專利名稱：：疾病標(biāo)記物的制作方法疾病標(biāo)記物本發(fā)明涉及受試者自身免疫病(autoimmunedisease)的評(píng)估方法，尤其是檢測(cè)/判定發(fā)展患上像多發(fā)性硬化(multiplesclerosis)之類疾病的風(fēng)險(xiǎn)的方法。免疫系統(tǒng)是抵抗疾病的初步防御機(jī)制。它可以抵抗由病原體像細(xì)菌和病毒引起的疾病，還可以抵抗因機(jī)體組織異常生長(zhǎng)(像癌癥)引起的疾病。免疫系統(tǒng)通常能夠識(shí)別正常地機(jī)體細(xì)胞(定義為“自身”‘self)和外來(lái)的病原體或者異常細(xì)胞(異己(non-self))。耐受是這樣一種機(jī)制，它可以讓免疫系統(tǒng)避免對(duì)自身抗原產(chǎn)生反應(yīng)。但是若發(fā)生了自身免疫疾病，免疫系統(tǒng)就會(huì)失去識(shí)別自身為正常的能力，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)自身的組織或細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。自身免疫所導(dǎo)致的病癥通常具有嚴(yán)重的臨床后果，是威脅建康的一個(gè)主要問(wèn)題。但是目前卻沒(méi)有足夠的闡述。一個(gè)自身免疫紊亂的例子就是多發(fā)性硬化(MS)。它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的進(jìn)行性疾病(progressivedisease)。在MS病例中，病人的免疫系統(tǒng)破壞髓鞘(myelin)。髓鞘質(zhì)是包圍和隔離(insulates)腦以及脊索(spinalcord)中神經(jīng)纖維的保護(hù)層。髓鞘的破壞導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)的破壞并且形成神經(jīng)纖維的疤痕。最終會(huì)在病人身上會(huì)出現(xiàn)很多癥狀像麻木，口齒不清，視覺(jué)損傷。病程期間還有一種癥狀是肢無(wú)力導(dǎo)致病人移動(dòng)問(wèn)題，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致肢體癱瘓。根據(jù)臨床診斷，目前多發(fā)性硬化有4種類型，主要是基于腦或者脊索(spinal)的哪部分受損，嚴(yán)重程度以及發(fā)作頻率。多發(fā)性硬化早期發(fā)作時(shí)通常比較短暫，癥狀輕。因此在早期不會(huì)尋求藥物干預(yù)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，最常見的早期癥狀是感覺(jué)變化或部分視力喪失(視神經(jīng)炎)。由于判定病人是否患了多發(fā)性硬化至少要依據(jù)兩個(gè)獨(dú)立的神經(jīng)病學(xué)癥狀事件，所以這種病在早期很難被確診。磁共振成像(Magneticresonanceimaging,MR)可以用來(lái)確定脫髓鞘的區(qū)域，測(cè)試腦脊液(cerebrospinalfluid,CSF)可以為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥(chronicinflammation)提供證據(jù)。另外，測(cè)定針對(duì)髓磷脂蛋白的抗體的量也是一個(gè)診斷多發(fā)性硬化的一個(gè)有用工具，這些髓磷脂蛋白諸如人髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelinoligodendrocyteglycoprotein,M0G)和髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)。但是這些方法都有缺陷，不太適用于測(cè)定大量對(duì)象包括明顯健康或者早期患者的疾病診斷。因此需要改善自身免疫病象多發(fā)性硬化的檢測(cè)和診斷的方法。尤其需要能夠?qū)膊∽龀鲈缙谠\斷，以及對(duì)那些沒(méi)有臨床癥狀的個(gè)體的疾病易感性(diseasesuscetibility)提供一些參考信息和指標(biāo)(indication)?；诖?，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案(embodiment)就是提供了測(cè)定受試者自身免疫病狀況(status)的方法。包含檢測(cè)受試者的白血球(leukocytes)產(chǎn)生的Th2細(xì)胞因子(Th2cytokine)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用Th2細(xì)胞因子作為生物標(biāo)記物(biomarker)來(lái)檢測(cè)受試者自身免疫病的狀況(status)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了測(cè)定受試者自身免疫病狀況的試劑盒，包含一個(gè)或多個(gè)適于測(cè)定通過(guò)受試者的白血球(leukocytes)產(chǎn)生的Th2細(xì)胞因子)。說(shuō)到“測(cè)定/檢測(cè)自身免疫病的狀況(status)”，通常欲以將所有關(guān)于評(píng)價(jià)該疾病方法都包括進(jìn)來(lái)，像該疾病是否已經(jīng)在受試者身上出現(xiàn)，受試者未來(lái)是否會(huì)發(fā)展患上該疾病，和/或目前或?qū)?lái)疾病的形式或嚴(yán)重性。因此方法有可能涉及任何可能的預(yù)后或診斷方法。比如檢測(cè)疾病的方法，診斷疾病的方法，監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的方法，評(píng)價(jià)預(yù)后(prognosis)疾病的方法，預(yù)測(cè)疾病結(jié)果的方法，確定患上該病風(fēng)險(xiǎn)的方法或者預(yù)測(cè)疾病易感性(susceptibility)的方法。