專(zhuān)利名稱(chēng)：Nell-1增強(qiáng)的骨礦化作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總地來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及NELL-1肽以及使用所述肽或其組合物來(lái)增強(qiáng)骨礦化作用以進(jìn)行 骨再生和/或骨修補(bǔ)的方法。
背景技術(shù)：
骨修復(fù)和再生過(guò)程中的缺陷與人類(lèi)的幾種疾病和障礙，例如骨質(zhì)疏松癥和成骨不全有 關(guān)。骨修復(fù)或軟骨修復(fù)機(jī)制的故障也和臨床整形外科中的重要并發(fā)癥如纖維性骨不連合導(dǎo)致 的骨折、移植體界面缺陷以及大的同體移植物故障相關(guān)。通過(guò)開(kāi)發(fā)新的旨在促進(jìn)和加強(qiáng)骨折 修復(fù)過(guò)程的治療方法，可改善許多人的生活品質(zhì)。
任何能促進(jìn)骨修復(fù)或軟骨修復(fù)的新技術(shù)對(duì)骨折的治療都是有價(jià)值的手段。相當(dāng)部分折斷 的骨仍通過(guò)澆鑄(casting)來(lái)治療，讓天然的機(jī)制來(lái)實(shí)行傷口的修復(fù)。雖然近年來(lái)在骨折的治療 方面已有了許多進(jìn)展，包括設(shè)備的改進(jìn)，但能促進(jìn)(或補(bǔ)充)傷口修復(fù)機(jī)制的新方法的開(kāi)發(fā) 仍然是本領(lǐng)域的重要進(jìn)展。例如，試圖用骨促進(jìn)蛋白質(zhì)或肽(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白，BMP)影 響骨修復(fù)的努力還只得到有限的成功。
因此，為了骨再生和骨修復(fù)，需要用于增強(qiáng)骨礦化作用的藥物和組合物。.
因此，需要用于增強(qiáng)軟骨再生和修復(fù)的藥物和組合物。
下述的實(shí)施方案針對(duì)了以上的問(wèn)題和需要。
發(fā)明概述本發(fā)明敘述一種成骨多肽(NELL-l)，該多肽由人類(lèi)NELL-1基因編碼，用于骨礦化作 用。NELL-l基因和基因產(chǎn)物(如mRNA、 cDNA、蛋白質(zhì)等等)為篩選NELL-1表達(dá)和/或活 性的調(diào)節(jié)劑，并因此為篩選骨形成的調(diào)節(jié)劑提供了良好的靶標(biāo)。此外，NELL-1基因可用來(lái)增 強(qiáng)骨折修復(fù)，例如，作為骨移植物的成分或骨移植物替代替代材料，或者作為單獨(dú)的藥劑而 不用骨移植物或骨移植物替代材料。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于篩選能改變骨礦化作用的試劑的方法。該方法包括 使含有NELL-1基因的細(xì)胞與測(cè)試試劑接觸，并檢測(cè)該NELL-1基因表達(dá)水平的變化，通過(guò) 與未接觸該測(cè)試試劑的細(xì)胞中的NELL-1基因表達(dá)比較，接觸細(xì)胞與未接觸細(xì)胞NELL-1表 達(dá)水平(例如，用基因組DNA拷貝數(shù)、mRNA水平、蛋白水平、蛋白活性等表示)之差異 就表示該藥劑調(diào)節(jié)了骨礦化作用。該方法還包括測(cè)試NELL-1活性調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)庫(kù)中或骨礦化 調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)庫(kù)中能改變NELL-1核酸或NELL-1蛋白表達(dá)的試劑。在一些實(shí)施方案中，通過(guò) 測(cè)量細(xì)胞中NELL-1 mRNA水平來(lái)檢測(cè)NELL-1的表達(dá)水平(例如，通過(guò)使該mRNA與一種 與NELL-l核酸特異性地雜交的探針雜交)。優(yōu)選的雜交方法包括但不限于Northem印跡(RNA 印跡)、使用從NELL-1衍生的DNA的Southern印跡(DNA印跡)、陣列雜交、親和層析 以及原位雜交。本發(fā)明方法可用在基于列陣的方法。因此， 一些實(shí)施方案中，該探針是形成 列陣的許多探針中的一個(gè)。NELL-1表達(dá)的水平還可用核酸擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR)來(lái)測(cè)定。
在其它實(shí)施方案中，NELL-1表達(dá)水平可通過(guò)測(cè)定生物樣品中NELL-1蛋白表達(dá)水平來(lái) 檢測(cè)(例如，通過(guò)毛細(xì)管電泳、Western印跡(蛋白質(zhì)印跡)、質(zhì)譜、ELISA、免疫電泳、免 疫組織化學(xué)等)。細(xì)胞可在活體外，或在活體內(nèi)和/或在原位培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試 試劑不是抗體和/或不是蛋白質(zhì)和/或不是核酸。優(yōu)選的測(cè)試試劑是小的有機(jī)分子。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對(duì)潛在的NELL-1表達(dá)和/或活性的調(diào)節(jié)劑進(jìn)行預(yù)篩選的 方法。所述方法包括使NELL-1核酸或NELL-1蛋白與測(cè)試試劑接觸；并測(cè)定該測(cè)試試劑與 該NELL-1核酸或NELL-1蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合。所述方法可進(jìn)一步包括記錄與NELL-1基 因或蛋白質(zhì)活性的候選調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)庫(kù)中的和/或骨礦化作用的候選調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)庫(kù)中的NELL-l 核酸或NELL-1蛋白特異性地結(jié)合的那些測(cè)試試劑。測(cè)試試劑可直接與NELL-1核酸和/或蛋 白接觸，或者與含該核酸和/或該蛋白的細(xì)胞和/或組織和/或生物體(如哺乳動(dòng)物)接觸。在 與細(xì)胞接觸時(shí)，該細(xì)胞可以是原代的或者是傳代的培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試試劑不 是抗體和/或蛋白質(zhì)和/或核酸。優(yōu)選的測(cè)試試劑是小的有機(jī)分子。當(dāng)該測(cè)定是測(cè)量測(cè)試試劑與 核酸結(jié)合的能力時(shí)，優(yōu)選的測(cè)定利用Northern印跡(RNA印跡)、使用DNA的Southern印 跡(DNA印跡)、陣列雜交、親和層析以及原位雜交。當(dāng)該測(cè)定是測(cè)量測(cè)試試劑與NELL-1 蛋白結(jié)合的能力時(shí)，優(yōu)選的測(cè)定利用毛細(xì)管電泳、Western印跡(蛋白質(zhì)印跡)、質(zhì)譜、ELISA、 免疫電泳、免疫組織化學(xué)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供增加骨礦化作用的方法。優(yōu)選的方法包括增加成骨的
細(xì)胞(例如成骨細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胎兒胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、硬腦膜
細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等)中或者含有所述細(xì)胞的環(huán)境中NELL-1基因產(chǎn)物的濃度。
在一個(gè)實(shí)施方案中，NELL-1基因產(chǎn)物的濃度可通過(guò)上調(diào)NELL-1基因的表達(dá)來(lái)提高。這可通過(guò)許多方法中的任何一個(gè)方法，包括但不限于上調(diào)內(nèi)源性NELL-1基因的表達(dá)(例如，通過(guò)修飾內(nèi)源性調(diào)控區(qū)如啟動(dòng)基因)或者用表達(dá)NELL-1蛋白的載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。 一些優(yōu)選的載體可結(jié)構(gòu)性地表達(dá)NELL-1蛋白，而另一些優(yōu)選的載體則是可誘導(dǎo)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NELL-1基因產(chǎn)物的濃度可通過(guò)含有NELL-1多肽的骨來(lái)提高。
本發(fā)明還提供促進(jìn)骨折修復(fù)的方法。這些方法包括提高骨折位置或其附近NELL-1基因產(chǎn)物的濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，增加骨折位置或其附近的成骨的細(xì)胞或骨前體細(xì)胞中的NELL-1基因產(chǎn)物。這些方法可包括向骨折位置引入能超表達(dá)NELL-1的成骨細(xì)胞或骨前體細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括原位提高成骨細(xì)胞或骨前體細(xì)胞中NELL-1基因產(chǎn)物濃度。NELL-1基因產(chǎn)物的上調(diào)可按本發(fā)明所述方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使細(xì)胞和/或骨折部位與NELL-l多肽接觸。
在骨折修復(fù)的另一個(gè)途徑中，使骨折部位與NELL-1蛋白接觸。該蛋白可通過(guò)細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生(例如，引入超表達(dá)NELL-1蛋白的細(xì)胞)和/或通過(guò)單獨(dú)施用或與藥物賦形劑結(jié)合施用該蛋白，和/或施用能夠表達(dá)NELL-l的"裸DNA"載體。NELL-1蛋白可以是骨修復(fù)/骨移植材料的成分和/或是假肢裝置的一部分。一個(gè)優(yōu)選的移植材料包括膠原蛋白和/或去礦化的或未礦化的骨片以及NELL-1蛋白和/或表達(dá)NELL-l蛋白的細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供骨或軟骨移植材料或藥物組合物，以便在接受移植的動(dòng)物中增強(qiáng)骨組織的形成。優(yōu)選的骨或軟骨移植材料包含可生物相容的基質(zhì)和NELL-1蛋白、與NELL-1相關(guān)的試物或它們的組合。優(yōu)選的移植材料是可吸收的/可生物降解的。優(yōu)選的移植材料可以是合成的或天然存在的(例如，自體移植)。所述基質(zhì)可包括可生物降解的聚合物并可用NELL-1蛋白、與NELL-1相關(guān)的試物和/或能表達(dá)NELL-l蛋白或NELL-1相關(guān)的試物的細(xì)胞浸充。 一個(gè)示例性的骨移植材料包含膠原蛋白綴合物，它含有已經(jīng)基本上均勻地分散在其中的(例如，約0.001-99.999重量％)膠原蛋白和(例如，約99.999-0.001重量％)NELL-1蛋白、與NELL-1相關(guān)的試物和/或能表達(dá)NELL-1蛋白或NELL-1相關(guān)試物的細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述


圖1A表示在E-14大鼠顱蓋原代細(xì)胞培養(yǎng)物中用腺病毒進(jìn)行NELL-1的超表達(dá)，以(3-半乳糖苷酶作為對(duì)照。圖1B表示在分別用NELL-l和p-半乳糖苷酶處理后礦化作用對(duì)時(shí)間的函數(shù)曲線(xiàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3次。進(jìn)行了 Student's T試驗(yàn)。使用NELL-1的礦化作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于使用P-半乳糖苷酶的礦化作用對(duì)照組，*P<0.001 。
圖2表示大鼠NELL-1蛋白和小鼠血小板反應(yīng)蛋白(TSP)-1的示意性結(jié)構(gòu)。所有的Nel-樣分子都含有幾個(gè)高度保守的基序，包括一個(gè)分泌信號(hào)肽、 一個(gè)NH2-末端的血小板反應(yīng)蛋白-l(TSP-l)-樣的模塊、5個(gè)腱蛋白樣的富含半胱氨酸的(CR)結(jié)構(gòu)域和6個(gè)上表皮生長(zhǎng)因子(EGF)-樣的結(jié)構(gòu)域。130-kDa的單體被設(shè)想為通過(guò)盤(pán)旋的螺旋區(qū)域或通過(guò)CR結(jié)構(gòu)域締合成同源三聚體。顯示了信號(hào)肽區(qū)域(實(shí)心黑方塊),TSP-N模塊(TSP-N,陰影方i央)，富含半胱氨酸(CR)結(jié)構(gòu)域(CR，實(shí)心白方塊)、上表皮生長(zhǎng)因子(EGF)-樣結(jié)構(gòu)域(E，影線(xiàn)方±央)，盤(pán)旋的螺旋區(qū)域(CC，條形)、Ca^-結(jié)合型EGF-樣結(jié)構(gòu)域("和RGD肽結(jié)構(gòu)域(RGD，實(shí)心白方塊)。圖3顯示了氨基酸序列，它包含圖2所顯示的各個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域。
圖4A-4D是部分NELL-1結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模型(例如，6-EGF樣結(jié)構(gòu)域)，使用本領(lǐng)域公知的計(jì)算機(jī)程序(如Swiss-Model)生成。
發(fā)明詳述
本發(fā)明敘述用來(lái)增強(qiáng)骨的礦化作用以進(jìn)行骨再生或骨修復(fù)的成骨肽或蛋白質(zhì)及其組合物。本發(fā)明還提供篩選能改變NELL-1肽或蛋白的活性的試劑或改變能表達(dá)NELL-1肽或蛋白的基因的方法。
