專利名稱：：黃曲霉毒素的固相萃取的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及適用于結(jié)合黃曲霉毒素(Bi、B2,G1和G2)的聚合物。該聚合物可用于黃曲霉毒素的固相萃取和將黃曲霉毒素固定在固相萃取(SPE)盒中以對(duì)從食品或飼料提取的溶液中的黃曲霉毒素進(jìn)行定性或定量分析。
背景技術(shù)：
：各種各樣的人類食品和動(dòng)物飼料，其中包括食用堅(jiān)果、油籽、谷物、草料和用它們生產(chǎn)的產(chǎn)品，很容易受到霉菌毒素的污染，這是霉菌的有毒代謝副產(chǎn)物，它們可能會(huì)在收獲前和后在糧食和飼料作物中存在。其中最重要的是黃曲霉毒素，由霉菌黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一組密切相關(guān)的霉菌毒素。并非所有的霉菌隔離群都產(chǎn)生黃曲霉毒素，因此僅僅存在黃曲霉或寄生曲霉并不意味著黃曲霉毒素將在基體上存在。因此直接測(cè)量黃曲霉毒素水平是食品和飼料的質(zhì)量控制的一個(gè)重要方面。這種測(cè)量通常使用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行。然而，在高效液相色譜設(shè)備無法使用或不適于使用的情況下，通過薄層色譜法(TLC)來測(cè)定也是可行的。在TLC分離后，用發(fā)射波長(zhǎng)366納米的汞燈作為光源以激發(fā)熒光，可以使用商用掃描儀進(jìn)行霉菌毒素測(cè)量，該熒光用光電倍增管檢測(cè)和量化。對(duì)于定量檢測(cè)，還有放射免疫檢定技術(shù)和以免疫化學(xué)為基礎(chǔ)的技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法。在從食品樣品中儀萃取法得到的溶液例如使用HPLC定量測(cè)定之前，可使用固相萃取對(duì)該溶液進(jìn)行“清理”工序，以去除可能會(huì)干擾霉菌毒素的評(píng)估的化合物?？梢允褂眯⌒蜕V柱(稱為“微型柱”，mini-column)進(jìn)行霉菌毒素的定量檢測(cè)，其中在微型柱的礦物吸附劑內(nèi)霉菌毒素被固定為一層。在紫外線光下觀察微型柱，被固定的霉菌毒素會(huì)產(chǎn)生熒光。多種微型柱方法已經(jīng)被采納成為AOAC國(guó)際(官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AssociationofOfficialAnalyticalCommunities)的正式測(cè)試。WO2006/123189描述了一種對(duì)固定在微型柱的層中的霉菌毒素進(jìn)行定量熒光測(cè)定的裝置，并且還提到了分子印跡聚合物和非分子印跡(空白)聚合物作為SPE盒中霉菌毒素吸附劑的用途。WO2003/101580公開了一種用于將霉菌毒素與固體載體結(jié)合的方法，其中包括利用霉菌毒素作為模板來準(zhǔn)備分子印跡聚合物(MIP)。從所提到的霉菌毒素和功能單體的大批清單中，實(shí)際制備的一些MIP僅使用霉菌毒素脫氧萎鐮菌醇(mycotoxinsDON)和玉米赤霉烯酮(ZON)作為模板。對(duì)于DON的MIP以二乙氨乙基-甲基丙烯酸甲酯(DEAMA)、4_乙烯基吡啶(4-VP)或甲基丙烯酸(MAA)與作為交聯(lián)劑的乙二醇-甲基丙烯酸酯(EDMA)或二乙烯基苯(DVP)聚合而成。對(duì)于ZON的MIP是用EDMA作為交聯(lián)劑以三氟甲基丙烯酸(TFM)或4-VP聚合得到的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可用作對(duì)于黃曲霉毒素有選擇性的SPE吸附劑的聚合物。本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)含有酰胺、胺、吡啶、磷酸鹽或磺酸鹽部分的聚合物在用作SPE吸附劑時(shí)能夠固定黃曲霉毒素。因此從廣義上看，本發(fā)明提供了含有酰胺、胺、吡啶、磷酸鹽或磺酸基的聚合物作為SPE吸附劑以固定黃曲霉毒素的用途。如果這種聚合物本身是新穎的，它們也形成本發(fā)明的另一個(gè)方面。