專利名稱：艾滋病診斷專用微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及艾滋病診斷專用微流控芯片，屬于測試領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)是由艾滋病病毒(HIV)引起的、通過性接觸和體液傳播、能破 壞人的細(xì)胞免疫系統(tǒng)、以機(jī)會性感染及惡性腫瘤為特征的慢性傳染病。加強(qiáng)對 HIV感染者及艾滋病患者的監(jiān)測和早期診斷，以達(dá)到控制艾滋病流行的目的,己 成為所有醫(yī)務(wù)工作者關(guān)心的重要課題，也是各國政府孜孜不倦的追求目標(biāo)。目前 艾滋病的診斷主要依據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀及實驗室檢査。其中HIV抗體檢測是 AIDS檢測中最常用的方法，HIV抗體也是最重要的一項指標(biāo)。艾滋病確診需要同 時獲取p24,gp41，gp120，gp36抗體含量。艾滋病抗體p24以及艾滋病抗體gp41 以及艾滋病抗體gp120以及艾滋病抗體gp36的專業(yè)技術(shù)含義在艾滋病診斷及治 療領(lǐng)域是公知的。傳統(tǒng)HIV抗體檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附實驗(EILSA)、明膠顆 粒凝集實驗(PA)、免疫層析/滲濾實驗、放射免疫沉淀實驗(RIPA)、免疫熒光實 驗(IFA)以及免疫印記實驗(WB)。臨床常用EILSA法及免疫層析/滲濾法作為初篩 實驗,而免疫印記(WB)則是確認(rèn)實驗的唯一方法。EILSA法雖有較高的靈敏度和 特異性,但也有少量的假陰性和假陽性；免疫印記實驗技術(shù)要求高,影響因素多、 操作復(fù)雜、價格昂貴。因此，僅用作權(quán)威部門作為確認(rèn)實驗而在臨床上絕少使用；
另外一些檢測抗體的方法免疫熒光實驗，明膠顆粒凝集實驗等因其靈敏度低、
特異性差、操作復(fù)雜或儀器昂貴等原因而在臨床及研究中未能大規(guī)模使用。
微流控芯片技術(shù)是將采樣、預(yù)處理、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測等集成在 微芯片上完成的一門前沿技術(shù)，具有分析速度快、信息量大、試劑消耗少、污 染小、操作費(fèi)用低、儀器簡便等優(yōu)點(diǎn)。目前，在微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，利用艾滋病多種特征抗體同時檢測、快速 診斷艾滋病的技術(shù)尚未見報道。
實用新型內(nèi)容
本實用新型所要解決的技術(shù)問題是，在微流控芯片技術(shù)這樣一個總的技術(shù) 框架內(nèi)，研發(fā)出一種能夠利用艾滋病多種特征抗體進(jìn)行同時檢測的艾滋病診斷 專用微流控芯片。
本實用新型通過如下方案解決所述技術(shù)問題，該方案提供的裝置是一種艾 滋病診斷專用微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板 狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所 述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有毛細(xì)管通道，以及，四個微儲液 池，毛細(xì)管通道的一端經(jīng)由歧管狀微通道分別與其中的三個微儲液池聯(lián)通，毛 細(xì)管通道的另一端與余下的一個微儲液池聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述毛 細(xì)管通道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由 金屬電極以及包覆在所述金屬電極上的抗體物質(zhì)表層構(gòu)成，本案特別之處在于， 所述毛細(xì)管通道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細(xì)管通道由四個微小 通道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極的裝設(shè)位 置分別位于所述四個微小通道內(nèi)，以及，該四個工作電極其表層結(jié)構(gòu)中的抗體