定義
在此使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"包括被修飾的或被改變的抗體的幾種形式，諸如完整的免疫求蛋白、只含有輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fv片段、由二硫鍵連接的Fv片段(Brinkmann et al. (1993)Proc.Natl.Acad. Sci. USA,卯547-551)、含有可變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab或(Fab)'2片段、單鏈抗體等(Bird et al. (1988) Science 242: 424-426; Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci.USA 85: 5879-5883)。抗體可以是來(lái)源于動(dòng)物(特別是小鼠或大鼠)或人類(lèi)的，或者可以是嵌合的(Morrison et al. (1984) Proc Nat. Acad. Sci. USA 81 : 6851-6855)或者是人源化的(Jones et al.(1986) Nature 321 : 522-525,和已公開(kāi)的UK patent application #8707252)。
術(shù)語(yǔ)"結(jié)合伙伴"或"捕獲劑"或"結(jié)合對(duì)"的一個(gè)成員是指與其他分子特異性地結(jié)合而形成結(jié)合復(fù)合物(例如抗體-抗原、凝集素-碳水化合物、核酸-核酸、生物素-抗生物素蛋白等)的分子。
術(shù)語(yǔ)"載體"、"藥學(xué)上可接受的載體"、"輸送載體"或"載體"可交換使用。在此使用的"特異性地結(jié)合"，當(dāng)是指生物分子(如蛋白質(zhì)、核酸、抗體等)時(shí)，是指一種結(jié)合反應(yīng)，該結(jié)合反應(yīng)對(duì)存在于異質(zhì)性分子群體(如蛋白質(zhì)和其他生物分子)中的某種分子而言是決定性的。因此，在設(shè)計(jì)好的條件(例如，在抗體情況下的免疫測(cè)試條件、在核酸情況下的嚴(yán)格雜化條件)下，特定的配體或抗體與它的特殊的"靶標(biāo)"分子結(jié)合，而與存在于樣品中的其他分子大量結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)"骨質(zhì)疏松癥"是指一組異源性的疾病，其特征是骨質(zhì)減少和骨折。臨床上，骨質(zhì)疏松癥可分為I型和II型。I型骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生在中年婦女中，與更年期雌激素的流失有
關(guān)，而n型骨質(zhì)疏松癥則與老年化有關(guān)。
成骨不全癥(oi)是指一組遺傳得到的結(jié)締組織疾病，其特征是骨和軟結(jié)締組織脆性
(Byers & Steiner (1992) A皿u. Rev. Med. 43: 269-289; Prockop (1990) J. Biol. Chem. 265:15349-15352)。男性和女性同等受累，目前估計(jì)的總發(fā)生率為1例/每5,000-14,000活產(chǎn)兒。聽(tīng)力喪失、牙質(zhì)生長(zhǎng)不全、呼吸功能不全、嚴(yán)重脊柱側(cè)凸和肺氣腫只是與一種或數(shù)種OI關(guān)聯(lián)的許多癥狀中的幾種。雖然尚沒(méi)有關(guān)于此種保健費(fèi)用的精確估計(jì)，但與OI相關(guān)的發(fā)病率和死亡率肯定來(lái)源于極端的骨折傾向(I-IV型OI)和骨折修復(fù)后的不正常骨骼的變形(II-IV型OI)。術(shù)語(yǔ)"核酸"或"寡核苷酸"或語(yǔ)法等同成分在此是指共價(jià)連接在一起的至少二個(gè)核苷酸。本發(fā)明的核酸優(yōu)選是單股的或雙股的并通常含有磷酸二酯鍵，但在一些情況下，如下所述，還包括可具有不同主鏈包括例如磷酸酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亞磷酰胺酯鏈接和肽核酸主鏈和鏈接的核酸類(lèi)似物。其他核酸類(lèi)似物包括帶有正電荷主鏈、非離子主鏈和非核糖主鏈的那些，包括在美國(guó)專(zhuān)利5,235,033和5,034,506以及ASC SymposiumSeries 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research (反義研究中的碳水化合物修飾)，第6和7章，Ed. Y. S. Sanghui和P. Dan Cook中描述的那些。含有一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也包括在本核酸定義內(nèi)。 一些核酸類(lèi)似物己在Rawls，C&ENewsJune2, 1997 ，第35頁(yè)中描述?？梢赃M(jìn)行核糖-磷酸主鏈改性以便加入諸如標(biāo)記基團(tuán)的其它部分，或者是為了提高這類(lèi)分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半壽命。
術(shù)語(yǔ)"特異性地與...雜交"和"特異性雜交"和"選擇性地與...雜交"在此是指在嚴(yán)格的條件下， 一個(gè)核酸分子優(yōu)先與一個(gè)特定的核苷酸序列的結(jié)合、成雙或雜交。
術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格的條件"是指這樣的條件，在該條件下， 一個(gè)探針將優(yōu)先與其靶標(biāo)序列雜交，而與其他序列較少或者根本不雜交。就核酸雜交而言，嚴(yán)格雜交和嚴(yán)格雜交洗滌條件是序列依賴(lài)性的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。核酸雜交的廣泛指南，例如，可見(jiàn)Tijssen (1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic AcidProbes(生物化學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)——與核酸探針雜交)，第I部分第2章，Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays (雜交原理禾卩核酸分子探針測(cè)試策略的概述)，Elsevier, N.Y.(Tijssen)。 一般地，高度嚴(yán)格的雜交和洗滌條件的選擇為在確定的離子強(qiáng)度和pH下，比該特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5'C。 Tm是在確定的離子強(qiáng)度和pH下，50%的靶標(biāo)序列與完全匹配的探針雜交的溫度。非常嚴(yán)格的條件選擇為與特定的探針的Tm相等。在Southern或Northern印跡法中的陣列或?yàn)V紙上具有超過(guò)100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)例子是使用標(biāo)準(zhǔn)的雜交溶液，42°C，雜交進(jìn)行過(guò)夜(參見(jiàn)例如，Sambrook (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第2版)Vol. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY，以及以下的詳細(xì)討論)。高度嚴(yán)格的洗滌條件的一個(gè)例子是在72。C采用0.15MNaCl進(jìn)行約15分鐘。嚴(yán)格的洗滌條件的一個(gè)例子是在65'C， 0.2xSSC洗滌15分鐘(參見(jiàn)例如，Sambrook，同上，對(duì)SSC緩沖液的敘述)。通常，在高度嚴(yán)格的洗滌之前先進(jìn)行低度嚴(yán)格的洗滌，以除去背景探針信號(hào)。對(duì)于例如有超過(guò)100個(gè)核苷酸的雙鏈體，中度嚴(yán)格洗滌的一個(gè)例子的條件是1 x SSC、45°C、 15分鐘。對(duì)于例如有超過(guò)100個(gè)核苷酸的雙鏈體，低度嚴(yán)格洗滌的一個(gè)例子的條件是4x至6xSSC、 40。C進(jìn)行15分鐘。
術(shù)語(yǔ)"成骨細(xì)胞"指能夠礦化的細(xì)胞。成骨細(xì)胞包括造骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞樣的細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胎兒胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、硬腦膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及成軟術(shù)語(yǔ)"骨軟骨祖細(xì)胞"是指能夠形成軟骨的任何細(xì)胞，例如，分化較低的成骨細(xì)胞，它們能夠礦化和/或形成軟骨。骨軟骨祖細(xì)胞包括造骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞樣的細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胎兒胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、硬腦膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及成軟骨細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)"測(cè)試試劑"指在本發(fā)明所述的測(cè)試中要被篩選的試物。該試劑實(shí)際上可以是任何化合物。它可以是單一分離的化合物，或者是化學(xué)(如組合化學(xué))文庫(kù)的一個(gè)成員。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)試試劑將是小的有機(jī)分子。
術(shù)語(yǔ)"小的有機(jī)分子"是指其分子大小可與那些通常用于藥物的有機(jī)分子的大小可以比擬。該術(shù)語(yǔ)排除生物大分子(如蛋白質(zhì)、核酸等)。優(yōu)選的小有機(jī)分子其分子量最高為約5000Dalton，更優(yōu)選最高約2000 Dalton，最優(yōu)選最高約1000 Dalton，約500 Dalton或約200 Dalton。
術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在此可交換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)也可應(yīng)用其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然氨基酸的人造化學(xué)類(lèi)似物的氨基酸聚合物，還可指天然存在的氨基酸聚合物。
術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物"指哺乳動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物綱的任何溫血脊椎動(dòng)物，其雌性體具有分泌乳汁的乳房用于喂養(yǎng)幼子。該術(shù)語(yǔ)包括，例如，人類(lèi)、馬、狗、貓、嚙齒動(dòng)物、牛、鯨、蝙蝠等。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)"可指從實(shí)驗(yàn)得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形式或通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助軟件產(chǎn)生的預(yù)言。用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的常用實(shí)驗(yàn)方法是x-射線(xiàn)結(jié)晶學(xué)和核磁共振(NMR)。在x-射線(xiàn)結(jié)晶學(xué)中，科學(xué)家通過(guò)測(cè)量從純化的蛋白質(zhì)分子的高品質(zhì)結(jié)晶衍射的x-射線(xiàn)束的方向和強(qiáng)度確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。NMR則使用高磁場(chǎng)和射頻脈沖來(lái)操作原子核的自旋狀態(tài)。形成的譜圖上的峰的位置和強(qiáng)度反映了分子中核的環(huán)境和位置。
在獲得1972諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的研究中，ChristianAnfinsen顯示了一個(gè)完全展開(kāi)的蛋白質(zhì)能夠自發(fā)折疊成它的生物活性的狀態(tài)，表明氨基酸序列含有說(shuō)明其3D結(jié)構(gòu)所需的全部信息。因此，對(duì)于本領(lǐng)域的專(zhuān)家，就有可能利用估算蛋白質(zhì)所有原子之間以及周?chē)肿又g的分子力的計(jì)算機(jī)程序來(lái)開(kāi)發(fā)預(yù)言蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的演算法(例如對(duì)于一般位置，可參考http:〃restools.sdsc.edu/biotools/biotools9.html#Partl)(例如對(duì)于特定的NELL-1位置，可參考http :〃modbase. compbio .ucsf edu/modbase-
cgi/model—details.cgi queryfile= 1163464665—2003&searchmode=default&filtermode=off&displaymode=moddetail&seq_id=&model—id=, http : 〃smart. embl.
