專利名稱：檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測豬病毒性傳染病病原的器具，特別是涉及一種檢 測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條。 技術(shù)背景
我國是生豬的生產(chǎn)和消費(fèi)大國。隨著大中小型規(guī)模化養(yǎng)豬場、種豬場數(shù)量 的逐年增加，豬繁殖障礙性疾病已成為我國規(guī)?；i場最重要的疾病之一，發(fā)
病率平均達(dá)30%以上，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。豬繁 殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬乙型腦炎病毒(JEV)是造 成豬繁殖障礙的三種重要病毒。PRRSV引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，主要表 現(xiàn)為感染母豬發(fā)熱，厭食，懷孕后期發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和弱仔等，感 染仔豬發(fā)生呼吸困難(肺炎)、免疫機(jī)能障礙和高死亡率，因部分病豬的耳朵 發(fā)紫，又稱藍(lán)耳病。藍(lán)耳病近年來在我國廣為傳播，如2006年我國南北10多個 省(市、區(qū))的豬群發(fā)生的"高熱病"現(xiàn)認(rèn)為是高致病性PRRSV毒株引起，發(fā)病 豬群達(dá)200萬頭，死亡40萬頭。因此，PRRSV被認(rèn)為是導(dǎo)致近年來豬肉價格上漲 的主要疾病之一。PPV引起豬細(xì)小病毒病，主要表現(xiàn)為受感染的母豬，特別是初 產(chǎn)母豬及血清學(xué)陰性經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、畸形胎、木乃伊胎和弱仔以及 屢配不孕，而其他年齡的豬感染后不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。目前豬細(xì)小病毒病 在我國豬群中廣為傳播，在大多數(shù)感染豬場呈地方性流行并且很難凈化，從而 造成了持續(xù)的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。JEV引起人畜共患病一流行性乙型腦炎。豬乙型腦炎，主要表現(xiàn)為感染豬發(fā)熱，厭食，母豬懷孕后期 突然發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和弱仔等，新生仔豬良莠不齊、死亡率高，感 染公豬出現(xiàn)睪丸炎。豬乙型腦炎主要由帶病毒的蚊蟲叮咬而傳播，主要分布在 亞洲各國，我國大部分地區(qū)均有本病發(fā)生。
快速診斷是有效防控疾病的基礎(chǔ)。但在生產(chǎn)中，P服SV、 PPV和JEV引起的繁 殖障礙性疾病，臨床癥狀相似，而且經(jīng)?；旌细腥荆瑔螒{臨床病理變化往往不 能及時正確診斷，最后確診有賴實(shí)驗(yàn)室檢查，如檢測病豬樣品中病原或其特異 抗體的存在、甚至用分離到的病原復(fù)制出臨床病例。目前實(shí)驗(yàn)室檢測這三種病 毒的方法有(1)病毒分離與鑒定，無菌取病豬樣品接種肺泡巨噬細(xì)胞或 MarC-145細(xì)胞(對PRRSV)、豬傳代腎細(xì)胞(對PPV和JEV)培養(yǎng)相應(yīng)病毒，用酶 或熒光素印跡抗體檢測細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒，或用中和抗體鑒定病毒；(2)用間 接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測PRRSV感染豬血清中的特異抗體，用血凝抑 制試驗(yàn)(HI)檢測PPV或JEV感染豬血清中的特異抗體；(3)用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測細(xì)胞培養(yǎng)物或病豬樣品中的PRRSV或JEV核酸，用PCR檢 測細(xì)胞培養(yǎng)物或病豬樣品中的PPV核酸。
病毒分離與鑒定和PCR檢測技術(shù)操作復(fù)雜、需要儀器和較長的時間，不適合 生產(chǎn)或現(xiàn)場的快速診斷需要。ELISA和HI比病毒分離與鑒定和PCR技術(shù)簡便、快 速，常用來檢測PRRSV (ELISA) 、 JEV和PPV (HI)及其抗體，但仍不便于我國 基層或現(xiàn)場普遍推廣應(yīng)用。因?yàn)镋LISA仍需要酶標(biāo)儀和試劑，較復(fù)雜的操作步驟 和經(jīng)驗(yàn)，HI也需要新鮮的豚鼠或鵝紅血球；這些儀器、試劑在基層或者缺乏， 或者缺乏操作人員和保存條件。為此，有人研究報道了用斑點(diǎn)免疫金滲濾法來 檢測PPV、 JEV和PRRSV。這種方法利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，將抗 原一抗體反應(yīng)由ELISA或HI的傳統(tǒng)液相環(huán)境轉(zhuǎn)到固相濾膜上快速進(jìn)行，并采用膠體金印跡代替酶印跡和紅血球印跡，憑肉眼直接觀察膠體金的顯色狀況而判斷
