專利名稱：應(yīng)用于快速診斷烈性傳染病霍亂的專用微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種應(yīng)用于快速診斷烈性傳染病霍亂的專用微流控芯片， 屬于測試領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
霍亂是由霍亂弧菌引起的一種烈性傳染病，屬于國際檢疫傳染病，也是我 國傳染病防治法規(guī)定的甲類傳染病病原之一。該病發(fā)病急、傳播快、涉及范圍
廣，可引起局部和世界性的爆發(fā)流行為特征；是一種嚴重危害人類健康和生命 的傳染病?；魜y弧菌是導(dǎo)致感染者嚴重腹瀉的病原菌，作為國際檢疫傳染病一 一霍亂的病原診斷，以檢出01群霍亂弧菌或0139群霍亂弧菌為準。
長期以來，對霍亂弧菌的診斷都是采用傳統(tǒng)的檢驗方法，即形態(tài)學(xué)、生理 生化特征及血清學(xué)鑒定以及噬菌體分型等，最快的也要十幾個小時才能完成。 時間長、樣本量大、準確率低，且一次只能獲得一種致病菌種類和數(shù)量。近年 來，在傳統(tǒng)的檢測方法基礎(chǔ)上，單克隆抗體和分子生物學(xué)技術(shù)越來越多地應(yīng)用 到霍亂弧菌的研究中，相關(guān)測試方法的飛速發(fā)展為霍亂弧菌的檢測提供了新的 強有力的手段。其中主要有膠體金標記免疫層析技術(shù)、實時熒光PCR技術(shù)、 基因傳感器技術(shù)、間接免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和核酸序列分析技術(shù) 等。然而，上述方法中，病原體的分離費時費力，不適用快速批量診斷。由于 需要孵育、洗脫、顯色等多重步驟， 一般需要數(shù)小時。核酸PCR檢測諸法中， 實時熒光定量PCR敏感性高、特異性強，可以縮短檢測窗口期，但需要較昂貴 的儀器設(shè)備，無法大面積推廣，且分離核酸和進行PCR反應(yīng)也需要數(shù)小時，故 無法快速檢測。免疫膠體金試紙條可以在數(shù)分鐘內(nèi)獲得結(jié)果，實現(xiàn)快速檢測， 但一般只能達到半定量測定標準，敏感性差，成本高，也難以同時檢測多種抗原。近年來發(fā)展很快的時間分辨熒光免疫分析方法和化學(xué)發(fā)光方法雖然靈敏度 高，但是仍需要繁瑣的前處理，且檢測價格昂貴。其中免疫分析技術(shù)是實現(xiàn)傳
染病準確診斷的重要手段，通過測定病后2周血清抗菌"診斷蛋白"(抗原/抗體， 簡稱DP)含量，可以獲取病原體的種類和數(shù)量。免疫分析本身有很強的選擇性， 對傳染病的早期診斷，判斷療效及預(yù)后等方面均有重要的意義。然而重大傳染 病菌的檢測非常復(fù)雜，傳統(tǒng)的免疫分析通常只針對單一指標進行檢測。由于一 種診斷蛋白可出現(xiàn)在不同病菌，或不同診斷蛋白可在同一致病菌同時出現(xiàn)，因 此，開展高效的多重免疫分析方法(SMIAs)，從生物相關(guān)性的角度真實地定量 反映各種致病菌的種類和數(shù)量；在早期預(yù)防和聯(lián)檢多種傳染病、判斷傳染病菌 發(fā)展程度、觀察和評價治療效果等方面都具有重要的醫(yī)學(xué)價值。
01、 0139霍亂弧菌聯(lián)檢需要同時獲取TP0821、 TP0319、 TP0624以及霍 亂弧菌0139菌體蛋白、甘露糖敏感血凝(rMSHA)等幾種診斷蛋白含量，綜合 分析才能得到，其中，前四種蛋白含量的檢測更具診斷意義。
所述診斷蛋白TP0821、 TP0319、 TP0624、霍亂弧菌0139菌體蛋白，以 及，相應(yīng)的TP0821抗體、TP0319抗體、TP0624抗體、0139菌體蛋白抗體， 其技術(shù)含義在霍亂診療技術(shù)領(lǐng)域是公知的。