物質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是艾滋病抗體p24以及艾滋病 抗體gp41以及艾滋病抗體gp120以及艾滋病抗體gp36。所述抗體物質(zhì)包含為 固定所述各艾滋病抗體而引入其中的輔助性介質(zhì)，所述輔助性介質(zhì)例如巰基丁 二胺銅修飾介質(zhì)，所述金屬電極可以首先利用所述輔助性介質(zhì)進(jìn)行表面修飾處 理，之后在其上包覆抗體物質(zhì)表層，抗體物質(zhì)表層與所述輔助性介質(zhì)渾然一體。 本案微流控芯片的結(jié)構(gòu)中涉及若干種電極，所述電極均為微小尺寸的電極，其 中的每一個電極的形狀均可以是任意選定的形狀，所述任意選定的形狀例如方 片形狀、矩形片狀、條狀或圓形片狀等等。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及若干個微儲液池，所述微儲液池是用于過渡性儲液的微池或微囊，其中的每一個微儲 液池的微型的內(nèi)腔其形狀均可以是任意選定的形狀，所述內(nèi)腔形狀例如微型的 圓柱形空腔狀、微型的方柱形空腔狀、微型的橢圓形空腔狀或微型的球形空腔 狀等等。本案裝置當(dāng)然還可以進(jìn)一步包括一些附件，所述附件例如多道電化學(xué) 工作站以及微流動泵等等，所述多道電化學(xué)工作站的技術(shù)含義以及微流動泵的 技術(shù)含義是公知的。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及的各個工作電極以及對電極以 及參比電極等，可以分別經(jīng)由相應(yīng)的專用串線與所述多道電化學(xué)工作站的相應(yīng) 接口進(jìn)行聯(lián)接。所述專用串線是用來將各所述電極與所述多道電化學(xué)工作站的 各相應(yīng)接口進(jìn)行相互聯(lián)接的專用電纜。所述微流動泵用于驅(qū)動微量液體流動， 所述微流動泵可以與按需選定的任意一個所述微儲液池聯(lián)通。
本案微流控芯片的具體實現(xiàn)路徑可以有多種，選其一詳解如下 一、高聚物微金電極蓋片的制備
1、 以石英/鉻板為光掩模，用紫外光作為光源對蓋片表面的選擇性區(qū)域進(jìn) 行輻射。
2、 采用已二胺作為胺化劑，1-[3， - (N-N-二甲基胺)丙基]-3-已基碳二亞
胺鹽酸鹽為偶合劑對經(jīng)過選擇性區(qū)域照射的高聚物進(jìn)行胺化反應(yīng)。
3、 將經(jīng)過選擇性區(qū)域胺化反應(yīng)的高聚物浸入氯金酸中反應(yīng)泡。
4、 用蒸餾水清洗以后，再將其浸入硼氫化鈉溶液中還原。
5、 用蒸餾水清洗以后，在將其浸入0.5mol/L的硫氰化鉀溶液中超聲清洗 30Min。
6、 將經(jīng)過清洗的高聚物蓋片浸入含有金離子、絡(luò)合劑和還原劑甲醛的鍍液 中，于45-60。C下反應(yīng)1h。
7、 將鍍有微金電極的蓋片放入烘箱中退火處理約3 h,即得到本發(fā)明的高聚 物多微金電極蓋片。其中微金電極長3mm，寬3mm，厚度約為0.1mm。相互 之間間距約為3mm。二、 帶有微通道的高聚物基片的制作
1、 制作單晶硅陽模
繪制芯片設(shè)計圖，圖形線條寬度約為25-100nm，采用高清晰激光照片系 統(tǒng)輸出在透明的膠片上，即得到光刻掩模。
通過化學(xué)氣相沉積法在基片表面上沉積一層氮化硅薄模作為犧牲層，在此 基片上通過旋轉(zhuǎn)覆模技術(shù)覆蓋一層光敏膠，于烘箱中6CTC處理15-20min;將 光刻掩模覆蓋在基片上，通過暴光成像的原理將光刻掩模上的圖像轉(zhuǎn)移到基片 表面的光膠層上；通過干法腐蝕的方法將光膠層上的平面二維圖形加工成具有 一定深度的立體結(jié)構(gòu)。即可得到具有凸起的通道的單晶硅陽模。制備好的單晶 硅陽模依次用H202: H2SCU溶液(體積比為1:4)，丙酮和蒸餾水清洗，以 除去其表面的氧化物。
2、 采用熱壓法復(fù)制微通道
將PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)有機(jī)玻璃片切割成長約6cm，寬4cm的 尺寸。超聲清洗，自然涼干，在熱壓裝置中將PMMA有機(jī)玻璃基片加熱到軟化 溫度(110°C)左右，然后在單晶硅陽模上施加一定的壓力，并持續(xù)約1min, 即可在PMMA有機(jī)玻璃基片壓制出與單晶硅陽模互補(bǔ)的微通道。然后，將陽模 和刻有微通道的PMMA基片一起冷卻后脫模，就得到所需的微通道。
3、 在蓋片上制作微儲液池 在蓋片上采用金剛鉆鉆出樣品池，廢液池，緩沖液池，檢測池等四個微儲液池。
三、 將高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片在低溫氧等離子氣氛中 處理干凈
四、 芯片封合