結(jié)果，因此比ELISA和HI更簡便、快速和實(shí)用。但目前報道的斑點(diǎn)免疫金滲濾法 一次只檢測一種豬病病原，即使這樣，也至少需添加2次試劑和洗滌2次才能獲 得結(jié)果；如果要鑒別診斷上述三種豬病病毒，則同時需要多種試劑盒和十幾個 操作步驟，非專業(yè)的基層人員使用仍顯得不方便。
專利文獻(xiàn)CN 101216488A中公開了一種檢測豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙 條及其制備方法，其是通過檢測P欣SV抗體進(jìn)行診斷，而不是直接檢測病毒的存 在，并且只能間接地診斷三種主要的豬繁殖障礙性病毒中一種(PRRSV)，有很 大的局限性。
實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型要解決的技術(shù)問題是提供一種結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確的檢測豬繁 殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，該檢測試紙條和斑點(diǎn)免疫金滲濾法一樣特 異、敏感但操作更簡便、快速和實(shí)用，且檢測成本更為低廉。
為解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型采用的技術(shù)方案是
一種檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，至少包括不吸水的支撐 層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層是由樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖 維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，所述纖維素膜上標(biāo)記有一個/條含有 抗豬/小鼠IgG的對照印跡，和至少一個/條含有豬繁殖障礙性病毒抗體的檢測
印跡，所述豬繁殖障礙性病毒抗體為抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV、豬細(xì)小 病毒PPV、豬乙型腦炎病毒JEV單克隆抗體(簡稱單抗)/多克隆抗體(簡稱多 抗)中的至少一種；所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有與檢測印跡所含豬繁殖障礙 性病毒抗體相對應(yīng)的并以膠體金標(biāo)記的抗豬繁殖障礙性病毒的多克隆抗體/單 克隆抗體。所述金標(biāo)抗體纖維層上如附著抗豬繁殖障礙性病毒金標(biāo)單抗，則相應(yīng)地以抗該病毒的多抗標(biāo)記檢測印跡，并以抗小鼠IgG溶液標(biāo)記對照印跡；金 標(biāo)抗體纖維層上如附著抗病毒金標(biāo)多抗，則相應(yīng)地以抗該病毒的單抗標(biāo)記檢測
印跡，并以抗豬IgG溶液標(biāo)記對照印跡。
在所述纖維素膜層上分別標(biāo)記有含PRRSV多抗/單抗、PPV多抗/單抗、JEV 多抗/單抗的三個/條檢測印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有對應(yīng)的混合金標(biāo) 抗體，它是以膠體金標(biāo)記的抗PRRSV、 PPV和JEV單抗/多抗的混合物。
在所述纖維素膜層上標(biāo)記有兩個/條檢測印跡，分別含有PRRSV多抗/單抗、 PPV多抗/單抗，或分別含有PRRSV多抗/單抗、JEV多抗/單抗，或分別含有PPV 多抗/單抗、JEV多抗/單抗，在所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有對應(yīng)的以膠體金標(biāo) 記的抗PRRSV、 PPV的單抗/或多抗，或抗PRRSV、 JEV的單抗/或多抗，或PPV、 JEV的單抗/或多抗。
所述纖維素膜層上標(biāo)記有一條/個檢測印跡時，其與對照印跡的排列組合為
"II ，," = ，，w, ,，，^ — I ，，w + ,，"丄,， "參 ，，" ，，"& ，，" ，， 中的
任意一種；纖維素膜層上標(biāo)記有兩條/個檢測印跡時，其與對照印跡的排列形式 為"卩l(xiāng)"、 "/ / 〃，、"三"、"±"、 ""、 " ; "、 中的任意一種；纖維
素膜層上標(biāo)記有三條/個檢測印跡時，其與對照印跡的排列形式為"I I I I "、