所述聚合物最好含有由丙烯酰胺基單體而來的部分，例如一種或多種亞甲雙丙烯酰胺(MBBA)、丙烯酰胺或丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)，或它們的衍生物。用于本發(fā)明的聚合物可通過常規(guī)聚合技術(shù)制備，不使用黃曲霉毒素或結(jié)構(gòu)類似物作為模板(template)。所述聚合物優(yōu)選被制備為大孔性的(macroporous)，例如通過在聚合過程中使用致孔劑形成。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種SPE吸附劑單元，包括裝有或涂有上述聚合物的吸附劑層的柱、試管、棒、針、膜或平整表面。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種黃曲霉毒素的熒光分析方法，包括以下步驟將黃曲霉毒素吸附在裝入或裝在試管、盒、棒或平整表面中的所述聚合物上，使所固定的黃曲霉毒素曝露在紫外線光中，以及檢測(cè)由所述固定的黃曲霉毒素發(fā)出的熒光?？捎糜诰酆衔锏闹苽洳⒃诰酆衔镏姓加羞m當(dāng)?shù)牟糠值膯误w包括丙烯胺；亞甲雙丙烯酰胺(MBAA)；丙烯酰胺，甲基丙烯酸磷酸乙二醇酯(EGMP)；4-乙烯基吡啶和2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)。優(yōu)選實(shí)施例是含有丙烯酰胺部分的聚合物，如丙烯酰胺和MBAA，它們特別有效。優(yōu)選地，所述功能單體與交聯(lián)劑有效交聯(lián)，所述交聯(lián)劑不干擾與黃曲霉毒素的相互作用。合適的交聯(lián)劑包括多元醇二丙烯酸酯，如乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)以及乙烯基苯(DVB)及其類似物。圖1是根據(jù)本發(fā)明的SPE吸附劑盒的剖視圖；圖2是圖1的SPE吸附劑盒的一種變型的剖視圖。具體實(shí)施例方式包括含有酰胺、胺、吡啶、磷酸鹽或磺酸鹽部分的聚合物單元的聚合物是本發(fā)明的主要組成部分，它可以通過將含有酰胺、胺、吡啶、磷酸鹽或磺酸鹽部分(功能單體)的適當(dāng)單體聚合而制備。聚合物最好是作成多孔的，以增加可與黃曲霉毒素相互作用的表面積。多孔聚合物可在致孔劑存在下通過聚合功能單體和交聯(lián)劑而制備，致孔劑即是可分散在單體中的物質(zhì)，并在單體的反應(yīng)后仍然分散在聚合物中，但可以在聚合物形成后被去除以在聚合物中形成孔。通?？紫抖鹊脑黾訒?huì)導(dǎo)致表面積增大，這可用于使結(jié)合力達(dá)到最大。通常情況下，一種合適的致孔劑在聚合反應(yīng)過程中是惰性的。致孔劑可以是固體、液體或氣體。固體或液體可以通過分解或溶解在一個(gè)合適的溶劑中而去除。通常情況下液體致孔劑可通過攪拌而在聚合物混合物中彌散，并可通過用合適的溶劑清洗聚合物而被去除。當(dāng)以上列出的功能單體與常用的交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和二乙烯基苯(DVB)交聯(lián)時(shí)，合適的致孔劑為N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。也可以使用在實(shí)踐中用于自由基引發(fā)聚合反應(yīng)的乙腈、甲醇、甲苯、乙醇、甘油或其它溶劑。功能單體與選定的交聯(lián)劑之間的反應(yīng)在適合反應(yīng)的常規(guī)條件下進(jìn)行。例如，列出的功能單體與交聯(lián)劑乙二醇二甲基和二乙烯基苯的反應(yīng)可在高溫(即高于環(huán)境溫度)下進(jìn)行，或在低溫條件下(即低于環(huán)境溫度)在UV光照射下進(jìn)行，或在合適的引發(fā)劑如1，1_偶氮(環(huán)己烷腈)存在時(shí)沉淀聚合。許多不同的自由基、原子轉(zhuǎn)移、離子聚合的引發(fā)劑，也可用于制備適當(dāng)?shù)木酆衔?。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)、UV或等離子體工藝，所述單體也可用于在珠子、膜或其它物品的表面上形成接枝聚合物。在SPE聚合物中，源自功能單體的單位與來自交聯(lián)劑的單位的比例可以從約51到約1100。已發(fā)現(xiàn)在約13至120范圍中的比例是特別有效的。