微流控芯片技術(shù)是將采樣、預(yù)處理、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測等集成在 一塊幾平方厘米的微芯片上進行的一門前沿技術(shù)，具有分析速度快、信息量大、 試劑消耗少、污染小、操作費用低、儀器簡便以及檢測速度和靈敏度俱佳等優(yōu) 點。微流控技術(shù)代表著21世紀分析儀器的發(fā)展方向。目前基于微流控芯片的檢 測技術(shù)主要有紫外吸收檢測、激光誘導(dǎo)熒光檢測、電導(dǎo)檢測、伏安檢測等。其 中紫外吸收檢測和電導(dǎo)檢測比較通用，但是其靈敏度較低；激光誘導(dǎo)熒光檢測 和伏安檢測靈敏度較高，但是測定對象不多，限制了它們的推廣。而傳感器中 采用電化學(xué)檢測，體積小、自動化程度高、成本低，非常適合于現(xiàn)場分析。目前，在微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，利用霍亂多種特征抗體同時檢測、快速診 斷霍亂的技術(shù)尚未見報道。
實用新型內(nèi)容
本實用新型所要解決的技術(shù)問題是，在微流控芯片技術(shù)這樣一個總的技術(shù) 框架內(nèi)，研發(fā)出一種能夠利用霍亂多種特征抗體進行同時檢測的應(yīng)用于快速診 斷烈性傳染病霍亂的專用微流控芯片。
本實用新型通過如下方案解決所述技術(shù)問題，該方案提供的裝置是一種應(yīng) 用于快速診斷烈性傳染病霍亂的專用微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼 合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微 流控芯片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有毛細管通 道，以及，四個微儲液池，毛細管通道的一端經(jīng)由歧管狀微通道分別與其中的 三個微儲液池聯(lián)通，毛細管通道的另一端與余下的一個微儲液池聯(lián)通，以及， 依序分別裝設(shè)在所述毛細管通道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比 電極，所述工作電極由金屬電極以及包覆在所述金屬電極上的抗體物質(zhì)表層構(gòu) 成，本案特別之處在于，所述毛細管通道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造 的毛細管通道由四個微小通道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個， 該四個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述四個微小通道內(nèi)，以及，該四個工作 電極其表層結(jié)構(gòu)中的抗體物質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是霍
亂TP0821抗體以及霍亂TP0319抗體以及霍亂TP0624抗體以及霍亂0139 菌體蛋白抗體。所述抗體物質(zhì)包含為固定所述各霍亂抗體而引入其中的輔助性 介質(zhì)，所述輔助性介質(zhì)例如巰基丁二胺銅修飾介質(zhì)，所述金屬電極可以首先利 用所述輔助性介質(zhì)進行表面修飾處理，之后在其上包覆抗體物質(zhì)表層，抗體物 質(zhì)表層與所述輔助性介質(zhì)渾然一體。本案微流控芯片的結(jié)構(gòu)中涉及若干種電極， 所述電極均為微小尺寸的電極，其中的每一個電極的形狀均可以是任意選定的 形狀，所述任意選定的形狀例如方片形狀、矩形片狀、條狀或圓形片狀等等。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及若干個微儲液池，所述微儲液池是用于過渡性儲液 的微池或微囊，其中的每一個微儲液池的微型的內(nèi)腔其形狀均可以是任意選定 的形狀，所述內(nèi)腔形狀例如微型的圓柱形空腔狀、微型的方柱形空腔狀、微型 的橢圓形空腔狀或微型的球形空腔狀等等。本案裝置當(dāng)然還可以進一步包括一 些附件，所述附件例如多道電化學(xué)工作站以及微流動泵等等，所述多道電化學(xué) 工作站的技術(shù)含義以及微流動泵的技術(shù)含義是公知的。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中 涉及的各個工作電極以及對電極以及參比電極等，可以分別經(jīng)由相應(yīng)的專用串 線與所述多道電化學(xué)工作站的相應(yīng)接口進行聯(lián)接。所述專用串線是用來將各所 述電極與所述多道電化學(xué)工作站的各相應(yīng)接口進行相互聯(lián)接的專用電纜。所述 微流動泵用于驅(qū)動微量液體流動，所述微流動泵可以與按需選定的任意一個所 述微儲液池聯(lián)通。
