專利名稱：熒光測量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適合測量熒光的方法和裝置。具體地，本發(fā)明適
合但不限于，適用于TIRF(全內(nèi)反射熒光)顯微術(shù)，包括細(xì)胞膜的TIRF
顯微術(shù)。
背景技術(shù)：
熒光是在通過電磁輻射對材料進(jìn)行激發(fā)或電子碰撞之后，從材料發(fā)射的電磁輻射。通常，激發(fā)的輻射具有比發(fā)射的輻射更高的能量(較高的頻率或較短的波長)。
典型地，激發(fā)輻射和發(fā)射輻射將在可見范圍內(nèi)。熒光測量可以用來提供對材料的結(jié)構(gòu)和/或功能更好的理解。
例如，熒光顯微術(shù)是顯微術(shù)的一種形式，其中，以將激發(fā)樣品內(nèi)的熒光團(tuán)(或熒光染料)的波長照射樣品。熒光團(tuán)可以在樣品內(nèi)自然存在，或可以人工引入。例如，生物分子可以具有通過化學(xué)反應(yīng)附加的熒光化學(xué)基團(tuán)(一般稱為"標(biāo)簽")。對產(chǎn)生的熒光圖像進(jìn)行研究可以提供關(guān)于樣品的有用信息。
TIRF顯微術(shù)是專用形式的熒光顯微術(shù)，可以用來檢查細(xì)胞膜中的
過程，并獲得關(guān)于邊界至細(xì)胞內(nèi)部的分子機(jī)制的知識。
TIRF顯微術(shù)使用倏逝波(evanescent wave)來選擇性地照射和激
發(fā)樣品的限制區(qū)域中的熒光團(tuán)。典型地，將樣品安裝在光學(xué)元件(例如，棱鏡或玻璃蓋玻片)上，或鄰近該光學(xué)元件安裝。在光學(xué)元件中提供激發(fā)光，使得光經(jīng)歷來自鄰近樣品的光學(xué)元件的表面的全內(nèi)反射。從而從光學(xué)元件的表面產(chǎn)生以指數(shù)衰減的倏逝電磁場，并且典型地在鄰近樣品中傳播幾百納米量級深度。從而，倏逝場可以用來激發(fā)直接鄰近光學(xué)元件的樣品的限制區(qū)域中的熒光團(tuán)。與傳統(tǒng)熒光顯微術(shù)相比，激發(fā)區(qū)的這種選擇性是有利的。在傳統(tǒng)技術(shù)中，來自樣品表面結(jié)合的熒光團(tuán)的熒光通常被背景熒光淹沒。
TIRF顯微術(shù)已經(jīng)用來測量細(xì)胞膜中的單熒光分子，并且是一種允許對活細(xì)胞的正常生理環(huán)境中的這種單分子進(jìn)行觀察的技術(shù)。例如，
S.E.D.Webb等人的文章"Multidimensional single-molecule imaging inlive cells using total-internal-reflection fluorescence microscopy"，OPTICS LETTERS, Vol.31， No.l4， pp2157-5159，描述了能夠?qū)罴?xì)胞中單分子進(jìn)行成像(利用波長和偏振進(jìn)行解析)的寬視野TIRF顯微鏡的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的實(shí)質(zhì)上是，解決本文或其他文章所描述的現(xiàn)有技術(shù)的一個或多個問題。本發(fā)明具體實(shí)施例的目的是改進(jìn)TIRF顯微術(shù)。
在第一方面中，本發(fā)明提供了一種對來自樣品的熒光進(jìn)行測量的
方法，包括以下步驟測量樣品表面的至少一部分的至少一個輪廓(profile),該表面實(shí)質(zhì)上橫穿軸延伸；利用輻射來照射樣品表面的所述部分以激勵熒光，輻射的強(qiáng)度沿著軸隨位置而變化；測量指示從樣品表面的所述部分發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的值；以及利用所述測量輪廓對熒光的測量值進(jìn)行修改，以考慮入射在表面上的輻射強(qiáng)度的空間變化。
本發(fā)明人己想到熒光測量技術(shù)(如，TIRF顯微術(shù))，其中，激發(fā)輻射的強(qiáng)度隨著位置而變化，可以通過考慮實(shí)際上入射在每個熒光團(tuán)的輻射的強(qiáng)度來改進(jìn)該熒光測量技術(shù)。典型地，在這樣的測量中，樣品的表面是不均勻的。由于激發(fā)輻射的強(qiáng)度隨著位置而變化，表面的不同位置(例如，不同高度處的位置)將經(jīng)歷不同的激發(fā)輻射強(qiáng)度。從而，可以通過考慮入射在不同樣品表面位置(即，因此入射在表面內(nèi)的不同熒光團(tuán)上)上的實(shí)際強(qiáng)度來改進(jìn)這樣的熒光測量。這樣的方法允許對來自表面上不同位置的熒光團(tuán)進(jìn)行定量測量。