例如，14的比例在熱聚合產(chǎn)生的聚合物中提供了有效的吸附劑，且119的比例在低溫UV聚合產(chǎn)生的聚合物中提供了有效的吸附劑。雖然EGDMA和二乙烯基苯(DVB)是優(yōu)選的交聯(lián)劑，也可以使用其它的能夠交聯(lián)功能雙丙烯酰胺聚合物的單體。該交聯(lián)劑的反應(yīng)活性最好與功能單體類似。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑包括，但不僅限于，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)，三甲基丙烯酸酯(TRIM)，二乙烯基苯(DVB)和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇一些適用于某一特定系統(tǒng)的其它單體和交聯(lián)劑。為在固定的黃曲霉毒素中供分析使用，最終的聚合物可裝入或裝在合適的用作SPE吸附劑單元的柱、試管、針、膜、棒或平整表面中，或與這些部件集成為一體。SPE吸附劑載體最好選擇為不發(fā)熒光的材料，在這一點(diǎn)上看，其將不會(huì)對(duì)吸附的黃曲霉毒素的熒光檢測(cè)造成干擾，或者其以可控的背景值發(fā)熒光。聚合物最好是粉末或預(yù)制的整塊材料裝入，如在市售的空SPE盒中所見的一樣，其以一層靠在預(yù)制熔合物上，或作為一均勻?qū)邮┘釉诎?、試管、針、膜或平整表面上。圖1所示為一個(gè)典型的單元。一個(gè)空的圓柱形SPE盒1(可從例如英國(guó)Poole的Supelco公司買到)具有一個(gè)噴出口2和在其入口的支持法蘭3。該盒由塑料材料制造，具有合適的低熒光，且在黃曲霉毒素的受激發(fā)熒光的條件下理想地不發(fā)熒光。多孔熔合物4，最好是非熒光材料如聚四氟乙烯(PTFE)，并且橫過可以接近噴出口2的孔徑。粉末形式的聚合物吸附劑裝入盒中，形成聚合物層5。另一個(gè)保持熔合物6放在聚合物層5的上表面上。替代地，適當(dāng)形狀的多孔聚合物單體放在熔合物4的頂上。在使用SPE單元時(shí)，從可能含有黃曲霉毒素的物質(zhì)中提取的液體注入盒中，(自然地或通過抽吸)使其流過吸收層5，通過噴出口3流出該盒。樣品中的任何黃曲霉毒素(如果有的話)被聚合物吸收，在熔合物6下面、在聚合物的上部區(qū)域中形成了一層或帶。通過將該單元插入到例如在WO2006/123189中所述的分析熒光計(jì)中，這樣形成的SPE吸附劑單元可用于定量分析所吸附的黃曲霉毒素，上述專利的全文在此引入作為參考。在分析過程中為了降低背景熒光，在盒的表面上提供一個(gè)不透明的區(qū)或條是有用的，以覆蓋正好在將出現(xiàn)所吸附的黃曲霉毒素的熒光帶的區(qū)域之下的聚合物。該效果可由該盒的另一個(gè)不透明區(qū)或條得益增補(bǔ)，所述另一個(gè)不透明區(qū)或條正好在熔合物6或?qū)⒊霈F(xiàn)熒光帶的區(qū)域之上。所述不透明區(qū)可以通過在裝入聚合物后在盒上貼上膠紙而形成，如紙膠帶或電氣絕緣膠帶，最好是黑色膠帶。另外，膠帶可在裝入聚合物前施加，如果聚合物的上層高度可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)的話。在以準(zhǔn)確控制的條件裝入聚合物的一個(gè)商業(yè)化工藝中，可以使用在制造過程中例如通過涂覆或噴灑不透明材料而形成不透明區(qū)的盒。這種減少背景熒光的技術(shù)也適用于其它SPE盒，或前面提到的含有礦物吸附劑的微型柱，其中以吸附劑材料形成吸附化合物的熒光帶。因此，它形成了本發(fā)明的另一個(gè)方面，與上述的本發(fā)明聚合物吸附劑的用途無關(guān)。SPE吸附劑單元也可用于在HPLC或ELISA的定量分析之前清理樣品。任選地，該聚合物可用礦物油處理，以改善在聚合物上固定的黃曲霉毒素帶的結(jié)合禾口焚光輸出(見PiletskaΕ.V.,Romero-GuerraM.,GuerreiroA.R.,KarimK.,TurnerA.P.R,PiletskyS.Α.(2005)Adaptationofthemolecularimprintedpolymerstowardspolarenvironment.(分子印跡聚合物對(duì)極地環(huán)境的適應(yīng))Anal.Chim.Acta，δ42，47_δ1。)