專利名稱：用于熒光檢測的容器與方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有集成的聚光光學裝置的反應容器，該反應容器能夠用于檢測與表 面結合的熒光分子。在生物分析中，基于固相的實驗起到核心作用，在所述實驗中，要檢測 的物質通過所述表面上固定的受體從溶液中不斷聚集。通過在所述表面上的基于親和力 (affinitaetsbasierte)的反應，生物物質即使在混合物中也能夠被非常有選擇性地檢測 出。典型的受體是抗體和DNA分子。特別恰當?shù)睦邮峭ㄟ^具有高親和力的抗體來檢測抗 原。通常，使用所謂的三文治測試(Sandwichtest)進行基于熒光的檢測，其中，捕獲抗體 (fangantikorper )、受體將待檢測的抗原結合到表面上。經(jīng)熒光標記的第二抗體也與抗原 結合，并且使得能夠進行對復合體的靈敏的檢測?？贵w濃度可以通過所結合的熒光標記的 強度測量來量化。因為可達到的靈敏度高，所以熒光檢測在生物技術中是最重要的檢測技 術之一。
背景技術：
對少量生物物質的量化在靈敏度、安全性以及成本方面對檢測技術的要求很高。 生物標記例如是與癌癥或心血管病癥結合出現(xiàn)的，對于生物標記的檢測追求越來越低的檢 測限制。對于醫(yī)學應用，分析的穩(wěn)固性和可復制性具有重要意義。此外，此類測試的數(shù)量持 續(xù)增加，要求測量涉及盡可能少的材料和時間。對于靈敏的測量方法的有效性，信噪比具有 核心意義。這對于熒光測量特別如此，在熒光測量中，熒光強度與噪聲的比例的技術改進降 低了檢測限制和/或節(jié)省了材料和時間。在通過熒光法進行的結合實驗檢測中，通過使得 來自與表面結合分子的熒光收集最大化，同時使所有干擾(噪聲)源的光收集最小化，可實 現(xiàn)信噪比的優(yōu)化。結合反應通常在水溶液與由玻璃或塑料材料制成的透明測量基底之間的界面處 進行，其中，透明測量基底被受體分子覆蓋。實驗溶液中自由擴散的分子的熒光信號是重要 的干擾源，自由擴散的分子的熒光信號能夠疊加在與表面結合的分子的熒光信號上，從而 增加了確定濃度的難度。這可以通過清洗步驟來避免，但是這會涉及時間和成本。對于使 得能夠實時測量結合反應并且避免成本過高的清洗步驟，表面選擇性熒光檢測具有決定性 的優(yōu)點。在此，重要的是限定檢測容積(Detektionsvolumen)盡可能地遠離表面，以將由自 由分子引起的熒光排除在所述檢測之外。要發(fā)出熒光需要具有合適波長的光的光學激勵。激勵光引起樣本和基底中的散射 和熒光。特別地，問題是由與要檢測的熒光染料的發(fā)光在頻譜上重疊并且通過波長濾波器 無法濾除的那部分光引起的。因為該部分光的重要部分是在測量基底中生成的，所以通過 減少基底材料中的檢測容積來抑制其貢獻。這可以通過熒光信號的空間過濾來實現(xiàn)。在此， 充分利用其中的熒光與散射光以在空間上分離的方式生成的環(huán)境，因此熒光與散射光可以 通過光學系統(tǒng)分離。借助于熒光和散射光的不同的光通路，例如通過光圈可以幾何方式強 烈抑制散射光?？傊瑹晒鉁y量的檢測容積的簡單的設計目標為第一，光學系統(tǒng)在界面處的熒光檢測應盡可能高；第二，在含水試樣中以及在基底中的光收集應盡可能少。兩個電介質材料(例如在水(折射率nl 1. 33)和玻璃(n2 1. 