自身免疫病的實(shí)例包括以下疾病，但不僅限這些風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA),S^Elil^il(myastheniagravis,MG),^^fiig^(Multiplesclerosis,MS)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,SLE)，自身免疫性甲狀腺炎(autoimmunethyroiditis或喬本氏甲狀腺炎Hashimoto‘sthyroiditis),格雷夫其Jf^f(Graves'disease),^ftJ(inflammatoryboweldisease)g^iiSlf^II視網(wǎng)膜炎(autoimmuneuveoretinitis)，多肌炎(polymyositis)以及某些類型的糖尿病(diabetes)。優(yōu)選地自身免疫病是一種脫髓鞘病，更有選中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病。非中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病的實(shí)例包括急性脫髓鞘性多神經(jīng)病(acutedemye1inatingpolyneuropathy)(歸-伯二氏綜合征(Guillain-BarreSyndrome)),慢性炎性脫髓鞘性神經(jīng)病(ChronicInflammatoryDemyelinatingneuropathy)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病包括多發(fā)性硬化(Multiplesclerosis,MS)，進(jìn)行性多病灶腦白質(zhì)病(ProgressiveMultifocalLeukoencephalopathy)；急個(gè)生1HWiit(AcuteDisseminatedEncephalomyelitis)；德維克氏病(Devicsyndrome)，白洛氏同心性硬化(BaloDisease)。這些疾病也可以是繼發(fā)性(secondary)脫髓鞘病像中樞神經(jīng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(CNSlupuserythematodes),干燥綜合癥(syogren‘ssyndrome),或者分離性腦血管炎(isolatedcerebralvasculitis)。最優(yōu)選的自身免疫病是多發(fā)性硬化(MQ。本方法可以用來(lái)評(píng)估任何形式的多發(fā)性硬化或者多發(fā)性硬化的亞型(subtype)。包括復(fù)發(fā)性/間歇性(RR，Relapsing/Remitting)，繼發(fā)性進(jìn)行性(SR,SecondaryProgressive)，原發(fā)性進(jìn)行性(PP，PrimaryProgressive)和進(jìn)行性復(fù)發(fā)性(PR，ProgressiveRelapsing)的多發(fā)性硬化。受試者優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選是人。比如受試者可以是懷疑患上了自身免疫病(例如出現(xiàn)了該病的其它病癥)并想要確診或排除的個(gè)體(individual)?；蛘呤茉囌咭部梢允且呀?jīng)確診患上了此病的個(gè)體，例如在一些實(shí)施方案中，其中本方法用來(lái)監(jiān)測(cè)受試者疾病的發(fā)展或者檢測(cè)疾病的嚴(yán)重程度。在另一些實(shí)施方案中，受試者是看起來(lái)似乎健康(無(wú)臨床癥狀)的個(gè)體，例如想要對(duì)早期疾病進(jìn)行篩選或測(cè)試將來(lái)發(fā)展患上此病易感性的個(gè)體。本發(fā)明的方法包括測(cè)定Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。所謂的通過(guò)“Th2細(xì)胞因子”，指的是一種與Type2helperTcell(Th2)響應(yīng)有關(guān)的因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼Th2細(xì)胞因子的基因位于人染色體5(或者鼠染色體11)上。特別是這樣的基因是人染色體5q23_31細(xì)胞因子基因簇的一部分。優(yōu)選的Th2細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素4(IL-4，interleukin4)，白細(xì)胞介素5(IL-5，interleukin5)，白細(xì)胞介素13(IL-13，interleukin13)。在一個(gè)實(shí)施方案中，Th2細(xì)胞因子的表達(dá)受GATA-3轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。本發(fā)明也包含了測(cè)定受試者產(chǎn)生的2個(gè)或者多個(gè)Th2細(xì)胞因子的方法，以及上述細(xì)胞因子(IL-4和IL-5，或者IL_4，IL-5和IL-13)的任何組合的方法。Th2細(xì)胞因子可以衍生于相對(duì)應(yīng)于受試者的任何物種。本方法優(yōu)選包括測(cè)定人Th2細(xì)胞因子，像人白細(xì)胞介素4，人白細(xì)胞介素5或者人白細(xì)胞介素13的產(chǎn)生。說(shuō)到“測(cè)定Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生”，意欲將任何直接的或者間接的測(cè)定Th2細(xì)胞因子(例如人白細(xì)胞介素幻水平方法都包括進(jìn)來(lái)。因此本方法包含檢測(cè)Th2細(xì)胞因子的衍生物或者其片斷，以及天然全長(zhǎng)蛋白(nativefull-lengthprotein)或者信使核糖核酸(mRNA)的序列。衍生物和片斷包括由于一個(gè)或多個(gè)氨基酸或者核苷酸殘基的缺失，取代或插入所導(dǎo)致的變體。例如由于天然存在的基因可變性(naturallyoccurringgenevariability)而產(chǎn)生的變體。衍生物也可以是基因處理過(guò)程中引起，或者機(jī)體內(nèi)的基因產(chǎn)物和/或降解產(chǎn)物。蛋白水平的修飾可以是由于機(jī)體內(nèi)的酶或者化學(xué)修飾而引起的。例如修飾可以是糖基化，磷酸化或者法尼基化(farnesylation)。