已發(fā)現(xiàn)以乙二醇二甲基丙烯酸酯或二乙烯基苯作為優(yōu)選的交聯(lián)劑、由亞甲基雙丙烯酰胺的多孔聚合物制備的SPE吸附劑對(duì)固定黃曲霉素B1,B2,G1和G2是特別有效的。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，如圖2所示，另一聚合物層7可加到盒中SPE吸附劑上的熔合物6上。在需要時(shí)這可以用來向加入盒中的樣品溶液提供額外的清理。對(duì)于黃曲霉毒素，由二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯(DEAEM)為基的聚合物作為一個(gè)合適的額外清理層，已發(fā)現(xiàn)它可以成功去除取自落花生(花生)的樣品中可能干擾的化合物。其它合適的清理材料和程序?qū)τ谀切┦煜し治鳇S曲霉毒素的存在的人來說將是眾所周知的。必須要小心以避免在清理樣本時(shí)減少黃曲霉毒素的數(shù)量。與上述用于定量分析的用途一樣，本發(fā)明的SPE聚合物還可用作結(jié)合黃曲霉毒素的片或膜的用途，或用在如W02006/120381所公開的傳感器中。此外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過先用甲醇洗然后用水洗，可輕易地從聚合物中去除黃曲霉毒素。這可用來“再生”聚合物以供進(jìn)一步使用，但在進(jìn)行重要的定性或定量檢測(cè)時(shí)不建議重復(fù)使用聚合物。然而這意味著聚合物可作為將在熒光分析以外方法如色譜法中受到定量測(cè)定的樣本的清理步驟。使從可能含有黃曲霉毒素的食品中提取的液體樣品與聚合物接觸，以吸附存在的任何黃曲霉毒素，而樣品中存在的其它材料通過用合適的溶劑清洗而從聚合物中去除。然后黃曲霉毒素從聚合物中洗脫出，且用作對(duì)任何存在的黃曲霉毒素進(jìn)行定量測(cè)定例如HPLC的清潔溶液。本發(fā)明的實(shí)施方式從下面的實(shí)施例將得到進(jìn)一步的理解。(所述聚合物的背景熒光的強(qiáng)度和所固定的黃曲霉毒素的熒光強(qiáng)度可由W02006/120381中公開的傳感器裝置確定。)例1聚合物的制備通過攪拌功能單體亞甲雙丙烯酰胺(MBAA)，5g；交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，20g;致孔劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，25克；和引發(fā)劑，1，1-偶氮(環(huán)己烷腈)，500mg,來制備聚合混合物。使用Honle100UV燈(強(qiáng)度0.157瓦/厘米2)(HonleUV公司，UK)照射該聚合混合物20分鐘，然后在80°C的油浴中熱退火12小時(shí)。用甲醇清洗以除去溶劑(DMF)，由此產(chǎn)生的聚合物是一種大孔材料。由此產(chǎn)生的本體聚合物經(jīng)研磨和在甲醇中濕篩。粒徑范圍為25至63μm的部分被收集和干燥。制備之后，將75mg的聚合物加入到空的Iml無熒光塑料盒(Supelco公司，英國(guó))中，該盒中裝有無熒光的特氟隆(聚四氟乙烯PTFE)熔合物(Supelco公司，英國(guó))。例2在MBAA基聚合物上固定AFB1通過加入2毫升水(例如HPLC級(jí)的水)預(yù)處理例1中制備的盒。將在4毫升甲醇中的黃曲霉毒素B1(AFBl)溶液(甲醇的濃度為從80%至20%，AFBl的濃度為從10至200ng)加入到盒中，以將黃曲霉毒素加到MBAA聚合物的層上。然后使用1毫升的20%甲醇(8020，水甲醇)清洗該盒，以去除干擾化合物。在MBAA聚合物層中固定的黃曲霉毒素層的存在，則通過利用W02006/120381中公開的傳感器裝置觀測(cè)到對(duì)UV光曝光所產(chǎn)生的熒光而顯示。在SPE盒頂部熔合物的正下方觀察到一尖銳的熒光帶。對(duì)MBAA基聚合物上AFBl的檢測(cè)靈敏度是非常好的，特別是在被20%甲醇吸附時(shí)。例3黃曲霉毒素B!、ByG^G2的固定隨后，在20%甲醇溶液中攙入IOOng的AFBl、AFB2、AFGl和AFG2毒素且加到例1中制備的各個(gè)盒中，隨后用1毫升20%甲醇進(jìn)行清洗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有毒素被吸附在非常相似的地方，接近頂部熔合物。