52)之間)的 界面的緊密性對熒光出射具有顯著的影響。與均勻介質內(nèi)的熒光照射相比，表面的出射并 非各向同性，而是在全反射臨界角α。方向上具有最大值，其中α c = arcsin (nl/n2)。對于水/玻璃界面，α。 61°。與界面結合的熒光分子將大約74%的光照射進 入玻璃中。在此，光總量的34%是在臨界角α。以上實現(xiàn)的。在臨界角以上的熒光出射(超 臨界角熒光)對于結合實驗具有極為重要的意義。其專門由直接位于界面前(也就是說， 到基底的距離與發(fā)射波長相比小很多)的分子進行。因此，僅限制在臨界角以上區(qū)域內(nèi)的 熒光收集允許實現(xiàn)表面選擇性檢測。未結合的熒光染料的貢獻因此可以幾乎被完全抑制， 這例如使得對結合反應的實時測量成為可能。表面選擇性熒光測量的傳統(tǒng)方法是通過所謂的界面瞬時激勵實現(xiàn)的。在此，激 勵光在臨界角以上入射到界面上并且在測量基底內(nèi)被全內(nèi)反射。因此，在界面的樣本側 (probeseite)上形成薄的激勵層，通過該激勵層，與表面結合的分子可以選擇性地受激勵 發(fā)出熒光。但此方法在技術上成本過高并且提高了小型化的難度。Ruckstuhl和Seeger描述了一種非常有效地在臨界角以上收集熒光發(fā)射的方法 (PCT/EP099/1548)。一種由玻璃或塑料制成的光學波導，該波導具有殼體表面(邊界表 面)，該表面通過內(nèi)反射對光進行校準。使用具有拋物面形狀的殼體表面將熒光校準成平 行的光束，并且利于對信號的進一步處理。被校準的熒光能夠通過作為空間過濾器的光圈 (Lochblende)被聚焦。所述光圈降低了基底內(nèi)的檢測容積并且過濾由其中的激勵光引起 的散射光/自發(fā)熒光。因此，瞄準儀實現(xiàn)了很高的信噪比，甚至允許檢測各個分子。即使僅 在臨界角以上收集熒光，瞄準儀的收集效率也大于30%，這明顯高于普通檢測系統(tǒng)的值?；?于光纖的熒光傳感器實現(xiàn)的收集效率大約為1%?；谡凵涞膯我煌哥R可以形成高達大約 0. 6的數(shù)值孔徑(N. A.)，并且實現(xiàn)至少5%的效率。然而傳統(tǒng)透鏡或透鏡系統(tǒng)主要收集在臨 界角以下的熒光，因此不能實現(xiàn)表面選擇性熒光收集。在生物分析領域中，對于單一測試通常使用小型標準化反應器皿，例如試管或比 色皿，對于具有更高能力的測試使用微量滴定板。在微量滴定板中，在7x11cm2的表面上以 柵格形式布置多個反應器皿，即所謂的井，這默認允許進行96、384或1526個獨立測量。所 述井通常是被順序選取，因此要求在測量之間將板快速移動。通過將用于朝臨界熒光的瞄 準儀集成到微量滴定板中，與傳統(tǒng)的板相比，可以顯著改善產(chǎn)生的信號。此外，可以實現(xiàn)對 具有高吞吐量的結合反應進行實時測量。但是，為此，瞄準儀必須縮小到直徑為數(shù)毫米。瞄準儀的突出的光收集能力被限制在圍繞光軸的有限范圍內(nèi)。隨著從光軸到熒光 發(fā)射的距離的增大，光束質量和收集效率惡化。這類似于熒光顯微鏡，在熒光顯微鏡中，具 有高數(shù)值孔徑的光透鏡雖然達到了很高的收集效率和靈敏度，但限于對象空間中相對較小 的范圍內(nèi)。為了充分利用瞄準儀的性能，在瞄準儀的光軸周圍的表面上，激勵光需要被聚成 束。