受試者Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生可以用任何合適的方法來(lái)測(cè)。包括測(cè)定受試者細(xì)胞因子的信使核糖核酸和/或者產(chǎn)生的蛋白。例如測(cè)定IL-5蛋白的方法包括抗體，捕捉分子(capturemolecule)，受體或者相應(yīng)與IL-5結(jié)合的片斷的使用。與IL-5或者其它Th2細(xì)胞因子結(jié)合的抗體是已知的(比如可以參考Abramsetal.，“Strategiesofanti-cytokinemonoclonalantibodydevelopmentimmunoassayofIL-IOandIL-5inclinicalsamples."ImmunolRevl27:5-24；Schumacher,etal.,"ThecharacterizationoffourmonoclonalantibodiesspecificformouseIL-5anddevelopmentofmouseandhumanIL-5enzyme-linkedimmunosorbent."JImmunol141(5):1576-81)或者可以由已知的方法產(chǎn)生，包括給動(dòng)物接種或者收集血清(來(lái)生產(chǎn)多克隆抗體)或脾臟細(xì)胞(spleencells)(與永生化(immortalised)細(xì)胞系融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞)(hybridomas)從而導(dǎo)致單克隆抗體)。測(cè)定IL-5的信使核糖核酸的方法包括利用互補(bǔ)的核酸探針(complementarynucleicacidprobe)，比如單鏈DNA探針(single-strandedDNA)或者實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)。檢測(cè)分子例如抗體或核酸探針可以是結(jié)合到固體支撐物例如塑料表面，珠子或陣列中(inanarray)。合適的測(cè)定IL-5蛋白的形式有(但不僅限與此)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA，enzyme-linkedimmunosorbentassay),放身寸免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA),Western印跡(Westernblotting)，免疫沉淀反應(yīng)(Immimoprecipitation)。合適的信使核糖核酸的檢測(cè)方法包括Northern印跡(Northernblotting)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。其它的Th2細(xì)胞因子像IL-4和IL-13，可以用與上述IL-5相關(guān)的類似方法和試劑來(lái)檢測(cè)，但是特異于那些其它的細(xì)胞因子?；蛘?，可以利用質(zhì)譜(massspectroscopy)來(lái)檢測(cè)Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平。質(zhì)譜允許根據(jù)分子量對(duì)細(xì)胞因子蛋白進(jìn)行檢測(cè)和量化。任何本領(lǐng)域已知的質(zhì)譜的本領(lǐng)域合適的離子化方法都可以使用，包括電子撞擊電離(electronimpaCt，El)，化學(xué)電離(chemicalionization,Cl),場(chǎng)致電離(fieldionization,FDI)，電噴射電離(electrosprayionization,ESI)，激光解析電離(laserdesorptionionization,LDI)，基質(zhì)輔助激光解析電離(matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)禾口表面增強(qiáng)激光角軍析離子化(surfaceenhancedlaserdesorptionionization,SELDI)。任何適合的質(zhì)譜檢測(cè)方法都可以使用，例如，四極桿質(zhì)譜(quadrapolemassspectroscopy，QMS)，傅里葉變換質(zhì)譜(fouriertransformmassspectroscopy，F(xiàn)T—MS)禾口飛對(duì)于時(shí)|1]質(zhì)i普(time_of_flightmassspectroscopy,TOF-MS)。在一個(gè)實(shí)施方案中，Th2蛋白的分泌是通過(guò)流式微珠陣列法(cytometricbeadarray,CBA)來(lái)測(cè)定的。流式微珠陣列法(或多重微珠分析multiplexedbeadassay)由多種不同類型的微珠的混合物組成，這些微珠大小一致，但是對(duì)發(fā)光(emitting)染料有不同的熒光強(qiáng)度。諸如抗體之類的捕捉分子共價(jià)偶聯(lián)到特定類型的微珠上，與被分析物(諸如IL-5)結(jié)合的抗體可以利用熒光發(fā)射(fluorescence-basedemission)和流式微珠分析的方法來(lái)檢測(cè)。在這種類型的分析中，將每種細(xì)胞因子(例如IL-4，IL-5，和IL-U)的特異性抗體結(jié)合到不同類型的微珠上，就可以檢測(cè)多種Th2細(xì)胞因子。本發(fā)明包括測(cè)定通過(guò)受試者白細(xì)胞Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。方法優(yōu)選針對(duì)體外檢測(cè)，也就是，測(cè)定從受試者中衍生或提取出來(lái)的分離的樣品(含有白細(xì)胞)中的Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。樣品可以是固體的組織樣品，也可以是從體液(bodyfluid)中衍生的樣品，比如但不僅限這些淋巴液(lymph)，尿液(urine)，血液(blood)，血清(serum),H(plasma),^{g^(fecalmatter),HW^(cerebrospinalfluid)#Bi^(saliva)。優(yōu)選的樣品衍生自血液或者淋巴。樣品最優(yōu)選富含或者含有純的白細(xì)胞群體(apurifiedpopulationofleukocytes)，尤其是淋巴細(xì)胞或者單核細(xì)胞(monocyte)。