例4對(duì)玉米和花生基質(zhì)中的MBAA聚合物的測(cè)試將攙入20ngAFBl的花生基質(zhì)裝在按照例1制備的盒上。用1毫升20%的甲醇清洗所述裝有樣品的盒。通過利用W02006/120381中公開的傳感器裝置觀測(cè)到對(duì)UV光曝光所產(chǎn)生的熒光，表明在MBAA聚合物層中固定的AFBl層的存在。例5用于去除干擾化合物的合并聚合物的盒在按照例1制備的盒中加入一個(gè)二乙基氨基甲基丙烯酸酯(DEAEM)基聚合物的上聚合物層，以提供用于固定任何干擾化合物的清理層，同時(shí)使黃曲霉毒素能夠到達(dá)MBAA基聚合物層。該DEAEM基聚合物層，有效地去除了很大一部分存在于落花生(花生)中的干擾成分。例6對(duì)AMPSA基聚合物結(jié)合AFBl的測(cè)試使用例1的方法，其中用AMPSA替換MBAA作為功能單體，制備聚合物盒。用2ml水清洗聚合物盒，且將4ml攙入200ngAFBl的80%甲醇裝入盒中。接下來用2ml水清洗新的聚合物盒，且將4ml攙入200ngAFBl的20%甲醇裝入盒中。可以看到吸附在AMPSA基聚合物上的AFBl帶。例7對(duì)4-乙烯基吡啶基聚合物結(jié)合AFBl的測(cè)試使用例1的方法制備聚合物盒，其中作為功能單體的MBAA更換為4_VP。用2ml水清洗聚合物盒，且將4ml攙有200ngAFBl的80%甲醇裝入聚合物盒中。接下來用2ml水清洗聚合物盒，且將4ml攙有200ngAFBl的20%甲醇裝入盒中。4-VP基聚合物證明結(jié)合20%甲醇溶液中的AFB1。例8對(duì)丙烯胺基聚合物結(jié)合AFBl的測(cè)試使用例1的方法制備聚合物盒，其中作為功能單體的MBAA更換為丙烯胺。用2ml水清洗聚合物盒，且將4ml攙有200ngAFBl的80%甲醇裝入聚合物盒中。接下來用2ml水清洗聚合物盒，且將4ml攙有200ngAFBl的20%甲醇裝入盒中。該丙烯胺基聚合物對(duì)80%和20%甲醇溶液都表現(xiàn)出一些結(jié)合。例9對(duì)EGMP基聚合物結(jié)合AFBl的測(cè)試使用例1的方法制備聚合物盒，其中作為功能單體的MBAA更換為EGMP。用2ml水清洗聚合物盒，將4ml攙入200ngAFBl的80%甲醇裝入聚合物盒中。接下來用2ml水清洗聚合物盒，將4ml攙入200ngAFBl的20%甲醇裝入盒中。EGMP基聚合物表現(xiàn)出從20%甲醇對(duì)AFBl的結(jié)合。例10對(duì)丙烯酰胺基聚合物結(jié)合AFBl的測(cè)試丙烯酰胺聚合物表現(xiàn)出對(duì)AFBl的結(jié)合，但該結(jié)合弱于MBAA。帶較小且位于層的中間。例11礦物油處理按照例1準(zhǔn)備MBAA基聚合物盒。按以下步驟用礦物油處理聚合物-1毫升乙腈-1毫升氯仿-2毫升含有礦物油的氯仿-1毫升氯仿-1毫升乙腈-2毫升水在礦物油處理后，MBAA盒顯示結(jié)合到被處理的聚合物上的AFBl的熒光增強(qiáng)了。例12MBAA基盒的再生按照例1準(zhǔn)備的MBAA基聚合物盒在經(jīng)過例2的測(cè)試后，按照以下步驟進(jìn)行清洗，以供重新使用_4毫升純甲醇-4毫升水該處理是足夠的，以便徹底去除吸附在MBAA基聚合物上的AFBl和為下一次使用而準(zhǔn)備盒。例13用DVB作為交聯(lián)劑制備的聚合物按照例1準(zhǔn)備MBAA基聚合物盒，但使用二乙烯基苯(DVB)作為交聯(lián)劑，而不是EGDMA。將加有IOOngAFBl的20%甲醇裝在聚合物上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用DVB替換EGDMA對(duì)吸附在盒上的毒素沒有造成任何明顯變化。例14MBAA聚合物在定量測(cè)定AFBl中的用途按照例1準(zhǔn)備五個(gè)盒，且增大被裝在聚合物上的20%甲醇中的AFBl的含量，以便讓盒裝有分別包含0、10、20、50和IOOngAFBl的熒光帶。使用W02006/120381中公開的傳感器裝置測(cè)量每個(gè)盒上固定的毒素的含量，在每個(gè)含量執(zhí)行六個(gè)測(cè)量。在各個(gè)增大含量的平均讀數(shù)為0.73,9.04,20.24,56.56和99.76ng，分別與4.41,3.38,2.64,2.47和1.63%的變化的系數(shù)相對(duì)應(yīng)。