在顯微鏡下對準(zhǔn)高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片，將此基 片和蓋片固定用二片蓋玻片夾緊，放置在烘箱中于11(TC左右保溫15min，即 可得到所需的四通道PMMA微流控芯片。五、 將步驟四所完成的PMMA芯片分別在工作電極、參考電極及對電極末端利 用銀膠接上銅片作為導(dǎo)線，待銀膠完全干后再封上熱熔膠以固定銅片，即完成
整個四通道微流控芯片的制作。
六、 包覆抗體物質(zhì)表層
1、 采用等離子體表面處理法將微電極表面處理干凈，將處理后的微電極浸于20 mmol丄-1除氧的CuL (巰基丁二胺銅)溶液20h，獲得CuL修飾電極。
2、 采用點(diǎn)樣儀將各種單克隆抗原點(diǎn)到電極表面，點(diǎn)樣量在0.1-10mL及 0.1-100mL之間任意選擇；點(diǎn)樣精度0.5 nl;點(diǎn)樣速度3s/ul，每隔3mm點(diǎn)一 次樣品，在非接觸噴樣模式下分別將10iJL的p24, gp41， gp120， gp36四種抗體 固定在四個CuL修飾的工作電極表面，至此，包覆抗體物質(zhì)表層的制備操作完 成。
詳解的本案微流控芯片的上述具體實現(xiàn)路徑其相關(guān)各個操作參數(shù)可以根據(jù) 實際需要進(jìn)行調(diào)整。
本案微流控芯片的使用方法
采用外加微泵驅(qū)動液流在四通道微流控芯片的毛細(xì)管通道中穩(wěn)定流動，利 用四通道電化學(xué)儀器分別對四種蛋白加以檢測。 本案微流控芯片的具體檢測使用步驟如下
1、 在微管路中加入樣品液，在外加微泵驅(qū)動下，各種抗原分子被各通道中 電極表面相應(yīng)抗體捕獲，通過夾心法結(jié)合酶標(biāo)"二抗"形成免疫復(fù)合物。
2、 采用多通道電分析儀，加入鄰苯二酚等電子媒介體，采用安培法檢測"二 抗"上酶引起!"!202還原的電流變化，由此獲得各種分析物含量。
3、 將結(jié)果進(jìn)行綜合分析，對艾滋病進(jìn)行診斷。
本實用新型的優(yōu)點(diǎn)是，在一塊微流控芯片上集成了分別包覆有四種特征抗 體物質(zhì)表層的四個工作電極，該四個工作電極分別針對檢測艾滋病的四種特征 診斷蛋白，本案微流控芯片是一種能夠利用艾滋病多種特征抗體進(jìn)行同時檢測的艾滋病診斷專用微流控芯片，其集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了該芯片的使用有
助于加快艾滋病診斷速度、有助于降低艾滋病診斷費(fèi)用。


圖1是本案微流控芯片實施例構(gòu)造示意圖，圖中包括所述附件。
圖中，1是微流動泵，2、 4、 5、 14分別是四個裝設(shè)位置不同的微儲液池， 3是歧管狀微通道，6是微流控芯片的蓋片，7是微流控芯片的基片，8是聯(lián)接 工作電極與多道電化學(xué)工作站的專用串線，本例圖中共顯示有四條同型的用于 聯(lián)接工作電極與多道電化學(xué)工作站的專用串線，9是多道電化學(xué)工作站，10是 裝設(shè)在微小通道內(nèi)的具有艾滋病抗體p24表層的工作電極，11是裝設(shè)在微小通 道內(nèi)的具有艾滋病抗體gp41表層的工作電極，12是裝設(shè)在微小通道內(nèi)的具有 艾滋病抗體gp120表層的工作電極，13是裝設(shè)在微小通道內(nèi)的具有艾滋病抗體 gp36表層的工作電極，15是參比電極，16是對電極，17是聯(lián)接對電極與多道 電化學(xué)工作站的專用串線，18是聯(lián)接參比電極與多道電化學(xué)工作站的專用串 線。
具體實施方式
在圖1所展示的本案實施例中，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起 的兩片板狀物，兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片6以及微流控芯片的基片 7，在兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有毛細(xì)管通道，以及，四個微儲 液池，該四個微儲液池分別是微儲液池2、微儲液池4、微儲液池5和微儲液池 14，毛細(xì)管通道的一端經(jīng)由歧管狀微通道3分別與微儲液池2以及微儲液池4 以及微儲液池5聯(lián)通，毛細(xì)管通道的另一端與余下的一個微儲液池14聯(lián)通，以 及，依序分別裝設(shè)在所述毛細(xì)管通道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極16以 及參比電極15，工作電極由金屬電極以及包覆在金屬電極上的抗體物質(zhì)表層構(gòu) 成，毛細(xì)管通道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，該呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細(xì)管通道由四個微小通 道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述四個微小通道內(nèi)，以及，該四個工作電極其表層結(jié)構(gòu)中的抗體物
