專利名稱：：通過差分帶電荷微粒遷移率進行脂蛋白分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體涉及利用離子遷移率測量裝置和方法進行用于診斷目的的微粒大小分析和包括脂蛋白的生物微粒的分析的領(lǐng)域。本發(fā)明還提供用于純化和分離包括但不限于脂蛋白和含有脂蛋白的生物復(fù)合物的生物分子的方法和儀器。
背景技術(shù)：
：提供以下描述僅僅幫助理解本發(fā)明。引用的文獻(xiàn)或提供的信息沒有一個被承認(rèn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。在美國，心血管疾病是死亡的主要原因。除了患者人口特征和當(dāng)前的健康外，用于測定將來心臟病風(fēng)險的最常用和接受的方法包括測定膽固醇和脂蛋白的血清濃度水平。存在完善確定的生化標(biāo)志——包括例如但不限于膽固醇和脂蛋白水平——的截斷值的推薦值，用于測定風(fēng)險。然而，膽固醇和脂蛋白測量顯然不是全部情況，因為多達(dá)50%的處于早期心臟疾病風(fēng)險的人們目前沒有被ATPIII指南(即，由NationalCholesterolEducationProgramandtheNationalHeart,LungandBloodInstitute發(fā)布的AdultTreatmentPanelIIIguidelines)所包含。測量血液中脂蛋白和其它脂質(zhì)的方法包括例如但不限于評價禁食的總膽固醇、三酸甘油脂、HDL(高密度脂蛋白)和/或LDL(低密度脂蛋白)膽固醇濃度。當(dāng)前，測量LDL膽固醇最廣泛使用的方法是間接Friedewald方法(Friedewald等，Clin.Chem.，1972，18:499-502)。Friedewald測定方法需要三個步驟1)測定血槳三酸甘油脂(TG)和總膽固醇(TC)，2)沉淀VLDL(極低密度脂蛋白)和LDL(低密度脂蛋白)，和3)定量HDL膽固醇(HDLC)。將VLDLC估算為血漿三酸甘油脂的五分之一，由公式LDLC=TC-(HDLC+VLDLC)計算LDL膽固醇濃度(LDLC)。雖然一般是有用的，但是在某些情況下Friedewald方法的準(zhǔn)確度有限。例如，誤差可能出現(xiàn)在三個步驟的任何一步中，部分因為這個方法要求在每個步驟中使用不同的方法。而且，F(xiàn)riedewald方法在某種程度上為間接的，因為它假定VLDLC濃度是血漿三酸甘油脂的五分之一。因此，當(dāng)一些患者的VLDL偏離這個比例時，出現(xiàn)進一步的不準(zhǔn)確。評價血液脂蛋白的另一種方法考慮測量脂蛋白的大小和密度。由于遺傳和非遺傳的影響，脂蛋白的大小分布在個體中呈現(xiàn)不同。脂蛋白的直徑一般為大約7nm到大約120nm的范圍。在這個直徑大小范圍中，存在為心血管疾病重要預(yù)測物的微粒亞組分。例如，在血流中，VLDL運輸三酸甘油脂；因此，血液中高的VLDL水平是高甘油三酯血癥的指示。通過顯示物質(zhì)數(shù)量為脂蛋白大小或密度的函數(shù)的分析技術(shù)，可以識別這些亞組分。關(guān)于脂蛋白密度分析，通過在不同鹽密度背景中的分析超離心，可以分析超離心分離的脂蛋白的漂浮性質(zhì)，以便測定水合LDL的密度，如在Lindgren等，BloodLipidsandLipoproteins:QuantitationCompositionandMetabolism,Ed.G丄Nelson,Wiley，1992，p.181-274中顯示，其通過引用并入本文。例如，通過使用已知為平衡密度梯度超離心分離的制備分離技術(shù)，基于密度或直徑，LDL類別可以被進一步地分成七個亞類。已知特定LDL亞類LDL-IIIa、IIIb、IVa和IVb的升高水平與包括動脈粥樣硬化的CHD(S卩，冠心病)增加的風(fēng)險密切相關(guān)。而且，測定總血清膽固醇水平以及LDL和HDL組分中的膽固醇水平常規(guī)地用作冠心病風(fēng)險的診斷試驗。脂蛋白類和亞類分布是更具預(yù)測性的試驗，然而，由于它昂貴和費時，因此醫(yī)生一般安排它僅用于有限數(shù)量的患者。關(guān)于脂蛋白大小的測量，目前沒有單一的接受方法。在臨床環(huán)境中測量脂蛋白大小的已知方法包括垂直自動方案(verticalautoprofile)(VAP)(參見，例如Kulkarni等，J.Lip.Res.，1994,35:159-168)，其中使用流式分析儀(flowanalyzer)對脂蛋白類中膽固醇進行酶法分析，隨后進行分光光度測定并分析得到的數(shù)據(jù)，所述脂蛋白類是通過短暫方定轉(zhuǎn)單垂直超離心(shortspinsingleverticalultracentrifugation)進行分離的。