分鐘后水泥干固。滴林格氏液于圓窗膜及水泥周圍，若數(shù)十秒內有液體滲透到圓孔的另一側，使干燥的小棉球變濕，證明水泥有滲漏，這樣的標本多被淘汰，少數(shù)標本用牙科水泥修補后經檢査沒有滲漏。然后用牙科水泥將聚乙烯圓片的中耳側周圍與供給室磨口封接。待干后向供給室注滿林格氏液，觀察一分鐘內液面有無下降，用干燥棉球擦拭封接處是否變濕(同樣包括小圓孔的內耳側)，如果液面稍有下降或棉球變濕，則證明封接處水泥有滲漏，這樣的標本被淘汰。用同樣的方法封接接受室與圓片的內耳一側，待水泥干固后向取樣管注滿林格氏液，觀察一分鐘內取樣管的液面有無下降，用干燥棉球擦拭封接處是否變濕,如果液面稍有下降或棉球變濕，證明封接處有滲漏，經修補后仍有滲漏的標本則被淘汰。初步檢漏的步驟穿插于裝置構建的全過程之中。實驗結束后除圓窗膜外，各組件可回收消毒，重復利用。試驗一體外圓窗膜試驗裝置的建立與質量控制1材料與方法1.1試劑及儀器戊巴比妥鈉(分析純)；林格氏液(北京雙鶴藥業(yè))；亞甲基藍(化學純)；牙科水泥(A粉及B液)；解剖剪；游絲鑷；聚乙烯培養(yǎng)皿；解剖顯微鏡(OlympuS)，手鉆及鉆頭；電子天平；分光光度儀(UV-120-2,Shimadzu，Japan)。1.2裝置的設計與滲漏檢測(如前所述)1.3亞甲基藍通透試驗觀察亞甲基藍標準曲線的制備用電子天平稱量亞甲基藍，分別配成O.l、0.2、0.5、1.0、1.5、7.0、8.0pg/ml標準液，用分光光度儀在665nm波長下檢測吸光度[6]。以亞甲基藍濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，進行線性回歸得到標準曲線。選擇3個構建好的圓窗膜體外通透裝置，使接受室充滿林格氏液。配制IOmg/ml亞甲基藍溶液，分別向供給室滴加0.21111，用膠膜覆蓋供給室上口。分別于20、40、60、120、180min從取樣管抽取接受室內的液體0.2ml，同時補充相等體積林格氏液。將收集的樣品用分光光度儀在665nm下檢測吸光度。觀察整個實驗過程中取樣管液面有無上升或下降、牙科水泥封接處有無藍色液體滲出；若出現(xiàn)上述情況中之一，則提示圓窗膜破損或封接處存在滲漏，該裝置將被放棄。2結果將亞甲基藍的標準曲線進行線性回歸，得到方程y=0.1252Z+0.0099，i2=0.9991，證明其線性相關性良好。將測得的樣品吸光度，帶入標準曲線求得各個時間點的濃度(C")，用公式a=CK^C—t算得各個采樣點的累積釋放量(a)，并繪制累積釋放量-時間曲線(圖3)。其中C"為實時濃度；F'為介質體積，本實驗為接受室的體積l，2ml;K為取樣體積，本實驗為0.21111。將Qn分別代入零級、Higuchi釋放方程m進行擬合，得到每種方程的回歸系數(shù)i^2-0.0934f-1.2156(零級釋放方程)，i2=0.9084;g=0.6833—/2-3.771(Higuchi釋放方程)，f=0.825。表明3h內亞甲基藍對圓窗膜的通透更符合零級釋放。3討論3.1擴散池設計合理性的討論自從1956年Schuknecht首次報告經鼓膜向中耳腔注射硫酸鏈霉素治療梅尼埃病(menieredisease,MD)以來，經鼓室給藥治療內耳疾病的研究已有近半個世紀的歷史。然而，迄今為止多數(shù)研究工作仍然采用體內動物實驗和較為簡單的臨床觀察。由于藥物進入內耳后的吸收、分布、清除等影響因素甚多，因此體內實驗的過程難以控制，實驗結果的重復性和可信性較差。尤其在開發(fā)內耳給藥的新劑型方面，嚴密而可靠的體外試驗非常重要。近年來，關于緩釋劑型內耳局部給藥的研究已有若干報道。