所述修改步驟可以包括根據(jù)所述測量輪廓和指示輻射束強(qiáng)度沿著軸隨位置的變化的信息，計(jì)算入射在所述表面上的輻射強(qiáng)度的空間
6變化。
所述樣品可以位于鄰近光學(xué)元件的位置，所述照射步驟包括提 供輻射束，使得產(chǎn)生用于激發(fā)樣品表面上的熒光團(tuán)的輻射的倏逝場， 所述輻射束被布置為在所述光學(xué)元件內(nèi)經(jīng)歷全內(nèi)反射。
可以將所述輻射束分成兩個子束，每個子束被布置為在相應(yīng)反射 平面中經(jīng)歷全內(nèi)反射。
所述對樣品表面的所述部分進(jìn)行照射的步驟可以包括提供第一 偏振態(tài)的所述輻射，以及所述測量值的步驟包括.，測量指示來自樣品 表面的所述部分、以第一偏振態(tài)發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的值，以 及測量指示來自樣品表面的所述部分、以不同的第二偏振態(tài)發(fā)射的熒 光的空間強(qiáng)度分布的值。
對樣品表面的所述部分進(jìn)行照射的步驟還可以包括順序地提供 不同的第二偏振態(tài)的所述輻射以激勵熒光。
所述測量值的步驟可以包括測量指示從樣品表面的所述部分、 在第一波長范圍內(nèi)發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的值，以及測量指示從 樣品的所述部分、在不同的第二波長范圍內(nèi)發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分 布的值。
可以在時間段內(nèi)，重復(fù)進(jìn)行測量所述輪廓和測量指示熒光的空間
強(qiáng)度分布的所述值的步驟，以對所述樣品的構(gòu)造(conformation)的改 變進(jìn)行監(jiān)視。
可以同時執(zhí)行測量所述輪廓和測量指示熒光的空間強(qiáng)度分布的 值的步驟。
對測量所述輪廓的步驟可以包括利用輻射束對樣品的所述部分
進(jìn)行照射，以及測量反射的輻射束的強(qiáng)度的空間變化。
所述測量所述輪廓的步驟可以包括測量樣品表面的所述至少一 部分的形貌。
可以通過非干涉寬視野光學(xué)輪廓測定法(optical profilometry)來
測量所述形貌。
可以通過寬視野光學(xué)層析顯微術(shù)來測量所述形貌。 所述樣品可以是生物細(xì)胞，細(xì)胞膜限定生物細(xì)胞的表面。在第二方面中，本發(fā)明提供了一種對來自樣品的熒光進(jìn)行測量的
裝置，所述裝置包括樣品架，用于支撐樣品，使得樣品表面的至少
一部分實(shí)質(zhì)上橫穿預(yù)定軸延伸；輪廓儀，用于測量樣品表面的所述部 分的至少一個輪廓；輻射源，用于采用輻射對樣品表面的所述部分進(jìn)
行照射以激勵熒光，輻射的強(qiáng)度沿著軸隨位置而變化；探測器，被布 置為測量指示從樣品表面的所述部分發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的 值；以及處理器，被布置為利用所測量的輪廓對熒光的測量值進(jìn)行修
改，以考慮入射在表面上的輻射強(qiáng)度的空間變化。
在第三方面中，本發(fā)明提供了一種用于對光學(xué)裝置進(jìn)行控制來執(zhí)
行熒光測量的設(shè)備，所述設(shè)備包括包含處理器可讀指令的程序存儲 器；以及處理器，被布置為對存儲在所述程序存儲器中的指令進(jìn)行讀 取和執(zhí)行，其中，所述處理器可讀指令包括被配置為對所述裝置進(jìn) 行控制來執(zhí)行上述方法的指令。
在第四方面中，本發(fā)明提供了一種承載計(jì)算機(jī)可讀代碼的載體介 質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可讀代碼被配置為使計(jì)算機(jī)執(zhí)行上述方法。