另一種方法(參見例如Jeyarajah，E.J.等，ClinLabMed.，2006,26:847-70)使用核磁共振(NMR)測定脂蛋白亞類的濃度。在這個方法中，獲得血漿或血清樣品的NMR化學(xué)位移譜。觀察到的整個血漿樣品的譜隨后通過計算機方法與先前獲得的脂蛋白亞類NMR譜的已知加權(quán)和進行匹配。給出樣品譜和計算譜之間最佳擬合的加權(quán)因子隨后用于估算血液樣品中組成脂蛋白亞類的濃度。另一種方法，梯度凝膠電泳分離(參見例如美國專利5，925，229;通過在此引用并入)是分離LDL亞類的梯度凝膠電泳方法。通過梯度凝膠電泳分離LDL組分，產(chǎn)生了與通過超離心分離獲得的結(jié)果相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。這種方法產(chǎn)生了LDL亞類的高分辨率，并且主要由研究工作實驗室使用這種方法。然而，凝膠分離方法——其依賴于隨后被光學(xué)測量的所有成分的均勻染色——受制于非均勻的顯色性。也就是，不是所有的脂蛋白同等地良好染色。因此，有差別的染色吸收可能產(chǎn)生錯誤的定量結(jié)果。另外，不均勻的顯色性可能產(chǎn)生錯誤的定性結(jié)果，因為測量的峰可以被扭曲到足夠的程度以致引起脂蛋白的一類或一個亞類與另一類或亞類混淆。而且，梯度凝膠電泳可能花費許多小時才完成。實際上，定量和定性測定來自生物樣品的脂蛋白的更近方法已經(jīng)由Be皿er等(美國專利7，259，018;通過在此引用并入)描述，該方法使用微粒大小和/或離子遷移率裝置。發(fā)明概述通過本發(fā)明提供用于對脂蛋白進行差分帶電荷微粒遷移率分析(differentialcharged-particlemobilityanalysis)(在本文也稱為"離子遷移率分析")的樣品的制備方法，和可用于對脂蛋白進行差分帶電荷微粒遷移率分析的儀器，所述對脂蛋白進行差分帶電荷微粒遷移率分析利用氣相電泳遷移分子分析儀。在第一方面，本發(fā)明提供脂蛋白的純化方法，該脂蛋白適合于脂蛋白類和亞類的差分帶電荷微粒遷移率分析，該方法包括以下步驟(a)制備含有在樣品下面的第一溶液的離心管，該樣品具有一種或多種脂蛋白和非脂蛋白成分，該第一溶液具有大于1.00g/mL和小于或等于大約1.21g/mL的第一密度；和(b)使離心管受到足以使非脂蛋白成分向離心管底部遷移并且遠(yuǎn)離脂蛋白的離心，由此提供純化的脂蛋白。在一些實施方式中，第一密度的范圍為大約1.15g/mL到大約1.21g/mL。在一些實施方式中，第一溶液優(yōu)選地為水溶液，更優(yōu)選地為水或其氖化形式。在本發(fā)明的這個方面的情況下，通過處理哺乳動物的血液標(biāo)本，獲得含有脂蛋白的樣品，如本文所述，該處理任選地包括通過加入包括例如但不限制于Na、K和/或Cs的Cl、Br和/或I鹽的鹽調(diào)整密度。本發(fā)明的這個方面進一步在某些實施方式中提供在離心管里面、在樣品上面并且鄰近樣品的第二溶液，該第二溶液優(yōu)選地為比第一溶液的密度低。因此，第二溶液的密度大于或等于1.00g/mL并小于第一溶液的密度。在一些實施方式中，第二溶液是水溶液。出人意料地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在離心管中用具有較低密度的溶液覆蓋含脂蛋白的樣品導(dǎo)致離心分離后脂蛋白的回收提高。不希望被任何理論約束，相信從較致密的含脂蛋白溶液到較不致密的、優(yōu)選地水溶液的、覆蓋在上面的第二溶液的離子流調(diào)節(jié)了其中脂質(zhì)的浮力，導(dǎo)致脂蛋白的回收提高。如本文使用的，"離心"指通過使溶液在適當(dāng)?shù)膬x器中受到高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，根據(jù)密度和密度相關(guān)的分子量，分離或分析在溶液中的物質(zhì)。如本文使用的，"純化"和相似的術(shù)語指特定成分的相對濃度相對于其它成分增加。例如但不限于，在例如損失脂質(zhì)組分的情況下，從脂蛋白溶液中去除脂質(zhì)構(gòu)成脂蛋白組分的純化。應(yīng)該理解的是，在離心的情況下"純化"和相似的術(shù)語指在離心后離心管中充分的分離，以允許通過本領(lǐng)域熟知的方法包括但不限于抽出和/或分級，提取分離的成分。出人意料地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在離心前，減小含有脂蛋白的溶液的密度——例如，但不限于通過減小其鹽濃度——導(dǎo)致脂蛋白的某些組分包括LDL和HDL組分的回收提高。