專利名稱：非特異吸附防止劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及防止在例如臨床診斷藥、臨床診斷裝置、生物芯片等中使用的各種蛋白等的非特異吸附的非特異吸附防止劑。
背景技術(shù)：
近年來，為了疾病的早期發(fā)現(xiàn)等的目的，而要求檢查的高敏感度，提高診斷藥的敏感度成為一大課題。在使用聚苯乙烯片、磁性粒子等固相的診斷藥中，為了提高敏感度，也在從使用酶顯色作為檢測方式的方式，向著使用能得到更高的敏感度的熒光、化學發(fā)光的方式轉(zhuǎn)變著，但實際上并未得到足夠的敏感度。其原因是，在血清等生物分子混合存在
下檢測特定的物質(zhì)進行診斷時，共存的生物分子、2次抗體、發(fā)光底物等向固相、器具/容器等進行非特異的吸附，其結(jié)果是干擾增加而防礙了高敏感化。因此，在免疫診斷測定中，由于特異性結(jié)合物質(zhì)以外的物質(zhì)非特異地吸附于在免疫反應(yīng)中使用的固相表面、器具/容器上而導致敏感度降低，為了減輕該種敏感度的降低，通常通過使用白蛋白、酪蛋白、明膠等生物來源物質(zhì)作為非特異吸附防止劑，來抑制非特異吸附、降低干擾。
然而，即使用以往的方法添加非特異吸附防止劑，也有非特異性的吸附殘留，進而在使用生物來源的非特異吸附防止劑時，由于存在以BSE為代表的生物污染問題等，而希望開發(fā)出用化學合成的高性能的非特異吸附防止劑.
作為基于化學合成的非特異吸附防止劑，在特開平10- 153599號公報、特開平11 -352127號公報中提出了具有聚氧乙烯的聚合物，以及在專利第3443891號中提出了特定的甲基丙烯酸系共聚物，但它們的非特異吸附的防止效果不充分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供如下的非特異吸附防止劑在廣域溫度范
3圍不固化，可以防止蛋白等向在化學發(fā)光免疫診斷測定等中使用的固相表面、器具/容器等的非特異吸附。
本發(fā)明人等為了解決該課題，發(fā)現(xiàn)特定組成的共聚聚合物具有高的非特異吸附防止效果，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一種方式的非特異吸附防止劑，由通過使含有單體(a)和單體(B)的單體單元進行聚合而得到的水溶性聚合物構(gòu)成，
所述單體(a)能夠通過均聚聚合而形成在常壓的水溶液中、80x:
以下具有最低臨界溶解溫度(LCST)的聚合物，
所述單體(B)能夠通過均聚聚合而形成在常壓的水溶液中不具有LCST的非離子性水溶性均聚物。
在上述的非特異吸附防止劑中，所述單體(a)能夠為n， n-二乙基丙烯酰胺。
上述的非特異吸附防止劑，由通過使含有上述單體(a)和上述單體(B)的單體單元進行聚合而得到的水溶性聚合物構(gòu)成，從而在廣域溫度范圍不固化，可以防止蛋白等向在化學發(fā)光免疫診斷測定等中使用的固相表面、器具/容器等的非特異吸附。
具體實施例方式
以下，對本發(fā)明的一個實施方式的非特異吸附防止劑，進行具體i兌明。
1.非特異吸附防止劑1.1.非特異吸附防止劑的構(gòu)成及制造
本實施方式涉及的非特異吸附防止劑，由通過使含有單體(a)和單體(B)的單體單元進行聚合而得到的水溶性聚合物構(gòu)成，所述單體
(a)能夠通過均聚聚合而形成在常壓的水溶液中、8or;以下具有最低
臨界溶解溫度(lowercritical solution temperature: LCST)的聚合物，所述單體(B )能夠通過均聚聚合而形成在常壓的水溶液中不具有LCST的非離子性水溶性均聚物。