"/ / / /"、"王"、"^"、 " "、中的任意一種。
所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜、聚偏二氟 乙烯膜中的任意一種制成。
所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維、聚酯纖維中的任意一種制成。
所述支撐層由不吸水的硬質(zhì)塑膠片或硬紙條制成。
所述吸水層用吸水紙制成。所述金標(biāo)抗體纖維膜層由玻璃棉、尼龍纖維、聚酯纖維中的任意一種制成。 在所述樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水層上敷設(shè)有保護(hù)膜，且在 樣品吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對應(yīng)的保護(hù)膜上偏向樣品吸附層一側(cè)
0. 3 0. 7 cm處印制有樣品標(biāo)記線。 本實(shí)用新型的有益效果是
(1) 檢測特異性強(qiáng)，敏感性高。該快速檢測試紙條以膠體金印跡高親和力 的特異性單抗/多抗為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價 鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)對單抗/多抗特異性 和親和力(結(jié)合力)影響很小，且具有較高的印跡率。因此，快速檢測試紙條 具有較高的特異性和敏感性，可檢測到2納克的相應(yīng)病毒的蛋白。
(2) 操作簡便，快速。使用該試紙條時無需附加任何其它儀器和試劑，只 要將其測試端插入待檢的澄清樣品液中30秒左右，然后在5分鐘左右即可判定 檢測結(jié)果。
(3) 結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確。以同時檢測三種豬繁殖障礙性病毒傳染病病原 的試紙條為例，以顯示棕紅色的檢測印跡和對照印跡作為檢測的陽性和陰性印 跡，即在纖維素膜上只顯示一條/個棕紅色對照印跡C，表示這三種豬病病毒在 被檢測樣品液中均未檢出，在纖維素膜上顯示一條/個棕紅色對照印跡C和三條 /個棕紅色檢測印跡R、 P、 J，則表示在被檢測樣品液中均檢出這三種豬病病毒， 檢測結(jié)果呈陽性；結(jié)果判定直觀、準(zhǔn)確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性 誤判。
(4) 減少投資和檢測成本。使用該快速檢測試紙條，不需另配其它儀器、 設(shè)備和試劑，節(jié)省大量儀器、設(shè)備和附加試劑費(fèi)用； 一條試紙一次可以檢測1 3種豬病病毒(原)，而且專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地進(jìn)行現(xiàn)場檢測，無需支付專家診斷檢査費(fèi)或送樣品去診斷室的路費(fèi)，節(jié)省檢測成本，檢測費(fèi)用低。
(5)應(yīng)用范圍廣，便于普遍推廣應(yīng)用。本實(shí)用新型操作使用簡單，成"一 步式"或"傻瓜式"，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包 括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個 體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會效益。


圖1為一種檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條的側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2為圖1的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1: 一種同時檢測三種豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，參見 圖1和圖2，圖中1為以塑膠薄片條制成的支撐層，2為以玻璃棉制成的樣品吸 附層，3為附著有膠體金標(biāo)記的抗PRRSV (代號R)、抗PPV (代號P)和抗JEV (代號J)單克隆抗體(Wi)的玻璃棉纖維層，4為硝酸纖維素膜，5為由吸水 濾紙制成的吸水層，將編號2、 3、 4、 5各層依次粘貼在支撐層1上，彼此拼接 的交界處纖維互相交叉滲透。在硝酸纖維素膜4上，分別以抗PRRSV、抗PPV、 抗JEV多克隆抗體IgG溶液(Xi)標(biāo)記出三種病毒的檢測印跡6-1、 6-2、 6-3， 并以羊(兔)抗小鼠IgG溶液標(biāo)記出對照印跡(C) 7;檢測印跡與對照印跡的 排列形式為"I I I I "。 8-1為覆蓋在樣品吸附纖維層2和金標(biāo)抗體纖維層3 上面的測試端的白色保護(hù)膜，在樣品吸附層2和金標(biāo)抗體纖維層3交界處對應(yīng) 的保護(hù)膜8-1上偏向于樣品吸附層2 —側(cè)0. 5cm處印有印跡線9， 9的右端印有 箭頭及max字樣，吸水層5 (手柄端)上覆蓋有其它顏色(如黃色)保護(hù)膜8-2。
