專利名稱：使用電泳的快速均相免疫測定的制作方法
使用電泳的快速均相免疫測定
相關(guān)申請因此，在本公開中，多相測定包括在檢驗(yàn)過程期間將抗體-靶蛋白復(fù)合物結(jié)合到表面，并隨后在測量樣品中蛋白質(zhì)的量之前清洗 掉任何殘余的未結(jié)合樣品和抗體。在另一方面，均相測定允許樣品和 抗體混合在一起并允許結(jié)果在沒有任何結(jié)合到表面或者清洗情況下被 測定。每種方法既有明確的益處，也有明確的局限(Ronkainen-Matsuno， 等2002)。均相測定可以是非常快的、容易適應(yīng)于新的蛋白質(zhì)和平臺， 并且可以很有成本效益。局限包括潛在的較低特異性和靈敏性。另外， 這些方式一般局限于小的靶抗原。目前檢測和/或測定溶液中分子濃度的方法沒有將短的測定 時(shí)間、高的靈敏性和測定較大樣品體積的能力進(jìn)行結(jié)合，所述測定較 大樣品體積的能力是檢測和/或定量以非常低的濃度存在的靶分子所需 要的。在本領(lǐng)域存在提高分子檢測和/或分子濃度測定的分析技術(shù)的需 要。
發(fā)明概述圖l-在等式中使用的符號列表。在大多數(shù)情況下，數(shù)量以用 厘米'克'秒為單位(c'g's單位)。圖7A-等式6a將顆粒的斯維德貝格系數(shù)(Svedberg Coefficient )定義為它的沉降速度除以離心加速度。圖8B-等式7b從等式6b計(jì)算IgG抗體的遷移率。
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圖9-熒光素(a)與第一抗體(b)結(jié)合而形成信號產(chǎn)生抗體 (Signal Generating Antibody) (c)。圖不是按比例的，并且單個(gè)圖表示 反應(yīng)中特定成分的存在，不表示每種成分的化學(xué)計(jì)量的量。

圖10-生物素衍生物(d)與第二抗體(e;)結(jié)合而形成捕獲抗體 (f)。圖不是按比例的，單個(gè)圖表示在反應(yīng)中特定成分的存在，不表示 每種成分的化學(xué)計(jì)量的量。圖15-在每個(gè)圖中的深色痕跡代表在捕獲層中生物素化的葡聚糖存在下的FITC標(biāo)記的中性抗生物素蛋白濃度，而淡色痕跡代表在捕獲層中沒有生物素化的葡聚糖存在下的FITC標(biāo)記的中性抗生物素蛋白濃度。圖16-來自人IL-6完整夾心測定的劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)。
雖然以上的實(shí)例描述了IL-6的EVEIA技術(shù)的應(yīng)用，但是技術(shù) 人員將會意識到所描述的方法、組合物和裝置可以容易地應(yīng)用于檢測 和/或測定任何選擇的分子的濃度，所述選擇的分子的抗體是商業(yè)可得 的或者容易制備的。在要求保護(hù)的方法的實(shí)踐中應(yīng)用的、針對各種靶 分子的抗體生成雜交瘤的商業(yè)來源，在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(例如 American Type Culture Collection, Manassas, VA)。針對實(shí)際上任何感興 趣靶的單克隆或者多克隆抗體或者其片段的制備技術(shù)也是本領(lǐng)域眾所 周知的，并且可以容易地被技術(shù)人員使用，而不需要過多的實(shí)驗(yàn)(參見， 例如，Harlow和Lane， 1988，在此通過引用并入其全部)。
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權(quán)利要求
1.一種檢測靶分子的方法，包括a)獲得可能含有所述靶分子的樣品；b)在結(jié)合檢測分子的第一結(jié)合劑和結(jié)合捕獲分子的第二結(jié)合劑存在的情況下，對所述樣品進(jìn)行垂直堆積電泳，其中所述靶分子結(jié)合所述第一和第二結(jié)合劑而形成復(fù)合物；和c)檢測由所述靶分子和第一及第二結(jié)合劑形成的所述復(fù)合物的存在。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，還包括i)在基本上不帶電荷的聚合物存在下進(jìn)行所述電泳，所述不帶電 荷的聚合物能夠結(jié)合所述捕獲分子而成為所述復(fù)合物的部分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述結(jié)合劑是抗體或者其抗原結(jié)合片段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述結(jié)合劑的一種或者兩種是生物受體或其片段。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述靶分子是蛋白質(zhì)或者多肽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述電泳是在最小流體動(dòng)力學(xué)半徑——等于兩倍橫切面面積除以周長——為0.5mm的管、槽或容器 中進(jìn)行的。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中樣品被裝載在所述管、槽或者容器的頂部，并且所述電泳在密度和/或粘度從所述管、槽或容器的 頂?shù)降撞恐饾u增加的梯度中進(jìn)行，所述梯度包括不同密度或粘度 的至少兩個(gè)相。