本案微流控芯片的具體實現(xiàn)路徑可以有多種，選其一詳解如下 一、高聚物微金電極蓋片的制備
1、 以石英/鉻板為光掩模，用紫外光作為光源對蓋片表面的選擇性區(qū)域進 行輻射。
2、 采用已二胺作為胺化劑，1-[3， - (N-N-二甲基胺)丙基]-3-已基碳二亞 胺鹽酸鹽為偶合劑對經(jīng)過選擇性區(qū)域照射的高聚物進行胺化反應(yīng)。
3、 將經(jīng)過選擇性區(qū)域胺化反應(yīng)的高聚物浸入氯金酸中反應(yīng)泡。
4、 用蒸餾水清洗以后，再將其浸入硼氫化鈉溶液中還原。
5、 用蒸餾水清洗以后，在將其浸入0.5mol/L的硫氰化鉀溶液中超聲清洗 30Min。
6、 將經(jīng)過清洗的高聚物蓋片浸入含有金離子、絡(luò)合劑和還原劑甲醛的鍍液 中，于45-60。C下反應(yīng)1h。
7、 將鍍有微金電極的蓋片放入烘箱中退火處理約3 h，即得到本發(fā)明的高聚 物多微金電極蓋片。其中微金電極長3mm，寬3mm，厚度約為0.1mm。相互之間間距約為3mm。
二、 帶有微通道的高聚物基片的制作
1、 制作單晶硅陽模
繪制芯片設(shè)計圖，圖形線條寬度約為25-100|jm，采用高清晰激光照片系 統(tǒng)輸出在透明的膠片上，即得到光刻掩模。
通過化學(xué)氣相沉積法在基片表面上沉積一層氮化硅薄模作為犧牲層，在此 基片上通過旋轉(zhuǎn)覆模技術(shù)覆蓋一層光敏膠，于烘箱中6CTC處理15-20min;將 光刻掩模覆蓋在基片上，通過暴光成像的原理將光刻掩模上的圖像轉(zhuǎn)移到基片 表面的光膠層上；通過干法腐蝕的方法將光膠層上的平面二維圖形加工成具有 一定深度的立體結(jié)構(gòu)。即可得到具有凸起的通道的單晶硅陽模。制備好的單晶 硅陽模依次用H202: H2SCU溶液(體積比為1:4)，丙酮和蒸餾水清洗，以 除去其表面的氧化物。
2、 采用熱壓法復(fù)制微通道
將PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)有機玻璃片切割成長約6cm，寬4cm的 尺寸。超聲清洗，自然涼干，在熱壓裝置中將PMMA有機玻璃基片加熱到軟化 溫度(11CTC)左右，然后在單晶硅陽模上施加一定的壓力，并持續(xù)約1min， 即可在PMMA有機玻璃基片壓制出與單晶硅陽?；パa的微通道。然后，將陽模 和刻有微通道的PMMA基片一起冷卻后脫模，就得到所需的微通道。
3、 在蓋片上制作微儲液池 在蓋片上采用金剛鉆鉆出樣品池，廢液池，緩沖液池，檢測池等四個微儲液池。
三、 將高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片在低溫氧等離子氣氛中 處理干凈
四、 芯片封合
在顯微鏡下對準高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片，將此基 片和蓋片固定用二片蓋玻片夾緊，放置在烘箱中于11CTC左右保溫15min，即可得到所需的四通道PMMA微流控芯片。
五、 將步驟四所完成的PMMA芯片分別在工作電極、參考電極及對電極末端利 用銀膠接上銅片作為導(dǎo)線，待銀膠完全干后再封上熱熔膠以固定銅片，即完成
整個四通道微流控芯片的制作。
六、 包覆抗體物質(zhì)表層
1、 采用等離子體表面處理法將微電極表面處理干凈，將處理后的微電極浸于20 mmol丄-1除氧的CuL (巰基丁二胺銅)溶液20h,獲得CuL修飾電極。
2、 采用點樣儀將各種單克隆抗原點到電極表面，點樣量在0.1-10mL及 0.1-100mL之間任意選擇；點樣精度0.5 nl;點樣速度3s/ul，每隔3mm點一 次樣品，在非接觸噴樣模式下將10iJL量的TP0821抗體，TP0319抗體， TP0624抗體，0139菌體蛋白抗體等四種抗體物質(zhì)分別固定在四個CuL修飾的 工作電極表面，至此，包覆抗體物質(zhì)表層的制備操作完成。