de/smart/show—motifs .pl ID=Q92832，或http:〃www.expasv.org/cgi-bin/niceprot.pl Q4VB90)。術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"指具有己確定的功能、預(yù)期的功能、或在可將來(lái)確定的功能的NELL-1分子的任何不連續(xù)的部分。圖2和3顯示了具有預(yù)期功能的預(yù)期NELL-1結(jié)構(gòu)域的例子。例如，觀察到的在重組的NELL-1與硫酸肝素之間的強(qiáng)結(jié)合相互作用可能就由TSP-N介導(dǎo)(Kuroda, S., M. Oyasu, et al. (1999). "Biochemical characterization and expression analysis ofneural thrombospondin-l-like proteins NELL-1 andNELL-2."("神經(jīng)的血小板反應(yīng)蛋白-l隱樣蛋白的生物化學(xué)表征與表達(dá)分析")Biochem Biophys Res Commun 265(1): 79-86.)。 NELL-1中的TSP-N模塊可能與細(xì)胞表面硫酸肝素蛋白多糖強(qiáng)烈相互作用，以介導(dǎo)一般的細(xì)胞功能(諸如散布、焦點(diǎn)拈連、分解和胞吞(Bornstein，P. (1995). "Diversity of function is inherent inmatricellular proteins: an appraisal of thrombospondin 1."("功能多樣'性是基質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)所固有的血小板反應(yīng)蛋白-1的評(píng)估")J Cell Biol 130(3): 503-6.)。此外，NELL-1可能是腱蛋白樣CR結(jié)構(gòu)域家族的一個(gè)成員，這包括腱蛋白、kielin、 crossveinless、扭曲的原腸胚形成和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Abreu, J. G., N. I. Ketpura, et al. (2002)， "Connective- tissue growth factor(CTGF) modulates cell signaling by BMP and TGF-beta."("結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)通過(guò)BMP禾Q TGF-beta調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)")Nat Cell Biol 4(8): 599-604)。 CR結(jié)構(gòu)域可以親-或反-配體的方式介導(dǎo)與BMP和TGF-p超級(jí)家族的其他成員的特異性相互作用(Abreu, Ketpura etal.2002)。此外，CR結(jié)構(gòu)域還影響其他功能，諸如受體結(jié)合和三聚體形成。但是，可以想象的是，在NELL-1中還可能鑒定出新的結(jié)構(gòu)域，并不限于圖2和3?？傊?，可以預(yù)期，NELL-1會(huì)有特異性的結(jié)構(gòu)域，它們執(zhí)行特異性的功能，諸如蛋白質(zhì)分泌、配體結(jié)合、三聚體或四聚體形成等。
術(shù)語(yǔ)"構(gòu)象改變"指任何由于微環(huán)境相互作用(如離子相互作用、疏水/親水相互作用、蛋白質(zhì)相互作用、受體相互作用、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用等)造成的NELL-1蛋白結(jié)構(gòu)變化。例如，硫酸肝素與NELL-1的結(jié)合已知在存在或不存在硫酸肝素下誘導(dǎo)了基于特定的反NELL-1抗體結(jié)合特性的的構(gòu)象改變。
術(shù)語(yǔ)"軟骨"是指軟骨的所有形式，包括但不限于，透明軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨。術(shù)語(yǔ)"蛋白多糖"指各種細(xì)胞外基質(zhì)分子，包括硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素。
術(shù)語(yǔ)"葡胺多糖"指各種細(xì)胞外基質(zhì)分子，包括透明質(zhì)酸。
本發(fā)明涉及以下的發(fā)現(xiàn)NELL-1基因產(chǎn)物能增強(qiáng)組織(如骨)礦化和軟骨形成。沒(méi)有束縛于特定的理論，相信NELL-1蛋白可通過(guò)與各種蛋白質(zhì)(包括TGF-p超級(jí)家族的成員)相互作用以及與存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的其他分子(諸如粘多糖和肝素或硫酸肝素樣分子)相互作用發(fā)揮其功能以促進(jìn)細(xì)胞分化并因此增強(qiáng)所希望的細(xì)胞功能。
術(shù)語(yǔ)"肝素和硫酸乙酰肝素"指二者均具有由重復(fù)的GlcUA和GlcNAc雙糖構(gòu)成的相同基本結(jié)構(gòu)的分子。單個(gè)鏈的大小可達(dá)到100 kDa,但一般是低于50 kDa。肝素由于其抗凝血作用而廣為人知，這是一個(gè)基于其與抗凝血酶III的結(jié)合。要在肝素和硫酸乙酰肝素之間進(jìn)行區(qū)分是困難的，這是因?yàn)槎叩慕Y(jié)構(gòu)和功能的標(biāo)準(zhǔn)不足以分離這兩種形式。它們都含有硫酸化和L-差向異構(gòu)作用的許多變體。N-去乙?；徒又腘-硫酸化看來(lái)是關(guān)鍵的步驟，這是因?yàn)轭~外的修飾主要是發(fā)生在N-硫酸化已經(jīng)發(fā)生的區(qū)域。在硫酸乙酰肝素中N-硫酸化的比例低于50%， (Fraansson， L. A., I. Carlstedt, et al. (1986)， "The functions of the heparan sulphateproteoglycans."("硫酸肝素蛋白多糖的功能")CibaFound Symp, 124: 125-42)，而在肝素中則通常是70%或更高(Roden, L., S. Ananth, et al. (1992). "Heparin—an introduction(肝素一介紹)"Adv Exp Med Biol, 313: 1-20)，因而N-硫酸化的量有時(shí)可用來(lái)區(qū)分肝素和硫酸乙酰肝素。葡萄糖醛酸的差向異構(gòu)化和接著發(fā)生的2-硫酸化對(duì)這二種葡胺多糖是典型的。在葡萄糖醛酸2位的硫酸化看來(lái)是為了阻止差向異構(gòu)化回到能量上更有利的形式。NEIX-1肽
NELL-1肽是一種810個(gè)氨基酸的肽，基本上分布在骨中。NELL-1肽是三聚體的肽并具 有如Ting所報(bào)道的氨基酸序列(Ting et al. (1999) J Bone Mineral Res, 14: 80-89;禾B GenBank Accession Number (登錄號(hào))U57523))(圖2和圖3)。
在一些實(shí)施方案中，NELL-1蛋白是一種由NELL-1基因或cDNA(SEQ IDNO:l、3和5) 表達(dá)的蛋白，它是由Watanabe發(fā)現(xiàn)的，Watanabe et al. (1996) Genomics 38 (3): 273-276; Ting et al. (1999) J Bone Mineral Res, 14: 80-89;和GenBank Accession Number U57523),還包括SEQ ID NO: 2, 4， 6。 NELL-1蛋白可包括保留了誘導(dǎo)骨礦化作用的能力的NELL-1蛋白片段。 NELL-1蛋白可以是天然的NELL-1蛋白或者是重組的蛋白。術(shù)語(yǔ)"NELL-1"蛋白包括NELL-1 肽、其片段或其衍生物。術(shù)語(yǔ)NELL-1蛋白還包括NELL-1肽的功能等同物或構(gòu)象等同物。 NELL-1肽的功能等同物或構(gòu)象等同物可通過(guò)參考NELL-1的功能結(jié)構(gòu)域或構(gòu)象結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。圖 4A-4D顯示了一些由計(jì)算機(jī)生成NELL-1結(jié)構(gòu)。
與NELL-1相關(guān)的試劑
在其它一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"NELL-1"肽或蛋白可以是與NELL-1相關(guān)的試劑，它們 可以是NELL-1肽的片段、NELL-1肽的衍生物、NELL-1肽的剪接變體或NELL-1肽的結(jié)構(gòu)、 功能或構(gòu)象等同物。
已經(jīng)報(bào)道了 NELL-1的計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬。報(bào)道了該肽具有如圖4A-4D所示的結(jié)構(gòu)。 NELL-1的關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域包括但不限于在圖2、 3以及4A-4D中所示的區(qū)域。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，與NELL-1相關(guān)的試劑可以是如上所述，具有一個(gè)或多個(gè) NELL-1的功能結(jié)構(gòu)域的肽或蛋白，或這些結(jié)構(gòu)域中任一個(gè)或其組合的功能等同物。 一些實(shí)施 方案中，所述功能結(jié)構(gòu)域可包括突變的序列和/或序列敲出體，條件是該結(jié)構(gòu)域的功能保持基 本不變。
在一些實(shí)施方案中，與NELL-1相關(guān)的試劑可以是肽或多肽，與NELL-1蛋白有約50%、 約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99% 的同源性。
在一些實(shí)施方案中，與NELL-1相關(guān)的試劑可以是NELL-1肽功能結(jié)構(gòu)域的任何或所有 的構(gòu)象等同物。這種構(gòu)象等同物可以具有與NELL-1類(lèi)似的氨基酸序列，例如，具有與NELL-1 蛋白約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約 95%或約99%程度的同源性。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)象等同物可具有基本上與NELL-1肽不 同或與NELL-1肽無(wú)關(guān)的氮基酸序列，只要這種(些)等同物具有與NELL-1肽的任何的或 所有的功能結(jié)構(gòu)域的2D或3D構(gòu)象或與NELL-1肽的2D或3D構(gòu)象基本相似的2D或3D構(gòu) 象，圖2示出了其中的一個(gè)。所述2D或3D構(gòu)象可以是但不限于，由實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的NELL-1蛋 白結(jié)構(gòu)形式或者是通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的軟件預(yù)言而得到。雖然尚未述及NELL-1，但構(gòu)象等同 物的可具有基本上不同的氨基酸序列的例子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白7和生長(zhǎng)分化因子5 (Schreuder et al. Crystal structure of recombinant human growth and differentiation factor 5:Evidence for interaction of the type I and type II receptor-binding sites (重組人生長(zhǎng)禾口分化因子5 的晶體結(jié)構(gòu)I型和II型受體結(jié)合位點(diǎn)相互作用的證據(jù))，Biochemical and Biophysical Research Communications 329 (2005) 1076-1086)。
在一些實(shí)施方案中，與NELL-1相關(guān)的試劑可以是這樣的化合物，它們的一級(jí)蛋白結(jié)構(gòu) 與NELL-1的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，但其最后的結(jié)構(gòu)與NELL-1的最后結(jié)構(gòu)類(lèi)似或相同。
在另外一些實(shí)施方案中，與NELL-1相關(guān)的藥劑還包括NELL-1肽的剪接變異體。NELL-1 肽的外顯子可被敲除，以便產(chǎn)生NELL-1肽的剪接變異體。例如，通過(guò)沿著2個(gè)外顯子區(qū)域 剪接NELL-1可將NELL-1剪接成2個(gè)或3個(gè)形成三聚體NELL-1肽的片段。在本領(lǐng)域中， 制備剪接變異體的方法和步驟是公知的(參見(jiàn)美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)20050148511，該專(zhuān)利的內(nèi)容通過(guò) 引用結(jié)合在此)。
在一些實(shí)施方案中，這里敘述的NELL-1肽可以是NELL-1肽的衍生物。在此使用的術(shù) 語(yǔ)"衍生物"是指任何從NELL-1衍生的化學(xué)的或生物學(xué)的化合物或材料、其結(jié)構(gòu)等同體、 或其構(gòu)象等同體。例如，這樣的衍生物可包括NELL-1肽的任何前藥形式、PEG化的形式或 能使NELL-1肽更加穩(wěn)定或使NELL-1肽具有更好的親骨性或親脂性的NELL-1肽的任何其 它形式。在一些實(shí)施方案中，所述衍生物可以是連接在聚乙烯醇、聚氨基酸、具有C1-C20個(gè) 碳原子的短烴鏈上或生物可相容的聚合物上的NELL-1肽。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"衍生 物"可包括NELL-1肽的模擬物。肽模擬物的合成方法在本領(lǐng)域已廣為報(bào)道。以下將敘述肽 (包括肽模擬物)合成的基本歩驟的例子