用于對照印跡的羊(或兔)抗小鼠/豬IgG抗體，及用于檢測印跡和金標(biāo)抗 體纖維層的抗PRRSV、抗PPV和抗JEV的多克隆抗體和單克隆抗體的常規(guī)的制備方法如下
1) 羊(或兔)抗小鼠/豬IgG的制備
以飽和硫酸銨法提取小鼠/豬血清中的IgG:取1份血清加2份PBS液(pH 7. 2)混勻，加等體積飽和硫酸銨液混勻，置4'C冰箱內(nèi)2小時，在4'C、10000r/min 離心15min，棄上清液；以適量PBS液(pH7. 2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其 最終濃度為33%，置4。C冰箱內(nèi)2小時，在4'C、 10000r/min條件下離心15min, 棄上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4。C冰箱內(nèi)用PBS液(pH7.2)過夜 透析，換液2 3次，在4。C、 10000r/min條件下離心15min，收集上清液，以 紫外分光光度計測定其蛋白濃度。以50"g 100"g (IgG) /kg體重經(jīng)皮下或 肌肉注射抗體陰性健康羊或家兔3 4次，末次免疫20天后，靜脈采血，以ELISA 測定其血清抗體效價在1: 2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血 清，以飽和硫酸銨法提取羊(兔)抗小鼠/豬的IgG (其提取方法與上述提取小 鼠血清IgG相同，不再重述)，用于標(biāo)記本發(fā)明試紙條的對照印跡。
2) 抗PRRSV、抗PPV和抗JEV單克隆抗體(Wi)的制備 以50 100ug/只的PRRSV (PPV或JEV)蛋白免疫Balb/c系小鼠三次，每
次間隔15 30天；第三次加強(qiáng)免疫后3 4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致 死，于75。/o酒精浸泡5 10inin，無菌取其脾細(xì)胞；剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾， 1000r/min離心10min，收集脾細(xì)胞；將1X 108的脾細(xì)胞與2X 107 5X107的NSO 漿細(xì)胞瘤細(xì)胞混合，1000r/min離心10min棄上清，細(xì)胞沉淀于37。C的水溶中 緩緩加入0. 7 lmL的40% 50%PEG4000 (pH 8.5 9.0)作用lmin，然后緩慢 加入無血清1640培養(yǎng)基15ml，以終止PEG的作用，37。C水浴5 10min， 1000r/min 離心10min棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔培養(yǎng)板 (100 200Wy孔)，置于37。C 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 10天后，以5 10ug/mL
10的純化PRRSV (PPV或JEV)蛋白包被96孔酶標(biāo)板，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 檢測雜交瘤的培養(yǎng)上清，挑取強(qiáng)陽性細(xì)胞克隆(0D45?！?.5)，進(jìn)行連續(xù)三次的有 限稀釋法克隆化，所生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)為92 98，其分泌的抗PRRSV (PPV或JEV)的單克隆抗體Wl (W2或W3)特異地與PRRSV (PPV或JEV)反應(yīng)，
而不與其它豬病病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)KT1。，輕鏈亞型為K或入， 重鏈亞型為IgGb IgG2a、 IgG2b、 IgG3，這三種病毒的單克隆抗體(Wi)，均用于
制備金標(biāo)單克隆抗體(Wi)。
3) 抗PRRSV、抗PPV和抗JEV金標(biāo)單克隆抗體(Wi)和金標(biāo)單克隆抗體纖 維膜的制備