現(xiàn)在參照附圖，僅通過示例描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，在附圖中
圖l是示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于對樣品的熒光進(jìn)行測量的 裝置的示意圖2是位于圖1所示采樣位置上的樣品的放大圖3a是示出了從置于圖l的采樣位置中的反射鏡反射的光的強(qiáng)度 變化的圖，作為沿著Z軸的反射鏡位置的函數(shù)；
圖3b示出了由圖l所示的CCD探測器的兩個二分之一部分所獲取 的圖像；以及
圖4是根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例的用于對樣品的熒光進(jìn)行測量的裝 置的示意圖。
具體實(shí)施例方式
在一些熒光測量技術(shù)中，如TIRF (全內(nèi)反射熒光)，用來激發(fā)樣品的輻射的強(qiáng)度隨位置而變化。由于熒光的強(qiáng)度取決于激發(fā)輻射的強(qiáng) 度(即，用來激勵熒光的輻射)，為了能夠精確評估熒光的發(fā)射，本發(fā) 明人已認(rèn)識到，期望測量樣品表面的輪廓，使得當(dāng)對產(chǎn)生的熒光測量 值進(jìn)行評估時，考慮在不同位置處的表面上入射的激發(fā)輻射的強(qiáng)度。 例如，圖2是安裝在光學(xué)元件(這里蓋玻片40)上的樣品42的一
部分的放大視圖。樣品42位于樣品培養(yǎng)液46中，可以是水溶液。樣品 42具有大致橫穿光軸Z延伸的表面44。樣品的表面44是非線性的，例 如，是皺褶狀的。因此，樣品表面中分子之間的距離將沿著軸Z隨其 位置而變化。
在該示例中，蓋玻片40實(shí)質(zhì)上垂至于軸Z延伸。所示的表面44包 括兩個熒光團(tuán)，P,、 P2。熒光團(tuán)沿著Z軸處于不同位置。
用來激勵熒光團(tuán)發(fā)熒光的適合波長的輻射束12入射在蓋玻片40 上，對輻射束12的入射角進(jìn)行選擇，使得輻射束12在蓋波片表面40a 經(jīng)歷全內(nèi)反射。該全內(nèi)反射產(chǎn)生從鄰近樣品42蓋波片的表面40a延伸的 倏逝電磁波或場。倏逝電磁場從表面40a以指數(shù)衰減，并將從而典型地 沿著樣品方向(如箭頭z所示)僅傳播大約100-300納米距離。因此， 激發(fā)輻射(倏逝場)的強(qiáng)度沿著軸Z隨位置而改變，并且具體地，沿 著箭頭z所示的方向減小。因此，最接近倏逝場從中傳播的表面40a的
熒光團(tuán)Pi將經(jīng)歷比熒光團(tuán)P2更高的倏逝場強(qiáng)度。
不同的熒光團(tuán)可以具有不同的量子產(chǎn)額。量子產(chǎn)額是熒光光子的 數(shù)目與吸收的激發(fā)光子的總數(shù)的比值。如果能夠?qū)⒛芰總魉椭疗渌?近熒光團(tuán)，則熒光團(tuán)的量子產(chǎn)額也可以改變。因此，為了評價熒光團(tuán) P" P2 (實(shí)際上，位于給定位置/表面的預(yù)定區(qū)域內(nèi)的熒光團(tuán)的數(shù)目) 的量子產(chǎn)額，需要確定在每個熒光團(tuán)P,、 P2的位置處的激發(fā)輻射的入 射強(qiáng)度。同樣，這樣的信息還可以用來確定多個熒光團(tuán)是否位于樣品 表面上的不同位置(或至少在預(yù)定區(qū)域內(nèi))處。此外，通過結(jié)合表面 輪廓隨時間對來自表面的熒光進(jìn)行監(jiān)視，表面上分子的構(gòu)造的改變可 以與表面輪廓的改變相關(guān)聯(lián)。
具體地，這樣的技術(shù)將對于在生理?xiàng)l件下分析藥物對過程的效果 (如細(xì)胞信號(cell signalling))特別有價值，即，使用活細(xì)胞和低受體密度，并允許檢驗(yàn)相對稀少或非同步事件(unsynchronised event)。 例如，在細(xì)胞信號過程中，?？吭诳缒さ鞍?例如，EGF受體、EGFR， 也被稱為HERl或ErbBl)的胞外區(qū)上的配體蛋白質(zhì)分子(ligand protein molecule)(例如，表皮生長基因，EGF)引起細(xì)胞內(nèi)相互作用，并因 此傳輸信號至細(xì)胞核。這樣的過程可以通過受體分子的構(gòu)造改變來完 成，并在分子的低聚反應(yīng)狀態(tài)下改變。