在開(kāi)始肽的合成之前，氨基酸(原料)的氨基末端可用FMOC(9-芴甲基氨基甲酸酯)或 其它保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，用一種固體載體如氯甲基樹(shù)脂(游離胺)作為引發(fā)劑。然后，進(jìn)行步驟(l) 到歩驟(3)反應(yīng)，如此反復(fù)，直到獲得所需要的肽(l)用碳二亞胺化學(xué)使游離氨基與羧基末端 進(jìn)行反應(yīng),(2)純化氨基酸序列，和(3)在溫和的酸性條件下將保護(hù)基(如FMOC保護(hù)基)脫 除，產(chǎn)生游離的胺。然后可將肽從樹(shù)脂上切下來(lái)，得到游離的肽或肽模擬物。
在一些實(shí)施方案中，在此所述的肽衍生物包括用物理方法或化學(xué)方法改性的NELL-1肽。 物理修飾可以是，例如,通過(guò)離子力諸如用平衡離子來(lái)形成離子對(duì)的修飾、通過(guò)氫鍵的修飾、 通過(guò)調(diào)節(jié)pH的修飾、通過(guò)溶劑選擇的修飾、或通過(guò)使用不同的蛋白質(zhì)折疊/解折疊步驟的修 飾，這包括選擇折疊/解折疊溫度、pH、溶齊IJ、折疊/解折疊的不同階段的時(shí)間長(zhǎng)度。
在一些實(shí)施方案中，肽衍生物可包括化學(xué)修飾的NELL-1肽。例如，可將短的碳?xì)浠鶊F(tuán)(如 甲基或乙基)選擇地連接在NELL-l肽分子的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上i以便改變所述肽的化學(xué)和Z 或物理性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可將單個(gè)的、寡聚的、或多聚的乙二醇(PEG)基團(tuán)選擇地連 接在NELL-1肽分子的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上，以便通過(guò)公知的蛋白PEG化歩驟來(lái)改變肽的化學(xué) 和/或物理性質(zhì)(參見(jiàn)例如Mok, H., et al., Mol. Ther., 11(1):66-79 (2005))。
V.用NELL-1核酸和/或多肽增加骨礦化作用在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供增進(jìn)骨生長(zhǎng)的方法和組合物。這在許多場(chǎng)合中是有用 的，包括但不限于骨重建(諸如用于重建由外傷、癌癥手術(shù)、或發(fā)育偏差引起的缺損)、成 骨不全癥的治療、骨質(zhì)疏松的治療以及大小骨折的愈合。
在一些實(shí)施方案中，與使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白(如BMP-1到BMP-24)的方式類(lèi)似，NELL-1 多肽可用來(lái)加速骨折的修復(fù)或誘導(dǎo)骨修復(fù)或在自然的愈合受到限制或不能發(fā)生的場(chǎng)合下的骨 修復(fù)或更換。 一般地，這樣的方法包括在或接近骨折的位置增加NELL-1基因產(chǎn)物的量。 NELL-1基因產(chǎn)物濃度可通過(guò)一種或多種方法增加。在一種方法中，可誘導(dǎo)在或接近骨折位置 上的細(xì)胞表達(dá)更高的NELL-1水平。這可通過(guò)，例如使用NELL-1表達(dá)的調(diào)節(jié)齊U、改變NELL-1 啟動(dòng)子或通過(guò)用表達(dá)NELL-1的構(gòu)成物轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。這可在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)，或者，在另一個(gè) 實(shí)施方案中，可改造這樣的細(xì)胞使它們?cè)诨铙w外超表達(dá)NELL-1 ，然后放置回對(duì)象生物體內(nèi)(如 在骨折位置或接近骨折的位置)。
可將表達(dá)或超表達(dá)NELL-1的細(xì)胞摻合在骨骼移植材料中和/或可將NELL-l多肽摻合在
這樣的骨移植材料中。這些移植材料可用來(lái)治療骨折或或者促進(jìn)假肢或骨移植物的置換/愈 合。
這些方法一般包括在或者接近骨或在骨前期細(xì)胞內(nèi)增加NELL-1蛋白濃度和/或使細(xì)胞 (例如，骨前期細(xì)胞)與NELL-1多肽接觸或與編碼NELL-1多肽的載體接觸。這可通過(guò)如 下方法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化骨前體細(xì)胞使得它表達(dá)更高的內(nèi)源性NELL-1水平，或者使得它表達(dá)來(lái)自 外源轉(zhuǎn)染的NELL-1核酸的NELL-1，或通過(guò)使骨骼、骨折部位、骨前體細(xì)胞與NELL-1蛋白 接觸，或者局部或全身施用NELL-1蛋白。
在此使用的，術(shù)語(yǔ)"骨前期細(xì)胞"是指有能力最終形成、或有助于形成新的骨組織的那 些細(xì)胞。這包括處在分化的不同階段的各種細(xì)胞，諸如，例如，干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成纖維 細(xì)胞、血管細(xì)胞、早骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等。骨前期細(xì)胞還包括己經(jīng)被分離并在 體外處理過(guò)(例如，經(jīng)過(guò)諸如細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子等試劑或甚至基因工程細(xì)胞的刺激)的細(xì) 胞。用本發(fā)明方法或組合物刺激過(guò)的骨前期細(xì)胞的具體類(lèi)型并不重要，只要以這樣的方法刺 激這些細(xì)胞，使它們被激活，在體內(nèi)實(shí)施方案中，最終能產(chǎn)生新的骨組織。
在各種確定的體外條件下或在不完全確定的體內(nèi)條件下，干細(xì)胞和骨髓細(xì)胞可分化成骨 細(xì)胞或骨前期細(xì)胞。在體內(nèi)的例子中，可簡(jiǎn)單地通過(guò)針吸的方法從哺乳動(dòng)物得到骨髓細(xì)胞。 在這個(gè)節(jié)點(diǎn)上，Nell-l蛋白可直接施用到該細(xì)胞上，然后該細(xì)胞/蛋白質(zhì)混合物(加或減其它載 體/支架結(jié)構(gòu)物)可立即用于移植或注射?；蛘?，在移植或注射前，可將分離的骨髓細(xì)胞先進(jìn) 行培養(yǎng)，以便除去造血細(xì)胞，然后用Nell-l處理。例如，將該細(xì)胞進(jìn)行離心，然后懸浮在 Dulbecco's Modified Eagles's Medium(DMEM)(Gibco BRL, Grand Island, NY)中，其包含10% 胎牛血清(FBS) (Hyclone, Logan, Utah)、 100 U/mL青霉素、100昭/mL鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺(Sigma, St. Louis, MO)。丟棄造血細(xì)胞(它們不會(huì)粘附在燒瓶上)，粘附的細(xì)胞就 是原代的BMSC。第一代傳代之后，在用50 pg/mL維生素C、 10 mmol/L p-磷酸甘油和10-8 mol/L地塞米松補(bǔ)充的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)該細(xì)胞，直到用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用第二代細(xì)胞進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"骨前期細(xì)胞"特別用來(lái)指那些位于骨前期組織內(nèi)、與骨前期組織接觸、或朝著骨 前期組織遷移(即"以骨前期組織為家")的細(xì)胞，這些細(xì)胞直接或間接地刺激成熟骨骼的 形成。這樣，前期細(xì)胞可是最終分化為成熟骨細(xì)胞分身的細(xì)胞，即，"直接地"形成新骨組 織的細(xì)胞。在本發(fā)明中，在刺激下能吸引更多的前期細(xì)胞或促進(jìn)附近細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞(如 分化成造骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和/或破骨細(xì)胞)的那些細(xì)胞也被認(rèn)為是前期細(xì)胞一這是由于它們的刺 激""間接地導(dǎo)致骨骼的修復(fù)或再生。這些細(xì)胞可通過(guò)各種生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子的加工，或通 過(guò)它們與其它細(xì)胞類(lèi)型的物理相互作用而間接地影響骨形成。前期細(xì)胞刺激骨修復(fù)的直接或 間接機(jī)理在實(shí)踐本發(fā)明中無(wú)需加以考慮。骨前期細(xì)胞和骨前期組織可以是在天然環(huán)境中到達(dá) 活性的骨生長(zhǎng)、修復(fù)或再生區(qū)域的細(xì)胞和組織。就骨前期細(xì)胞而言，還可能是那些被吸引或 被補(bǔ)充到這種區(qū)域的細(xì)胞。它們可以是那些存在于動(dòng)物模型人造的切骨部位的細(xì)胞。骨前期 細(xì)胞還可以從動(dòng)物或人的組織中分離并保持在體外的環(huán)境中?？蓮闹蝎@得骨前期細(xì)胞的合適 的身體部位是這樣的區(qū)域，諸如骨組織和流體圍繞在骨折或其它骨骼缺損周?chē)?無(wú)論這是否是 人造的位點(diǎn))，或者，實(shí)際上來(lái)自骨髓骨組織和流體圍繞在骨折或其它骨骼缺損周?chē)?。分離后 的細(xì)胞可用在此公開(kāi)的方法和組合物刺激，如果需要，還可返回到動(dòng)物身體內(nèi)需要刺激骨修 復(fù)的適當(dāng)位置。在這樣的情況下，含核酸的細(xì)胞本身就是治療藥劑的一種形式。這種體外方 案是業(yè)內(nèi)公知的。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，骨前期細(xì)胞和組織是到達(dá)人們希望進(jìn)行治療 的骨折或骨損傷區(qū)域的細(xì)胞和組織。因此，在治療實(shí)施方案中，要鑒別應(yīng)該對(duì)其施用本發(fā)明 治療組合物的合適的靶標(biāo)前期細(xì)胞并無(wú)困難。在這樣的情況下，得到適當(dāng)?shù)拇碳そM合物(如 NELL-1多肽)，如在此所公開(kāi)的，并使該組合物與骨折或骨缺損部位接觸就足夠了。該生物 學(xué)環(huán)境的性質(zhì)是這樣的，無(wú)需由醫(yī)生進(jìn)行進(jìn)一步的靶向確認(rèn)或細(xì)胞確認(rèn)，這些適當(dāng)?shù)募?xì)胞就 會(huì)被激活。
A) 轉(zhuǎn)化細(xì)胞以增加NELL-1的產(chǎn)生
在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，可在體外和/或體內(nèi)將表達(dá)核酸(如cDNA)的NELL-1基 因克隆到能轉(zhuǎn)染細(xì)胞(諸如人的或其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的基因治療載體中。這種克隆和細(xì)胞 轉(zhuǎn)染的方法和歩驟在1999年10月5日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/412,297,中已有敘述，其內(nèi)容 全部通過(guò)引用結(jié)合于此。
B) 施用外源產(chǎn)生的NELL-1
1)將NELL-l蛋白輸送到靶細(xì)胞.
本發(fā)明NELL-1蛋白或相關(guān)的試劑對(duì)促進(jìn)細(xì)胞分化是有用的。為了促進(jìn)細(xì)胞分化， NELL-1蛋白或相關(guān)試劑可通過(guò)靜脈內(nèi)、非腸胃道途徑、表面途徑、經(jīng)口或局部給藥(如通過(guò) 氣溶膠或透皮方式)。特別優(yōu)選的給藥方式包括動(dòng)脈內(nèi)注射、向骨折部位注射或放在可生物降 解的基質(zhì)中輸送。NELL-1蛋白試劑可與藥學(xué)上可接受的載體組合以形成藥物組合物，該載體 可被稱(chēng)為載體或賦形劑。
15在一些實(shí)施立方按中，載體可包括化學(xué)凝膠，該凝膠包括由于pH、離子環(huán)境、溶劑濃 度的改變而形成的主鍵。這種化學(xué)凝膠的例子包括但不限于多糖，如甲殼素、甲殼素加離子 鹽(如P-磷酸甘油)、海藻酸鹽加Ba2+,Sr2+,Ca2+,Mg2+、膠原、纖維蛋白、血漿或其組合 物。
在一些實(shí)施方案中，載體可包括物理凝膠，它包括由于溫度的改變而形成的次價(jià)鍵。這 種物理凝膠的例子包括但不限于海藻酸鹽、聚乙二醇-聚(乳酸-共-羥基乙酸)-聚乙二醇) (PEG-PLGA-PEG)三嵌段共聚物、瓊脂糖和纖維素。在一些實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明組合 物的物理凝膠可包括在高剪切力下為液體但在低剪切力下膠凝為固體的物理凝膠。這種物理 凝膠的例子包括但不限于透明質(zhì)酸或聚氧乙烯。所述物理凝膠可以是具有預(yù)先確定的大小和 形狀的預(yù)先形成的材料。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明載體可包括在響應(yīng)刺激時(shí)發(fā)生分解或釋放出活性劑的材料。 這種刺激的例子包括機(jī)械刺激、光、溫度改變、pH改變、離子強(qiáng)度改變或電磁場(chǎng)改變。這些 材料在本領(lǐng)域是公知的。這種材料的一些例子有甲殼素、海藻酸鹽、普朗尼克(pluronics)、 甲基纖維素、透明質(zhì)酸和聚氧乙烯。其它例子在Brandl F, Sommer F, Goepferich A. "Rational design of hydrogels for tissue engineering: Impact of physical factors on cell behavior "("用于組 織工程的水凝膠的合理設(shè)計(jì)物理因素對(duì)細(xì)胞行為的影響")in Biomaterials. Epub 2006 Sep 29 中已有敘述。
在一些實(shí)施方案中，載體可包括含有以下成分的凝膠羥磷灰石、磷灰石、磷酸三鈣、 磷酸鈣、生物活性玻璃、人異體移植骨或軟骨、牛骨和軟骨或者它們的混合物。