例15冰上的UV聚合(聚合物1)為了調(diào)查聚合物形態(tài)的可能變化，采用弱紫外燈(光強(qiáng)度為0.015千瓦)進(jìn)行聚合。聚合溶液保持在4°C(在冰上)。聚合進(jìn)行了4小時(shí)。由于MBAA在DMF中的溶解度在較低的溫度下較低，聚合物中的MBAA濃度由例1中熱聚合制備的聚合物中的20%減至UV聚合中的5%。聚合混合物是1克MBAA，19克E⑶MA(95%交聯(lián))，20克DMF，200mg引發(fā)劑1，1_偶氮(環(huán)己烷腈)。使用甲醇(使用約100個(gè)周期)通過Soxhlet(索氏)提取從聚合物中去除DMF；和然后在真空中徹底干燥聚合物。由此產(chǎn)生的聚合物使用超離心磨機(jī)(UltracentrifiugeMill)(Retsch公司，英國(guó))研磨，以獲得尺寸更規(guī)則均勻的顆粒。一些粒度的部分被收集，其背景熒光的強(qiáng)度和對(duì)黃曲霉毒素B1的結(jié)合能力被評(píng)估。其中包括粒度為25-63μπι，63-125μm和125-212μm的部分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的部分具有不同的背景熒光，其中最低的背景熒光由粒度為63-125μπι和125-212μm的部分所提供(表1)。粒度為63-125μm的部分從所固定的黃曲霉毒素產(chǎn)生最強(qiáng)烈的熒光。表1聚合物1的不同部分的性質(zhì)和性能。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將上述聚合物的性能與例1制備的其中包含20%MBAA的熱聚合的聚合物進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UV聚合的聚合物產(chǎn)生了顯著降低的背景熒光。雖然它減少了功能單體的數(shù)量(5%，與熱聚合物情況下的20%相比)，在盒頂部它在數(shù)量上將黃曲霉毒素結(jié)合成尖銳的帶。還與市售的SPE結(jié)合相吸附劑(Phenomenex公司的“Phenyl”(苯基))進(jìn)行了背景熒光和對(duì)黃曲霉毒素的結(jié)合的比較。雖然“Phenyl”吸附劑的背景熒光明顯小于UV聚合產(chǎn)生的MBAA聚合物，但MBAA聚合物強(qiáng)烈吸附黃曲霉毒素，成為聚合物盒頂部的一個(gè)高熒光市ο例16制備具有少量的溶劑(DMF)和5%MBAA的MBAA基聚合物(聚合物2)為了進(jìn)一步改變聚合物形態(tài)，聚合物被制備為只含有一半數(shù)量的溶劑(DMF)。所有其它條件仍然與例15相同。該聚合物被脫氣、冷卻并保持在冰上，并且用紫外(UV)光照射4小時(shí)以進(jìn)行聚合。為了將5%MBAA溶解在減少溶劑的混合物中，有必要對(duì)混合物進(jìn)行超超聲處理30分鐘。表2.聚合物2的不同粒度的性質(zhì)和性能。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>粒度為63-125μm的部分再次具有背景熒光和被固定的黃曲霉毒素的熒光強(qiáng)度的最佳組合；和表現(xiàn)出與聚合物1的相應(yīng)部分類似的特點(diǎn)。例17制備具有加倍數(shù)量的溶劑(DMF)和5%MBAA的MBAA基聚合物(聚合物3)為了進(jìn)一步改變聚合物形態(tài)，使用與例15相比加倍數(shù)量的溶劑(DMF)制備聚合物。所有其它條件仍然與例15相同。該聚合物被脫氣、冷卻并保持在冰上，并且用UV光照射4小時(shí)以進(jìn)行聚合。由此產(chǎn)生的聚合物具有與聚合物1和2類似的背景強(qiáng)度，但只有不到一半的從固定的黃曲霉毒素發(fā)出的熒光。例18在_20°C，1%MBAA條件下的UV聚合(聚合物4)對(duì)進(jìn)一步降低UV聚合時(shí)的溫度的影響進(jìn)行了測(cè)試。由于MBAA的溶解度在-20°C降低，其濃度降低到1%。所有其它參數(shù)保持不變。如前所述，對(duì)聚合物進(jìn)行聚合和處理。雖然背景熒光略低于在+4°C制備的聚合物1-3，聚合物4提供了從固定的黃曲霉毒素發(fā)出的很小的熒光信號(hào)。