以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在50 100mL沸騰的0. 01 0. 05%氯金酸 水溶液中加入2 4mL的0. 5 2%檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的膠體金。 以0. lmol/L的K2C(U周膠體金pH值至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的印跡比將 待印跡的抗PRRSV(或PPV，或JEV)的單克隆抗體Wl (W2或W3)加入pH8. 5 9. 5 的金溶膠中，印跡10min后，加20%PEG10000至終濃度0. 05%, 4"C下、1500 3000r/min離心20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4。C下、15000r/min離心1 小時，棄上清液，獲初步純化金標(biāo)抗體蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱 層析，分離純化金標(biāo)蛋白，分別獲得膠體金印跡的抗PRRSV、抗PPV和抗JEV的 單克隆抗體。將1:100 500稀釋的膠體金印跡的上述單克隆抗體中的2 3種 混合吸附于精制玻璃棉(尼龍纖維或聚酯纖維)中，4'C下低溫真空干燥，即制 得金標(biāo)單克隆抗體纖維膜。
4) 抗PRRSV、抗PPV和抗JEV多克隆抗體(Xi)的制備
分別采用國家批準(zhǔn)的針對這三種豬病的滅活疫苗或弱毒疫苗，單獨(dú)多次免 疫接種抗體陰性健康豬。末次免疫20天后靜脈采血，以ELISA或HI測定其血清抗體效價在1:2000或1:1024以上，則心臟采血或頸動脈放血，收集其高免 血清，以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，
不重述)。
5) 上述檢測試紙條的檢測操作方法
a檢測樣品液的制備無菌取病豬或流產(chǎn)胎兒的腦、肺、腸、肝、淋巴結(jié)等 組織，將其剪碎、研磨，以生理鹽水制成1:2 5倍待檢測樣品懸液，置4。C或 室溫澄清或離心;若取病豬的血液，則分離血清，并以生理鹽水作1:10 50倍
稀釋待測。
b檢測操作將該快速檢測試紙條測試端插入待檢測樣品澄清液或血清中， 插入深度不超過印跡線9，約30秒后取出試紙條，水平放置約1 5分鐘，同時
觀察結(jié)果。
c結(jié)果判斷如果在檢測試紙條纖維素膜上只顯示出一條/個棕紅色對照印 跡C，表示測檢結(jié)果呈陰性，說明在被檢樣品液中未檢測出PRRSV、 PPV和JEV; 如果檢測試紙條上的纖維素膜出現(xiàn)棕紅色的對照印跡C和檢測印跡R或P或J， 表示檢測結(jié)果呈陽性，即在待檢樣品中檢測出相應(yīng)的PRRSV或PPV、或JEV;如 果檢測印跡R、 P、 J同時出現(xiàn)，表示在待檢樣品中同時檢測出PRRSV、 PPV、 JEV 這三種豬病病毒；如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已 失效或操作有誤。
6) 所述檢測試紙條測試的原理如下
當(dāng)該快速檢測試紙條測試端(樣品吸附帶)插入待檢測樣品溶液后，待檢 溶液通過虹吸帶動待檢豬病病毒及金標(biāo)抗體纖維膜中的金標(biāo)抗體一起向硝酸纖 維素膜擴(kuò)散，并最終滲入手柄端濾紙中，擴(kuò)散過程中待檢豬病病毒可與該病毒 相對應(yīng)的金標(biāo)單抗相結(jié)合，進(jìn)而與纖維素膜上檢測印跡中的抗該病毒的多抗IgG結(jié)合，從而顯示出棕紅色的檢測印跡R、 P、 J;而對照印跡中的羊抗或兔抗小鼠
IgG則可與金標(biāo)單抗(Wi)結(jié)合，形成棕紅色對照印跡C。如果待檢樣品液中沒 有PRRSV、 PPV、 JEV這三種豬病病毒，試紙條只顯示出一條(個)棕紅色對照 印跡C;樣品溶液中含有PRRSV (PPV或JEV)，則分別與其對應(yīng)的金標(biāo)單抗Wi 結(jié)合，再與纖維素膜上的抗病毒的多抗IgG檢測印跡R (P或J)結(jié)合，顯示出 棕紅色檢測印跡，為陽性印跡；如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則 表明試紙條已失效或操作失誤。
實(shí)施例2: —種同時檢測三種豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，其結(jié) 構(gòu)、制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于由尼龍纖維制成的金標(biāo)抗 體纖維層3上附著以膠體金標(biāo)記的抗PRRSV、抗PPV和抗JEV金標(biāo)多克隆抗體(Xi) (R+P+J);在硝酸纖維素膜4上，分別以抗PRRSV、抗PPV和抗JEV單克隆抗 體IgG溶液(Wi)噴涂出三條檢測印跡(R+P+J)，并以羊(或兔)抗豬IgG溶 液噴涂出對照印跡C，檢測印跡與對照印跡的排列形式為"/ / / /"、"王"、"^"、
"""中的任意一種。其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定 等均與實(shí)施例l相同，不重述。
