專利名稱：一種三聚氰胺快速檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型是利用膠體金方法來檢測畜產(chǎn)品、 于膠體金免疫檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
飼料及奶制品類食品中三聚氰胺殘留，屬
三聚氰胺(英文名稱Melamine)，簡稱三胺，又叫蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，性 狀為純白色單斜棱晶體，無味，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工 原料。其主要可用于制作三聚氰胺甲醛樹脂(MF)的原料，三聚氰胺還可以作阻燃劑、 減水劑、甲醛清潔劑等。目甜三聚氰胺被認(rèn)為毒性輕微，在動(dòng)物體內(nèi)代謝很快且不會(huì)存留， 主要影響泌尿系統(tǒng)。
由于食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測試方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人摻雜進(jìn)食品 中，以提升食品檢測中蛋白含量指標(biāo)。2007年深圳檢驗(yàn)檢疫局從臺灣進(jìn)口的3批觀賞魚 飼料中檢出二聚氰胺；同年福建、天津、山東、珠海檢驗(yàn)檢疫局從馬來西亞、泰國、秘 魯?shù)倪M(jìn)口魚粉中檢出三聚氰胺超標(biāo)；據(jù)美國食品藥品管理局(FDA)官方消息，美國 FDA在關(guān)國國內(nèi)生產(chǎn)的用于牛、綿羊、山羊、魚、蝦的顆粒飼料中發(fā)現(xiàn)含有三聚氰胺； 2007年北京檢驗(yàn)檢疫局從進(jìn)口澳大利亞的寵物食品中檢出三聚氰胺陽性，向年3月在 美閨發(fā)生多起寵物貓、狗中毒死亡事件。經(jīng)調(diào)査是由于一些寵物飼料供應(yīng)商為了增加飼 料中蛋白質(zhì)的含量，在小麥蛋白粉和人米蛋白粉中添加了三聚氰胺，從而導(dǎo)致貓、狗中 毒死亡。由此可見，三聚氰胺非法添加早就已經(jīng)為我們敲響了警鐘。
在2008年9月，中國爆發(fā)三鹿牌嬰幼兒配方奶粉受污染事件，導(dǎo)致食用了受污染 奶粉的嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥，進(jìn)而查出市面上銷售的大部分奶制品中均含三聚氰胺。 三聚氰胺被人食用后會(huì)在胃的強(qiáng)酸性環(huán)境中水解，先生成三聚氰酸二酰胺，進(jìn)一歩水解生成 三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸，三聚氰酸隨后在腸道內(nèi)被吸收，從而進(jìn)入血液，在血 液中三聚氰酸能夠和鈣離子結(jié)合形成不溶解的三聚氰酸鈣，腎臟在過濾血液雜質(zhì)的時(shí)候三聚 氰酸鈣就會(huì)在腎臟聚集最終形成結(jié)石。據(jù)報(bào)道，在該次事件中全國共發(fā)現(xiàn)萬余名因食用受 污染奶粉致腎結(jié)石的嬰幼兒，而在奶制品中三聚氰胺殘留量超標(biāo)會(huì)嚴(yán)重影響人類健康水平， 已成為不容忽視的食品污染源。
目前，檢測三聚氰胺殘留的分析方法主要是依靠氣相色譜(GC)與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用法 (GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MSMS)等方法。這些 方法可實(shí)現(xiàn)精度的定量分析但速度較慢，檢測成本較高，受檢測范圍和精度的限制?？傊?這些方法普遍存在著樣品前處理過程復(fù)雜，靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大， 耗時(shí)，檢測設(shè)備昂貴，并要求有專業(yè)的技術(shù)人員及較長的分析周期。
隨著免疫診斷技術(shù)的發(fā)展，快速診斷三聚氰胺診斷技術(shù)不斷創(chuàng)新，包括酶聯(lián)免疫吸附法、 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法等，上述方法各有所長，但都需專用儀器、專業(yè)人員操作，仍不適于三聚 氰胺高發(fā)地區(qū)的大規(guī)?，F(xiàn)場調(diào)查。故現(xiàn)今急需要一種快速、準(zhǔn)確、簡單、安全的檢測手段。
本實(shí)用新型在傳統(tǒng)免疫檢測法的基礎(chǔ)上引入了膠體金快速檢測技術(shù)，研制出三聚氰胺顏 色顆粒免疫層析法檢測試紙。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員檢 測，真.IH達(dá)到復(fù)雜原理與簡易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)具有保存方便，有效期長的特點(diǎn)。將顏 色顆粒免疫層析法jI入三聚氰胺檢測，為三聚氰胺的快速診斷提供了一個(gè)新的分析檢測途徑。