4[12首先，對用于制造該水溶性聚合物的單體單元的組成進行說明。保存中的蛋白質(zhì)如果發(fā)生變性，則分子內(nèi)構(gòu)象發(fā)生變化，由原本親水性的狀態(tài)變化為疏水性的狀態(tài)，以該疏水性部分為起點進而誘發(fā)其它蛋白質(zhì)變性。認為在常壓的水溶液中、80"C以下具有LCST的聚合物，由于其親水性/疏水性平衡而阻止變性蛋白的凝集、具有保持分散狀態(tài)的功能。能形成在常壓的水溶液中、80"C以下具有LCST的聚合物的單體，是用于實現(xiàn)非特異吸附防止效果的必須成分。單體(A)可以使用l種或組合2種以上使用。作為單體(A)，從共聚性良好的觀點出發(fā)，優(yōu)選含有丙烯酰胺衍生物的丙烯系單體，從非特異吸附防止效果高的觀點出發(fā)，更優(yōu)選N， N-二乙基丙烯酰胺。 1.1.2.單體(B)
如上所述，單體(B)是能夠通過均聚聚合而形成在常壓的水溶液中不具有LCST的非離子性水溶性均聚物的單體。單體(B)可以使用1種或組合2種以上而使用。
[19作為單體(B)，例如可以舉出丙烯酰胺、N, N-二曱基丙烯酰胺、N -羥乙基丙烯酰胺等取代或非取代的丙烯酰胺類，羥乙基丙烯酸酯、聚乙二醇單(曱基)丙烯酸酯、聚乙二醇單甲基醚(甲基)丙烯酸酯、甘油(甲基)丙烯酸酯等(曱基)丙烯酸酯類，乙酸乙烯酯、(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、烯丙基縮水甘油醚等通過聚合后水解而成為水溶性聚合物的單體，N-乙烯基乙酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、烯丙醇等其它單體。
5單體(B)是用于維持或強化非特異吸附防止效果、且在廣域溫度 范圍特別是高溫區(qū)域防止非特異吸附防止劑的析出/固化的必須成分。 作為單體(B)，更優(yōu)選取代或非取代的丙烯酰胺類，進而優(yōu)選N， N-二甲基丙烯酰胺。
1.1.3.單體單元的組成和聚合
作為其它單體(C)，例如可以將如下物質(zhì)與單體(A)及單體(B) 共聚來制造水溶性聚合物，所述物質(zhì)是丙烯酸、曱基丙烯酸、衣康酸、 馬來酸酐、巴豆酸等的具有羧基的陰離子性單體，苯乙烯磺酸、異戊二 烯磺酸、2 -丙烯酰胺-2 -甲基丙烷磺酸等具有磺酸基的陰離子性單 體，烯丙基胺、氨基苯乙烯、N， N-二曱基氨基丙基丙烯酰胺、N， N -二甲基氨基丙基丙烯酰胺的氯曱烷季鹽等具有伯 季氨基陽離子性 單體，(甲基)丙烯酸曱酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、 (甲基)丙烯酸丁酯、(曱基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸環(huán)己酯、 (甲基)丙烯酸異水片酯、(曱基)丙烯酸芐酯、苯乙烯等疏水性單體。
另外，作為其它單體(C)，將1~10重量％的陰離子性單體、特別 是苯乙烯磺酸、異戊二烯磺酸、2-丙烯酰胺-2-曱基丙烷磺酸等，與 單體(A)及單體(B)共聚，來制造水溶性聚合物，由此在作為免疫 診斷藥的稀釋液而使用時，有時可以得到非特異檢測體的信號抑制效 果。
用于制造作為本實施方式涉及的非特異吸附防止的水溶性聚合物 的單體單元的組成，將全部單體設(shè)為100重量％ 、優(yōu)選單體(A)為30 ~ 99重量％ 、單體(B )為1 ~ 70重量％ 、和其它單體(C )為0 ~ 49重 量％ ,更優(yōu)選單體(A)為40 ~ 95重量％ 、單體(B )為5 ~ 60重量％ 和其它單體(C )為0 ~ 20重量％ 。
如果單體(A)小于30重量％，則有非特異吸附防止效果不充分的 情況，如果單體(B)小于1重量％，則在高溫區(qū)域有非特異吸附防止 劑發(fā)生析出/固化的情況。
用作單體單元的單體，可以是將能作為工業(yè)用原料而獲得的物質(zhì)純 化、或者不經(jīng)純化而直接用于共聚合。單體單元的聚合，例如可以用自由基聚合、陰離子聚合、陽離子聚 合等公知的聚合方法來進行，從制造容易的觀點出發(fā)，優(yōu)選自由基聚合。
另外，單體單元的聚合可以通過與公知的溶劑、引發(fā)劑、鏈轉(zhuǎn)移劑
等一起攪拌、加熱來實施。聚合時間通常為30分鐘 24小時，聚合溫 度為0~120匸左右。