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述樣品被裝載在所述管、槽或者容器的底部或底部附近，并且所述電泳在密度和/或粘度從所述 管、槽或容器的頂?shù)降撞恐饾u增加的梯度中進(jìn)行，所述梯度包括 不同密度或粘度的至少兩個(gè)相。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述梯度包括樣品層、捕獲 層和堆積層。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述梯度包括與所述捕獲層混 合的樣品層和堆積層。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述捕獲分子是生物素，并且 所述電泳在生物素結(jié)合蛋白存在的情況下進(jìn)行。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述生物素結(jié)合蛋白選自抗生 物素蛋白、鏈酶抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述電泳在結(jié)合生物素的 中性聚合物存在下進(jìn)行。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述復(fù)合物包括靶分子，第一 結(jié)合劑，第二結(jié)合劑，選自抗生物素蛋白、鏈酶抗生物素蛋白或 中性抗生物素蛋白的多價(jià)生物素結(jié)合劑以及一種或者多種結(jié)合生 物素的聚合物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述復(fù)合物的形成導(dǎo)致了質(zhì)荷 比增加和所述靶分子與復(fù)合物的電泳遷移率的降低。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述復(fù)合物形成包括靶分子、 第一結(jié)合劑、第二結(jié)合劑、多價(jià)生物素結(jié)合劑和一種或多種結(jié)合生物素的聚合物在溶液中自組裝而形成可檢測的低遷移率復(fù)合 物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述復(fù)合物在所述堆積層聚集以增進(jìn)檢測。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述復(fù)合物在所述堆積層變得基本不動(dòng)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中不是復(fù)合物部分的第一結(jié)合劑 遷移穿過所述堆積層并且與所述復(fù)合物分離。
21. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，還包括ii) 測量所述復(fù)合物中所述檢測分子的量以確定所述樣品中所 述靶分子的濃度。
22. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述檢測分子是熒光、發(fā)光、化 學(xué)發(fā)光、放射性核或產(chǎn)生熒光、發(fā)光、化學(xué)發(fā)光或者顏色產(chǎn)物的 酶。
23. 檢測靶分子的裝置，包括a) 垂直布置的管、槽或容器，其具有至少0.5 mm的流體動(dòng)力學(xué) 半徑；b) 在所述試管、槽或容器內(nèi)密度逐漸增加的梯度，所述梯度包括 樣品層、捕獲層和堆積層。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的裝置，還包括i) 靶分子、結(jié)合檢測分子的第一結(jié)合劑和結(jié)合捕獲分子的第二結(jié) 合分子，其中所述靶分子、第一和第二結(jié)合分子能夠在所述樣品層中 形成復(fù)合物；ii) 所述捕獲層中的基本不帶電荷的聚合物，其能夠結(jié)合所述捕獲 分子而成為所述復(fù)合物的部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測和/或測定靶分子濃度的方法、組合物和裝置。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括允許靶分子形成具有結(jié)合到檢測分子的第一結(jié)合劑和結(jié)合到捕獲分子的第二結(jié)合劑的復(fù)合物，允許所述復(fù)合物進(jìn)一步與能夠結(jié)合到所述捕獲劑、基本上不帶有電荷的聚合物結(jié)合，和進(jìn)行垂直梯度電泳以與未結(jié)合靶、第一和第二結(jié)合劑以及聚合物分離所述復(fù)合物。完整的復(fù)合物通過電泳聚集在堆積層并且所述檢測分子被檢測和/或定量。因?yàn)閺?fù)合物含有高質(zhì)荷比，所以它在堆積層變?yōu)榛静粍?dòng)，而未結(jié)合成分遷移穿過堆積層并與復(fù)合物分離。這提供了非?？焖俸挽`敏的測定，所述測定可以在短時(shí)間內(nèi)檢測非常低濃度的靶分子。
文檔編號G01N33/00GK101680865SQ200880011244
公開日2010年3月24日 申請日期2008年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月7日
發(fā)明者B·范特-赫爾, S·P·蒂雷爾 申請人:里澤爾診斷公司