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品包含從受試者中提取的外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells)。分離樣品中的Th2細(xì)胞因子水平優(yōu)選和對(duì)照的相比較。Th2細(xì)胞因子對(duì)照的水平可以通過(guò)測(cè)定比如來(lái)源于健康受試者的對(duì)照樣品來(lái)獲得。對(duì)照樣品可以源于和受試者來(lái)源的同樣的組織樣品。在受試者上分離的樣品中測(cè)得的Th2細(xì)胞因子(例如IL-4，IL-5或者IL-13)水平比對(duì)照樣品低，則通常意味著受試者有自身免疫病，比如受試者已患此病，或者未來(lái)有可能發(fā)展患上此病。在一些實(shí)施方案中，對(duì)受試者以及對(duì)照受試者的Th2細(xì)胞因子水平的定量分析能夠?qū)膊∵M(jìn)行預(yù)后評(píng)估，例如疾病的嚴(yán)重性或者可能的發(fā)展速度。例如，與對(duì)照相比，IL-5(或者IL-4或IL-13)的大幅降低則可能意味著病情糟糕(worseprognosis)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的樣品受到一種試劑的攻擊，這種試劑通常刺激Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。該試劑優(yōu)選刺激來(lái)源于健康受試者的樣品產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子。例如在對(duì)攻擊的應(yīng)答測(cè)定分離的樣品中IL-5的產(chǎn)生并在相同的試劑攻擊下，比較對(duì)照樣品產(chǎn)生的IL-5。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的純蛋白衍生物(purifiedproteinderivative)。優(yōu)選，該試劑是一種T細(xì)胞激活劑(Τcellactivator)0任何以抗原依賴性的或抗原獨(dú)立性(incbpendent)的形式來(lái)激活T細(xì)胞的試劑都可以使用。試劑可以通過(guò)結(jié)合T細(xì)胞受體或其它機(jī)理來(lái)激活T細(xì)胞。合適的T細(xì)胞激活試劑包括植物凝血素(phytohaemagglutinin，PHA,一種能夠刺激所有人T細(xì)胞的外源凝集素)；抗-⑶3或抗-⑶觀抗體，任選涂覆在微珠上；佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA),URMIlMM(ionomycin，一禾中丐(inophore)。也可以使用上述試劑的組合，例如PHA和PMA。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，T細(xì)胞激活劑是細(xì)胞刺激劑(Cytostim)。細(xì)胞刺激劑用來(lái)快速而有效的再激發(fā)人的效應(yīng)/記憶T細(xì)胞(effector/memoryTcell)。它是以抗體為基礎(chǔ)的試劑，作用模式與超級(jí)抗原(superantigen)類似，但是不依賴某些特定的T細(xì)胞受體(TCR)的νβ區(qū)域(domains)。它通過(guò)結(jié)合T細(xì)胞受體(Tcellreceptor)并把它交聯(lián)到抗原呈遞細(xì)胞的MHC分子上導(dǎo)致激活T細(xì)胞。通過(guò)Cytostim的刺激，幾個(gè)小時(shí)后，⑶4+和⑶8+T細(xì)胞開始分泌細(xì)胞因子，或者開始上調(diào)它們細(xì)胞表面的激活標(biāo)記物。在另外的實(shí)施方案中，分離的樣品受到自身抗原的攻擊，它可以是欲以被檢測(cè)的針對(duì)自身免疫病的免疫應(yīng)答的自身抗原。這種試劑優(yōu)選含有髓鞘堿性蛋白(一種與多發(fā)性硬化和其它脫髓鞘病有關(guān)的自身抗原)或者其片段(例如在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫病是一種脫髓鞘病像多發(fā)性硬化)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)比較Th2細(xì)胞因子(比如IL-5，IL_4或者IL-13)的產(chǎn)生水平比對(duì)照降低了至少25%，至少50%，至少75%或者至少90%來(lái)確定該疾病存在性或者其易感性的。試劑處理后的任何合適的時(shí)間點(diǎn)都可以來(lái)比較細(xì)胞因子水平，優(yōu)選在6小時(shí)到28天。最優(yōu)選12小時(shí)到14天，最優(yōu)選是在1-10天內(nèi)測(cè)。比如，試劑處理后的24小時(shí)，4天或者8天來(lái)比較。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。例如，用于測(cè)定通過(guò)受試者(例如含有來(lái)源于受試者白細(xì)胞的樣品)的白細(xì)胞產(chǎn)生的Th2細(xì)胞因子的試劑盒。因此該試劑盒適于篩選，診斷，和/或評(píng)估自身免疫病如多發(fā)性硬化的預(yù)后。試劑盒包含一個(gè)或者多個(gè)能夠跟Th2細(xì)胞因子蛋白或者其信使核糖核酸特異結(jié)合的試劑(例如與Th2細(xì)胞因子結(jié)合的抗體，以便對(duì)細(xì)胞因子蛋白進(jìn)行檢測(cè)和定量)。可選的一個(gè)或者多個(gè)緩沖液，可檢測(cè)的標(biāo)簽(detectablelabels)，或者在特定分析中可能用到的其它試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包含通常用來(lái)刺激例如來(lái)自正常受試者對(duì)照樣品中Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的試劑。因此該試劑可以是T細(xì)胞激活劑或者與將要測(cè)試的自身免疫病有關(guān)的抗原。