如本文使用的術(shù)語"脂蛋白"和"脂蛋白微粒"指從哺乳動物的血液中獲得的微粒，其包括以非共價鍵生物學(xué)裝配以包封例如但不限于膽固醇和其它脂質(zhì)的脫脂載脂蛋白。脂蛋白優(yōu)選地指具有大約7到120nm大小范圍的生物微粒，并且包括如本文所定義的VLDL(極低密度脂蛋白)、IDL(中密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)、Lp(a)[脂蛋白(a)]、HDL(高密度脂蛋白)和乳糜微粒。如本文使用的術(shù)語"脫脂載脂蛋白"指組成脂蛋白的結(jié)合脂質(zhì)的蛋白質(zhì)。如在本領(lǐng)域中已知的，脫脂載脂蛋白分成五個大類:ApoA、ApoB、ApoC、ApoD和ApoE。如本文使用的術(shù)語"生物微粒"指源于生命來源(livingsourece)的具有非共價結(jié)合分子裝配體的物質(zhì)。生物微粒的非限制的例子包括例如由脫脂載脂蛋白和脂質(zhì)裝配的脂蛋白；由非共價結(jié)合的外殼蛋白和糖蛋白裝配的病毒成分；由抗體和它們相關(guān)的抗原裝配的免疫復(fù)合物等。如本文使用的術(shù)語"標(biāo)志"、"生化標(biāo)志"和相似的術(shù)語指具有與疾病或狀況已知相關(guān)性的自然出現(xiàn)的生物分子(或其衍生物)。在數(shù)值情況下，如本文使用，術(shù)語"大約"表示其值的+/_10%。在另一方面，本發(fā)明提供純化脂蛋白的方法，該方法包括以下步驟(a)制備含有樣品和位于樣品的下面并鄰近樣品的第一溶液的離心管，樣品包括一種或多種脂蛋白和非脂蛋白成分，其中樣品還包括活性綠葡聚糖(ReactiveGreendextran)和葡聚糖硫酸酯(DS)，其中第一溶液含有氧化氖(D20);和(b)使離心管受到足以使非脂蛋白成分向離心管底部遷移并遠(yuǎn)離脂蛋白的離心。在一些實施方式中，隨后移出如此分離的純化脂蛋白，用于差分帶電荷微粒遷移率分析。在一些實施方式中，第一溶液的密度為1.0g/mL到大約1.21g/mL。在一些實施方式中，第一溶液的密度為1.00g/mL到大約1.10g/mL。在一些實施方式中，第一溶液基本上為D20。在另一方面，本發(fā)明提供用于差分帶電荷微粒遷移率分析的脂蛋白的純化方法，該方法不包括離心，該方法包括以下步驟a)使含有脂蛋白和非脂蛋白的溶液與一種或多種多陰離子化合物和一種或多種二價陽離子混合；b)使含有脂蛋白的沉淀物在混合溶液中形成；和c)在步驟b)之后，收集沉淀的脂蛋白并在再溶解之后對沉淀的脂蛋白進行差分帶電荷微粒分析。在另一方面，本發(fā)明提供用于差分帶電荷微粒遷移率分析的脂蛋白的純化方法，該方法不包括離心，該方法包括以下步驟a)使含有脂蛋白和非脂蛋白的溶液與一種或多種脂蛋白_捕獲配體混合，該脂蛋白_捕獲配體能夠結(jié)合脂蛋白，形成脂蛋白/脂蛋白_捕獲配體復(fù)合物；b)分離脂蛋白/脂蛋白-捕獲配體復(fù)合物；和c)從脂蛋白/脂蛋白-捕獲配體復(fù)合物釋放脂蛋白并對脂蛋白進行差分帶電荷微粒遷移率分析。在一些實施方式中，脂蛋白選自HDL、LDL、Lp(a)、IDL和VLDL。在一些實施方式中，脂蛋白_捕獲配體選自適配體和抗體。在一些實施方式中，脂蛋白-捕獲配體是抗體。在考慮分離和/或純化本文描述的脂蛋白方面的某些實施方式中，本發(fā)明提供分析脂蛋白的大小分布的方法，該方法包括以下步驟(a)依照本文描述的任一方法提供一種或多種脂蛋白；和(b)對一種或多種脂蛋白進行帶電荷微粒遷移率分析，由此測定脂蛋白的大小分布。在以上方面的一些實施方式中，方法用于測定患者樣品中的HDL、LDL、IDL和VLDL和更優(yōu)選地為HDL、LDL、IDL、VLDL和Lp(a)的濃度?；颊邩悠穬?yōu)選為血漿或血清。本文描述的方法也可以包括使用內(nèi)標(biāo)例如一種或多種標(biāo)記的脂蛋白(例如，熒光標(biāo)記)以在處理期間監(jiān)測樣品損耗，以獲得被評估的起始樣品中脂蛋白濃度的更準(zhǔn)確測定。在另一方面，本發(fā)明提供分析脂蛋白大小分布的方法，該方法包括以下步驟(a)對進行差分帶電荷微粒遷移率分析的一種或多種脂蛋白，在微粒大小的一個或多個區(qū)域中，測定差分遷移率微粒大小分布；(b)減去非脂蛋白試劑或非脂蛋白樣品物質(zhì)對微粒大小分布的供量(基值，contribution)，獲得脂蛋白微粒大小分布；和(c)輸出脂蛋白微粒大小分布到顯示器、打印機或存儲器。