可使用的面積的大小以及激勵光以光軸為中心的精度取決于瞄準儀的大小。瞄準儀的 小型化導致可用面積縮小，從而提高了對精度的要求。這提高了對馬達驅動的偏移裝置的 要求和成本，導致更多的時間需求并且可能對測量的穩(wěn)定性和可復制性具有負面影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及在廉價的液體容器內(nèi)在臨界角以上的熒光收集的方法，其中，液體容 器例如為試管和由塑料制成的微量滴定板(Mikrotiterplatte)。這通過新型瞄準儀以及通 過將該單元集成在容器底部內(nèi)實現(xiàn)。特別地，改進之一是將關于激勵光的聚焦光學器件集 成在容器的底部中。通過布置在被分析物與容器底部之間在界面以下的凸表面，激勵光能 夠在瞄準儀的光軸附近被聚焦到界面上。這導致在將激勵光以瞄準儀的光軸為中心時允許 的容差顯著增大。因此，具有以下優(yōu)點在順序選取數(shù)個反應時，容器在檢測系統(tǒng)上的偏移 可以更小并且以更小的精度實現(xiàn)，但對測量靈敏度和可復制性不造成負面影響。因此，在兩 次測量之間對容器的手動或自動變換可以更快進行和/或通過更廉價的部件實現(xiàn)。
具體實施例方式

圖1示出本發(fā)明的實施例。所示瞄準儀1是液體容器的一部分。在瞄準儀的底面 上集成有凸起形狀的面2，以聚焦激勵光。特別地，凸面2以關于瞄準儀的光軸可旋轉對稱 的方式布置，并且優(yōu)選是將該軸附近的光聚焦到對面的傳感器表面3上，所述傳感器表面3 與液態(tài)被分析物接觸。關于結合實驗，傳感器表面3可以被受體分子覆蓋。以大角度發(fā)射到 波導材料中的熒光被瞄準儀的殼體表面4反射并且在底面通過光出射面5離開瞄準儀。如 果殼體表面被折射率小于1. 1的介質(例如折射率為1.0的空氣)包圍，則殼體表面的瞄 準可以基于全內(nèi)反射。但是，所述殼體表面也可以是鏡面化的金屬。殼體表面優(yōu)選是形成 為凸起的形狀，使得熒光在射出瞄準儀后關于光軸9匯成束。使用拋物面型殼體表面特別 有利，因為由此熒光可以被瞄準成為幾乎平行的光束。殼體表面4可以與光出射面5直接 鄰接，但是也可以與例如用于支撐該部件的另一表面6鄰接。通過光不透光的光圈7可以 阻止激勵光在光入射面2之外進入瞄準儀1。因此，通過選擇光圈7的外直徑，可以將熒光 收集的角度范圍限制為向上。通過不透光光圈8，可以將熒光收集的角度范圍限制為向下， 以優(yōu)選為在臨界角α。以上。但是，在沒有光圈8的情況下，例如通過適當選擇殼體表面4 的外直徑，也可以將光收集的角度范圍限制為向下。傳感器表面3區(qū)域至少在被光源激勵 的區(qū)域內(nèi)是平坦的。特別地，所述平坦區(qū)域具有大于100微米的直徑。瞄準儀的大小優(yōu)選 是適于被分析物容器的相應大小。通常直徑在2毫米到15毫米之間。如果選擇了拋物面 形殼體表面4，則其焦距優(yōu)選是在0. 4毫米至3毫米的范圍內(nèi)。拋物面形殼體表面的焦點于 是優(yōu)選是位于傳感器表面上，使得入射到殼體表面上的熒光被瞄準成大體平行的光束。凸 起的光入射面至傳感器表面的距離優(yōu)選為2毫米至20毫米。光入射面2的直徑通常小于 殼體表面4的內(nèi)直徑并且優(yōu)選是在0. 5毫米至6毫米范圍內(nèi)。對于瞄準儀的低成本量產(chǎn)， 可注塑成型的光學級塑料如PMMA、PC、PS、Zeonor或Zeonex是特別適合的。