利用上述過程，在過程中，測量樣品(例如，細(xì)胞)的輪廓，允 許受體聚類和細(xì)胞膜皺褶之間的任何關(guān)系是可識別的。通過測量熒光 能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)，在RIFR顯微術(shù)中識別細(xì)胞構(gòu)造的改變。對熒
光偏振的檢驗(yàn)可以用來明確蛋白質(zhì)內(nèi)和蛋白質(zhì)之間的距離和角度改 變。此外，如果對熒光輻射的偏振進(jìn)行監(jiān)視，則能夠?qū)⒂捎谑荏w構(gòu)造 改變的熒光偏振的任何改變與隨著細(xì)胞膜形狀改變的受體方向的改變 進(jìn)行區(qū)分。
現(xiàn)在將參照附圖對本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)方式進(jìn)行描述。 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于對熒光進(jìn)行測量的裝置100。
裝置100被布置為同時地，測量樣品表面的輪廓和測量來自表面的熒 光的空間分布。盡管這些操作均可由分離的裝置順序地執(zhí)行，但是提 供單一裝置來執(zhí)行這兩個操作，允許兩用地使用組件，并同時執(zhí)行操 作。如果樣品經(jīng)歷構(gòu)造改變，則期望同時測量。當(dāng)在一定時間段(例 如，規(guī)則的時間間隔)內(nèi)重復(fù)測量時，特別期望這樣的同時操作，允 許對試樣或樣品的構(gòu)造的改變進(jìn)行研究。例如，可以每一秒或小于一 秒、或每100毫秒、或者甚至每30毫秒或小于30毫秒對生物樣品重復(fù)進(jìn)
行測量。
將描述圖1所示的裝置100的組件。首先，將描述用于提供熒光激 發(fā)輻射的組件和光學(xué)元件。
裝置100包括輻射源10，用于提供預(yù)定波長(或預(yù)定波長范圍) 的電磁輻射，用于激發(fā)一個或多個類型的熒光團(tuán)。提供輻射，使得利 用輻射來照射樣品表面的一部分以激勵熒光。在該具體示例中，利用 TIRF顯微術(shù)，并從而將輻射束12引入光學(xué)元件(這里，蓋波片40)，
在光學(xué)元件的表面處，輻射束經(jīng)歷全內(nèi)反射。產(chǎn)生的倏逝場用來激發(fā)樣品42內(nèi)的熒光團(tuán)。
各種光學(xué)布置可以用來向光學(xué)元件40提供輻射束12。在該具體實(shí)
施例中，輻射束12通過的、位于輻射源10和光學(xué)元件40之間的光路包 括束整形透鏡14、 18和24，以及物鏡32。束還穿過空間濾光鏡16以 確保高斯束輪廓，以及孔徑20以在樣品42處改變束的直徑。束穿過二 色分光鏡22。 二色分光鏡22用來將用于激發(fā)熒光團(tuán)的輻射12的光路與 用來測量樣品42的表面44的輪廓的輻射束52的路徑迸行組合。
附加地，裝置100包含用來測量樣品42的表面44的輪廓的裝置。 為了允許對表面44的輪廓和來自表面(或至少來自表面內(nèi)熒光 團(tuán))的熒光進(jìn)行同時測量，優(yōu)選地使用光學(xué)技術(shù)測量輪廓。這樣的光 學(xué)技術(shù)涉及利用輻射束對樣品的相關(guān)表面進(jìn)行照射，以及測量來自 反射的輻射束(例如，來自入射在諸如CCD (電荷耦合器件)的探測 器上的反射束形成的圖像)的強(qiáng)度的空間變化。
已知許多適合的光學(xué)輪廓測量術(shù)和裝置，例如，白光干涉輪廓儀， 或非干涉光學(xué)輪廓儀，例如，差動共焦顯微術(shù)(DCM)，或?qū)捯曇肮?學(xué)層析顯微術(shù)?？梢岳眠@些技術(shù)中的任何技術(shù)。然而，在圖l所示的 具體裝置中，該裝置被布置為執(zhí)行非干涉寬視野光學(xué)輪廓測定
(NIWOP)。這樣的技術(shù)可以用來提供樣品的納米深度分辨率。例如， NIWOP技術(shù)和裝置在以下文章中進(jìn)行了描述(1) Wang,C.C,，Lin,J.Y&Lee, C.H."Membrane ripples of a living cell measured by non-interferometric widefield optical profilometry",Optics Express 13,10665-10672(2005)，和(2) Lee,C.H.Mong, H.Y.&Lin, W.C.