質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是艾滋病抗體p24以及艾滋病抗 體gp41以及艾滋病抗體gp120以及艾滋病抗體gp36，該四個工作電極分別是 裝設(shè)在第一并聯(lián)支流微小通道內(nèi)的具有艾滋病抗體p24表層的工作電極10以 及裝設(shè)在第二并聯(lián)支流微小通道內(nèi)的具有艾滋病抗體gp41表層的工作電極11 以及裝設(shè)在第三并聯(lián)支流微小通道內(nèi)的具有艾滋病抗體gp120表層的工作電極 12以及裝設(shè)在第四并聯(lián)支流微小通道內(nèi)的具有艾滋病抗體gp36表層的工作電 極13。本例圖中包括作為所述附件的多道電化學(xué)工作站9以及微流動泵1，參 比電極15可以經(jīng)由專用串線18與多道電化學(xué)工作站9的對應(yīng)接口聯(lián)接，對電 極16可以經(jīng)由專用串線17與多道電化學(xué)工作站9的對應(yīng)接口聯(lián)接，工作電極 10、 11、 12以及13可以分別經(jīng)由四條同型專用串線8與多道電化學(xué)工作站9 的對應(yīng)接口聯(lián)接，作為附件的微流動泵1可以與按需選定的任意一個微儲液池 聯(lián)通，本例中，微流動泵1與微儲液池4聯(lián)通。
權(quán)利要求1. 艾滋病診斷專用微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有毛細(xì)管通道，以及，四個微儲液池，毛細(xì)管通道的一端經(jīng)由歧管狀微通道分別與其中的三個微儲液池聯(lián)通，毛細(xì)管通道的另一端與余下的一個微儲液池聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述毛細(xì)管通道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由金屬電極以及包覆在所述金屬電極上的抗體物質(zhì)表層構(gòu)成，其特征是，所述毛細(xì)管通道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細(xì)管通道由四個微小通道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述四個微小通道內(nèi)，以及，該四個工作電極其表層結(jié)構(gòu)中的抗體物質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是艾滋病抗體p24以及艾滋病抗體gp41以及艾滋病抗體gp120以及艾滋病抗體gp36。
專利摘要本實用新型涉及艾滋病診斷專用微流控芯片，屬于測試領(lǐng)域。艾滋病的快速且廉價的診斷是醫(yī)療技術(shù)進(jìn)步的諸多企望之一，本實用新型提供一種利用艾滋病多種特征抗體同時檢測、快速診斷艾滋病的微流控芯片。本案要點(diǎn)在于，芯片內(nèi)含有呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細(xì)管通道，該并聯(lián)構(gòu)造含有四條相互并聯(lián)的微小通道，共有四個工作電極分別裝設(shè)在所述四條微小通道內(nèi)，該四個工作電極的表層物質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是艾滋病抗體p24以及艾滋病抗體gp41以及艾滋病抗體gp120以及艾滋病抗體gp36。本案微流控芯片其集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了該芯片的使用有助于加快艾滋病診斷速度、有助于降低艾滋病診斷費(fèi)用。
文檔編號G01N33/569GK201259501SQ20082013154
公開日2009年6月17日 申請日期2008年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月8日
發(fā)明者岳 宋, 寧 干, 李天華, 李榕生, 欣 楊, 王青春, 王魯雁 申請人:寧波大學(xué)