在另一方面，本發(fā)明提供包括儲存在其上的計算機編碼的計算機可讀媒介，用于分析脂蛋白大小分布的計算機編碼包括(a)對進行差分帶電荷微粒遷移率分析的一種或多種脂蛋白，在微粒大小的一個或多個區(qū)域中，測定差分遷移率微粒大小分布；(b)減去非脂蛋白試劑或非脂蛋白樣品物質(zhì)對微粒大小分布的供量，獲得脂蛋白微粒大小分布；和(c)輸出脂蛋白微粒大小分布到顯示器、打印機或存儲器。在另一方面，本發(fā)明提供用于差分帶電荷微粒遷移率分析的儀器，其包括(a)—個或多個適合于通過毛細(xì)管運輸樣品的泵，(b)當(dāng)樣品流入毛細(xì)管里面時，適合于使樣品的微粒帶電荷的電離器，和(c)適合于對帶電荷微粒的樣品進行差分帶電荷微粒遷移率分析的離子遷移率分析儀。電離器可以包括在一部分毛細(xì)管周圍的傳導(dǎo)性連接器(皿ion)。在一種實施方式中，傳導(dǎo)性連接器在部分毛細(xì)管中形成微量滴定區(qū)(microtiteregion)并施加電荷到流過其中的樣品上，因而使樣品的微粒帶電荷。本儀器的某些實施方式還包括適合于提供用于差分帶電荷微粒遷移率分析的樣品到一個或多個泵的自動進樣器。在一些實施方式中，一個或多個泵可以包括適合于提供樣品到納流量泵(nanoflowpump)的高流量泵，所述納流量泵適合于提供樣品到毛細(xì)管。高流量泵可以以大約15-25微升/分鐘的速度泵送樣品，以及納流量泵可以以大約100-200納升/分鐘的速度泵送樣品。附圖簡述圖1顯示在3.7小時的超離心期間密度對脂蛋白從血漿樣品中回收的影響。使用不同密度溶液并離心3.7小時，一式兩份制備樣品。在收集脂蛋白組分后，在差分帶電荷微粒遷移率分析之前進行透析。每個圖顯示每個重復(fù)的曲線。溶液的密度A=1.23g/mL;B=1.181g/mL;C=1.170g/mL;D=1.165g/mL。橫坐標(biāo)是脂蛋白直徑(nm)，和縱坐標(biāo)是任意刻度的質(zhì)量坐標(biāo)，該質(zhì)量坐標(biāo)與作為尺寸(即直徑)的函數(shù)算出的微粒實際數(shù)目線性相關(guān)。圖2顯示在離心分離試驗中使用020或低鹽方案(沒有D^)從血漿中回收脂蛋白的比較。暗的曲線反映使用020作為稠密溶液(1.107g/mL)的2小時離心。淺的曲線反映使用KBr作為稠密溶液(1.151g/mL)的3.7小時離心。A-表示2小時離心的白蛋白的峰高；B-表示3.7小時離心的白蛋白峰高。橫坐標(biāo)是脂蛋白直徑(nm)，和縱坐標(biāo)是任意刻度的質(zhì)量坐標(biāo)，如在圖1的圖例中所討論。圖3顯示在離心分離試驗中使用與RGD/DS[RGD:與葡聚糖結(jié)合的活性綠19(ReactiveGreen19)(RG19);RGD/DS:與DS結(jié)合的RGD]聯(lián)合的D20，從血槳回收ApoAl、ApoB和總膽固醇(TC)的結(jié)果。橫坐標(biāo)表示測量的分析物。與每個框相關(guān)的數(shù)字指唯一的患者識別數(shù)字系統(tǒng)。圖4顯示使用RGD、在離心純化后從血漿回收脂蛋白的結(jié)果。RGD以不同濃度加入到樣品并且使用D20作為稠密溶液離心2小時15分鐘。白蛋白峰高被表示出使用的RGD的四種不同濃度;A，10mg/mLRGD;B，15mg/mLRGD;C，20mg/mLRGD;和D，25mg/mLRGD。橫坐標(biāo)是脂蛋白直徑(nm)，和縱坐標(biāo)是任意刻度的質(zhì)量坐標(biāo)，如在圖1的圖例中所討論。圖5顯示在用RGD和乙二胺四乙酸(EDTA)、或用RGD/DS和EDTA和任選地醋酸銨(AA)離心純化后從血漿回收脂蛋白的結(jié)果。圖例(A)用7.5mg/mLRGD和2.5mg/mLDS提取，用與5ug/mLDS—起的25mM醋酸銨稀釋；(B)用7.5mg/mLRGD和2.5mg/mLDS提取，用25mM醋酸銨稀釋；(C)用7.5mg/mLRGD提取，用與5ug/mLDS—起的25mM醋酸銨稀釋；(D)用7.5mg/mLRGD提取，用25mM醋酸銨稀釋。橫坐標(biāo)是脂蛋白直徑(nm)，和縱坐標(biāo)是任意刻度的質(zhì)量坐標(biāo)，如在圖1的圖例中所討論。圖6顯示在傳統(tǒng)的密度分離和透析后，在稀釋的緩沖液中包含DS的結(jié)果。A和B:在醋酸銨稀釋緩沖液中包含5ug/mLDS。C和D:在醋酸銨稀釋緩沖液中沒有DS。橫坐標(biāo)是脂蛋白直徑(nm)，和縱坐標(biāo)是任意刻度的質(zhì)量坐標(biāo)，如在圖1的圖例中所討論。圖7顯示通過差分帶電荷微粒遷移率分析獲得的脂蛋白曲線與關(guān)于脂蛋白組分的典型報告。橫坐標(biāo)是脂蛋白直徑(nm)，和縱坐標(biāo)是質(zhì)量，由差分帶電荷微粒遷移率數(shù)據(jù)和本領(lǐng)域已知的參數(shù)計算。