"Noninterferometric wide-field optical profilometry with nanometer depth resolution" ，Optics Letters 27,1773-1775(2002)，其內(nèi)容均通過引
用包含在本文中。
輻射源50提供了針對NIWOP輪廓測量的輻射束52。該技術(shù)利用以 三個不同的相位對樣品表面44進(jìn)行網(wǎng)格圖案成像。通過位于束52的光 路中的光柵54提供網(wǎng)格圖案。光柵包括平移臺，以允許光柵同時沿著 束52的光軸以及橫穿光軸(即，改變相位)移動。光柵的橫穿移動可 以用來在樣品表面44上提供不同相位的三種網(wǎng)格圖案，樣品表面的圖像用來對樣品表面輪廓進(jìn)行三維測量(即，測量表面44的形貌)。
通過二色分光鏡22將輻射束52引入公共光路中，作為輻射束12 (從而束12和52穿過公共光學(xué)元件)。二色分光鏡22被布置為透射束12 的波長，并反射束52的波長。通過另一二色濾光鏡30將兩個束12、 52 引入物鏡32。 二色濾光鏡30被布置為反射束12的波長，以及部分反射 和部分透射束52的波長。
對光柵54的空間頻率進(jìn)行選擇，使得允許使用單個物鏡32同時用 于TIRF顯微術(shù)和輪廓測定。對用于輪廓測定的輻射束52的波長進(jìn)行選 擇，使得既不與激發(fā)束12的波長交疊，也不與預(yù)期的熒光發(fā)射光譜交 疊。光柵54具有單一空間頻率，并在位置上鄰近樣品平面的共軛平面。 對于TIRF顯微術(shù)所需的物鏡，選擇空間頻率以使樣品表面輪廓的預(yù)期 范圍上的深度分辨率最大化。例如，對于近似2nm深度分辨率和近似 200nm的深度范圍，理想的光柵空間頻率等于(物鏡32的數(shù)值孔徑)/ (輻射束52的波長X物鏡32的放大倍數(shù))。
輪廓測定束52將從樣品表面反射回作為反射的束52'，并返回穿過 物鏡32，并且反射的圖像最終由探測器66進(jìn)行探測。從輻射束12的全 內(nèi)反射產(chǎn)生的倏逝輻射將激發(fā)樣品表面上的熒光團(tuán)Pi、 P2，使熒光團(tuán) 發(fā)熒光，即發(fā)射熒光45。類似地，熒光45將穿過二色濾光鏡30，最終 形成由探測器66探測的圖像。
反射的輪廓測定輻射束52'和熒光發(fā)射45首先沿著公共光路傳播 至二色濾光鏡58。
具體地，反射束52'和熒光從樣品表面42通過物鏡32、通過二色濾 光鏡30傳播。輻射52'、 45然后穿過濾光鏡51，濾光鏡51被布置為使熒 光和反射波長通過，并阻擋其他波長(例如，激發(fā)束12的波長)。然后， 反射束52'和熒光45在入射到二色濾光鏡58之前穿過透鏡53和56，以及 孔徑55。
二色濾光鏡58將反射束52，與熒光45分離(通過從反射的波長中選 擇的波長對由二色濾光鏡58透射的波長)。然后沿著各自光路引導(dǎo)分離 的輻射信號52'、 45，以在探測器66的各自的傳感器區(qū)域68a、 68b上成 像。具體地，在該具體布置中，每個信號從相應(yīng)的反射鏡60a、 60b反射，穿過濾光鏡62a、 62b (被布置為使相應(yīng)信號的波長通過，并阻擋 其他波長)，然后由透鏡(在該示例中，透鏡64對兩個信號是公共的) 聚焦，使得在相應(yīng)探測器區(qū)域68a、 68b上成像。
然后，每個圖像的空間強(qiáng)度的變化由探測器66進(jìn)行測量，并傳遞 至處理器70。圖3B示出了由探測器66獲取的圖像。圖像的左側(cè)與由探 測器元件68a探測的圖像相對應(yīng)，并且右側(cè)與由探測器元件68b探測的 圖像相對應(yīng)。CCD可以用作探測器66。探測器圖像的兩個二分之一部 分是相同的視場。在圖3B所示的具體示例中，樣品在其表面上具有很 低濃度的熒光團(tuán)。圖像的左側(cè)與單分子熒光圖像相對應(yīng)。圖3中圖像的 右側(cè)與在NIWOP中使用的三個圖像之一相對應(yīng)，以計(jì)算樣品表面的輪 廓(圖像上的線形成光柵54)。
利用不同相位的光柵，從反射的輻射來獲取三個不同圖像，以允 許計(jì)算表面的輪廓。
處理器70被布置為，利用測量的樣品表面40輪廓，對測量的熒光
值進(jìn)行修改，以考慮入射在表面上的輻射的強(qiáng)度的空間變化。
具體地，處理器70被布置為，通過執(zhí)行以下步驟/計(jì)算來對測量的 熒光值進(jìn)行修改以考慮倏逝場的強(qiáng)度變化
(i) 計(jì)算樣品表面輪廓。
(ii) 根據(jù)樣品表面輪廓，計(jì)算樣品表面上倏逝場強(qiáng)度分布(即， 入射在樣品表面上激發(fā)輻射的強(qiáng)度空間分布)。
(iii) 通過用每個測量的強(qiáng)度除以空間位置處樣品表面的倏逝場 強(qiáng)度，，對所測量的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行修改或"歸一化"。