例19用三(乙二醇)二甲基丙烯酸酯交聯(lián)劑和5%MBAA制備的MBAA基聚合物(聚合物5)為了再次改變聚合物形態(tài)，采用不同的交聯(lián)劑(三(乙二醇)二甲基丙烯酸酯，95%)制備聚合物5，其性能與采用乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)作為交聯(lián)劑制備的聚合物1相比較。背景熒光很低，而且所固定的黃曲霉毒素的熒光是相當(dāng)高的。然而，聚合物5是柔性的，且可顯著改變其體積，這取決于所吸附溶劑的數(shù)量。例20使用不同的溶劑-DMSO(聚合物6)和甲苯(聚合物7)使用不同的溶劑(分別是DMSO(二甲基亞砜)和甲苯)在冰上紫外光聚合4小時(shí)制作了兩個(gè)聚合物(聚合物6和7)。MBAA在這些溶劑中的有限溶解度得到了只有的MBAA濃度。所有其它參數(shù)保持不變。聚合物6和7的背景熒光高且所固定的黃曲霉毒素產(chǎn)生了低的熒光。例21經(jīng)索氏(Soxhlet)清洗的聚合物15g聚合物1(5%MBAA；粒度為63-125μm的部分)在索氏提取器中用甲醇洗滌過夜(約100個(gè)周期的清洗)。上述清洗進(jìn)一步通過減少聚合物的背景熒光而提高了聚合物的性能；且所固定的黃曲霉毒素的熒光強(qiáng)度與所吸附的毒素?cái)?shù)量成比例。例22將4ml20%甲醇中的IngAFBl與清洗后的聚合物1結(jié)合對(duì)4毫升的20%甲醇中的低水平AFBl的結(jié)合進(jìn)行了評(píng)價(jià)。當(dāng)在4毫升20%甲醇中攙入Ing的AFBl和裝在清洗后的聚合物1(粒度63-125μm的部分)上時(shí)，Ing的AFBl很容易被檢測(cè)。所有這些盒也使用W02006/123189中的設(shè)備進(jìn)行定量掃描。結(jié)果表明，UV聚合物的背景熒光是熱聚合物的幾乎一半，是“Phenyl”聚合物的大約兩倍。也可以在UV下得到SPE管的一個(gè)圖象，該管包含吸附了IOOng的黃曲霉毒素B1的UV聚合物的?？梢钥吹剑摼酆衔飳?duì)黃曲霉毒素具有較高的親和力且黃曲霉毒素帶位于緊接頂部熔合物的下方。例23沉淀(precipitation)聚合聚合混合物是150mgMBAA,600mgE⑶MA(95%交聯(lián))，2g乙腈和30mg引發(fā)劑(偶氮二異丁腈(AIBN))。反應(yīng)在被氮?dú)饬髑逑吹?0ml礦物油中進(jìn)行了15分鐘。聚合物混合物還被氮?dú)馇逑?分鐘和然后轉(zhuǎn)送到礦物油中。使用勻漿器分散混合物15分鐘，然后用光纖UV燈(Cermax公司，英國(guó))照射2小時(shí)，之后用更強(qiáng)的UV燈(Honle公司，英國(guó))照射20分鐘。過濾珠子及用氯仿和丙酮洗滌以去除礦物油。雖然聚合物的背景熒光較低，且所固定的黃曲霉毒素發(fā)出較高的熒光，但聚合物的產(chǎn)量低。這一工藝還產(chǎn)生大量的廢礦物油。例24測(cè)量食品中的黃曲霉毒素對(duì)使用選定的聚合物從食品基質(zhì)(玉米和花生)中提取黃曲霉毒素進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在SPE管中裝入75mg例15的MBAA基聚合物，且加入Iml的20%甲醇。在80%甲醇中的食品提取物被水稀釋4倍，且攙入IOng的黃曲霉毒素Bp作為對(duì)照樣本，用水稀釋食品提取物4倍，不加入毒素。當(dāng)被固定在玉米或花生提取物的MBAA基聚合物上時(shí)，IOng的黃曲霉毒素容易被檢測(cè)到。例25聚合物盒的光學(xué)特性的改進(jìn)當(dāng)使用W02006/120381中公開的一種傳感器測(cè)量裝置測(cè)量時(shí)，由熱聚合(例1)產(chǎn)生的MBAA基聚合物的背景熒光通過使用黑色薄膠帶直接在被固定的毒素的上面或下面來掩蓋背景熒光的發(fā)射，而顯著地減少了。使用光學(xué)改進(jìn)的盒容易檢測(cè)和測(cè)量IOng的黃曲霉毒素Bp權(quán)利要求含有由丙烯酰胺基單體而來的部分的聚合物作為黃曲霉毒素的固相萃取(SPE)吸附劑的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述單體是一種或多種亞甲雙丙烯酰胺(MBBA)、丙烯酰胺或丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)或它們的衍生物。3.