用交叉線顯示的區(qū)域表示相對風(fēng)險，斜線部分表示中等風(fēng)險，垂直線部分表示較低風(fēng)險，交叉線部分表示較高風(fēng)險，和陰影部分表示不確定的風(fēng)險。圖8圖解依照本發(fā)明的實施方式的用于差分帶電荷微粒遷移率分析的儀器。圖9A和9B圖解與圖8的儀器一起使用的連接器(conjunctiveunions)的實施方式。發(fā)明詳述如在表1中顯示，"VLDL、IDL、LDL和HDL"指脂蛋白的分類。應(yīng)該理解的是，在表l中使用的尺寸的值通過凝膠電泳的方法來測定，如本領(lǐng)域已知的。用本文公開的差分帶電荷微粒遷移率分析方法，與用凝膠電泳獲得的數(shù)據(jù)相比，觀察到用差分帶電荷微粒遷移率分析獲得的脂蛋白直徑的所有測量值轉(zhuǎn)變?yōu)檩^小的直徑。不希望被任何理論約束，相信這種不同是由于測量凝膠尺寸引起。這種轉(zhuǎn)變表現(xiàn)出是線性相關(guān)的和通過下式近似0.86*凝膠直徑=IM直徑表1描述使用傳統(tǒng)的凝膠電泳測量，指定給各種脂蛋白組分的標(biāo)準(zhǔn)類和亞類名稱具有亞類VLDLI和II的極低密度脂蛋白(VLDLs);具有亞類IDLI和II的中密度脂蛋白(IDLs);具有亞類I、IIa、IIb、IIIa、IIIb、IVa和IVb的低密度脂蛋白(LDLs);和高密度脂蛋白(HDLs)，其一般包括數(shù)個亞類，例如HDL1Ia、IIb、IIIa、IIIb和IIIc。表l.主要的脂蛋白類、亞類、密度和和微粒大小<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>不希望被任何理論約束，相信觀察到的差分帶電荷微粒遷移率分析直徑和凝膠電泳直徑之間的不同，可能也是因為在電泳凝膠的固有外加電場影響下與凝膠基質(zhì)相互作用的脂蛋白的變形。該尺寸差異也可能是因為用于轉(zhuǎn)化微粒密度(由分析超離心分離獲得)為電子顯微鏡術(shù)獲得的微粒大小的歷史數(shù)據(jù)。如本文使用，"乳糜微粒"表示具有大小為70-120nm、相應(yīng)密度小于1.006g/mL的生物微粒。沒有發(fā)現(xiàn)乳糜微粒在預(yù)測心臟疾病例如CHD中具有任何臨床意義。在本領(lǐng)域已知的"ApoA"是HDL的蛋白質(zhì)成分。"ApoB"是LDL、IDL、Lp(a)和VLDL的蛋白質(zhì)成分，并且實際上為低密度脂蛋白的主要的脫脂載脂蛋白，其具有人遺傳基因座(geneticlocus)2p24_p23，如本領(lǐng)域已知的。如本文使用，"白蛋白"指組成大約60%的血漿的普遍存在的蛋白質(zhì)，其具有大約1.35g/mL的密度，如本領(lǐng)域已知的。"Lp(a)"和"脂蛋白(a)"指在血清中發(fā)現(xiàn)的具有不同于IDL和LDL的分子組成的脂蛋白類型，發(fā)現(xiàn)其與脫脂載脂蛋白a[即o(a)]復(fù)合。Lp(a)具有與LDL和IDL重疊的微粒大小，并且因此當(dāng)樣品中存在Lp(a)微粒時可能干擾微粒大小分析。雖然一些患者具有天然存在的低Lp(a)濃度，但是相信對于那些具有顯著Lp(a)濃度的患者，在LDL大小測量之前去除Lp(a)以排除其他不準(zhǔn)確的測量是好的做法。以這種方式，可以避免可能的Lp(a)大小干擾問題。本發(fā)明考慮用于差分帶電荷微粒遷移率和制備差分帶電荷微粒遷移率的樣品中的儀器和方法。差分帶電荷微粒遷移率利用這樣的原理特定大小和電荷狀態(tài)的微粒當(dāng)在層流中傳送穿過電場時以可預(yù)測的方式表現(xiàn)。因此，差分帶電荷微粒遷移率分析是當(dāng)帶電荷微粒暴露于電場時，測定被分析的帶電荷微粒的大小的技術(shù)。電遷移率是離子的物理性質(zhì)并且與離子受到電場時獲得的速度相關(guān)。電遷移率Z被定義為z2￡(1)其中V二終速和E=引起微粒運動的電場。微粒直徑可以由以下獲得Z=3—(2)其中n=在微粒上的電荷數(shù)量(在本情況下為單電荷)，e=1.6X10—19庫侖/電荷，C。二微粒大小依賴性滑移校正因子(slipcorrectionfactor),n=氣體粘度，和(1=微粒直徑。因此，解出d提供以下的關(guān)系wCc.五77d=3叨r(3)。因此，微粒直徑作為已知參數(shù)的函數(shù)的明確關(guān)系產(chǎn)生。通過把參數(shù)設(shè)置為不同的值，如在以下進一步地描述和本領(lǐng)域已知的，可以選擇不同微粒直徑的帶電荷微粒。在差分帶電荷微粒遷移率分析的優(yōu)選方法中，在分析期間改變作用于帶電荷微粒的電場強度E。在差分帶電荷微粒遷移率分析中，使用一系列的層流運送微粒(例如，脂蛋白等)穿過系統(tǒng)。