需要說明的是，通過使用2， 2，-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(和光純 藥工業(yè)公司制"V-50")、 2， 2，-偶氮雙(l-亞氨基-l一p比咯基-2-乙基丙烷) 二鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)公司制"VA-067")等陽離子性 引發(fā)劑作為引發(fā)劑，非特異吸附防止劑可以與陰離子性的固相表面庫侖 結(jié)合，可以提高非特異吸附防止效果。這樣的引發(fā)劑的使用量，相對于 單體總量100質(zhì)量份，優(yōu)選0.2 5質(zhì)量份。另外，通過使用2-巰基乙 胺(半胱胺)、3-巰基丙胺、2-巰基丙胺等陽離子性分子量調(diào)節(jié)劑， 非特異吸附防止劑可以與上述的陽離子性引發(fā)劑同樣地與陰離子性的 固相表面庫侖結(jié)合，可以提高非特異吸附防止效果。相對于單體的總量 100質(zhì)量份，這樣的分子量調(diào)節(jié)劑的使用量優(yōu)選為0.1 ~ 10質(zhì)量份。
1.2.非特異吸附防止劑的物性和用途
本發(fā)明的非特異吸附防止劑的數(shù)均分子量通常為1000 ~ 1000000， 優(yōu)選2000 ~ 100000，進而優(yōu)選3000 ~ 50000。本實施方式涉及的非特異 吸附防止劑(水溶性聚合物)的分子量分布，典型的是重均分子量/數(shù) 均分子量為1.5 ~ 3。
作為本實施方式涉及的非特異吸附防止劑時的共聚聚合物為水溶 性。在本發(fā)明中，"為水溶性"是指，在水中添加/混合共聚聚合物以使 251C下成為1。/。的聚合物固態(tài)成分時，用目視為透明溶解的狀態(tài)。
本實施方式涉及的非特異吸附防止劑，具有通過例如向容器 器具 等涂布的方法、向診斷藥的稀釋劑、反應(yīng)溶劑、保存劑添加的方法而有 效地防止蛋白等的非特異吸附的效果。
另外，本實施方式涉及的非特異吸附防止劑，通過用作免疫診斷藥 的稀釋液，可以抑制非特異檢測體的信號。進而，本實施方式涉及的非特異吸附防止劑，通過作為例如用作臨 床診斷藥的標識抗體、標識抗原、酶、 一次抗體、 一次抗原的穩(wěn)定劑， 血漿制劑中所含的蛋白穩(wěn)定劑，用于隱形眼鏡的清洗的酶等的穩(wěn)定劑等 而添加到蛋白溶液中，具有長期維持蛋白活性的效果。
2.實施例
以下，舉出實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受它們的 限制。
2.1. 實施例1
將作為單體(A)的二乙基丙烯酰胺70g、作為單體(B)的二甲基 丙烯酰胺30g、和作為鏈轉(zhuǎn)移劑的半胱胺鹽酸鹽2g混合于900g水中， 裝入帶有攪拌機的可分離燒瓶。 一邊向其中吹入氮， 一邊升溫到701C， 添加2,2，-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽lg作為引發(fā)劑后，繼續(xù)聚合2小時， 進而升溫到801C，進行3小時熟化后，冷卻到室溫。通過透析將得到的 共聚物溶液純化，進而進行凍結(jié)干燥，從而得到本實施例的非特異吸附 防止劑(N-l) 69g。
非特異吸附防止劑(N-1)的用GPC測定的數(shù)均分子量為8000， 重均分子量為16000。
將非特異吸附防止劑(N-1)的0.5%水溶液裝滿于聚苯乙烯制的 96孔板中，在37匸下孵育30分鐘后，用交換水洗凈5次。接著，將西 洋辣根過氧化物酶標記的鼠IgG抗體(Millipore公司制"AP124P") 水溶液裝滿于上述的處理板中，在室溫下孵育30分鐘后，用PBS緩沖 液洗凈3次。用TMB (3，3，，5,5，-四曱基聯(lián)苯胺)/過氧化氫水/硫酸使其 顯色，測定450nm的吸光度。得到的吸光度為0.058的低值，確認了可 以防止鼠IgG抗體的非特異吸附。需要說明的是，在37X:下的孵育中 沒有聚合物的析出/固化。
2.2. 實施例2