現(xiàn)在將簡要描述裝置100的操作。首先，執(zhí)行校準(zhǔn)技術(shù)，以對裝 置100的輪廓測定部分進(jìn)行校準(zhǔn)。具體地，平面反射鏡位于顯微鏡的樣 品平面中(即，接近一般由樣品42占據(jù)的位置中)。禁用輻射源IO，使 得僅輻射束52入射到采樣位置。利用相對空間相位O、 2p/3、 4p/3的光 柵54，獲得三個順序圖像。可以根據(jù)以下公式來計(jì)算截面圖像 (sectioned image)強(qiáng)度15
,,=^[(7。-/2,/3)2+(/。-/"/3)2+(、/3-、/3)2r其中，Ix是在空間相位X獲得的圖像。
然后，針對沿著Z軸的一系列平面反射鏡的位置，利用所計(jì)算的 截面圖像Is來獲取三個圖像(每個圖像與不同的空間相位相對應(yīng))。然 后將截面圖像Is的強(qiáng)度繪制為沿著Z軸的位置的函數(shù)，以提供類似于圖
3A所示的響應(yīng)曲線。在圖3A中，任意地，已選擇位置z-O作為峰值圖 像強(qiáng)度。矩形A指示，響應(yīng)曲線的一部分，其中，強(qiáng)度與沿著Z軸的反 射鏡的位置成正比，并具有斜率a。
一旦已校準(zhǔn)了輪廓測定裝置，將樣品42置于物鏡32前面的采樣位 置中。定位光柵54，使得光柵54 (但在圖3A所示的線性區(qū)內(nèi))在樣品 表面44上離焦(out-of-focus)成像。如在初始校準(zhǔn)中，對應(yīng)于處于相 對空間相位0、 2p/3、 4p/3的光柵，獲得三個圖像，根據(jù)15 (例如，根 據(jù)與樣品的三個不同相位相對應(yīng)的三個不同圖像，在圖3B的右側(cè)示出
了一個例子)，計(jì)算所得圖像強(qiáng)度Isdef。^ed。
同時，輻射源10提供輻射束12，并且通過探測器元件68a來收集 示出了熒光的空間分布的所得圖像。在圖3B的左側(cè)中示出了典型的熒 光圖像。
然后，可以根據(jù)以下公式來計(jì)算樣品的表面輪廓Zs。
其中，Ic是沒有光柵的情況下獲得的傳統(tǒng)反射圖像，并通過以下
公式給出
可以將倏逝場(即，用于激發(fā)熒光的輻射)的強(qiáng)度的變化表示為
沿著光軸Z的位置的函數(shù)
<formula>formula see original document page 14</formula>
其中，rM和n,分別是樣品培養(yǎng)液46和蓋波片40的折射率，以及e是 軸Z和在蓋波片上入射的束12之間的角度。然后，可以根據(jù)以下公式 計(jì)算每個位置處的修改后的熒光強(qiáng)度(即，為了考慮入射束強(qiáng)度而調(diào) 整的熒光強(qiáng)度)f = F/I(ZS)
其中，f是調(diào)整后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)是在每個空間位置處測量的熒光 強(qiáng)度。
應(yīng)當(dāng)理解，僅作為示例描述了上述實(shí)施例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言顯而易見的是，各種其他實(shí)現(xiàn)方式將落在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
例如，盡管圖1示出了包括TIRF顯微鏡配置在內(nèi)的裝置100，其中， 在熒光通過激發(fā)束經(jīng)歷全內(nèi)反射的光學(xué)元件傳播返回之后對該熒光進(jìn) 行測量，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，可以使用其他TIRF配置(例如在熒光透射 過樣品之后對該熒光進(jìn)行測量的配置)來實(shí)現(xiàn)所述裝置。
此外，盡管如圖2所示，束12僅在光學(xué)元件40的單一反射平面處 經(jīng)歷全內(nèi)反射，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，其他實(shí)現(xiàn)方式也是可能的。例如， 可以將輻射束分成兩個或多個子束，每個子束被配置為經(jīng)歷從各自反 射平面的全內(nèi)反射。每個反射平面包含z軸。例如，可以通過鮑爾克盒 (Pockelcdl)將輻射束作為時間的函數(shù)而分開，使得輻射束在沿著與 每個子束相對應(yīng)的不同路徑透射時交替。每個路徑能夠?qū)椛涫o予 不同的特性，例如， 一個路徑能夠與第一偏振態(tài)相對應(yīng)，第二路徑與 不同的偏振態(tài)相對應(yīng)。備選地，能夠在空間上將輻射束分成兩個或多 個子束，使得每個子束在各自的反射平面中同時反射。
同樣，盡管如圖l所示，在相同的探測器66上將反射束52，成像為 熒光，但是還可以在不同的探測器上對反射束進(jìn)行成像。圖4示出了這 樣的備選裝置配置200，其中，在不同的探測器66a上對反射束52，進(jìn)行