Balough等向栗鼠中耳注射纖維蛋白凝膠(fibringlue)與慶大霉素(GM)的混合物；以此凝膠態(tài)纖維蛋白為GM的緩釋載體。殷團芳等將透明質酸和鏈霉素的混合物灌注圓窗，但只觀察了形態(tài)學和電生理指標。由于沒有用體外試驗說明他們所用的制劑的釋藥性能，他們的實驗結果均缺乏說服力。只有Witte等在研究轉化生長因子-a對圓窗膜的通透特性的實驗中，模擬了中耳腔與內耳環(huán)境，用聚乙烯材料、試管及豚鼠圓窗膜構建成雙室模型。該裝置由左室和右室構成，分別代表中耳腔和外淋巴腔；處于兩室之間中心處的培養(yǎng)皿鉆有一直徑約1.5mm的？L，圓窗膜(連有圓窗龕)即被牙科水泥封接于此孔(與圖2類似)。實驗時左室給予4ml含有轉化生長因子-a的溶液，右室給予等體積的培養(yǎng)液。其觀測時間共4天。本實驗所設計的圓窗膜體外試驗裝置對其進行了改進，不同之處①Witte的裝置中培養(yǎng)皿與試管之間用環(huán)氧樹脂粘連；本實驗所有封接處均使用牙科水泥，對體外圓窗膜的刺激性更小。②Witte設計的裝置為左右兩室，分別代表中耳腔與外淋巴腔，實驗時兩室各給予4ml的液體；本實驗裝置由上下兩室構成，分別代表中耳腔與外淋巴腔，實驗時上室(供給室)給予藥液0,2ml、沒過圓窗膜約2mm，下室(接受室)充滿林格氏液，體積為l,2ml，此比例更接近生理條件下的給藥情況，因為生理條件下給予較少的藥液浸沒圓窗，而外淋巴腔的容積則相對較大。③Witte的實驗中，從開始觀測到實驗結束所用的時間共4天；本實驗從取圓窗膜到實驗結束均在兩天內完成。由于圓窗膜體外后脫離了生理存活環(huán)境，實驗時間越短、圓窗膜將越接近生理狀態(tài)，因此本實驗設計在兩天內完成。如果實驗條件能夠進一步改善，本實驗可以在24小時內完成。體外透皮試驗/透角膜試驗裝置-Franz擴散池為藥劑學已經廣泛成熟應用的體外試驗裝置，本實驗設計的圓窗膜體外試驗裝置與其相比則較顯粗糙，但我們在實驗過程中采取了相應的補償方法①Franz擴散池由于尺寸較大(通常高5cm)，因此實驗時下室(接受室)可放入星形攪拌子、置于磁力攪拌器上，其中的液體可被混合均勻。而本實驗由于圓窗膜極小，因此接受室的高度僅1.5cm、外徑lcm，沒有合適的攪拌子；為了使接受室內的液體混合均勻，每次取樣前及取樣過程中都需搖晃裝置數(shù)次。②大多數(shù)Franz擴散池的接受室設計有恒溫水夾層，可以通過恒溫水來維持實驗過程中接受室的溫度。而本實驗裝置體積太小，因此未設計恒溫水夾層；本實驗觀測過程中保持室溫為25'C。③用Franz擴散池進行實驗時，體外的皮膚或角膜被夾于供應室與接受室之間，無需使用粘連材料。而本實驗由于圓窗膜極小，必需粘于帶孔的聚乙烯薄片方能使之固定，因此供給室、薄片、接受室之間也需要粘連材料。本實驗使用的粘連材料全為無刺激且防水的牙科水泥，并在整個實驗過程中密切注意粘連處的滲漏情況，一但發(fā)現(xiàn)即淘汰該標本。總結Witte和Kasperburer的經驗及Franz擴散池的結構，本實驗吸取其優(yōu)點并根據情況進行了若干改進，較好解決了體外圓窗膜通透試驗中可能出現(xiàn)的各種問題。3.2亞甲基藍透膜釋放曲線亞甲基藍屬于小分子染料，價格便宜且用普通分光光度儀即可進行檢測，因此本實驗選擇亞甲基藍作為模型藥，對設計實驗裝置進行檢測。根據羅宗銘等[6]的經驗，亞甲基藍在665nm的檢測波長下其吸光度最強，因此，本實驗以665nm波長為檢測波。所測得的標準液回歸系數(shù)為0.9991(>0.999)。據此可以認為，其濃度在0.1-8.