在易揮發(fā)的溶液中的脂蛋白被引入含有大約5%C02的電霧化槽(electrospraychamber)中，其中脂蛋白脫溶劑。在電霧化槽中，脫溶劑的、帶電荷的脂蛋白被電離空氣中和，電離空氣例如但不限于通過在槽中的a粒子發(fā)射器引入。根據(jù)Fuch式，可預(yù)測比例的微粒從含有單電荷的槽浮出并且被從槽運送到差分遷移率分析儀(DifferentialMobilityAnalyzer)(DMA)。有關(guān)Fuch公式細(xì)節(jié)，參考Fuchs，N.A.-TheMechanicsofAerosols,Macmillan，1964。"差分遷移率分析儀"、"DMA"和類似術(shù)語指基于離子的電遷移率分類帶電微粒的裝置，如在本領(lǐng)域已知和在本文描述的。在差分帶電荷微粒遷移率分析13中，當(dāng)微粒具有已知的均勻電荷時，可以從其遷移率確定分類的微粒的大小。在DMA中，微粒在槽的頂部外表面進入并在快速流動的層流(即，"鞘流(sheathflow)")中被運送。鞘流是被過濾的(除去微粒)空氣，其不斷地以20升/分鐘的等速度再循環(huán)穿過DMA。當(dāng)微粒穿過DMA(在鞘流中運行)時，槽上的電勢以已知的速率上升。當(dāng)電勢改變時，通過在槽底部內(nèi)表面的切口收集不同直徑的微粒。微粒根據(jù)它們的電荷和直徑順著非直線路徑穿過DMA。在任何給定的電勢下，已知大小的微粒將沿著會允許它們穿過收集切口的路徑。穿過收集切口的微粒被另一個不同的層流氣流加快，并且被運送到粒子計數(shù)器。粒子計數(shù)器通過壓縮使微粒增大到例如通過激光檢測系統(tǒng)可以被檢測和計數(shù)的大小。了解當(dāng)微粒被收集時被施加到DMA的電勢允許準(zhǔn)確測定以該大小存在的微粒直徑和微粒數(shù)量。收集這種數(shù)據(jù)并儲存在接收器(bins)中，作為不同微粒大小的時間函數(shù)。用這種方式，基于收集數(shù)據(jù)所需的時間、引入電霧化裝置中的樣品流速和該大小的帶電荷微粒的數(shù)量，任何給定大小范圍的微粒的數(shù)量可以被測定并轉(zhuǎn)化為微粒的濃度。在考慮脂蛋白的分離和/或純化的本發(fā)明方法中，最初的樣品收集和制備可以通過本領(lǐng)域熟知的方法進行。典型地，首先取出2到5ml的空腹血液樣品。在已經(jīng)禁食了至少12小時時間的受試者中，乳糜微粒一般不存在；因此，通過禁食消除了VLDL大小和乳糜微粒大小的重疊。樣品隨后先在離心機(例如，臨床離心機)中旋轉(zhuǎn)，優(yōu)選地以大約2000XG離心大約IO分鐘，該離心足以從樣品中去除細(xì)胞成分。在這個過程中，密度更大的細(xì)胞成分在樣品底部分層。隨后使用本領(lǐng)域熟知的方法例如吸出，抽出余下在上面的含有脂蛋白的較小密度血漿樣品。過去，在制備用于離心中，血漿樣品可以使用無機鹽如氯化鈉(NaCl)、溴化鈉(NaBr)等的高純度溶液或固體調(diào)整密度到特定密度。在一些以前的方案中，可以選擇特定密度大于或等于待分析的脂蛋白物質(zhì)的最高密度，使得當(dāng)密度分層時，脂蛋白物質(zhì)將漂浮。"密度分層"和類似術(shù)語指在進行離心的溶液中成分的分層。這些密度在表l中列表。密度調(diào)整的樣品隨后可以被超離心，例如在100，OOOXG進行大約18小時，以從脂蛋白中分離非脂蛋白。優(yōu)選地通過超離心，非脂蛋白蛋白質(zhì)特別是白蛋白可以從血漿樣品中去除。在超離心期間，脂蛋白將漂浮到樣品的頂部。因此，通過從密度調(diào)整的最低密度到最高密度順序地離心，脂蛋白的各種類和亞類可以被順序地提取。一般地，在離心樣品的提取后，需要透析步驟，以除去為調(diào)整密度而引入的鹽，在本領(lǐng)域熟知的條件下，該透析步驟一般需要4-12小時。本文描述的含有脂蛋白樣品的離心條件在生物化學(xué)分離領(lǐng)域是眾所周知的。例如但不限于，樣品一般以223，000XG在l(TC離心l-4小時。在一些實施方式中，離心使用50，000-100，000、100，000-120，000、120，000-150，000、150，000-200，000、200，000-230，000、230，000-250，000XG的離心力或更大的力。在一些實施方式中，離心的時間是1、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18小時或甚至更長。在差分帶電荷微粒遷移率分析之前，整分試樣的脂質(zhì)組分被從離心管的頂部移出(例如，10-200PL)并以pH7.4的25mM醋酸銨(AA)、0.5mM氫氧化銨稀釋(例如，l:800)。