成像。在圖中，相同的附圖標(biāo)記用來代表類似的特征。
裝置200通過被布置為對束52、52'的波長的輻射進(jìn)行完全反射(而 不是像二色分光鏡30，部分地反射或部分地透射這樣的波長)來實(shí)現(xiàn) 該配置。此外，所述裝置包括位于束52、52'的光路中的另一分束器52a， 使得在探測器66a上對反射束52'的一部分進(jìn)行成像。
在圖1中，僅通過探測器元件68a捕獲單一熒光圖像，該熒光圖像 包括所有有關(guān)熒光波長和偏振。然而，通過波長和/或偏振來分離熒光 45。例如，用來執(zhí)行TIRF測量的裝置200的組件可以具有以下文章中 描 述 的 用 于 TIRF 測 量 的 配 置 Webb,S.E.D.,Needham,S.R.，Roberts,S.K.&Martin-Fernandez,M丄."Multi dimensionalsingle-moleculeimaginginlivecells using total-internal-reflection fluorescence microscopy", Optics Letters 31,2157-2159(2006),其內(nèi)容通過引用包含在本文中。
在圖4所示的實(shí)現(xiàn)方式中，裝置200被布置為通過波長(這里，分
為兩個分離的波長分量)和偏振(即，水平和垂直偏振)兩者對熒光 45進(jìn)行分離，但是將所有分量(45a-d)同時成像在探測器66b的相應(yīng) 部分(68a-68d)上。分束器58a、 58b、 58c用來將熒光45分成4個分量 45a-d，其分別從相應(yīng)的反射鏡60a-d反射并通過相應(yīng)的濾光鏡。相應(yīng) 的濾光鏡62a-62d確保探測器66b的每個部分/元件68a-d僅接收一個偏 振態(tài)的波長分量中的一個。
裝置200在輻射12的光路中還包括偏振元件15。偏振元件15可以
實(shí)現(xiàn)為偏振板(被布置為僅透射一個偏振態(tài))和/或偏振旋轉(zhuǎn)器。偏振 元件15確保僅由單個偏振態(tài)的輻射激發(fā)樣品。在操作期間，當(dāng)激發(fā)束 12處于第一偏振態(tài)時，收集到與不同波長/偏振分量的熒光的強(qiáng)度相對 應(yīng)的一組圖像。隨后，調(diào)整偏振元件15，使得將激發(fā)束12置于不同的 偏振態(tài)，然后收集到與不同的波長/偏振分量的熒光的強(qiáng)度相對應(yīng)的另 一組圖像。例如，這允許對熒光團(tuán)P,、 P2的偶極子的方向的改變進(jìn)行
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，各種備選實(shí)現(xiàn)方式將落在所附 權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種對來自樣品的熒光進(jìn)行測量的方法，包括以下步驟測量樣品表面的至少一部分的至少一個輪廓，所述表面實(shí)質(zhì)上橫穿軸延伸；利用輻射來照射樣品表面的所述部分以激勵熒光，輻射的強(qiáng)度沿著軸隨位置而變化；測量指示從樣品表面的所述部分發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的值；以及利用所述測量輪廓對熒光的測量值進(jìn)行修改，以考慮入射在表面上的輻射強(qiáng)度的空間變化。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述修改步驟包括根據(jù) 所述測量輪廓和指示輻射束強(qiáng)度沿著軸隨位置的變化的信息，計(jì)算入 射在所述表面上的輻射強(qiáng)度的空間變化。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述樣品位于鄰近光 學(xué)元件的位置，所述照射步驟包括提供輻射束，使得產(chǎn)生用于激發(fā) 樣品表面上熒光團(tuán)的輻射的倏逝場，所述輻射束被布置為在所述光學(xué) 元件內(nèi)經(jīng)歷全內(nèi)反射。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，將所述輻射束分成兩個子 束，每個子束被布置為在各自的反射平面中經(jīng)歷全內(nèi)反射。
5、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中 所述對樣品表面的所述部分進(jìn)行照射的步驟包括提供第一偏振態(tài)的所述輻射，以及所述測量值的步驟包括測量指示來自樣品表面的所述部分、以 第一偏振態(tài)發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的值，以及測量指示來自樣品 表面的所述部分、以不同的第二偏振態(tài)發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的 值。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，對樣品表面的所述部分進(jìn) 行照射的步驟還包括順序地提供不同的第二偏振態(tài)的所述輻射以激 勵熒光。