實(shí)施例3: —種同時檢測兩種豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、 制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于由聚酯纖維制成的金標(biāo)抗體纖 維層上僅附著有抗PRRSV、抗PPV金標(biāo)單克隆抗體(Wi);在聚偏二氟乙烯制成 的纖維素膜層4上分別以對應(yīng)的抗PRRSV、抗PPV多克隆抗體IgG溶液(Xi)標(biāo) 記出兩個檢測印跡，并以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液印上對照印跡，檢測印跡 與對照印跡的排列形式為"lll"、 "http:///"、"三"、"±"、 ""、 " i "、 中的任意一種。其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例1 相同。
13實(shí)施例4: 一種同時檢測兩種豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、 制備方法與實(shí)施例3基本相同，不同之處在于由尼龍纖維制成的金標(biāo)纖維層
上附著抗PRRSV、抗PPV金標(biāo)多克隆抗體(Wi);聚偏二氟乙烯纖維素膜層4上 分別以對應(yīng)的抗PRRSV、抗PPV單克隆抗體IgG溶液(Xi)印制出兩條檢測印跡 "/"，并以羊(或兔)抗豬IgG溶液標(biāo)記出對照印跡"\"。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例5: —種同時檢測兩種豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、
制備方法與實(shí)施例2基本相同，不同之處在于金標(biāo)抗體纖維層上僅附著有抗
PPV和抗JEV金標(biāo)多克隆抗體(Xi );純纖維素膜層4上分別以對應(yīng)抗PPV和抗
JEV單克隆抗體IgG溶液(Xi)標(biāo)記出兩條檢測印跡"I ",并用羊(或兔)抗
豬IgG溶液在純纖維素膜上印制對照印跡"一"。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例6: —種同時檢測兩種豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、
制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于玻璃棉制成的金標(biāo)抗體纖維層
上僅附著有抗PRRSV、抗JEV金標(biāo)多克隆抗體(Xi);羧化纖維素膜層4上分別 以抗PRRSV和抗JEV單克隆抗體IgG溶液(Xi)印制出相應(yīng)的兩條檢測印跡"i "， 用羊(或兔)抗豬IgG溶液在羧化纖維素膜上印制對照印跡"…"。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例7: —種檢測兩種豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、制
備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于玻璃棉制成的金標(biāo)抗體纖維層上
附著有抗P欣SV和抗PPV的金標(biāo)多克隆抗體(Xi);在硝酸纖維素膜層上分別以 抗PRRSV、抗PPV金標(biāo)單克隆抗體IgG溶液(Xi)標(biāo)記出兩條檢測檢測印跡"i "， 并以羊(或兔)抗豬IgG溶液在硝酸纖維素膜上印制對照印跡"i "。實(shí)施例8: —種檢測兩種豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、制 備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于金標(biāo)抗體纖維層上附著有抗JEV 和抗PPV的金標(biāo)金標(biāo)單克隆抗體(Xi);在硝酸纖維素膜層上分別以抗JEV和抗
PPV金標(biāo)多克隆抗體IgG溶液(Wi)噴涂出兩條檢測印跡"I "，并以羊(或兔) 抗小鼠IgG溶液在硝酸纖維素膜上印上對照印跡"i "。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例l相同。
實(shí)施例9: 一種檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備方 法與實(shí)施例3基本相同，不同之處在于由尼龍纖維制成的金標(biāo)纖維層上附著
有抗PRRSV金標(biāo)多克隆抗體(Wi);在聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上以對 應(yīng)的抗PRRSV單克隆抗體IgG溶液(Xi)印制出一個/條檢測印跡，并以羊(或 兔)抗豬IgG溶液標(biāo)記出對照印跡，檢測印跡與對照印跡的排列組合為"II "、
= ，，"y J "" + ，，"丄""秦 "、 '，《 & ,，tf*^r，， 中的任章~"種。