在一些實(shí)施方案中，包括上述任何一種凝膠的載體還可進(jìn)一步包括交聯(lián)劑以便進(jìn)一步調(diào) 節(jié)降解動(dòng)力學(xué)和受控釋放?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，載體可包括包括任何一種上述凝膠的 互穿相復(fù)合材料或互穿網(wǎng)絡(luò)(IPN)。交聯(lián)劑的一些例子包括但不限于普通交聯(lián)劑(聚環(huán)氧垸、二 甲基丙烯酸乙二醇酯、N，N'-亞甲基二丙烯酰胺、亞甲基二(4-苯基異氰酸酯)、二甲基丙烯酸 乙二醇酯、二乙烯基苯、甲基丙烯酸烯丙酯、羰基二咪唑、磺酰氯、氯代碳酸酯、n-羥基丁 二酰亞胺酯、丁二酰亞胺酯、環(huán)氧化合物、芳基鹵化物、磺基丁二酰亞胺酯以及馬來(lái)酰亞胺)； PEG基交聯(lián)劑(如MAL-dPEGx-NHS-酯、MAL-dPEGx酸、Bis-MAL-dPEGx等)和光活化交 聯(lián)劑、N-羥基丁二酰亞胺基交聯(lián)劑、二賴(lài)氨酸、三賴(lài)氨酸和四賴(lài)氨酸。
在一些實(shí)施方案中，載體可以是聚合物載體或非聚合物載體。在一些實(shí)施方案中，載體
是可生物降解的，如可通過(guò)酶促的或水解的機(jī)理降解的。載體的例子包括但不限于合成的可
吸收聚合物(例如但不限于聚(a-羥基酸)，如聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D, L-丙交酯)(PDLLA)、
聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(-己內(nèi)酯)、聚(碳酸丙二醇酯)、聚(p-二噁
垸酮)、聚(己內(nèi)酯-共-乙交酯)、聚(乙交酯-共-碳酸丙二醇酯)、聚(D，L-丙交酯-共-碳酸丙二醇
酯)、聚丙烯酸酯、聚羥基丁酸酯(PHB)、聚酐、聚(酐-共-酰亞胺)、丙烯-共-富馬酸酯、聚內(nèi)
酯、聚酯、聚碳酸酯、聚陰離子聚合物、聚酐、聚酯-酰胺、聚氨基酸、均聚肽、聚(磷腈)、
聚(glaxanone)、多糖和聚原酸酯、丙交酯乙交酯共聚物(polyglactin)、羥丙酸羥乙酸共聚
物(polyglacticacid)、聚醛糖酸、聚丙烯酸、聚鏈烷酸酯；它們的共聚物或混合物以及任何衍生物和改性物。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,563,489和PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/03024316,通過(guò)引用結(jié)合 于此。載體的其它離子包括纖維素聚合物，包括但不限于烷基纖維素、羥烷基纖維素、甲基 纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、羥甲基纖維素及 其陽(yáng)離子鹽。載體的其它例子包括合成的和天然的生物陶瓷，例如但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、 磷灰石、生物活性玻璃材料和珊瑚磷灰石。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2002187104; PCT國(guó)際申 請(qǐng)WO/9731661和PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/0071083,通過(guò)引用結(jié)合在此。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體還可進(jìn)一步用組合物涂布，該組合物包括用溶膠-凝膠技術(shù)或用 浸漬技術(shù)得到的生物玻璃和/或磷灰石，例如但不限于模擬的體液(其鈣和磷的濃度為天然血 清濃度的1.5至l」7倍，在約15-65 0C溫度用各種方法將溶液pH調(diào)節(jié)到約2.8-7.8的范圍)(參 見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6,426,114和6,013,591;和PCT國(guó)際專(zhuān)利WO/9117965,通過(guò)引用結(jié)合于此)。
載體的其它例子包括膠原(如Collastat、 Hdistat膠原海綿)、透明質(zhì)酸、纖維蛋白、甲殼 素、磷灰石和動(dòng)物膠。參見(jiàn)例如PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/9505846; WO/02085422，通過(guò)引用結(jié)合 于此。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括肝素結(jié)合劑，包括但不限于肝素樣聚合物，如硫酸葡聚 糖、硫酸軟骨素、硫酸肝素、巖藻聚糖、海藻酸鹽或它們的衍生物；肽片段，其氨基酸被修 飾以提高肝素親和性(參見(jiàn)例如Journal of Biological Chemistry (2003), 278(44), p. 43229-43235，通過(guò)引用結(jié)合于此)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可以是液體、固體或凝膠的形式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基材可包括可流動(dòng)凝膠形式的載體?？蛇x擇該凝膠使之便于在希望 形成軟骨的部位注射，如通過(guò)注射器。該凝膠可以是化學(xué)凝膠，它可以是由一級(jí)鍵合形成的 化學(xué)凝膠，并可通過(guò)pH、離子基團(tuán)和/或溶劑濃度控制。該凝膠也可以是物理凝膠，它由次 級(jí)鍵合形成并由溫度和粘度控制。該凝膠的例子包括但不限于普朗尼克(pluronics)，動(dòng)物膠、 透明質(zhì)酸、膠原、聚丙交酯-聚乙二醇溶液和綴合物、甲殼素、甲殼素&b-磷酸甘油(BST-凝 膠)、海藻酸鹽、瓊脂糖、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚環(huán)氧乙垸、在N-甲基-2-吡咯垸酮 中的聚丙交酯/乙交酯。參見(jiàn)例如Anatomical Record (2001), 263(4), 342-349，通過(guò)引用結(jié)合 于此。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是可光聚合的，諸如通過(guò)波長(zhǎng)為至少250nm的電磁輻射。可 光聚合的聚合物的例子包括聚(PEG)丙烯酸亞乙基酯衍生物、PEG甲基丙烯酸酯衍生物、富 馬酸二羥基丙酯-共-乙二醇、聚乙烯醇衍生物、PEG-共-聚(羥基酸)二丙烯酸酯大單體、以及 修飾的多糖如透明質(zhì)酸衍生物、和右旋糖酑甲基丙烯酸酯。參例如美國(guó)專(zhuān)利5,410,016，通過(guò) 引用結(jié)合于此。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基材可包括對(duì)溫度敏感的載體。例子包括由如下物質(zhì)制備的載體
N-異丙基丙烯酰胺(NiPAM)或通過(guò)結(jié)合甲基丙烯酸乙酯和N-丙烯酰氧基丁二酰亞胺而得到的
具有降低的最低臨界溶液溫度(LCST)和升高的肽(如NELL-l)結(jié)合力的改性NiPAM;或甲基
丙烯酸垸基酯如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯和甲基丙烯酸十二烷基酯。PCT專(zhuān)利申請(qǐng)
WO/2001070288;美國(guó)專(zhuān)利5,124,151，通過(guò)引用結(jié)合于此。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中載體可具有用如下物質(zhì)裝飾和/或固定化的表面細(xì)胞粘合分子、 粘合肽、粘合肽類(lèi)似物(它們可通過(guò)受體介導(dǎo)的機(jī)理促進(jìn)細(xì)胞-基質(zhì)的附著)和/或分子部分(它 們可通過(guò)非受體介導(dǎo)的機(jī)理促進(jìn)粘合)，例如但不限于多陽(yáng)離子的聚氨基酸-肽(如聚賴(lài)氨酸)、 多陰離子的聚氨基酸-肽、Mefp-級(jí)的粘合分子和其它富含DOPA-的肽(如聚賴(lài)氨酸-DOPA)、 多糖和蛋白聚糖。參見(jiàn)例如PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/2004005421 、 WO/2003008376、 WO/9734016， 通過(guò)引用結(jié)合于此。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括各種天然的基質(zhì)或它們的組分，諸如衍生化的軟骨基質(zhì)、 去礦化的骨基質(zhì)、或從異體移植物、異種移植物衍生的其它組分，或從無(wú)核原生蟲(chóng)、原生生 物、真菌、植物或動(dòng)物界衍生的任何其它天然的材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括由螯合劑構(gòu)成的材料，螯合劑諸如，但不限于膠原、明 膠、透明質(zhì)酸、海藻酸、聚乙二醇、烷基纖維素包括羥烷基纖維素如甲基纖維素、乙基纖維 素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基-甲基纖維素和羧甲基纖維素、血、纖維蛋白、聚 氧乙烯氧化物、半水合硫酸鈣、磷灰石、聚羧乙烯以及聚(乙烯醇)。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利 6,620,406，通過(guò)引用結(jié)合于此。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括表面活性劑以促進(jìn)NELL-1穩(wěn)定性和/或在載體材料如但 不限于，聚氧酯，如聚山梨酯80、聚山梨酯20或普朗尼克-F-68 (PluronicF-68)中的分散。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可包括緩沖劑，諸如，但不限于甘氨酸、谷氨酸鹽酸鹽、氯化 鈉、胍、肝素、谷氨酸鹽酸鹽、乙酸、琥珀酸、聚山梨醇酯、硫酸葡聚糖、蔗糖以及氨基酸。 參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,385,887,通過(guò)引用結(jié)合于此。在一個(gè)實(shí)方案中，載體可包括如上所述材 料的組合。例如，載體可以是PLGA/膠原載體膜。該膜可浸泡在包括NELL-1肽的溶液中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于人體的植入體可包括含有NELL-1的基材，NELL-1的量要足 夠用來(lái)誘導(dǎo)軟骨形成或修復(fù)植入物的周?chē)?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于人體的植入物可包括具有表面的基材，該表面含有足夠量的 NELL-1，以便誘導(dǎo)軟骨形成或修復(fù)植入物的周?chē)?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于人體的植入物可包括具有表面的基材，該表面含有成軟骨細(xì)胞 和足夠量的NELL-1，以便誘導(dǎo)軟骨形成或修復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，植入物可用細(xì)胞接種， 細(xì)胞包括但不限于自體細(xì)胞、成軟骨或造骨細(xì)胞、表達(dá)NELL-1或另一種成軟骨分子。
植入物可包括做成篩、針、螺絲、板、或假肢關(guān)節(jié)形狀的基材。例如基材可以是牙齒或 整形外科植入物的形狀，NELL-1可用于促進(jìn)植入物與周邊骨骼的整合。植入物可包括可吸收 的基材，如包含膠原的基材。
NELL-1肽可與可接受的載體組合以形成藥物組合物?？山邮艿妮d體可含有生理上可接 受的化合物，該化合物例如可起使組合物穩(wěn)定化的作用，或者增加或減少藥劑的吸收。生理 上可接受的化合物可包括，例如，碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化劑(如 抗壞血酸或谷胱甘肽)、螯合劑、低分子量蛋白質(zhì)、減少抗有絲分裂劑的排空或水解的組合 物或賦形劑或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。其它生理上可接受的化合物包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑或防腐劑(它對(duì)于防止微生物 的生長(zhǎng)和作用特別有用)。各種防腐劑是公知的，包括例如苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人 員會(huì)理解，載體的選擇，包含生理上可接受的化合物的選擇取決于，例如給藥的途徑。
組合物可以各種單位劑型給藥，這取決于給藥的方法。例如，合適的單位劑型可包括粉 劑或注射劑或可塑的糊膏或懸浮劑。
本發(fā)明組合物可包含溶解在藥學(xué)上可接受的載體(如用于水溶性肽的水性載體)的 NELL-1肽溶液?？梢允褂酶鞣N載體，如緩沖的生理鹽水等。這些溶液是滅菌的， 一般不含不 希望有的物質(zhì)。這些組合物可用常規(guī)的、公知的滅菌技術(shù)來(lái)滅菌。組合物可含有藥學(xué)上可接 受的輔助物質(zhì)，以便接近生理?xiàng)l件，這些物質(zhì)如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如 乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化轉(zhuǎn)、乳酸鈉等。
在這些配方中的NELL-1肽的濃度可以有廣范圍的變化，并基本上按照以下因素加以選 擇液體的體積、粘度、體重等，并要與所選擇的具體的給藥方式和病人的需要相一致。
給藥方案由臨床適應(yīng)癥、病人的各種變量(如體重、年齡、性別)以及臨床表現(xiàn)(如受傷 程度、受傷部位等)決定。
但是，本發(fā)明中有用的NELL-1肽或試劑的治療有效劑量是這樣一個(gè)劑量，它對(duì)病人有 正面的臨床效果，或者如上面所述，通過(guò)測(cè)量藥劑增強(qiáng)軟骨原分化的能力而對(duì)細(xì)胞有所 希望 的效果。可調(diào)節(jié)每種肽或藥劑的治療有效劑量，以期達(dá)到所需要的臨床效果，同時(shí)使負(fù)面的 副作用降到最低。在確定對(duì)具體病人合適的個(gè)別方案和劑量水平時(shí)，對(duì)于具體的病人，肽或 藥劑的劑量可根據(jù)給藥途徑、疾病的嚴(yán)重程度、病人的年齡和體重、病人正在服用的其它藥 物以及主治醫(yī)師通常要考慮的因素來(lái)選擇。