發(fā)明內(nèi)容
木實(shí)用新型針對上述存在的一些問題，提供了一種適用于檢測三聚氰胺是否超標(biāo)的顏色 顆粒免疫層析法檢測三聚氰胺的試紙條。
為解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本實(shí)用新型是由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、多抗顏色顆粒固定墊、樣品吸液層組成， 試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上包被一條試驗(yàn)線和一條羊抗鼠多克隆抗體控 制線，在底板端端頭為吸水板，另 -端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水 板和多抗顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有樣品吸液層。
其中的顏色顆?？梢允且环N金屬溶膠顆粒，可包括膠體金顆粒、膠體銀顆粒、鐵顆粒、 磁性顆粒； 一種標(biāo)記顆?？砂ㄈ玖项w粒、乳膠顆粒、熒光顆粒。
其中的樣品吸液層是山三層材料疊加組成，第一層為無紡布層，規(guī)格為10 25g/m2;第 二層為玻璃纖維層；第三層為10 25g/r^規(guī)格的無紡布層，上述物質(zhì)均需經(jīng)過表面活性劑緩 沖液浸泡處理，干燥后備用，上述裝覽除有毛細(xì)管作用原理外，還有虹吸作用原理，大大加 快吸水移動(dòng)速度。
用三聚氰胺免疫原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，得到抗三聚氰胺的多克隆抗體，用于制成抗三聚氰胺 多抗顏色顆粒固定墊。其中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以是兔、羊、馬、雞。
硝酸纖維素膜上固定有兩條線， 一條試驗(yàn)線是由三聚氰胺合成免疫原包被，另一條控制 線是羊抗鼠多克隆抗體制成。按公知技術(shù)將底板、硝酸纖維素膜及顏色顆粒固定墊、吸水板 進(jìn)行組裝。檢測時(shí)，把檢測三聚氰胺殘留的膠體金試紙的樣品吸液層端放入飼料浸汁或奶制 品溶液中，i于毛細(xì)管虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至三聚氰胺多克隆 抗體顏色顆粒固定墊時(shí)，樣品中的三聚氰胺與三聚氰胺多抗標(biāo)記探針發(fā)生特異結(jié)合，當(dāng)移動(dòng) 至固定有三聚氰胺合成免疫原試驗(yàn)線時(shí)，由于三聚氰胺多克隆抗體顏色顆粒固定墊中的抗體 與樣品中三聚氰胺優(yōu)先結(jié)合成復(fù)合物而失去其與三聚氰胺合成免疫原結(jié)合，因此其膠體金不 能滯留于試驗(yàn)線上，試驗(yàn)線處沒有紅色線顯示，即只有-條紅色控制線為陽性；相反如果樣 品中沒有三聚氰胺，三聚氰胺多克隆抗體顏色顆粒固定墊中的抗體移動(dòng)到試驗(yàn)線上，三聚氰 胺多克隆抗體就會(huì)與三聚氰胺合成免疫原發(fā)生特異結(jié)合，使膠體金滯留于試驗(yàn)線上，即二條 紅色線為陰性。
制成試紙其檢測三聚氰胺設(shè)定檢出量以上，觀察窗處出現(xiàn)一條紅線為陽性；設(shè)定檢出量 以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；設(shè)定檢出量時(shí)在試驗(yàn)線處為一條模糊陰影線為界限值，從而得出判 斷。
當(dāng)移動(dòng)至羊抗鼠多克隆抗體控制線時(shí)，無論樣品中有無三聚氰胺，標(biāo)記的金標(biāo)探針都會(huì) 與已設(shè)定好的羊抗鼠多克隆抗體結(jié)合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產(chǎn)生則代 表操作有誤，檢測時(shí)樣品液面超過MAX線或試紙已經(jīng)過期。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的一種三聚氰胺快速檢測試紙具有這樣的有益效 果，即特異性強(qiáng)，靈敏度高，易儲(chǔ)存，無須專門技術(shù)人員操作，且結(jié)果易讀。

圖1為本實(shí)用新型的主視結(jié)構(gòu)圖。
圖2為本實(shí)用新型的側(cè)視結(jié)構(gòu)圖。
圖3為本實(shí)用新型的檢測顯示陽性結(jié)果圖。
圖4為本實(shí)用新型的檢測顯示陰性結(jié)果圖。
圖屮1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗(yàn)線，5、顏 色顆粒固定墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、 MAX線。具體實(shí)施例
1. 三聚氰胺抗原合成