(Vg/ml時對吸光度具有良好的線性相關性。本實驗以10mg/ml亞甲基藍溶液作為釋放液注入供給室，三小時內亞甲基藍逐漸經圓窗膜滲透到接受室，可觀察到接受室內液體的顏色逐漸變藍并加深。藥物在3h內的吸光度由0.035到0.65，處于標準曲線的范圍內。比較其累積通透量的模擬方程(零級和Higuchi方程)，相關系數(shù)W進行t檢驗證明兩種方程的有統(tǒng)計學差異(t=6.137,P=0.026<0.05)，三小時內亞甲基藍對圓窗膜的通透更符合零級釋放，即符合表面擴散機制[1()]。并且可以證明該體外通透裝置的可靠性。試驗二離體圓窗膜對地塞米松不同制劑的通透性材料和方法一、主要設備、材料高效液相色譜儀(AgilentllOO，美國);雙室擴散池(自制)；色譜柱(Nova-Pak8C183.9*150mm);電子天平(BP3100Psartorius);解剖顯微鏡(Olympus);手鉆及鉆頭；甲醇(色譜純，天津四友)；地塞米松磷酸鈉(天津天藥)；林格氏液(北京天鶴)；海藻酸鈉(分析純)；羧甲基甲殼胺(青島海匯)；牙科水泥(A粉及B液)。二、高效!相色譜(HPLC)分析方法的建立1.色譜行為考查根據文獻[7]配制0.025mol/l磷酸二氫鉀緩沖鹽，以甲醇、緩沖鹽溶液(體積比從40:60到60:40)作為流動相，分別進樣空白淋格氏液和地塞米松磷酸鈉標準液(以林格氏液代替人工外淋巴作溶劑)，在柱溫25'C、240nm檢測波長下考察保留時間和峰形。發(fā)現(xiàn)流動相甲醇:緩沖鹽為46:54(V:V)保留時間約8.5min，空白林格氏液對藥物沒有干擾，地塞米松磷酸鈉溶液峰形尖銳。2.建立標準曲線、回收率及精密度試驗用lmg/ml的lt備液配制1、5、10、25、50、100、250、500和1000pg/ml的標準液。HPLC檢測，每次進樣10nl，每個濃度重復兩針。以峰面積(A)對藥物濃度(C)進行線性回歸得標準曲線方程。另配地塞米松磷酸鈉10、25、100pg/ml三種濃度的樣品，于日內、日間分別進行HPLC檢領!l,得到回收率及精密度。三、構建離體圓窗膜通透試驗模型(如前所述)四、不同制劑的離體通透試驗1.實驗分組及配液以林格氏液為溶劑，20mg/ml地塞米松磷酸鈉(DXM)為基礎溶液(A組)，添加海藻酸鈉(ALG)、羧甲基甲殼胺(CHI)輔料后配成四種組份(B-E):B:ALG(25g/l)+CHI(4g/l)+DXM(20mg/ml);C:ALG(25g/l)+CHI(6g/l)+DXM(20mg/ml);D:ALG(25g/l)+DXM(20mg/ml);E:CHI(4g/l)+DXM(20mg/ml)。各組溶液配制好后在超聲清洗器內超聲助溶混勻。2.分時段采樣與檢測每組制劑平行構建三個擴散池，接受室內灌滿林格氏液，供給室用注射器加入藥液0,2ml，用膠膜覆蓋。室溫下分別于20、40、60、120、180、300、420、540min從接受室取0.2ml液體注入lml離心管內，同時向接受池補入同樣體積林格氏液。將所采集的樣品用HPLC法在前述條件下進行檢測。結果1.HPLC標準曲線、回收率及精密度試驗1、5、10、25、50、100、250、500和1000嗎/ml的標準液用前術方法及條件檢測到的峰面積(A)對藥物濃度(C)進行線性回歸，得標準曲線方程y=14.72x-26.345，R2=0.99992?；厥章始熬芏葯z測相對標準偏差均小于10%(表1)，表明該檢測方法具有可靠性。2.五組地塞米松制劑對圓窗膜通透量的檢測目測所配制的五組制劑，不含輔料的地塞米松對照組(A組)與單獨4g/l羧甲基甲殼素(E組)的流動性接近，幾無黏性；其余三組的黏度相近且較大。