實(shí)施例10: —種檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備 方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于由聚酯纖維制成的金標(biāo)抗體纖維層 上僅附著有抗PPV金標(biāo)單克隆抗體(Wi);在聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4 上以對應(yīng)的抗PPV多克隆抗體IgG溶液(Xi)標(biāo)記出一個檢測印跡" "，并 以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液印上對照印跡" "。其它包括檢測樣品制備、 操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例11: 一種檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備 方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于玻璃棉制成的金標(biāo)抗體纖維層上僅 附著有抗JEV金標(biāo)多克隆抗體(Xi);羧化纖維素膜層4上以抗JEV單克隆抗體IgG溶液(Xi)印制出一條檢測印跡""，并以羊(或兔)抗豬lgG瘠液在羧 化纖維素膜上印制對照印跡"---"。
實(shí)施例12: —種檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備 方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于由玻璃棉制成的金標(biāo)抗體纖維層上 附著有抗JEV金標(biāo)金標(biāo)單克隆抗體(Xi);在硝酸纖維素膜層上以抗JEV和抗PPV
金標(biāo)多克隆抗體IgG溶液(Wi)噴涂出一條檢測印跡"I ",并以羊(或兔)抗 小鼠IgG溶液在硝酸纖維素膜上印上對照印跡"i "。
實(shí)施例13:該快速檢測試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例1基本相同，不同之處在于
支撐層1由不吸水的硬紙條制成，測試端樣品吸附纖維層2由尼龍纖維制成， 纖維素膜層4采用純纖維素膜制成。
實(shí)施例14:該快速檢測試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例1基本相同，不同之處在于
樣品吸附纖維層2由聚酯纖維膜制成，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。其它
包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
1中的檢測操作
方法，不重述。
實(shí)施例15:該快速檢測試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例3基本相同，不同之處在于-測試端的樣品吸附纖維層2用尼龍纖維制成，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯 (PVDF)纖維膜。
實(shí)施例16:該快速檢測試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例7基本相同，不同之處在于 樣品吸附帶2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。其它包括檢測樣 品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例l中的檢測操作方法，不重述。
權(quán)利要求1. 一種檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層是由樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，其特征在于所述纖維素膜層上標(biāo)記有一個/條含有抗豬/小鼠IgG的對照印跡，和至少一個/條含有豬繁殖障礙性病毒抗體的檢測印跡，所述豬繁殖障礙性病毒抗體為抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒PRRSV、豬細(xì)小病毒PPV、豬乙型腦炎病毒JEV單克隆抗體/多克隆抗體中的至少一種；所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有與檢測印跡所含豬繁殖障礙性病毒抗體相對應(yīng)的并以膠體金標(biāo)記的抗豬繁殖障礙性病毒的多克隆抗體/單克隆抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，其 特征在于在所述纖維素膜層上分別標(biāo)記有含PRRSV多抗/單抗、PPV多抗/單抗、 