圖2示出具有被集成在容器底部內(nèi)的瞄準儀1的、用于熒光測量的分析裝置的可 能實施例。光源10發(fā)射出具有適于熒光激勵的波長的光。所述光通過光學部件11被充分 瞄準，并形成合適的光束直徑。這些部件可以包括光學透鏡、光纖、鏡以及光圈(Blende)。 所述光通過波長濾波器12在光譜上被進行濾波。激勵光沿光軸方向射入瞄準儀內(nèi)。在臨 界角以上發(fā)射的熒光以環(huán)形形式射出瞄準儀成為光束。但是，瞄準儀也從凸面2收集熒光。 在圍繞光軸的該角度范圍內(nèi)的熒光也可由未與界面3結合的分子發(fā)射。因此，對于表面選 擇性測量，從凸面2收集的熒光必須被完全阻隔。為此，反射器元件14被布置在瞄準儀下
6面，該反射器元件14將軸附近發(fā)射的熒光與超臨界熒光分離。在所示情況下，反射器元件 14將激勵光13引至瞄準儀的光軸上，同時，將凸面2所收集的熒光完全反射出檢測光束通 道。在另一實施例中，反射器元件可以被構造成反射超臨界發(fā)射的熒光，同時讓激勵光和在 軸附近收集的熒光通過。在檢測光束通道內(nèi)，設置有光學部件15，所述光學部件15將超臨 界熒光聚焦通過光圈16并且將所述熒光投射到檢測器17的感光表面上。所述光圈在此用 作空間過濾并被構建為使得瞄準儀內(nèi)的散射光和產(chǎn)生的自發(fā)熒光被基本阻隔，同時讓來自 所述表面的熒光通過。在檢測光束通道內(nèi)優(yōu)選包括波長濾波器18。在本發(fā)明的一個實施例中，凸面2具有非球面形狀。該表面的曲率可被選擇成使 得激勵光在波導材料內(nèi)被衍射限定地聚焦。如圖3所示，此非球面體的焦距可被選擇成使 得焦點位于傳感器表面3以下或以上。通過這種方式，可以在界面上產(chǎn)生具有限定直徑的 激勵盤，其優(yōu)選具有小于300微米的直徑。在本發(fā)明的一個實施例中，凸面2的直徑被選擇為小于被瞄準的激勵光束13的橫 截面(圖4)。激勵光束中在所述凸面之外入射到瞄準儀的部分被不透光的光圈7阻隔在 瞄準儀處。如果激勵光束具有均勻的強度橫截面，也就是說，在整個橫截面上具有不變的強 度，則在瞄準儀的光軸與激勵光束之間的特定橫向偏移對傳感器表面3的激勵橫截面沒有 影響。由此，在瞄準儀的表面結合的熒光能夠在不需要高精度橫向調(diào)節(jié)瞄準儀的情況下被 可復制地選取。這對于數(shù)個瞄準儀的快速順序選取是特別有利的。傳感器表面3優(yōu)選在光 軸附近的一定范圍內(nèi)被激勵，所述范圍優(yōu)選具有小于300微米的直徑。直徑為數(shù)毫米的更 小的瞄準儀當然要求激勵光束更加精確地集中到光軸上。通過將凸面2集成在容器的底部 中，即使被瞄準的激勵光束13相對于瞄準儀的光軸偏移數(shù)百微米。也能夠使入射到傳感器 表面的激勵光更加精確地集中到光軸上。在本發(fā)明的一個實施例中，凸面2的直徑大于被瞄準的激勵光束的橫截面(圖5)。 即使瞄準儀和激勵光束具有特定的橫向偏移，光也能夠以非常軸向居中地到達瞄準儀的傳 感器表面3。在本發(fā)明的一個實施例中，在容器底部中優(yōu)選是集成有由塑料或玻璃(例如顯微 鏡保護玻璃)制成的透明、優(yōu)選為平坦的基底，。這如圖6所示。此基底19可通過光學粘合 劑20與瞄準儀結合。所述基底、光學粘合劑以及瞄準儀1優(yōu)選具有相似的折射率。