從接受池釆集的樣品用HPLC檢測，將檢測到的峰面積(Au)代入標準曲線，求得各個時間點的濃度(oo，用公式a=cFf算得各個采樣點的累積釋放量(a，表3)，其中"時測濃度；F(:介質體積，本實驗為接受室的體積1.21111;F"取樣體積，本實驗為0.21111。將Qn分別代入零級、一級、Higushi釋放方程^進行擬合(A組以3小時為界分兩段擬合)，得到每種方程的回歸系數(shù)R2(表3)。以時間為橫坐標，累積釋放量為縱坐標作圖，得到五組制劑的累積通透釋放曲線(圖5)。從圖l的實驗結果可見，不含輔料的地塞米松對照組(A組)在給藥3小時內釋放曲線較陡，證明藥物迅速透過圓窗膜釋放到接受池，表3示給藥后3小時釋放符合零級方程，其速釋放速率為0.2407pg/min。3小時后釋放曲線變?yōu)槠骄徤仙?，推測藥物經過前3小時的快速釋放后達到相對平衡。25g/l海藻酸鈉與6g/l或4g/l羧甲基甲殼胺(B組與C組)在9小時內的釋放曲線最為平緩(圖l);按零級方程計算(表3)，B和C兩組的釋放速率分別為0.0407pg/min和0.0366^g/min。此兩組輔料對地塞米松的緩釋作用最強(pO.Ol)，但兩者之間沒有顯著差異(pX).05)。單獨25g/l海藻酸鈉(D組)的釋放曲線為緩慢上升型(圖l)，其斜率介于A組與B組(或C組)之間，證明有緩釋性，但其緩釋作用較B、C兩組弱。由零級方程得到其釋放速率為O.1051pg/ml(表3)。從圖l可見單獨4g/傲甲基甲殼胺(E組)的釋放曲線在3小時前與A組伴行，3小時后略高于A組，證明羧甲基甲殼胺能使藥物的釋放量大于對照組，提示E組配方有微小促滲作用。討論海藻酸鈉與殼聚糖是藥劑學中常用的緩釋輔料，它們均為無毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料，具較好的可塑性，廣泛應用于藥物載體領域。其中海藻酸鈉荷負電，殼聚糖荷正電，兩者可通過靜電相互作用約束藥物釋放，因此構成多種藥物、生物制品、疫苗及細胞的緩釋載體。本實驗所用的羧甲基甲殼胺即殼聚糖的衍生物。地塞米松屬于類固醇激素，能與細胞內受體結合，抑制一氧化氮合成酶和細胞因子、粘附分子、血小板因子轉錄，從而抑制炎癥過程。動物實驗和臨床實驗已證實地塞米松能夠通透圓窗膜，可以用來治療多種內耳疾病，如自身免疫性聾、突發(fā)性感音神經性聾、噪聲性聾、梅尼埃病、急性腦膜炎后迷路炎。參考趙武奇等(2004)的實驗結果，本實驗將上述兩種輔料與地塞米松配伍，分為五組進行試驗(A-E組)。考察9小時內地塞米松對離體圓窗膜通透的情況，不含輔料的對照組(A組)在給藥后3小時迅速通透圓窗膜，3小時后釋放接近平衡；而含有海藻酸鈉(25g/1)與羧甲基甲殼胺(4g/1、6g/1，B組與C組)的制劑釋藥速率最慢，緩釋作用最強(p<0.01);單獨25g/l海藻酸鈉的緩釋作用次之。然而比較B、C兩組之間的緩釋性沒有顯著差異(pX).05)，證明6g/l或4g/l的羧甲基甲殼胺與25g/l海藻酸鈉聯(lián)用時其緩釋作用相近。根據輔料少副作用小的原則，推薦在后續(xù)的研究中將羧甲基甲殼胺的濃度定為4g/1。E組(僅含4g/1羧甲基甲殼胺輔料)地塞米松的通透量稍大于對照組，證明羧甲基甲殼胺有微小促滲作用。此結果與Goycoolea(2001)—致，后者認為圓窗膜對通透的物質有電荷選擇性，如陽離子鐵蛋白的通透性大大超過陰離子鐵蛋白；本實驗中羧甲基甲殼胺帶正電荷，因此有可能而促進地塞米松通過圓窗膜。