在一些例子中，細(xì)胞分化可用載體來(lái)指導(dǎo)，用NELL-1來(lái)加速。藥學(xué)上可接受的載體可 含有生理上可接受的化合物，這些化合物起到，例如使組合物穩(wěn)定化或者增加或減少藥劑的 吸收的作用。生理上可接受的化合物可包括，例如碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、 抗氧化劑(如抗壞血酸、或谷胱甘肽)、螯合劑、低分子量蛋白質(zhì)、能降低抗有絲分裂劑的 排空或水解的組合物或賦形劑或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。
其它生理上可接受的化合物包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑或防腐劑(它對(duì)于防止微生物 的生長(zhǎng)和作用特別有用)。各種防腐劑是公知的，包括例如苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人 員會(huì)理解，藥學(xué)上可接受的載體，包括生理上可接受的化合物的選擇取決于，例如抗有絲分 裂劑的給藥途徑，還取決于該抗有絲分裂劑的具體的物理-化學(xué)特性。優(yōu)選的用于輸送骨形態(tài) 生成蛋白(BMP)制劑在美國(guó)專(zhuān)利5,385,887中詳細(xì)敘述。
根據(jù)給藥方法，藥物組合物可以用多種單位劑型給藥。例如，適合口服給藥的單位劑型 包括粉劑、片劑、藥丸、膠囊和藥錠。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，如果經(jīng)口服給藥，NELL-1蛋白必須加以 保護(hù)以免被消化。這通常可通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)使該蛋白與組合物復(fù)合使它能抵抗酸和酶的 水解，或者通過(guò)將該蛋白包裝在合適的抵抗消化的載體(如脂質(zhì)體)中。保護(hù)化合物免受消 化的方法在業(yè)內(nèi)公知(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,391,377，該專(zhuān)利敘述了治療劑經(jīng)口輸送的脂質(zhì)組 合物)。特別有用，例如，用于治療外科傷口，促進(jìn)骨重建和/ 或修復(fù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可用于非腸胃道給藥，如靜脈內(nèi)給藥或施用于體穴或 器官內(nèi)腔。用于給藥的組合物通常包含NELL-1蛋白溶解于藥學(xué)上可接受的載體(對(duì)于水溶
性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選水性載體)中的溶液?？梢允褂酶鞣N載體，如緩沖的生理鹽水等。這些溶 液是滅菌的， 一般不含不需要的物質(zhì)。這些組合物可通過(guò)常規(guī)的公知的技術(shù)滅菌。組合物可
含有使組合物接近生理?xiàng)l件所需的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性
調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。
這些制劑中NELL-1蛋白的濃度可廣為變化，基本上根據(jù)液體體積、粘度、體重等加以 選擇，并要與所選擇的具體給藥方式和病人的需要一致。通常NELL-1蛋白以藥學(xué)上可接受 的溶液的形式使用(包括從冷凍干燥的形式重新溶解的溶液)。例如，Nell-l蛋白可按至少約1 mg/ml，優(yōu)選約2-8mg/ml的濃度溶解，以便可輸送藥學(xué)上有效量的蛋白而無(wú)需使用過(guò)多體積 的載體。對(duì)于一些應(yīng)用，可能需要2mg/ml以上的濃度。
劑量方案由臨床指標(biāo)、病人變量(如體重、年齡、性別)和臨床表現(xiàn)(如受傷程度、受傷部 位等)確定。 一般，NELL肽和其它藥劑的劑量可按照業(yè)內(nèi)公知的方法，基于藥劑的類(lèi)型、疾 病和其他因素(如年齡和性別)加以確定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，NELL肽的劑量一般在0.001 pg/mm2 -1 pg/mm2，或更優(yōu)選0.001 ng/mm2 -1 ng/mm2，或更優(yōu)選0.001嗎/mm2 - l昭/mm2，或更優(yōu)選0.001 mg/mm2 -1 mg/mm2， 或更優(yōu)選0.001 g/mm2 -1 g/mm2的范圍，用或不用特定的載體或支架。在另一個(gè)實(shí)施方案中， NELL肽的劑量范圍一般在0.001 pg/ml - lpg/ml，或更優(yōu)選0.001 ng/ml -1 ng/ml，或更優(yōu)選 0.001 pg/ml - l|ag/ml，或更優(yōu)選0.001 mg/ml - 1 mg/ml，或更優(yōu)選0.001 g/ml - 100 g/ml的范圍， 用或不用特定的載體或支架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NELL肽的劑量一般在0.001 pg/kg-l pg/kg，或更優(yōu)選0.001 ng/kg -1 ng/kg,或更優(yōu)選0.001昭/kg - l昭/kg，或更優(yōu)選0.001 mg/kg -1 mg/kg，或更優(yōu)選0.001 gm/kg -1 gm/kg，更優(yōu)選0.001 kg/kg - 1 kg/kg的范圍，用或不用特 定的載體回支架。而且，應(yīng)該理解，所有劑量都可連續(xù)給予或者分為每時(shí)間段給予的劑量。 時(shí)間段的例子包括但不限于每1小時(shí)、每2小時(shí)、每4小時(shí)、每6小時(shí)、每8小時(shí)、每12 小時(shí)、每24小時(shí)、每48小時(shí)或每72小時(shí)或每周、每2周、每4周或每個(gè)月、每2個(gè)月、 每4個(gè)月等。
但是，因?yàn)镹ELL肽可對(duì)體外造骨細(xì)胞凋亡有影響(Zhang, X., et al., J Bone Miner Res， 2003. 18(12): p. 2126-34)，所以大大高于最佳范圍的NELL劑量(如，NELL-1劑量)并不能增 加軟骨的形成或修復(fù)。因此，即使更優(yōu)選的NELL肽劑量也不應(yīng)該大大高于最佳劑量范圍。 所述NELL肽的更加優(yōu)選的最佳劑量范圍可按照以下因素加以改變例如哺乳動(dòng)物對(duì)象的類(lèi) 型、年齡、所在地域以及性別；所用的載體或支架材料；以及不同NELL肽的純度和功效。 在一個(gè)實(shí)施方案中，NELL肽的更加優(yōu)選的最佳劑量范圍包括但不限于1 ng/mm2-100 ng/mm2 ，或更加優(yōu)選100 ng/mm2 - 1000 ng/mm2，或更加優(yōu)選1 jxg/mm2 -100昭/匪2，或更 加優(yōu)選100 pg/mm2 - 1000 pg/mm2的范圍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NELL肽的更加優(yōu)選的最佳 劑量范圍包括但不限于1 ng/ml -100 ng/ml，或更加優(yōu)選100 ng/ml - 1000 ng/ml，或更加優(yōu)選1嗎/ml - 100嗎/ml，或更加優(yōu)選100嗎/ml- 1000嗎/ml的范圍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽的 更加優(yōu)選的最佳劑量范圍一般在1嗎/kg -100 pg/kg，或更加優(yōu)選100嗎/kg - 1000 pg/kg，或 更加優(yōu)選lmg/kg-100mg/kg的范圍，用或不用特定的載體或支架。而且，要理解，所有劑 量都可以是連續(xù)給予的劑量，或分為每一定時(shí)間段給予的劑量。時(shí)間段的例子包括單部限于 每1小時(shí)、每2小時(shí)、每4小時(shí)、每6小時(shí)、每8小時(shí)、每12小時(shí)、沒(méi)24小時(shí)、每48小 時(shí)或每72小時(shí)或每周、每2周、每4周或每個(gè)月、每2個(gè)月、每4個(gè)月等。在此使用的術(shù) 語(yǔ)"大大高于最佳劑量范圍"是指，例如高于最佳劑量約1%-50%、約5%-50%、約10%-50%、約20% - 50%、約30% - 50%或約40% - 50%。
NELL肽的抑制劑的劑量按照抑制劑的類(lèi)型、要治療、預(yù)防或改善的骨或軟骨的狀況以 及接受含該抑制劑的組合物的哺乳動(dòng)物對(duì)象的年齡、地點(diǎn)和性別而改變。 一般，NELL肽的 抑制劑的劑量處在，例如但不限于0.001 pg/mm2 - 1 pg/mm2，或優(yōu)選0.001 ng/mm2 -1 ng/mm2， 或更優(yōu)選0.001嗎/mm2 - lng/mm2，或更優(yōu)選0.001 mg/mm2 - 1 mg/mm2，或更優(yōu)選0.001 g/mm2 -1§/1111112的范圍，用或不用特定的載體或支架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NELL肽的抑制劑的 劑量一般在0.001 pg/ml -1 pg/ml，或更優(yōu)選0.001 ng/ml -1 ng/ml，或更優(yōu)選0.001嗎/ml -l嗎/ml，或更優(yōu)選0.001 mg/ml - 1 mg/ml，或更優(yōu)選0.001 g/ml - 100 g/ml的范圍，用或不用特 定的載體或支架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NELL肽抑制劑的劑量一般在0.001 pg/kg-1 pg/kg， 或更優(yōu)選0.001 ng/kg - 1 ng/kg，或更優(yōu)選0.001昭/kg - 1[ig/kg，或更優(yōu)選0.001 mg/kg -1 mg/kg，或更優(yōu)選0.001 gm/kg -1 gm/kg，或更優(yōu)選0.001 kg/kg -1 kg/kg的范圍，用或不用特 定的載體或支架。而且，要理解，所有的劑量都可以是連續(xù)給于的劑量，或分為每一定時(shí)間 段給予的劑量。時(shí)間段的例子包括但不限于每1小時(shí)、每2小時(shí)、每4小時(shí)、每6小時(shí)、每 8小時(shí)、每12小時(shí)、每24小時(shí)、每48小時(shí)或每72小時(shí)或每周、每2周、每4周、或每個(gè) 月、每2個(gè)月、每4個(gè)月等。
NELL肽受體的調(diào)節(jié)劑的劑量按照以下因素而變化抑制劑的類(lèi)型、受體的類(lèi)型、要治
療、預(yù)防、或改善的骨或軟骨的狀況以及接受含有NELL肽的受體的調(diào)節(jié)劑的組合物的哺乳
動(dòng)物的年齡、地域和性另1J。一般，NELL肽的受體的調(diào)節(jié)劑的劑量處在，但不限于，0.001 pg/mm2
-1 pg/mm2，或更優(yōu)選0.001 ng/mm2 - 1 ng/mm2，或更優(yōu)選0.001嗎/mm2 - l嗎/mm2，或更優(yōu)選
0.001 mg/mm2 -1 mg/mm2，或更優(yōu)選0.001 g/mm2 -1 g/mm2的范圍，用或不用特定的載體或
支架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NELL肽的受體的調(diào)節(jié)劑的劑量一般在0.001 pg/ml -1 pg/ml，
或更優(yōu)選0.001 ng/ml - 1 ng/ml ，或更優(yōu)選0.001 pg/ml - lpg/ml，或更優(yōu)選0.001 mg/ml - 1
mg/ml，或更優(yōu)選0.001 g/ml-100 g/ml，的范圍，用或不用特定的載體或支架。在另一個(gè)實(shí)施
方案中，NELL肽的受體的調(diào)節(jié)劑的劑量一般在0.001 pg/kg-lpg/kg，或更優(yōu)選0.001 ng/kg國(guó)
1 ng/kg，或更優(yōu)選0.001 ng/kg - 1(xg/kg，或更優(yōu)選0.001 mg/kg -1 mg/kg，或更優(yōu)選0.001 gm/kg
-lgm/kg，或更優(yōu)選0.001 kg/kg-1 kg/kg的范圍，用或不用特定的載體或支架。而且，應(yīng)該
理解，所有的劑量都可以是連續(xù)給予的劑量，或分為每一定時(shí)間段給予的劑量。時(shí)間段的例
子包括但不限于每l小時(shí)、每2小時(shí)、每4小時(shí)、每6小時(shí)、每8小時(shí)、每12小時(shí)、每24
小時(shí)、每48小時(shí)或每72小時(shí)或每周、每2周、每4周或每個(gè)月、每2個(gè)月、每4個(gè)月等。2)骨移植物材料
骨創(chuàng)傷，如同其它許多創(chuàng)傷一樣，都會(huì)引起生物活性劑的釋放，這些活性劑對(duì)于傷口的 愈合過(guò)程是十分關(guān)鍵的。天然存在于骨中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)—旦從傷口釋放，就會(huì)刺激 骨誘導(dǎo)并再生失去的或受傷的骨組織。同樣的這些蛋白質(zhì)以其純化的形式，能被用來(lái)刺激骨 生長(zhǎng)進(jìn)入可生物降解的基質(zhì)，使人們能夠在正常的骨骼邊界之內(nèi)或以外實(shí)現(xiàn)骨的人工制造。 不受某一特定理論的束縛，人們相信，按照與使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白類(lèi)似的方式，NELL-1蛋白 可用來(lái)刺激骨的再礦化。
如上所述，NELL-1蛋白可用于全身給藥。此外，或者用另一個(gè)方式，NELL-1蛋白可直 接施用在骨或骨折的部位。這可在外科手術(shù)時(shí)(例如，在固定復(fù)雜的骨折時(shí)，在進(jìn)行骨重建時(shí)， 在實(shí)行骨移植時(shí)等)或通過(guò)直接注射來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，特別是在外科手術(shù)進(jìn)行骨重建或修復(fù)時(shí)，希望用緩釋"載體" 給予NELL-1蛋白。緩釋載體包括但不限于可生物降解的輸送載體。優(yōu)選的可生物降解的輸 送載體優(yōu)選是多孔的。