根據(jù)要求1或2的用途，其中所述丙烯酰胺基單體已通過共聚和反應(yīng)與交聯(lián)單體交聯(lián)。4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中交聯(lián)劑是乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)或二乙烯基苯(DVB)。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的用途，其中所述丙烯酰胺單體與交聯(lián)劑單體的單位比例是從13至Ij120。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所述的用途，其中黃曲霉毒素包括一種或一種以上的黃曲霉毒素BpByG1和G2。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)所述的用途，其中聚合物及其上所吸收的黃曲霉毒素用作熒光分析方法的樣品。8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)所述的用途，其中從聚合物洗脫出所吸收的黃曲霉毒素，和用作定量測(cè)定方法的樣品。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任何一項(xiàng)所述的用途，其中所述聚合物在低于環(huán)境的溫度下通過紫外線聚合反應(yīng)獲得。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的用途，其中通過去除在聚合時(shí)出現(xiàn)的致孔劑而使所述聚合物變成大孔性的。11.由亞甲雙丙烯酰胺(MBAA)、丙烯胺、甲基丙烯酸磷酸乙二醇酯(EGMP)、4_乙烯基吡啶或2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)的交聯(lián)聚合物作為黃曲霉毒素的SPE吸附劑的用途。12.—種SPE吸附劑單元，包括裝有或涂有一層由丙烯酰胺基單體而來的聚合物吸附劑的試管、盒、針、膜、棒或平整表面。13.根據(jù)要求12的單元，其中所述單元是一個(gè)具有聚合物吸附劑內(nèi)層的盒或試管，且在該單元的外表面上、在聚合物層的上表面以上和以下的一個(gè)區(qū)域是不透明的。14.一種黃曲霉毒素的熒光分析方法，所述方法包括以下步驟將黃曲霉毒素吸附在裝入或裝在試管、盒、針、膜、棒或平整表面上的由丙烯酰胺基單體而來的聚合物上，使所固定的黃曲霉毒素曝露在紫外光中，以及檢測(cè)由固定的黃曲霉毒素發(fā)出的熒光。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述黃曲霉毒素包括一種或一種以上的黃曲霉毒素B”B2λG1禾口G2016.一種在定量測(cè)定黃曲霉毒素之前的清理方法，其中使樣本液體與由裝入或裝在試管、盒、棒、針、膜或平表面上的丙烯酰胺基單體而來的聚合物接觸，以吸附存在的任何黃曲霉毒素，并從所述聚合物洗脫出黃曲霉毒素以對(duì)存在的任何黃曲霉毒素進(jìn)行定量測(cè)定。全文摘要從丙烯胺、亞甲雙丙烯酰胺(MBAA)、丙烯酰胺、乙二醇甲基磷酸酯(EGMP)、4-乙烯基吡啶或2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)單體制備聚合物，該聚合物適合用于在黃曲霉毒素的固相萃取中結(jié)合黃曲霉毒素，和將黃曲霉毒素固定在固相萃取(SPE)盒中以對(duì)從食品或飼料提取的溶液中的黃曲霉毒素進(jìn)行定性或定量分析。優(yōu)選的實(shí)施例是含有丙烯酰胺基的聚合物，如丙烯酰胺和MBAA。聚合物最好是例如使用乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)或二乙烯基苯(DVB)交聯(lián)的和大孔性的(macroporous)。文檔編號(hào)G01N33/50GK101809048SQ200880004635公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2008年2月8日優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日發(fā)明者O·皮萊斯卡,R·科克,S·皮萊斯基申請(qǐng)人:拓克西密特有限公司