除了使用作為單體(A)的二乙基丙烯酰胺85g和作為單體(B) 的丙烯酰胺15g，來代替在實施例1中作為單體(A)的二乙基丙烯酰胺70g和作為單體(B)的二甲基丙烯酰胺30g以外，其它用與實施例 l同樣的方法，得到共聚聚合物(N-2)。
共聚聚合物(N-2)的用GPC測定的數(shù)均分子量為7200，重均分 子量為15000。
另外，用與實施例l同樣的方法，測定共聚聚合物(N-2)的吸光 度，結(jié)果該吸光度為0.076，確認了可以防止鼠IgG抗體的非特異吸附。 需要說明的是，在37X:下的孵育中沒有聚合物的析出/固化。
2.3. 實施例3
除了使用作為單體(A)的N-異丙基丙烯酰胺70g,來代替在實 施例1中作為單體(A)的二乙基丙烯酰胺70g以外，其它用與實施例 l同樣的方法，得到共聚聚合物(N-3)。
共聚聚合物(N-3)的用GPC測定的數(shù)均分子量為6800，重均分子 量為13000。
另外，用與實施例1同樣的方法，測定共聚聚合物(N-3)的吸光度， 結(jié)果該吸光度為0.18，確認了可以防止鼠IgG抗體的非特異吸附。需要說 明的是，在37lC下的孵育中沒有聚合物的析出/固化。
2.4. 比較例1
除了使用作為單體(A)的二乙基丙烯酰胺100g,來代替在實施例 1中作為單體(A)的二乙基丙烯酰胺70g、作為單體(B)的二甲基丙 烯酰胺30g以外，其它用與實施例1同樣的方法，得到共聚聚合物(X
共聚聚合物(X-1)的用GPC測定的數(shù)均分子量為7800,重均分子 量為16000。
另外，用與實施例l同樣的方法，測定共聚聚合物(X-l)的吸光度， 結(jié)果該吸光度為0.21，得到了比實施例1的非特異吸附防止劑(N - 1)的 吸光度稍高的值。另外，在37X:下的孵育中聚合物發(fā)生析出/固化。
2.5. 比較例2除了使用作為單體(A)的二曱基丙烯酰胺100g，來代替在實施例 1中作為單體(A)的二乙基丙烯酰胺70g和作為單體(B)的二甲基丙 烯酰胺30g以外，其它用與實施例1同樣的方法，得到共聚聚合物(X -2)。
共聚聚合物(X-2)的用GPC測定的數(shù)均分子量為8400，重均分子 量為17000。
另外，用與實施例l同樣的方法，測定共聚聚合物(X-2)的吸光度， 結(jié)果該吸光度為1.8，得到了與實施例1的非特異吸附防止劑(N-l)的 吸光度相比為顯著高的值。需要i兌明的是，沒有確i人在37t:下的孵育中聚 合物發(fā)生析出/固化。
2.6.比較例3
除了使用牛血清白蛋白(BSA)來代替非特異吸附防止劑(N-l) 以外，用與實施例同樣的方法測定共聚聚合物(X-2)的吸光度，結(jié)果該 吸光度為0.20，得到了比實施例1的非特異吸附防止劑(N - 1)的吸光度 稍高的值。需要說明的是，沒有確認在37C下的孵育中BSA發(fā)生析出/固 化。
權(quán)利要求
1.一種非特異吸附防止劑，其特征在于，由通過使含有單體A和單體B的單體單元進行聚合而得到的水溶性聚合物而構(gòu)成，所述單體A能夠通過均聚聚合而形成在常壓的水溶液中、80℃以下具有最低臨界溶解溫度LCST的聚合物，所述單體B能夠通過均聚聚合而形成在常壓的水溶液中不具有LCST的非離子性水溶性均聚物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的非特異吸附防止劑，其中，所述單體A 為N， N-二乙基丙蜂酰胺。
全文摘要
本發(fā)明提供一種非特異吸附防止劑，其由通過使含有單體A和單體B的單體單元進行聚合而得到的水溶性聚合物而構(gòu)成，所述單體(A)能夠通過均聚聚合而形成在常壓的水溶液中、80℃以下具有最低臨界溶解溫度LCST的聚合物，所述單體(B)能夠通過均聚聚合而形成在常壓的水溶液中不具有LCST的非離子性水溶性均聚物。
文檔編號G01N33/531GK101680888SQ20088001756
公開日2010年3月24日 申請日期2008年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日
發(fā)明者小川俊博, 田守功二, 高本英司 申請人:Jsr株式會社