人們已在開(kāi)發(fā)可生物降解的多孔輸送載體以便控制物質(zhì)的釋放同時(shí)也為細(xì)胞的附著和 引導(dǎo)組織再生提供場(chǎng)所方面做了大量工作?？缮锝到獾牟牧贤ǔ７譃槎?lèi)1)親水的；和 2)疏水的。親水材料(去礦化的冷凍干燥的骨、陶瓷、纖維蛋白、明膠等)對(duì)水有高親和性， 它們使水性的NELL-1蛋白溶液容易結(jié)合在材料的內(nèi)部孔隙中。疏水材料(L-聚乳酸、D,L-聚 乳酸、聚羥基乙酸等)，雖然在孔隙度、外部尺寸、形狀和機(jī)械特性等在范圍上有無(wú)限的潛在 能力，但卻難以用水性溶液"浸潤(rùn)"。為了增加溶液向該材料的內(nèi)表面的沉積，疏水材料經(jīng) 常用蛋白質(zhì)浸漬，或者用表面活性劑來(lái)幫蛋白質(zhì)(如NELL-1)的浸漬。
關(guān)于包含諸如纖維蛋白原、聚乳酸(PLA)、乳酸共聚物、聚羥基酸(如聚(3-羥基丁酸)、 多孔陶瓷、明膠、瓊脂等材料的各種可生物降解的輸送材料的詳細(xì)敘述參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利 5,736,160、 4,181,983、 4,186,448、 3,902,497、 4,442,655、 4,563,489、 4,596,574、 4,609,551、 4，620，327和5,041,138，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此。
在一些實(shí)施方案中，輸送載體可以與上述的載體相同。
其他輸送載體包括但不限于骨移植物材料。骨移植物材料可從天然材料(如移植的骨或骨 片段)、合成材料(如各種聚合物和/或陶瓷)或二者的組合物產(chǎn)生。骨移植物材料通常用來(lái)填充 空隙或替代失去的骨材料。這樣的移植物材料被用作假體裝置(如骨置換或支撐)的組分以幫 助假體與活骨的緊密結(jié)合/磨練。
使用生物活性玻璃和磷酸鈣、膠原、其混合物等的骨移植片具有良好的生物相容性并在 一些情況下會(huì)導(dǎo)致骨組織形成和結(jié)合。為了恢復(fù)健康的目的，已經(jīng)使用許多不同的玻璃、玻 璃-陶瓷和晶相材料，單獨(dú)使用或與可聚合的丙烯酸品種，以及其它聚合物家族聯(lián)合使用。這 包括羥基磷灰石、氟磷灰石、氧磷灰石、鈣硅石、鈣長(zhǎng)石、氟化鈣、氟硅鈣鈉石、鈉硅灰石、 硅堿鈣石、金云母、三斜磷鈣石、鈣磷石、磷酸八鈣(octocalciumphosphate)、白磷鈣石、 磷酸四鈣、堇青石以及柏林石。敘述這些應(yīng)用的代表性專(zhuān)利包括美國(guó)專(zhuān)利3,981,736、4,652，534、4,643,982、 4,775,646、 5,236,458、 2,920,971、 5,336,642禾B 2，920,971 。其它參考文獻(xiàn)包括日本 專(zhuān)利87-010939和德國(guó)專(zhuān)利OS 2,208,236。其它參考文獻(xiàn)可參見(jiàn)W. F. Brown, "Solubilities of Phosphate & Other Sparingly Soluble Compounds,"("磷酸鹽和其它微溶性化合物的溶解性") Environmental Phosphorous Handbook, Ch. 10 (1973)。除上述的以外， 一些動(dòng)物來(lái)源的材料， 包括珊瑚和珍珠母，也可為了恢復(fù)健康的目的用于生物材料。
骨移植物可包含約0.001%-10%之間的NELL-1肽或相關(guān)的試劑。在一些實(shí)施方案中， 骨移植片可包含上述劑量的NELL-1 。
其它骨移植物材料包括用以下物質(zhì)增強(qiáng)的柔軟可塑的丙烯酸基骨結(jié)合劑15 -75重量％ 的生物活性玻璃以及1-10重量％的玻璃礦物纖維(美國(guó)專(zhuān)利4,239,113)、骨填料(土磷酸三鐘 和生物陶瓷A2慘合在雙酚-A-甲基丙烯酸二縮水甘油酯(bisGMA)中，通過(guò)過(guò)氧化物體系(如 過(guò)氧化苯甲酰)與胺的作用而聚合)(Vuillemin et al. (1987) Arch. Otolygol. Head Neck Surg. 113:836-840)。兩個(gè)組分，含有水楊酸酯和丙烯酸酯的樹(shù)脂復(fù)合材料，通過(guò)氫氧化鈣粘固反 應(yīng)而固化，已在美國(guó)專(zhuān)利4,886,843中描述，而美國(guó)專(zhuān)利5,145,520和5,238,491則公開(kāi)了填 料和粘固劑。上述材料可被加工以便結(jié)合NELL-1蛋白。
此外，包含骨形態(tài)發(fā)生蛋白的移植物材料是公知的。因此，例如美國(guó)專(zhuān)利4,394,370敘 述了適合用于骨缺陷體內(nèi)移植的由再造的膠原和去礦化骨粒子構(gòu)成的復(fù)合物或由再造的膠原 和在海綿中制備的溶解骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成的復(fù)合物。類(lèi)似的，美國(guó)專(zhuān)利5,824,084敘述了 用生物相容性的可移植材料(優(yōu)選材料具有帶電荷的表面)制備的基材。生物相容性的可移 植材料的例子包括含有磷酸鈣的合成陶瓷、 一些聚合物、去礦化的骨基質(zhì)或礦化的骨基質(zhì)。 這些材料可另含結(jié)合在該基材表面上的細(xì)胞粘附分子。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞粘附分子"是統(tǒng)指層粘連 蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、血管細(xì)胞粘合分子(V-CAM)和細(xì)胞間粘附分子(I-CAM)以及膠原 蛋白。特別適合的移植材料包括，例如分離的礦化海綿骨節(jié)段、礦化骨的粉末或顆粒、去礦 化的海綿骨節(jié)段、去礦化骨的粉末或顆粒、鹽酸胍提取的去礦化骨基質(zhì)、燒結(jié)的致密骨或海 綿骨、珊瑚羥磷灰石(由Interpore以商品名Interpore 500銷(xiāo)售)以及顆粒狀陶瓷(如由Zimmer 出售的，摻合到骨移植片替代品Collagraft中的那種)、或絲狀海綿(如由礦化骨的粉末或顆 粒、Orquest用膠原蛋白制備的那些)。NELL-1蛋白可結(jié)合到這些移植物材料的任何一種或 用骨形態(tài)發(fā)生蛋白替代。
VII.試劑盒
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供試劑盒，用于進(jìn)行分析化驗(yàn)或使用上述的組合物。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)容器，容器中含有抗體和/或核酸探針和/ 或適合用于檢測(cè)NELL-1基因表達(dá)和/或活性水平的底物。試劑盒可任選包括任何試劑和/或儀 器以方便所述分析化驗(yàn)的進(jìn)行。這樣的試劑包括但不限于緩沖劑、標(biāo)記物、標(biāo)記的抗體、標(biāo) 記的核酸、用于使熒光標(biāo)記可視化的濾光片套件、印跡膜等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可包含含有NELL-1蛋白、上述的相關(guān)試劑、或編碼
NELL-1蛋白的載體和/或包含編碼NELL-1蛋白的載體的細(xì)胞的容器。此外，試劑盒可包括說(shuō)明性資料，它包含實(shí)行本發(fā)明分析化驗(yàn)方法的指南(即方案)或本 發(fā)明組合物的給藥方法，同時(shí)還附有禁忌征候(counter indications)。雖然說(shuō)明性資料通常包 含書(shū)寫(xiě)的或印刷的資料，但它們并不限于這些。任何能儲(chǔ)存這種說(shuō)明并將它們傳達(dá)給終端使 用者的媒介都在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。這樣的媒介包括但不限于電子儲(chǔ)存媒介(如磁盤(pán)、磁 帶、磁帶盒、芯片)、光學(xué)媒介(如CDROM)等。這種媒介可包括提供這些說(shuō)明性資料的互聯(lián) 網(wǎng)地址。
3) NELL-1用于骨質(zhì)疏松癥
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明NELL-1蛋白可用來(lái)治療、預(yù)防或改善骨質(zhì)疏松癥。在該實(shí) 施方案中，可將NELL-1蛋白給藥到骨質(zhì)疏松的部位。接著，可將物理力(如震動(dòng)或超聲) 施用到給藥的部位以使NELL-1肽分散開(kāi)來(lái)。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)如下動(dòng)作將NELL-1 肽給藥到骨質(zhì)疏松部位(a)在組織(骨)中制造一個(gè)切口， (b)通過(guò)該切口將NELL-1肽輸 送到該組織中。在一些實(shí)施方案中，可將Nell-l肽包含在藥學(xué)上可接受的載體中以達(dá)到緩釋 的目的。
4) NELL-1用于軟骨再生
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明NELL-1蛋白可用來(lái)治療、預(yù)防或改善軟骨退化。在一個(gè)實(shí) 施方案中，可將NELL-1肽給藥到纖維軟骨疾病(如脊椎盤(pán)疾病)部位，用或不用藥學(xué)上可 接受的載體，用或不用其它裝置(如盤(pán)核替換裝置、異體移植裝置、細(xì)胞)或生物因子(如 LIM-I蛋白)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將NELL-1肽給藥到纖維軟骨疾病部位(如半月板)， 用或不用藥學(xué)上可接受的載體，用或不用其它裝置(如半月板異體移植片、或半月板支架或假 體或細(xì)胞)或生物因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將NELL-1肽給藥到透明軟骨疾病的部位 (如膝關(guān)節(jié)軟骨)，用或不用藥學(xué)上可接受的載體，用或不用其它裝置(如軟骨異體移植片或 軟骨支架或假體)或生物因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將NELL-1肽給藥到透明軟骨疾病(如 氣管軟化癥)部位(如氣管軟骨)，用或不用藥學(xué)上可接受的載體，用或不用其它裝置(如軟骨 異體移植片或軟骨支架或假體)或生物因子。
在其他實(shí)施方案中，可將NELL-1肽給藥到彈性軟骨疾病部位(如耳或喉頭蓋)，用或 不用藥學(xué)上可接受的載體，用或不用其它裝置(如細(xì)胞)或生物因子。
組合物的給藥方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明組合物可配制為適合于向哺乳動(dòng)物對(duì)象(如人類(lèi))以任何合適的給藥/輸送方式給 藥的制劑。普通的技術(shù)人員按照上述教導(dǎo)，用合適的載體與合適量的NELL肽或以上定義的 相關(guān)試物，就可將本發(fā)明組合物配制為任何所需的制劑。
輸送該組合物的一些例子包括，如通過(guò)完整皮膚向各種部位的經(jīng)皮注射、或通過(guò)非完整 皮膚(外科切開(kāi)的部位或外傷部位)直接注射。在一些實(shí)施方案中，輸送可以是本發(fā)明組合 物的外科植入。在一些實(shí)施方案中，輸送可以是以下的一種血管外輸送，注射或基于導(dǎo)管
24的注射；血管內(nèi)輸送，注射或基于導(dǎo)管的注射；靜脈內(nèi)輸送，注射或基于導(dǎo)管的注射；動(dòng)脈 內(nèi)輸送，注射或基于導(dǎo)管的注射；鞘內(nèi)輸送，注射或基于導(dǎo)管的注射；骨內(nèi)輸送，注射或基 于導(dǎo)管的注射；軟骨內(nèi)輸送，注射或基于導(dǎo)管的注射；或膀胱內(nèi)輸送，注射或基于導(dǎo)管的注 射。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物向哺乳動(dòng)物對(duì)象的輸送可以是通過(guò)帶有經(jīng)皮的或可植
入導(dǎo)管的機(jī)械泵的輸送。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物向哺乳動(dòng)物對(duì)象的輸送可以是向身體的任何區(qū)域/器官 的基于導(dǎo)管的輸送。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物向哺乳動(dòng)物對(duì)象的輸送可以是通過(guò)各種促進(jìn)提高組織 滲透或更廣的組織分散的裝置(如超聲、離子電泳、加熱、加壓，等等)經(jīng)由擴(kuò)大分散途徑 的輸送。
實(shí)施例
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明而非對(duì)其進(jìn)行限定。 實(shí)施例1. NELL-1增強(qiáng)胎兒顱蓋造骨細(xì)胞的礦化
在此敘述的NELL-1基因的全長(zhǎng)度cDNA的核苷酸序列與小雞Nel基因有大約61%的 同源性，因此，被命名為人NELL-l(Watanabe et al. (1996) Genomics. 38(3)， 273-276)。 NELL-1 蛋白含一信號(hào)肽、一NH2-末端的血小板反應(yīng)蛋白(TSP)-樣的模塊(Francois and Bier (1995) Cell. 80(1): 19-20),、 5個(gè)von Wiilebrand因子(VWF) C結(jié)構(gòu)域和6個(gè)EGF-樣的結(jié)構(gòu)域。
人類(lèi)NELL-1基因表達(dá)基本上位于沿旁縫間骨(parasutural bone)邊沿的間質(zhì)細(xì)胞和造骨 細(xì)胞的成骨前沿，并在新形成的骨的間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。人類(lèi)多器官組織mRNA印跡顯示，人類(lèi) NELL-1基因特定地在胎兒大腦中表達(dá)，而不在胎兒肺、腎或肝內(nèi)表達(dá)。我們還證明，NELL-1 基因在大鼠顱蓋骨祖細(xì)胞表達(dá)，但在大鼠脛骨、基質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中多半不存在。 我們的數(shù)據(jù)提示，NELL-1基因在頭蓋膜內(nèi)骨和神經(jīng)組織(神經(jīng)嵴源的)中優(yōu)先表達(dá)。.