試劑盒還包括本發(fā)明方法的使用說(shuō)明，例如如何使用某種試劑來(lái)測(cè)定受試者自身免疫病狀況，如測(cè)定受試者是否已患此病或者是否易感患上此病?，F(xiàn)在來(lái)舉例說(shuō)明本發(fā)明方法在下面特定實(shí)施方案中的應(yīng)用，其中圖1顯示的是來(lái)自于健康受試者以及多發(fā)性硬化患者的外周血單核細(xì)胞被髓鞘堿性蛋白處理后的不同時(shí)間點(diǎn)所分泌的IL-5的測(cè)定結(jié)果；圖2顯示的是來(lái)自于健康受試者以及多發(fā)性硬化患者的外周血單核細(xì)胞被結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物處理后的不同時(shí)間點(diǎn)所分泌的IL-5的測(cè)定結(jié)果；圖3顯示的是來(lái)自于健康受試者以及多發(fā)性硬化患者的外周血單核細(xì)胞被髓鞘堿性蛋白處理后的不同時(shí)間點(diǎn)所分泌的干擾素-Y(IFN-y)的測(cè)定結(jié)果；圖4顯示的是來(lái)自于健康受試者以及多發(fā)性硬化患者的外周血單核細(xì)胞被髓鞘堿性蛋白處理后分泌的IL-5和IL-4，數(shù)據(jù)來(lái)自于所有的時(shí)間點(diǎn)。輔助性T淋巴細(xì)胞(Thelper(Th)lymphocytes)的分化在確立有效的免疫應(yīng)答和建立對(duì)病原體免疫記憶方面發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。原態(tài)(NaiVe)Th細(xì)胞受到抗原和分化信號(hào)(polarizingsignal)的刺激，可以發(fā)展為獨(dú)特的細(xì)胞因子模式(profile)=Thl細(xì)胞表達(dá)干擾素IFN-γ從而激活細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，而Th2細(xì)胞通過(guò)表達(dá)IL-4，IL-5和IL-13來(lái)激活B細(xì)胞的增殖和抗體的產(chǎn)生。誘導(dǎo)Thl和Th2發(fā)生分化的分化信號(hào)分別是白細(xì)胞介素IL-12和IL-4。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，通過(guò)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的Th2細(xì)胞因子和患有自身免疫病像多發(fā)性硬化的受試者的疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。相反，Thl細(xì)胞因子像干擾素-Y的產(chǎn)生和疾病狀態(tài)無(wú)關(guān)。下面詳細(xì)討論一下本發(fā)明所涉及到的一系列有興趣的Th2細(xì)胞因子。人IL-5(UniProtKB/Swiss-Protaccessionno.P05113)是含有由兩個(gè)多肽鏈的形成的同源二聚體(homodimer)糖蛋白(glycoprotein)，每條肽鏈含有115個(gè)氨基酸殘基(Tanabeetal.,“Molecularcloningandstructureofthehumaninterleukin-5gene.",J.Biol.Chem.26216580-16584(1987)；Milburnetal.,“Anoveldimerconfigurationrevealedbythecrystalstructureat2.4Aresolutionofhumaninterleukin-5",Nature1993;363(6425):172-176.)。IL-5通常由T細(xì)胞和柱狀細(xì)胞(mastcells)來(lái)產(chǎn)生，其功能有可能是刺激B細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫球蛋白的分泌，以及誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞活化。IL-4是參與刺激活化的B細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖，以及分化CD4+T細(xì)胞為Th2細(xì)胞。人IL-4(UniProtKB/Swiss-Protaccessionno.P05112)也是產(chǎn)生自153氨基酸的前體蛋白，它被剪切后形成1氨基酸的成熟形式(matureform)糖蛋白，(Yokotaetal.,“IsolationandcharacterizationofahumaninterleukincDNAclone,homologoustomouseB—cellstimulatoryfactor1,thatexpressesB-cell-andT~cell-stimulatingactivities.",Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.835894-5898(1986))。IL-13和IL-4關(guān)系密切，在發(fā)炎和過(guò)敏的(allergic)情況下，這兩種細(xì)胞因子對(duì)免疫細(xì)胞有類似的活性。IL-13的受體是多亞基受體，包含IL-4受體的alpha鏈(IL-4Ra)以及至少一個(gè)已知的2個(gè)IL-13特異結(jié)合鏈。轉(zhuǎn)錄因子，信號(hào)傳感器(signaltransducer)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(activatoroftranscription6(STAT6))跟調(diào)節(jié)IL-4和IL-13的表達(dá)有關(guān)。人IL-13(UniProtKB/Swiss-Protaccessionno.P35225)是含有112氨基酸的糖蛋白，由前體蛋白通過(guò)剪切掉20個(gè)殘基的信號(hào)序列后得到的(Mintyetal.，“Interleukin-13isanewhuman1ymphοkiηeregulatinginflammatoryandimmuneresponses.“，Nature362:248-250(1993)；McKenzieetal.，"Interleukin13，aT-cell-derivedcytokinethatregulateshumanmonocyteandB-cellfunction.