詳解的本案微流控芯片的上述具體實現(xiàn)路徑其相關(guān)各個操作參數(shù)可以根據(jù) 實際需要進行調(diào)整。
本案微流控芯片的使用方法
采用外加微泵驅(qū)動液流在四通道微流控芯片的毛細管通道中穩(wěn)定流動，利 用四通道電化學(xué)儀器分別對四種蛋白加以檢測。 本案微流控芯片的具體檢測使用步驟如下
1、 在微管路中加入樣品液，在外加微泵驅(qū)動下，各種抗原分子被各通道中 電極表面相應(yīng)抗體捕獲，通過夾心法結(jié)合酶標"二抗"形成免疫復(fù)合物。
2、 采用多通道電分析儀，加入鄰苯二酚等電子媒介體，采用安培法檢測"二
抗"上酶引起H202還原的電流變化，由此獲得各種分析物含量。
3、 將結(jié)果進行綜合分析，對霍亂進行診斷。
本實用新型的優(yōu)點是，在一塊微流控芯片上集成了分別包覆有四種特征抗 體物質(zhì)表層的四個工作電極，該四個工作電極分別針對檢測霍亂的四種特征診 斷蛋白，本案微流控芯片是一種能夠利用霍亂多種特征抗體進行同時檢測的應(yīng)用于快速診斷烈性傳染病霍亂的專用微流控芯片，其集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點決定 了該芯片的使用有助于加快霍亂診斷速度、有助于降低霍亂診斷費用。

圖1是本案微流控芯片實施例構(gòu)造示意圖，圖中包括所述附件。
圖中，1是微流動泵，2、 4、 5、 14分別是四個裝設(shè)位置不同的微儲液池， 3是歧管狀微通道，6是微流控芯片的蓋片，7是微流控芯片的基片，8是聯(lián)接 工作電極與多道電化學(xué)工作站的專用串線，本例圖中共顯示有四條同型的用于 聯(lián)接工作電極與多道電化學(xué)工作站的專用串線，9是多道電化學(xué)工作站，10是 裝設(shè)在微小通道內(nèi)的具有霍亂TP0821抗體表層的工作電極，11是裝設(shè)在微小 通道內(nèi)的具有霍亂TP0319抗體表層的工作電極，12是裝設(shè)在微小通道內(nèi)的具 有霍亂TP0624抗體表層的工作電極，13是裝設(shè)在微小通道內(nèi)的具有霍亂0139 菌體蛋白抗體表層的工作電極，15是參比電極，16是對電極，17是聯(lián)接對電 極與多道電化學(xué)工作站的專用串線，18是聯(lián)接參比電極與多道電化學(xué)工作站的 專用串線。
具體實施方式

在圖1所展示的本案實施例中，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起 的兩片板狀物，兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片6以及微流控芯片的基片 7，在兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有毛細管通道，以及，四個微儲 液池，該四個微儲液池分別是微儲液池2、微儲液池4、微儲液池5和微儲液池 14，毛細管通道的一端經(jīng)由歧管狀微通道3分別與微儲液池2以及微儲液池4 以及微儲液池5聯(lián)通，毛細管通道的另一端與余下的一個微儲液池14聯(lián)通，以 及，依序分別裝設(shè)在所述毛細管通道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極16以 及參比電極15，工作電極由金屬電極以及包覆在金屬電極上的抗體物質(zhì)表層構(gòu) 成，毛細管通道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，該呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細管通道由四個微小通 道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述四個微小通道內(nèi)，以及，該四個工作電極其表層結(jié)構(gòu)中的抗體物