有利地，在本文描述的一些實施方式中，透析步驟不必與本發(fā)明的方法連用，使得分析需要較少的時間。在考慮脂蛋白的本發(fā)明實施方式中，脂蛋白選自HDL、LDL、IDL、Lp(a)和VLDL。在一些實施方式中，脂蛋白是HDL。在考慮脂蛋白的本文提供方面的一些實施方式中，脂蛋白可以源于血漿樣品，其通過本領(lǐng)域熟知或如本文描述的方法獲得。術(shù)語"生物樣本"、"生物樣品"和相似的術(shù)語指外植的、取出的或其它方法收集的生物組織或流體，其包括例如但不限于全血、血清和血漿。在血液情況下術(shù)語"血漿"指當(dāng)分離全血成為固體和液體成分時獲得的流體。在血液情況下術(shù)語"血清"指在血液已經(jīng)被凝塊后，當(dāng)分離全血成為固體和液體成分時獲得的流體。在本發(fā)明的任一方面的一些實施方式中，生物樣品是人源的。在本文提供的任一方面的一些實施方式中，生物樣品是血清。在本文提供的任一方面的一些實施方式中，生物樣品是血漿。在考慮離心的本發(fā)明的一些實施方式中，離心沒有達(dá)到平衡。"離心平衡"和相似術(shù)語指進行足夠時間和在足夠離心力下的離心，使得被離心的溶液的成分已經(jīng)達(dá)到中密度浮力，如本領(lǐng)域所熟知的。出人意料地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，縮短的離心方案——如在本文描述其中離心平衡沒有達(dá)到，然而可以提供脂蛋白的顯著純化。在考慮離心含有脂蛋白和非脂蛋白成分的樣品的本發(fā)明的一些實施方式中，純化的脂蛋白在離心后從離心管的頂端部分收集。"離心管的頂端部分"和類似術(shù)語指當(dāng)從離心機轉(zhuǎn)子外面觀看時，在離心管上面部分中的液體，其可以但不必包括在極其上面的液體。進一步，涉及純化脂蛋白的本發(fā)明的任一方法，已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)離心沒有到平衡時，溶液密度減少到小于或等于大約1.21g/mL的值實際上導(dǎo)致LDL和HDL的回收提高，因而導(dǎo)致LDL和HDL純化。通過本領(lǐng)域熟知的各種物理生物化學(xué)方法，包括但不限于平衡密度超離心和分析超離心(analyticultracentrifugation)，可以直接測定脂蛋白密度?；谖⒘４笮『臀⒘４笮『兔芏戎g的已知關(guān)系，也可以間接地測定脂蛋白密度。通過本領(lǐng)域熟知的各種生物化學(xué)方法，包括但不限于本文描述的方法，可以測定脂蛋白大小。離子遷移率分析也稱為離子電遷移率或帶電荷微粒遷移率分析，比本文描述的其它方法具有優(yōu)勢，因為它不僅基于物理原理準(zhǔn)確地測量微粒大小，而且直接計數(shù)以每個尺寸存在的微粒數(shù)量，因而提供直接測量脂蛋白大小和每種脂蛋白的濃度。在分析氣溶膠中的微粒中通常使用離子遷移率分析，并且適合于離子遷移率分析的分析器已經(jīng)適合于分析大的生物大分子。離子遷移率分析是非常靈敏和準(zhǔn)確的方法，然而其具有離子遷移率分析測量引入系統(tǒng)的所有微粒的缺點。因此，最重要的是在分析之前分離和/或純化感興趣的化合物。脂蛋白是這種方法的候選者，因為脂蛋白可以基于密度和本文描述的其它特征與其它血白蛋白中分離。通過用各種密度的溶液離心純化的血漿樣品的脂蛋白的示例性差分帶電荷微粒遷移率結(jié)果在圖1中顯示。在這些試驗中，血清樣品(25uL)被覆蓋在四種不同密度鹽(KBr)溶液的層(200uL)上。溶液的密度是1.165、1.170、1.181和1.23g/mL。每個樣品在223，000XG超離心3.7小時的時間。去除在離心分離后的頂部100uL。每個密度的分級脂蛋白樣品被用pH7.4的醋酸銨(25mM)、氫氧化銨(0.5mM)透析過夜。在透析之后，通過差分帶電荷微粒遷移率分析每個樣品，得到的曲線在圖1中顯示。在與1.23g/mL相比更低密度處所見的HDL區(qū)域中，脂蛋白曲線的降低是明顯的。不希望被任何理論所約束，這種觀察結(jié)果被認(rèn)為是由于使用較低密度鹽溶液而更有效去除了血漿蛋白質(zhì)。進一步參考圖l，橫坐標(biāo)是微粒大小(即，直徑)，和縱坐標(biāo)是任意刻度的質(zhì)量。在以微粒質(zhì)量對獨立變量(例如大小、密度、遷移率等)分布中曲線下的面積直接表示脂蛋白微粒質(zhì)量。測量技術(shù)依賴于作為大小(直徑)的函數(shù)對各個微粒計數(shù)。因此可能使用微粒的體積和密度，將特定大小的微粒數(shù)轉(zhuǎn)化為質(zhì)量值。脂蛋白的密度是微粒大小的熟知的函數(shù)并且可以從例如文獻(xiàn)中獲得。