1) 將PH=7.4的PBS溶液與二氧六環(huán)(按照體積比2:1)混合液100毫升，放入水浴鍋中加熱 升溫至50。C，開始分5批攪拌下加入三聚氰胺共0,2g (1.58mmol)，持續(xù)攪拌5小吋。
2) 在上述混合液中，加入0.5g的戊二醛溶液，反應(yīng)4小時(shí)。
3) 將800mgBSA溶于80mlPBS和二氧六環(huán)的混合液中，成淡黃色半透明溶液。
4) 在4。C冰浴下，將歩驟2中制得的反應(yīng)液滴加到溶于BSA的混合液中，溶液成土黃色透 明溶液，其中含有少量的雜質(zhì)，反應(yīng)7小時(shí)后，將反應(yīng)液裝入透析袋中，用PH二7.4的 溶液透析4大，透析后15分鐘3000轉(zhuǎn)/min離心后凍十，紫外檢測270nm處三聚氰胺-BSA 相對BSA的峰，有明顯偏移，充分證明二聚氰胺-BSA連接抗原成功。
2. 三聚氰胺多克隆抗體的制備
采用快速免疫法進(jìn)行免疫，免疫動(dòng)物可以為兔、羊、馬、雞，基礎(chǔ)免疫起記為第1天， 第3天進(jìn)行一次加強(qiáng)，第30大左右進(jìn)行第2次加強(qiáng)，第2次加強(qiáng)后IO天左右采血檢測，檢 測后達(dá)到采血標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行采血?？寡褰?jīng)飽和硫酸氨沉淀上柱DE52，純化備用。
3. 膠體金的制備及與三聚氰胺多克隆抗體的結(jié)合
(1) 取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到85 95'C，加入適量檸檬酸三納繼續(xù)加熱 攪拌至沸騰3 10分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2) 把三聚氰胺多克隆抗體標(biāo)記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
4. 制膜機(jī)制膜利用電腦控制傳動(dòng)速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5. 試紙條組合按公知技術(shù)組合。
6. 使用方法把試紙的樣品吸液層端放入飼料浸汁或奶制品溶液中(液面不得超過MAX線圖 中8)， 1分鐘后取出試紙平放，由于毛細(xì)管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動(dòng)，5
分鐘時(shí)觀察結(jié)果。
7. 結(jié)果判斷根據(jù)國家規(guī)定檢測限設(shè)定cutoff值，檢測三聚氰胺濃度檢測限以上，觀察窗 處出現(xiàn)一條紅線為陽性；檢測限以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；檢測濃度在檢測限時(shí)在試驗(yàn)線處為 一條模糊陰影線為界限值。
權(quán)利要求1.一種三聚氰胺殘留快速檢測試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、顏色顆粒固定墊(5)、樣品吸液層(6)、MAX線(8)組成，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條包被三聚氰胺免疫原的試驗(yàn)線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有樣品吸液層。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三聚氰胺殘留快速檢測試紙，其特征在于樣品吸液層由三層材 料疊加組成，第一層為10 25g/rr^無紡布層、第二層為玻璃纖維層、第三層為10 25g/m2 無紡布層。
專利摘要一種三聚氰胺快速檢測試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、顏色顆粒固定墊、樣品吸液層組成。底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有三聚氰胺合成免疫原試驗(yàn)線和一條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和多抗顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有樣品吸液層，通過顏色顆粒免疫層析免疫競爭方法制成試紙，利用免疫顏色顆粒免疫層析法來檢測畜產(chǎn)品、飼料及奶制品中的三聚氰胺殘留量。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員檢測，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)具有保存方便，有效期長的特點(diǎn)。
文檔編號G01N33/543GK201344932SQ20082012393
公開日2009年11月11日 申請日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者萬積成 申請人:萬積成