選擇所 述結構，使得熒光在基底的上側被激勵以及收集，也就是說，傳感器表面3位于基底上。使 用所述平坦基底具有以下優(yōu)點第一，顯微鏡保護玻璃允許測量熒光具有很小的背景；第 二，這樣的玻璃可量產(chǎn)并且成本低；第三，所述基底避免含水試樣與殼體表面4接觸。殼體 表面4的氣態(tài)環(huán)境21通過全內(nèi)放射實現(xiàn)無損失的瞄準；第四，玻璃特別適合于是受體分子 固定。在所示實例中，瞄準儀被集成在試管22內(nèi)。圖7示出本發(fā)明的另一實施例。這里，液體容器僅包括兩個部件容器壁和作為容 器底部的瞄準儀。所述容器壁被構造成與傳感器表面3鄰接。通過這種方式，能夠避免被 分析物液體與殼體表面接觸。所述容器壁優(yōu)選是橫向包圍瞄準儀。由此可保護光學殼體表 面4不被污染，例如不被使用者的指紋污染。此外，通過使用不透光的容器壁，可以阻止周 圍的光通過殼體表面進入瞄準儀。此構造的優(yōu)點為極大降低了制造成本以及降低了黏貼 表面的數(shù)量，所述黏貼表面的數(shù)量可引發(fā)質量波動。在本發(fā)明的一個實施例中，平坦基底是微量滴定板的底部，通過該微量滴定板檢測熒光(圖8)。各個井在底側設置有瞄準儀。在此，瞄準儀可單獨與微量滴定板的底部相 連或者可以被集成在光學元件上，所述光學元件包括布置在一平面上的多個瞄準儀。各瞄 準儀可具有所述井的柵距，但是也可以被布置得更密集，這使得可以在一個井的多個位置 進行測量。例如通過將具有瞄準儀的微量滴定板垂直于光軸移動的偏移單元24，順序執(zhí)行 瞄準儀的選取。可替選地，可以平移激勵光束。
權利要求
一種液體容器，包括用于支撐液體的底部和側壁，其中，所述底部包括a)在所述容器注入液體時與液體接觸的平的傳感器表面；b)位于所述傳感器表面以下的光入射面，所述光入射面用于將光聚焦在所述傳感器表面上；c)光出射面；d)以及殼體表面，該殼體表面被構造成使得從所述傳感器表面反射的光通過所述光出射面射出。
2.一種用于在根據(jù)權利要求1所述的液體容器內(nèi)在質量或數(shù)量上確定被分析物的方 法，其中，激勵光通過光入射面被聚焦在傳感器表面上，從而激勵表征所述被分析物的發(fā)光 標記，并且，所產(chǎn)生的熒光在殼體表面被反射并在通過光出射面射出后被檢測到。
3.一種分析裝置，包括a)用于支撐根據(jù)權利要求1所述的液體容器的支撐器；b)光源，所述光源被布置成使得所述光源的光能夠通過光入射面聚焦在所述液體容器 的傳感器表面上；以及c)檢測器，該檢測器被布置成能夠檢測從所述液體容器的光出射面射出的光。
4.根據(jù)權利要求1所述的液體容器在結合實驗中的用途。
5.根據(jù)權利要求1所述的液體容器，其特征在于，所述光入射面被形成為凸面形狀。
6.根據(jù)權利要求1至5之一所述的液體容器，其特征在于，所述光入射面被形成為非球 面形狀。
7.根據(jù)權利要求1至5之一所述的液體容器，其體征在于，所述光入射面被形成為球面 形狀。
8.根據(jù)權利要求1所述的液體容器，其特征在于，所述光入射面被形成為圓柱形。
9.根據(jù)權利要求1所述的液體容器，其特征在于，所述光入射面是菲涅耳透鏡。
10.根據(jù)權利要求1所述的液體容器，其特征在于，在光入射面上的衍射結構用于將光 聚焦在所述傳感器表面上。