“，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:3735-3739(1993)；Dolganovetal.，“Coexpressionoftheinterleukin-13andinterleukin-4genescorrelateswiththeirphysicallinkageinthecytokinegeneclusteronhumanchromosome5q23_3L“Blood873316-3326(1996))οIL-3，IL-4,IL-5,IL_9，IL-13的基因和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞菌落剌激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF))基因被包含于位于人染色體5和小鼠染色體11上的緊密相連的基因簇(Leeetal.，〃TheIL-4andIL-5genesarecloselylinkedandarepartofacytokinegeneclusteronmousechromosome11"SomatCellMoIGenet1989；15(2):143-152；vanLeeuwenetal.，“Molecularorganizationofthecytokinegenecluster,involvingthehumanIL-3,IL-4,IL-5,andGM-CSFgenes，onhumanchromosome5"，Blood1989；73(5):1142-1148)。在Th2類型的響應(yīng)中，這些基因常常是在輔助性T細(xì)胞中共同表達(dá)的。各種轉(zhuǎn)錄因子參與了Th2細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)節(jié)。GATA3(GATA結(jié)合蛋白3)控制著一系列細(xì)胞因子包括IL-4,IL-5和IL-13的產(chǎn)生(Stevensetal.Eur.J.Immunol.36，3305.2006)。組蛋白去乙?；?(Histonedeacetylase4)和p300(又叫組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶histoneacetyltransferase)控制著IL-5啟動(dòng)子的活性。C/EBPbeta,GATA3，NFAT和YYl是跟IL-5啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，是吸引組蛋白去乙?；?所關(guān)鍵的(Hanetal.BiochemicalJournal400,439.2006)。已經(jīng)知道AP-I和GATA-3跟IL-5啟動(dòng)子結(jié)合。突變分析證明，在調(diào)節(jié)IL-5方面，Ets/NFAT和AP-I及GATA-3—起發(fā)揮著重要的作用(Wangetal.InternationalImmunology18，313.2006)。Bcl-3調(diào)節(jié)分化細(xì)胞分泌產(chǎn)生IL-4，IL-5和IL-13。Bcl-3缺陷型細(xì)胞產(chǎn)生這3種細(xì)胞因子的能力受損，并且這些細(xì)胞顯示GATA-3的降低(Cornetal.JournalofImmunology175,2102.2005)。GATA-3在T細(xì)胞中的強(qiáng)制性表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生1ι2的細(xì)胞因子IL_4和IL-5(Sundrudetal.JournalofImmunology171，3542.2003)。Bcl_6在轉(zhuǎn)錄后修飾水平上(attheposttranscriptionallevel)抑制GATA-3的表達(dá)(Kusametal.JournalofImmunology170，2435.2003)。通過(guò)誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子和抑制干擾素-、，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GATA-3在Th2細(xì)胞因子記憶方面起著關(guān)鍵性的作用。在原態(tài)(Mive)T細(xì)胞，GATA-3濃度較低。其緩慢并持久性表達(dá)的上調(diào)受Th2-分化條件，IL-4同時(shí)遞送(simultaneousIL-4delivery)和抗原刺激T細(xì)胞受體的誘導(dǎo)。GATA-3的轉(zhuǎn)錄由Stat6來(lái)激活，Stat6由IL-4信號(hào)來(lái)控制。因此GATA-3的表達(dá)在調(diào)控Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生方面起著重要作用。GATA-3所起的作用是不一樣的，N-端指區(qū)(N-terminalfinger)影響IL-5而C-端指區(qū)(C-terminalfinger)控制IL-4和IL-13。因此，不受任何理論限制，自身免疫病像多發(fā)性硬化患者的淋巴細(xì)胞的Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的減少(像IL-4，IL-5和IL-13)有可能是與轉(zhuǎn)錄因子例如GATA-3對(duì)基因的調(diào)控有所不同而相關(guān)的。實(shí)施例(Examples)(Abbreviations)PBMC，外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells)；PPD，結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(purifiedprotein_derivativeofMycobacteriumtuberculosis)；MBP，髓磷脂堿性蛋白(myelinbasicprotein)；CBA，流式微珠陣列法(cytometricbeadarray)；qRT-PCR,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitativereal-timepolymerasechainreaction)。