質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是霍亂TP0821抗體以及霍亂 TP0319抗體以及霍亂TP0624抗體以及霍亂0139菌體蛋白抗體，該四個工作 電極分別是裝設(shè)在第一并聯(lián)支流微小通道內(nèi)的具有霍亂TP0821抗體表層的工 作電極10以及裝設(shè)在第二并聯(lián)支流微小通道內(nèi)的具有霍亂TP0319抗體表層的 工作電極11以及裝設(shè)在第三并聯(lián)支流微小通道內(nèi)的具有霍亂TP0624抗體表層 的工作電極12以及裝設(shè)在第四并聯(lián)支流微小通道內(nèi)的具有霍亂0139菌體蛋白 抗體表層的工作電極13。本例圖中包括作為所述附件的多道電化學(xué)工作站9以 及微流動泵1，作為附件的微流動泵1可以與按需選定的任意一個微儲液池聯(lián) 通，本例中，微流動泵1與微儲液池4聯(lián)通，參比電極15可以經(jīng)由專用串線 18與多道電化學(xué)工作站9的對應(yīng)接口聯(lián)接，對電極16可以經(jīng)由專用串線17 與多道電化學(xué)工作站9的對應(yīng)接口聯(lián)接，工作電極10、 11、 12以及13可以 分別經(jīng)由四條同型專用串線8與多道電化學(xué)工作站9的對應(yīng)接口聯(lián)接。
權(quán)利要求1. 應(yīng)用于快速診斷烈性傳染病霍亂的專用微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有毛細管通道，以及，四個微儲液池，毛細管通道的一端經(jīng)由歧管狀微通道分別與其中的三個微儲液池聯(lián)通，毛細管通道的另一端與余下的一個微儲液池聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述毛細管通道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由金屬電極以及包覆在所述金屬電極上的抗體物質(zhì)表層構(gòu)成，其特征是，所述毛細管通道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細管通道由四個微小通道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述四個微小通道內(nèi)，以及，該四個工作電極其表層結(jié)構(gòu)中的抗體物質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是霍亂TP0821抗體以及霍亂TP0319抗體以及霍亂TP0624抗體以及霍亂O139菌體蛋白抗體。
專利摘要本實用新型涉及一種應(yīng)用于快速診斷烈性傳染病霍亂的專用微流控芯片，屬于測試領(lǐng)域。快速且廉價地對烈性傳染病霍亂進行診斷是醫(yī)療技術(shù)進步的諸多企望之一，本案提供一種利用霍亂多種特征抗體同時檢測、快速診斷霍亂的微流控芯片。本案要點是，芯片內(nèi)含有呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細管通道，該并聯(lián)構(gòu)造含有四條相互并聯(lián)的微小通道，共有四個工作電極分別裝設(shè)在所述四條微小通道內(nèi)，該四個工作電極的表層物質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是霍亂TP0821抗體以及霍亂TP0319抗體以及霍亂TP0624抗體以及霍亂O139菌體蛋白抗體。本案芯片其集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點決定了該芯片的使用有助于提高霍亂診斷速度并降低診斷耗費。
文檔編號G01N33/569GK201259502SQ200820131548
公開日2009年6月17日 申請日期2008年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月8日
發(fā)明者岳 宋, 寧 干, 李天華, 李榕生, 欣 楊, 王青春, 王魯雁 申請人:寧波大學(xué)