11.根據(jù)權利要求1.4至10之一所述的液體容器，其特征在于，在底部集成有不透光的 光圈，通過所述光圈，能夠橫向限制在所述光入射面周圍的光進入。
12.根據(jù)權利要求1、4至11之一所述的液體容器，包括在外側的凹入部，所述凹入部用 于將所述液體容器固定在分析裝置中。
13.根據(jù)權利要求1、4至11之一所述的液體容器，包括在外側的凸出結構，所述凸出結 構用于將所述液體容器固定在分析裝置中。
14.根據(jù)權利要求1所述的液體容器，其中，所述底部被粘貼在所述容器中。
15.根據(jù)權利要求1所述的液體容器，其中，所述底部在不使用粘合物的情況下被插入 所述容器內(nèi)。
16.根據(jù)權利要求1所述的液體容器，其中，在所述底部中集成有透明、平坦的基底。
17.根據(jù)權利要求1所述的液體容器，被用作試管。
18.根據(jù)權利要求1所述的液體容器，被用作微流體芯片。
19.多個根據(jù)權利要求1和4至18所述的液體容器被布置在一平面上。
20.根據(jù)權利要求1、4至16以及19所述的液體容器的布置，所述液體容器凹入在微量 滴定板中。
21.根據(jù)權利要求2所述的用于在根據(jù)權利要求1、4至20之一所述的液體容器內(nèi)確定 被分析物的方法，其中，激勵光完全照射光入射面并且通過不透光的光圈橫向限制光的入射。
22.根據(jù)權利要求2所述的用于在根據(jù)權利要求1、4至20之一所述的液體容器內(nèi)確定 被分析物的方法，其中，激勵光被全部引導到光入射面上。
23.根據(jù)權利要求2所述的用于在根據(jù)權利要求1、4至20之一所述的液體容器內(nèi)確定 被分析物的方法，其中，以大于臨界角從所述傳感器表面射出的光通過所述光出射表面。
24.根據(jù)權利要求3所述的分析裝置，其中，掃描裝置允許所述液體容器偏移。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種液體容器(22)，其包括用于支撐液體的底部(1)和側壁。所述底部(1)包括平的傳感器表面(3)，在容器被注入液體時，傳感器表面(3)與液體接觸；光入射面(2)，其位于傳感器表面(3)以下，用于將光(13)聚焦到傳感器表面(3)上；光出射面(5)；以及殼體表面(4)，所述殼體表面(4)用于反射來自傳感器表面(3)的光，使得光能夠通過光出射面(5)射出。本發(fā)明還涉及一種用于在所述液體容器(22)中在質量或數(shù)量上確定被分析物的方法。在該方法中，激勵光(13)通過光入射面(2)被聚焦在傳感器表面(3)上，使得表征被分析物的發(fā)光標記被激勵，并且所激發(fā)的光在殼體表面(4)上被反射并且在通過光出射面(5)后被檢測到。本發(fā)明還涉及一種分析裝置，包括用于放置所述液體容器的支持器；光源(10)，該光源(10)被布置成使得該光源(10)的光(13)能夠通過光入射面(2)在液體容器(22)的傳感器表面(3)上聚焦；以及能夠檢測從液體容器(22)的光出射面(5)射出的光(9)的檢測器。
文檔編號G01N33/551GK101910823SQ200880014319
公開日2010年12月8日 申請日期2008年6月27日 優(yōu)先權日2007年4月30日
發(fā)明者史蒂芬·斯格, 托馬斯·拉克斯塔爾 申請人:托馬斯·拉克斯塔爾;史蒂芬·斯格