PBMC的收集及其在液氮中的保存檸檬酸化的(Citrated)外周血樣品是從已做出書面同意(writteninformedconsent)的健康個(gè)體和多發(fā)性硬化患者中收集到的。PBMC的分離是利用離心儀Histopaque-1077(Sigma,Poole,UK)通過(guò)如前所述密度離心法(densitycentrifugation)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。分離后的PBMC可以立即進(jìn)行培養(yǎng)(新鮮PBMC)也可以低溫保存(cryopreserved)在液氮中以備以后培養(yǎng)(冷凍PBMC)。對(duì)于凍存PBMC，應(yīng)在25°C下，在40%αMEM(GibcoInvitrogenLtd；Paisley,UK)中ΖΟΧΚΛιιΓ1的細(xì)胞整分樣補(bǔ)充20MmHEPES,lOOUmF1青霉素(penicilium)，100μgmF1硫酸鏈霉素(streptomycinsulphate)，4mM谷酉先胺(glutamine)(allfromSigma,Poole,UK)，50%熱滅活的自身血菜(heatinactivatedautologousplasma)和10%二甲基亞砜(DimethylSulphoxide)。然后將整分樣(aliquot)的細(xì)胞放在NalgeneCryo1°C凍存盒(NalgeEuropeLtd；Hereford,UK)中，先在_70°C中過(guò)夜保存，第二天再轉(zhuǎn)到液氮中保存。使用時(shí)，先將細(xì)胞快速溶解，然后用含有5%熱滅活的自身血漿的組織培養(yǎng)液(tissueculture)洗兩次，再以合適的濃度重新懸浮細(xì)胞以備培養(yǎng)。以臺(tái)盼藍(lán)染色(Trypanblueexclusion)來(lái)估計(jì)細(xì)胞存活率(Viability)大于95%。細(xì)胞培養(yǎng)(Cellculture)在48孑L組織培養(yǎng)板(NuncInternational,Costar,CorningInc.NewYorkUSA)中，將新鮮或者凍融的PBMC以含有1.δΧΙΟ^Γ1細(xì)胞的培養(yǎng)物確立在Iml的αMEM中。監(jiān)測(cè)10天細(xì)胞對(duì)50μgm”的PPD(Μ·A.A.F=CentralVet.Laboratory,Addlestone,Surrey,UK)和50μgmr1的人MBP的響應(yīng)。對(duì)照孔中不含抗原。經(jīng)過(guò)20小時(shí)，或者2，4，6，8和10天的培養(yǎng)，從每Iml培養(yǎng)基中取出兩份ΙΟΟμ1細(xì)胞懸浮液整分樣品，通過(guò)測(cè)定其對(duì)[3H]胸腺嘧啶(thymidine)的吸收來(lái)測(cè)定細(xì)胞的增值情況。在不含有抗原的培養(yǎng)基中觀察到的背景[3H]胸腺嘧啶吸收要從相應(yīng)PPD或MBP反應(yīng)中扣除掉，結(jié)果以δccpm的形式來(lái)表示。將剩余的細(xì)胞懸浮液離心并從細(xì)胞沉淀中提取RNA。將上清回收分裝后保存在-20°C。RNA和上清分別用來(lái)測(cè)定PBMC在不同培養(yǎng)間隔的細(xì)胞因子(IL_4，IL-5和干擾素-Y)基因的誘導(dǎo)和分泌情況。測(cè)定分泌的細(xì)胞因子流式微珠陣列分析法培養(yǎng)液上清中的細(xì)胞因子應(yīng)按照廠家的使用說(shuō)明利用流式微珠陣列法來(lái)分析(BD(TM)CBAHumanThl/Th2cytokinekit,BectonDickensonBiosciences,Cowley,Oxford,UK)ο根據(jù)FACSCalibur(BDBiosciences)測(cè)得的數(shù)據(jù)，利用BDCBA軟件將結(jié)果以圖和表的形式來(lái)表示。細(xì)胞因子的最小可計(jì)量結(jié)果分別是IL_52.4pgmr1,IL-42.Bpgmr1,IFN-γ7.Ipgmr10在MBP或者PPD的刺激下細(xì)胞因子的分泌如圖1和圖2所示，MBP或者PPD處理源于健康受試者的PBMCs后的4_10天內(nèi)會(huì)引起IL-5的分泌。而相應(yīng)的源于多發(fā)性硬化患者的PBMC分泌的IL-5明顯降低。但是如圖3所是，二者的PBMC分泌的IFN-Y針對(duì)MBP應(yīng)答則沒(méi)有顯著差別。對(duì)所有時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)分析表明，多發(fā)性硬化患者的PBMCIL-4和IL-5的產(chǎn)生明顯降低(圖4)。進(jìn)一步的實(shí)施例在進(jìn)一步的實(shí)施例中，PBMCs得于明顯健康的受試者，或者出現(xiàn)一個(gè)或者多個(gè)可能意味著多發(fā)性硬化早期臨床癥狀的受試者，或者已經(jīng)確診患有多發(fā)性硬化的受試者。使用上述方法可以測(cè)定這些各個(gè)體的通過(guò)PBMCs在MBP和/或PPD的刺激下分泌的IL_4，IL-5和IL-13。對(duì)每一個(gè)個(gè)體，Th2細(xì)胞因子的分泌來(lái)和對(duì)照的水平相比，其基于來(lái)自于多個(gè)健康受試者的平均值。對(duì)于明顯健康的個(gè)體，如果IL-4，IL-5和/或者IL-13比對(duì)照水平低，則意味著易患病體質(zhì)(predisposition)有發(fā)展成為多發(fā)性硬化的傾向或者是處在早期階段，說(shuō)明需要做進(jìn)一步的檢查來(lái)確診和/或需要采取一些預(yù)防措施。而對(duì)于出現(xiàn)了典型臨床癥狀的受試者，Th2細(xì)胞因子分泌水平的降低則可能確診了患有多發(fā)性硬化并且需要采11取初始的治療措施，例如以干擾素為基礎(chǔ)。對(duì)于已經(jīng)確診患有多發(fā)性硬化的受試者，其Th2細(xì)胞因子分泌相對(duì)于對(duì)照的降低可以用來(lái)檢測(cè)疾病的發(fā)展。權(quán)利要求1.確定受試者中自身免疫病狀況的方法，包括通過(guò)來(lái)自所述受試者的白細(xì)胞測(cè)定Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中疾病是脫髓鞘病。