JEV多抗/單抗的三個/條檢測印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有對應(yīng)的以膠體 金標(biāo)記的抗PRRSV、 PPV和JEV單抗/多抗的混合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，其 特征在于在所述纖維素膜層上標(biāo)記有兩個/條檢測印跡，分別含有PRRSV多抗 /單抗、PPV多抗/單抗，或分別含有PRRSV多抗/單抗、JEV多抗/單抗，或分別 含有PPV多抗/單抗、JEV多抗/單抗，在所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有對應(yīng)的以 膠體金標(biāo)記的抗PRRSV、 PPV的單抗/或多抗，或抗PRRSV、 JEV的單抗/或多抗， 或PPV、 JEV的單抗/或多抗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測豬繁殖障礙性病 毒傳染病病原的試紙條，其特征在于所述纖維素膜層上標(biāo)記有一條/個檢測印 跡時，其與對照印跡的排列組合為"II "、 " = ，,、 "/ /"、 "一 I "、 " + "、"丄"、":"、""、 """、 "^"中的任意一種；纖維素膜層上標(biāo)記有兩條/個檢測印跡時，其與對照印跡的排列形式為"ll["、"http:///"、"三"、"±"、" "、" "、"i "中的任意一種；纖維素膜層上標(biāo)記有三條/個檢測印跡時，其與對照印跡 的排列形式為"I I I I "、 "/ / / /"、"王"、"^"、 " "、""中的任意一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，其特征在于所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜、聚偏二氟乙烯膜中的任意一種制成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，其特征在于所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維、聚酯纖維中的任意一種 制成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，其 特征在于所述支撐層由不吸水的硬質(zhì)塑膠片或硬紙條制成。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，其特征在于所述吸水層用吸水紙制成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，其特征在于所述金標(biāo)抗體纖維膜層由玻璃棉、尼龍纖維、聚酯纖維中的任意一 種制成。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，其 特征在于在所述樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水層上敷設(shè)有保護(hù)膜， 且在樣品吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對應(yīng)的保護(hù)膜上偏向樣品吸附層 一側(cè)0. 3 0. 7 cm處印制有樣品標(biāo)記線。
專利摘要本實(shí)用新型公開了可檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條，它包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，該吸附層由樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，在纖維素膜層上標(biāo)記有一個含有抗豬/小鼠IgG的對照印跡，和至少一個含有豬繁殖障礙性病毒抗體的檢測印跡，所述豬繁殖障礙性病毒抗體為抗PRRSV、PPV、JEV單克隆抗體/多克隆抗體中的至少一種；在金標(biāo)抗體纖維層上附著有與檢測印跡所含病毒抗體相對應(yīng)的抗豬繁殖障礙性病毒的金標(biāo)多克隆抗體/單克隆抗體。該試紙條檢測時特異性強(qiáng)、敏感性高，無需附加設(shè)備、試劑，人人均可操作，適合現(xiàn)場快速鑒別診斷豬繁殖障礙性病毒傳染病。
文檔編號G01N33/544GK201285399SQ20082014880
公開日2009年8月5日 申請日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者劉慶堂, 張改平, 李學(xué)伍, 楊繼飛, 楊艷艷, 柴書軍, 王愛萍, 肖治軍, 東 趙, 鄧瑞廣, 邢廣旭 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院