7、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述測量值的步驟包括測量指示從樣品表面的所述部分、在第一波長范圍內(nèi)發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的值，以及測量指示從樣品表面的所述部分、在不同的第二波長范圍內(nèi)發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的值。
8、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在時間段內(nèi)，重復(fù)進(jìn)行測量所述輪廓和測量指示熒光的空間強(qiáng)度分布的所述值的步驟，以對所述樣品的構(gòu)造的改變進(jìn)行監(jiān)視。
9、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，同時執(zhí)行測量所述輪廓和測量指示熒光的空間強(qiáng)度分布的值的步驟。
10、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，測量所述輪廓的步驟包括利用輻射束對樣品的所述部分進(jìn)行照射，以及測量反射的輻射束的強(qiáng)度的空間變化。
11、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述測量所述輪廓的步驟包括測量樣品表面的所述至少一部分的形貌。
12、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其中，通過非干涉寬視野光學(xué)輪廓測定法來測量所述形貌。
13、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其中，通過寬視野光學(xué)層析顯微術(shù)來測量所述形貌。
14、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品是生物細(xì)胞，通過細(xì)胞膜限定所述生物細(xì)胞的表面。
15、 一種對來自樣品的熒光進(jìn)行測量的裝置，所述裝置包括樣品架，用于支撐樣品，使得樣品表面的至少一部分實(shí)質(zhì)上橫穿預(yù)定軸延伸；輪廓儀，用于測量樣品表面的所述部分的至少一個輪廓；輻射源，用于采用輻射對樣品表面的所述部分進(jìn)行照射以激勵熒光，輻射的強(qiáng)度沿著軸隨位置而變化；探測器，被布置為測量指示從樣品表面的所述部分發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的值；以及處理器，被布置為利用所測量的輪廓對熒光的測量值進(jìn)行修改，以考慮入射在表面上的輻射強(qiáng)度的空間變化。
16、 一種用于對光學(xué)裝置進(jìn)行控制來執(zhí)行熒光測量的設(shè)備，所述設(shè)備包括包含處理器可讀指令的程序存儲器；以及處理器，被布置為對存儲在所述程序存儲器中的指令進(jìn)行讀取和執(zhí)行，其中，所述處理器可讀指令包括被配置為對所述裝置進(jìn)行控制以執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法的指令。
17、 一種承載計(jì)算機(jī)可讀代碼的載體介質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可讀代碼被配置為使計(jì)算機(jī)執(zhí)行權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于對熒光進(jìn)行測量的方法和裝置。所述方法包括測量樣品表面的至少一部分的至少一個輪廓，所述表面實(shí)質(zhì)上橫穿軸延伸；以及利用輻射來照射樣品表面的所述部分以激勵熒光。輻射的強(qiáng)度沿著軸隨位置而變化。測量指示從樣品表面的所述部分發(fā)射的熒光的空間強(qiáng)度分布的值。利用測量輪廓對熒光的測量值進(jìn)行修改，以考慮入射在表面上的輻射強(qiáng)度的空間變化。
文檔編號G01N21/64GK101688839SQ200880012484
公開日2010年3月31日 申請日期2008年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日
發(fā)明者史蒂芬·埃德溫·多米尼克·韋布, 瑪麗莎·馬丁-費(fèi)爾蘭德斯 申請人:科學(xué)技術(shù)設(shè)備委員會