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中疾病是多發(fā)性硬化。4.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中Th2細(xì)胞因子是IL-5。5.根據(jù)上述權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中Th2細(xì)胞因子是IL-4。6.根據(jù)上述權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中Th2細(xì)胞因子是IL-13。7.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述方法包括提供了包含源于所述受試者的白細(xì)胞分離的樣品；和確定所述分離的樣品中Th2細(xì)胞因子的水平。8.權(quán)利要求7的方法，還包含將在所述分離的樣品中確定的Th2細(xì)胞因子水平和對(duì)照的Th2細(xì)胞因子水平進(jìn)行比較。9.權(quán)利要求8的方法，其中對(duì)照的Th2細(xì)胞因子水平是在來(lái)源于健康受試者的對(duì)照樣品中確定的，和從受試者分離的樣品中的Th2細(xì)胞因子水平低，則指示受試者中的自身免疫病。10.權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法，其中響應(yīng)于用試劑處理所述從受試者分離的樣品來(lái)測(cè)定從所述分離的樣品中Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，所述試劑在來(lái)自健康受試者的對(duì)照樣品中刺激Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。11.權(quán)利要求10的方法，其中試劑包含結(jié)核分枝桿菌的純蛋白衍生物。12.權(quán)利要求10的方法，其中的試劑是T細(xì)胞激活劑。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述T細(xì)胞激活劑是植物凝血素，抗CD3抗體，抗CD^抗體，佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯，細(xì)胞刺激劑或離子霉素。14.權(quán)利要求10的方法，其中所述試劑是與自身免疫病有關(guān)的自身抗原。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述試劑包含髓磷脂堿性蛋白或者其片段。16.權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離的樣品源自血液或者淋巴組織。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述分離的樣品包含純化的血液白細(xì)胞制備物。18.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生是通過(guò)確定Th2細(xì)胞因子的mRNA水平來(lái)測(cè)定的。19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生是通過(guò)測(cè)定Th2細(xì)胞因子蛋白的分泌水平來(lái)測(cè)定的。20.權(quán)利要求19的方法，其中Th2細(xì)胞因子蛋白的分泌是用流式微珠陣列法來(lái)測(cè)定的。21.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中受試者是人。22.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中確定受試者中自身免疫病的狀況包括檢測(cè)疾病，診斷疾病，監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，評(píng)估疾病預(yù)后，或者預(yù)測(cè)對(duì)疾病的易感性。23.Th2細(xì)胞因子作為測(cè)定受試者自身免疫病狀況的生物標(biāo)記物之用途。24.權(quán)利要求23的用途，其中所述自身免疫病包括多發(fā)性硬化。25.權(quán)利要求23或者M(jìn)的用途，其中所述Th2細(xì)胞因子包括IL-4，IL-5或IL-13。26.確定受試者自身免疫病狀況的試劑盒，包括一種或多種適合于通過(guò)來(lái)自所述受試者白細(xì)胞測(cè)定Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的試劑。27.權(quán)利要求沈的試劑盒，還包含促進(jìn)Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的試劑。28.權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述試劑包含T細(xì)胞激活劑。29.權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述試劑是與自身免疫病有關(guān)的自身抗原。30.權(quán)利要求四的試劑盒，其中所述自身免疫病是多發(fā)性硬化，并且所述試劑是髓磷脂堿性蛋白。31.權(quán)利要求沈-30中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述試劑盒包含與Th2細(xì)胞因子結(jié)合的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及用于自身免疫病的生物標(biāo)記，并且特別是涉及確定受試者自身免疫疾病狀況的方法，包含通過(guò)受試者的白細(xì)胞測(cè)定Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及有關(guān)的用途和試劑盒。文檔編號(hào)G01N33/68GK102317787SQ200880021775公開日2012年1月11日申請(qǐng)日期2008年4月23日優(yōu)先權(quán)日2007年4月24日發(fā)明者希瑟·斯特里特,戴維·賴思申請(qǐng)人:艾匹托普技術(shù)(布里斯托爾)有限公司