圖IA說(shuō)明NELL-1在E-14大鼠顱蓋原代細(xì)胞培養(yǎng)物用腺病毒的超表達(dá)，以(3-半乳糖苷 酶作為對(duì)照。圖IB顯示了分別用NELL-1和(3-半乳糖苷酶處理后，礦化作用作為時(shí)間函數(shù)的 曲線(xiàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。進(jìn)行了 Student's T試驗(yàn)。用NELL-1的礦化作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于 用P-半乳糖苷酶對(duì)照組的礦化作用，*P<0.001。
A)材料和方法
從胎兒妊娠第7、 11、 14、 17天進(jìn)行全小鼠胚胎RNA分析。構(gòu)建攜帶NELL-1 cDNA的 腺病毒(AD5，帶有El-A基因敲除和MCV啟動(dòng)子)并感染入大鼠胎兒顱蓋骨原代細(xì)胞培養(yǎng)物 和MC3T3細(xì)胞株。病毒按照以下方案構(gòu)建用各10mg的pJM17 (含有缺陷的腺病毒基因 組)和pAC-CMV-基的質(zhì)粒(含有義的大鼠NELL-1和用CaP04的反義大鼠NELL-l)共轉(zhuǎn) 染293細(xì)胞，產(chǎn)生在10-14天表達(dá)大鼠NELL-1的重組腺病毒載體。將病毒進(jìn)行噬斑純化并 進(jìn)行DNA印跡(Southernblot)以確保NELL-1基因的結(jié)合。含(3-半乳糖苷酶基因的腺病毒用作對(duì)照組并考察其與不同類(lèi)型細(xì)胞的感染的效力。在MC3T3和NIH3T3細(xì)胞中觀察到大 約80-卯％的感染效力。
感染后14、 17、 21天進(jìn)行VonKossa染色。用ImagePro系統(tǒng)定量礦化作用的面積。用 雙尾的(two-tailed) Student's t試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*p<0.01的統(tǒng)計(jì)學(xué)P值被認(rèn)為是有意 義的。從超表達(dá)NELL-1的細(xì)胞提取RNA并進(jìn)行小鼠cDNA陣列分析。用磷光影像分析儀 定量雜交信號(hào)。
B) 結(jié)果
從妊娠的第14天起，NELL-lmRNA微弱表達(dá)，并在整個(gè)妊娠期間稍有增加。妊娠的 第14天是胎兒顱蓋骨開(kāi)始礦化的時(shí)間點(diǎn)。超表達(dá)NELL-1的原代大鼠胎兒顱蓋骨細(xì)胞培養(yǎng)物 和MC3T3細(xì)胞培養(yǎng)物都顯示了超過(guò)P-半乳糖苷酶對(duì)照組的礦化作用。在感染后的第17天， 與對(duì)照組比較，NELL-1的超表達(dá)使顱蓋骨的成骨原代細(xì)胞培養(yǎng)物的礦化作用提高了大約30 倍。這些結(jié)果是基于VonKossa染色并用ImagePro軟件定量的。該相對(duì)增高在感染后第21 天降低為2倍。從NELL-l感染的MC3T3細(xì)胞得到的小鼠cDNA陣列結(jié)果顯示，與對(duì)照組 比較，BMP-7基因表達(dá)下調(diào)了 20%，裂手(SplitHand)和裂腳(SplitFoot)基因上調(diào)了 3 倍。這2個(gè)基因都與骨形成和顱骨面發(fā)育密切相關(guān)。
C) 討論和結(jié)論
在這個(gè)研究中，我們清楚地證實(shí)了， NELL-1是與骨形成緊密聯(lián)系的，它增強(qiáng)顱蓋造骨 樣細(xì)胞的礦化作用。 一些已鑒別的下游效應(yīng)物清楚地在骨形成和胚胎發(fā)育中起重要的作用。 如在CS中見(jiàn)到的，過(guò)早的頭蓋縫閉合可能是由于頭蓋骨的過(guò)度產(chǎn)生，因此，可能與NELL-1 分子的超表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果和NELL-1的蛋白質(zhì)功能分析的初步結(jié)果將該蛋白質(zhì)歸類(lèi)為生 物學(xué)相關(guān)分子。作為NELL-1可能的一個(gè)角色，這些蛋白質(zhì)可作為一種調(diào)節(jié)劑，通過(guò)與其他 生長(zhǎng)因子相互作用而起作用。最近，TSP-1已顯示是TGF (3-1的主要活化劑(Francois and Bier (1995) Cell. 80(1): 19-20)。 TGF (3-1以形式由大多數(shù)細(xì)胞分泌，該無(wú)活性形式不能與細(xì)胞受體 相互作用。TGF(3-1的活性最初被它與其稱(chēng)為潛伏相關(guān)蛋白(LAP)的NH2-末端前肽二聚體的 非共價(jià)鍵締合而受到掩蔽。在細(xì)胞外TGF(3-1活化中，TSP-1與LAP的NH2-末端區(qū)相互作用， 形成三分子復(fù)合物。在該復(fù)合物內(nèi)，發(fā)生了構(gòu)象改變，這導(dǎo)致TGF(H能夠進(jìn)入受體。像腱 蛋白這樣具有高度同源性的分子(它有4個(gè)VWFC結(jié)構(gòu)域(可能是同源三聚體))可在原腸胚 形成過(guò)程中被分泌，并在爪蟾(Xenopus)背腹圖案形成中起關(guān)鍵作用(Crawford et al. (1998) Cell. 93(7): 1159-1170)。近來(lái)，已揭示腱蛋白直接與腹部BMP-4(骨形態(tài)發(fā)生蛋白4， TGF卩超 級(jí)家族的一個(gè)成員)結(jié)合并中和BMP-4的活性(Piccolo et al. (1996) Cell, 86(4):589- 598)。這 些結(jié)果提示，NELL-1蛋白通過(guò)與某些TGFP超級(jí)家族成員的相互作用可在細(xì)胞外行使其未經(jīng) 確認(rèn)的功能。由于已知TGFP-l是骨發(fā)生的一個(gè)調(diào)節(jié)劑，NELL-1蛋白在增強(qiáng)礦化作用中的作 用可以與TGFf3超級(jí)家族相聯(lián)系。
應(yīng)該理解，本發(fā)明實(shí)施方案與實(shí)施例只是為了說(shuō)明的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到它 的各種修改和改變且這些改進(jìn)和變化包括在本申請(qǐng)的精神和范圍以及所附權(quán)利要求書(shū)的范圍
中。所有在此引用的出版物、專(zhuān)利、和專(zhuān)利申請(qǐng)書(shū)都通過(guò)引用其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此。
權(quán)利要求
1、一種增加骨礦化作用的方法，所述方法包含增加成骨細(xì)胞中NELL-1基因產(chǎn)物的濃度。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述NELL-1基因產(chǎn)物是NELL-1蛋白、與NELL-1 相關(guān)的試劑或它們的組合。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述成骨細(xì)胞選自成熟的造骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞、 間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胎兒胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、硬腦膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成軟 骨細(xì)胞。
4、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述與NELL-1相關(guān)的試劑是物理修飾的NELL-1肽。
5、 如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述與NELL-1相關(guān)的試劑是化學(xué)修飾的 NELL-1肽。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是PEG化的NELL-1肽 或包含至少一個(gè)短鏈烴基的NELL-1肽。
7、 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是NELL-1肽模擬物。
8、 一種促進(jìn)骨折修復(fù)的方法，所述方法包含在骨折部位或接近骨折的部位增加NELL-1 基因產(chǎn)物的濃度。
9、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中增加NELL-1基因產(chǎn)物的濃度包含用表達(dá)NELL-1蛋 白或與NELL-1相關(guān)的試劑的載體轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞。
10、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述NELL-1基因產(chǎn)物是NELL-1蛋白、與NELL-1 相關(guān)的試劑或它們的組合。
11、 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述成骨細(xì)胞選自成熟的造骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞、 間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胎兒胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、硬腦膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成軟 骨細(xì)胞。
12、 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述NELL-1相關(guān)的試劑是物理修飾的NELL-1肽。
13、 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述NELL-1相關(guān)的試劑是化學(xué)修飾的NELL-1肽。.
14、 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是PEG化的NELL-1 肽或包含至少一個(gè)短鏈烴基的NELL-1肽。
15、 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是NELL-1肽模擬物。
16、 一種促進(jìn)骨折修復(fù)的方法，所述方法包含將包含NELL-1蛋白或與NELL-1相關(guān)的 試劑的組合物給藥到骨折的部位。
17、 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。
18、 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包含膠原蛋白。
19、 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述與NELL-1相關(guān)的試劑是物理修飾的NELL-1肽。
20、 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述與NELL-1相關(guān)的試劑是化學(xué)修飾的NELL-1肽。
21、 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是PEG化的NELL-1 肽或包含至少一個(gè)短鏈烴基的NELL-1肽。
22、 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是NELL-1模擬物。
23、 一種能夠增強(qiáng)動(dòng)物骨組織形成的骨移植物，所述骨移植物包含可生物相容的基質(zhì)和 NELL-1蛋白或與NELL-1相關(guān)的試劑。
24、 如權(quán)利要求23所述的骨移植物，其中所述可生物相容的基質(zhì)是可再吸收的。
25、 如權(quán)利要求23所述的骨移植物，其中所述可生物相容的基質(zhì)包含可生物降解的聚 合物。
26、 如權(quán)利要求23所述的骨移植物，其中所述可生物相容的基質(zhì)包含膠原蛋白。
27、 如權(quán)利要求23所述的骨移植物，其中所述NELL-1蛋白或與NELL-1相關(guān)的試劑是 山在基質(zhì)中的表達(dá)NELL-1蛋白或NELL-1藥劑的細(xì)胞產(chǎn)生的，所述細(xì)胞是外源性的。
28、 如權(quán)利要求23所述的骨移植物，其中所述與NELL-1相關(guān)的試劑是物理修飾的 NEIX-1肽。
29、 如權(quán)利要求23所述的骨移植物，其中所述與NELL-1相關(guān)的試劑是化學(xué)修飾的 NEIX-1肽。
30、 如權(quán)利要求29所述的骨移植物，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是PEG化的NELL-1 肽或包含至少一個(gè)短鏈烴基的NELL-1肽。
31 、如權(quán)利要求29所述的骨移植物，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是NELL-1模擬物。
32、 一種能誘導(dǎo)動(dòng)物骨組織形成的骨移植物，包含膠原蛋白綴合物，所述組合物含有約 99.999 - 0.001重量％膠原蛋白和約0.001 - 99.999重量。/oNELL-l蛋白、與NELL-1相關(guān)藥劑或 它們的組合。
33、 如權(quán)利要求32所述的骨移植物，還包含可生物降解的聚合物。
34、 如權(quán)利要求32所述的骨移植物，其中所述與NELL-1相關(guān)的試劑是物理修飾的 NELL-1肽。
35、 如權(quán)利要求32所述的骨移植物，其中所述與NELL-1相關(guān)的試劑是化學(xué)修飾的 NE1X-1月太。
36、 如權(quán)利要求35所述的骨移植物，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是PEG化的NELL-1 肽或包含至少一個(gè)短鏈烴基的NELL-1肽。
37、 如權(quán)利要求35所述的骨移植物，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是NELL-1模擬物。
38、 一種藥物組合物，包含NELL-1肽、與NELL相關(guān)的試劑或它們的組合。
39、 如權(quán)利要求38所述的藥物組合物，還包含藥學(xué)上可接受的載體。
40、 如權(quán)利要求39所述的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體是用于選自以下輸送模式的載體口服給藥、外用表面給藥、原位植入、靜脈內(nèi)給藥、腸胃外給藥、局部給藥、動(dòng)脈內(nèi)注射、注射到骨折部位內(nèi)以及在可生物降解的基質(zhì)內(nèi)輸送。
41、 如權(quán)利要求38所述的藥物組合物，其中所述與NELL相關(guān)的試劑是物理修飾的 NELL-1肽。
42、 如權(quán)利要求38所述的藥物組合物，其中所述與NELL相關(guān)的試劑是化學(xué)修飾的 NEIX-1肽。
43、 如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是PEG化的 NELL-1肽或包含至少一個(gè)短鏈烴基的NELL-1肽。
44、 如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其中所述化學(xué)修飾的NELL-1肽是NELL-1模擬物。
45、 如權(quán)利要求38所述的藥物組合物，所述組合物被配制為適合用于選自以下輸送模 式的制劑通過(guò)完整皮膚經(jīng)皮注射到部位、通過(guò)外科切開(kāi)的部位或外傷部位直接注射、外科 手術(shù)植入、血管外輸送、血管外注射、血管外基于導(dǎo)管的注射、血管內(nèi)輸送、血管內(nèi)注射、 血管內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、靜脈內(nèi)輸送、靜脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、動(dòng)脈內(nèi)輸送、 動(dòng)脈內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、鞘內(nèi)輸送、鞘內(nèi)注射、鞘內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、骨內(nèi)輸 送、骨內(nèi)注射、骨內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、軟骨內(nèi)輸送、軟骨內(nèi)注射、軟骨內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、 膀胱內(nèi)輸送、膀胱內(nèi)注射、膀胱內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、通過(guò)帶有經(jīng)皮的或可植入導(dǎo)管的機(jī)械泵 的輸送、基于導(dǎo)管的向身體的一個(gè)區(qū)域或器官的輸送、或者用能增加組織滲透或擴(kuò)大組織分 布的裝置通過(guò)擴(kuò)大的分散的輸送。
46、 如權(quán)利要求45所述的組合物，其中所述的裝置提供超聲、離子電泳、加熱或加壓。.
47、 一種治療、預(yù)防或改善骨質(zhì)疏松的方法，所述方法是通過(guò)在預(yù)選部位向骨組織給予 有效量的NELL-1肽。
48、 如權(quán)利要求47所述的方法，還包含向預(yù)選部位施加物理力，以分散該NELL-1肽。
49、 如權(quán)利要求48所述的方法，其中給藥的步驟包括 在預(yù)選部位的骨組織中制造一個(gè)切口，及 通過(guò)該切口向預(yù)選部位的骨組織輸送。
50、 如權(quán)利要求48所述的方法，其中物理力是超聲。
51、 如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述NELL-1肽被配制為適合用于選自以下輸送模 式的制劑通過(guò)完整皮膚經(jīng)皮注射到部位、通過(guò)外科切開(kāi)的部位或外傷部位直接注射、外科 手術(shù)植入、血管外輸送、血管外注射、血管外基于導(dǎo)管的注射、血管內(nèi)輸送、血管內(nèi)注射、 血管內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、靜脈內(nèi)輸送、靜脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、動(dòng)脈內(nèi)輸送、 動(dòng)脈內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、鞘內(nèi)輸送、鞘內(nèi)注射、鞘內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、骨內(nèi)輸 送、骨內(nèi)注射、骨內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、軟骨內(nèi)輸送、軟骨內(nèi)注射、軟骨內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、 膀胱內(nèi)輸送、膀胱內(nèi)注射、膀胱內(nèi)基于導(dǎo)管的注射、通過(guò)帶有經(jīng)皮的或可植入導(dǎo)管的機(jī)械泵 的輸送、基于導(dǎo)管的向身體的一個(gè)區(qū)域或器官的輸送、或者用能增加組織滲透或擴(kuò)大組織分 布的裝置通過(guò)擴(kuò)大的分散的輸送。
52、 如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述的裝置提供超聲、離子電泳、加熱或加壓。
全文摘要
本發(fā)明提供用于骨修復(fù)或骨再生的增強(qiáng)骨礦化作用的方法，以及用于此目的的組合物和移植物。本發(fā)明還提供篩選能提高或調(diào)節(jié)細(xì)胞中的NELL-1基因表達(dá)或NELL-1蛋白產(chǎn)生的試劑的方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101678067SQ200880014123
公開(kāi)日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2008年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日
發(fā)明者康·汀 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)校務(wù)委員會(huì)