Chandrasekhar等(2000)曾比較三種輔料(透明質酸、DMSO、組胺)對地塞米松圓窗膜給藥的促滲作用；結合本實驗的這一結果，將對激素沖擊治療突發(fā)性耳聾有研究意義。表1.HPLC法測定地塞米松磷酸鈉林格氏液的精密度及回收率(±s)濃度(pg/ml)測得量^g/ml)回收率(％)《趙紫曰內1010.12±0.64101.24±6.39%7.20%n=52524.16±1.0296.02±4.07%4.80o/010098.22±0.8198.22±0.81%0.94%曰間109.44±0.9294.36±9.23%8.64%n=32524.04±1.1696.16±4.65%4.28%10096.44±2.4396.44±2.43%2.23%表2.不同時間點所求得的累積釋放量(3f±s,.w=3)time\QnA(Hg)B(嗎)c(嗎)D(Hg)E(嗎)20min12.5.2±2.595.61±0.385.49±3.174.23±0.8310.42±0.9440min21.32±3.608.66±1.057.54±2.427.42±0.9215.56±2.6060min22.12±4.8211.17±1.759.07±2.9611.00±1.3424.21±3.01120min37.88±2.4710.85±3.8011.95±3.4521.33±1.9141.49±3.28180min50.88±15.6013.58±3.5814.19±3.0129.48±2.1947.96±4.52300min51.47±16.5117.62±4,9917.33±2.2139.59±7.6960.70±3.84420min56.76±15.8422.03±8.4220.67±1.2046.69±11.8165.36±5.73540min57.58±8.8826.46±10.0423.00±2.8861.25±9.5270.15±7.12表3.零級、一級、Higuehi釋放方程的擬合<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求1.一種圓窗膜的離體通透試驗裝置，由圓窗膜、供給室、接受室及中間帶孔的圓片組成，其特征是供給室代表中耳腔，接受室代表鼓階外淋巴腔，圓片位于兩室之間，圓窗膜位于圓片中央孔，各組件順序封接，模擬生理環(huán)境下的鼓室與內耳的關系。2.根據權利要求1所述的圓窗膜的離體通透試驗裝置，其特征在于供給室和接受室的內徑都為lcm，接口處為磨砂玻璃；供給室高lcm，接受室高1.5cm;接受室與取樣管形成連通器，取樣管內徑2mra，高度略高于接受室，接受室的容積為1.2ml。3.根據權利要求l所述的圓窗膜的離體通透試驗裝置，其特征在于圓片中央的孔為漏斗形，大口朝向接受室，即內耳側，小口朝向供給室，即鼓室側；圓窗膜位于中央孔的鼓室側。4.根據權利要求l所述的圓窗膜的離體通透試驗裝置，其特征在于每個組件的連接使用無毒且防水的牙科水泥。專利摘要一種圓窗膜的離體通透試驗裝置，由圓窗膜、供給室、接受室及中間帶孔的圓片組成。供給室代表中耳腔，接受室代表鼓階外淋巴腔，圓片位于兩室之間，圓窗膜位于圓片中央孔，各組件順序封接。該離體試驗裝置使用了對藥物影響低的玻璃組件及對圓窗膜無毒的連接材料，可模擬鼓室與內耳的關系和經圓窗膜給藥的生理環(huán)境，能節(jié)約實驗成本并提高結果的可靠性。文檔編號G01N33/48GK201373874SQ200820119940公開日2009年12月30日申請日期2008年6月6日優(yōu)先權日2008年6月6日發(fā)明者婭劉,孫建軍申請人:孫建軍;劉婭