與該圖相關(guān)的質(zhì)量值被簡單地標(biāo)刻度，表示為相對值，但是使用稀釋因子以及樣品和空氣穿過離子遷移率分光計的流速，可以轉(zhuǎn)化為血漿中脂蛋白的實際質(zhì)量。因此，在一些實施方式中，在非平衡離心之前，調(diào)整含脂蛋白溶液的密度到低于分離較高密度脂蛋白(例如，HDL)所預(yù)期的密度，實際上導(dǎo)致HDL和LDL的分離。有利地，減小含有脂蛋白樣品的密度的方法也導(dǎo)致與白蛋白的分離提高。在考慮離心含有脂蛋白和非脂蛋白成分的樣品的本文提供方面的一些實施方式中，第一溶液包括D^。在一些實施方式中，通過020的含量基本確定第一溶液的密度，其中第一溶液具有1.00到大約1.10g/mL的密度。D20的密度在25"近似為1.107gm/mL。因此，在本發(fā)明的一些實施方式中，含水的成分包括0-99%020或甚至更高。在一些實施方式中，D20的量在例如但不限于10-99、20-99、30-99、40-99、50-99、10-90、20-90、30-90、40-90、50-90%等的范圍中。在一些實施方式中，020的含量是一個具體值，其例如但不限于大約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或甚至100%的020。在一些實施方式中，第一溶液基本上為D20。術(shù)語"本質(zhì)上020"指包括水性成分而不具有另外加人的H20的D20。術(shù)語"基本上為DW和類似術(shù)語指在大于50%的范圍中的D20含量，例如但不限于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或甚至100%D20。在這個方面的一些實施方式中，含有脂蛋白的樣品包括很少任何加入的鹽，如果有的話。參考圖2(試驗條件在實施例1中提供)，其顯示使用D20而沒有另外的密度調(diào)整用鹽以及使用無020的低密度鹽溶液進行離心操作的結(jié)果，在2小時(D20)和3.7小時(低密度鹽溶液)后，觀察到LDL和某些HDL組分(例如，HDL-IIb和HDL-IIa)的大約相同的回收。進一步參考圖2，020和低密度鹽離心過程的曲線產(chǎn)生了相似的曲線，盡管對于020樣品，白蛋白增加(在HDL第3區(qū)域起始的峰)是因為離心時間減少判斷的。不希望被任何理論所約束，使用020，減少了鹽含量同時增加了密度，表現(xiàn)出導(dǎo)致從含有脂蛋白的樣品中離心和純化脂蛋白需要較短的時間。參考圖3，在圖3的使用條件(實施例2的試驗條件)下，觀察到離心后ApoAl和ApoB近似相等的回收，這表明用D20獲得的較低密度沒有產(chǎn)生更大的、較小密度微粒的選擇性回收。在涉及在離心之前通過在含有脂蛋白的樣品溶液上面并鄰近放置較小密度的溶液來純化脂蛋白的本發(fā)明方法的一些實施方式中，使用無機鹽優(yōu)選地為NaCl和/或NaBr進行含有脂蛋白的溶液的單個密度調(diào)整。例如，在離心管中的這個樣品上面可以放置一層第二溶液，該第二溶液的密度小于含有脂蛋白的樣品溶液的密度?？蛇x地，在離心管中的第二溶液下面，可以引入含有脂蛋白的樣品溶液。依照表l中的密度，可以選擇含有脂蛋白樣品的密度調(diào)整在1.00到大約1.21g/mL的范圍內(nèi)，以分離具有相同或較小密度的脂蛋白類。可以選擇第二溶液的密度在1.00g/mL至恰好小于含有脂蛋白的樣品溶液密度的范圍中，優(yōu)選地在1.00到大約1.15g/mL的范圍中，更優(yōu)選地為1.00g/mL。以這種方式，密度小于含有脂蛋白的樣品溶液的密度的HDL、IDL、LDL、Lp(a)和VLDL脂蛋白可以被同時提取。出人意料地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，給在離心管中含有脂蛋白的溶液提供具有更低密度的、在該含有脂蛋白的溶液的上面并與之鄰近的溶液，導(dǎo)致使用離心分離使脂蛋白的回收提高。在優(yōu)選的實施方式中，從離心管的最頂部、在彎液面處，向下吸取含有脂蛋白的組分至適當(dāng)?shù)钠谕w積。進一步說明這些方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)與較高密度樣品所需的相應(yīng)時間期間比較，在較低密度樣品中含有脂蛋白的樣品的離心分離所需的時間減少。在離心分離的情況下，術(shù)語"相應(yīng)時間期間"和類似術(shù)語指在離心期間離心力相等的條件下，獲得規(guī)定水平的離心所需的離心時間長度。例如但不限于，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，需要至少2個小時離心(在例如230，000XG)以從典型的含有脂蛋白的樣品中移出足夠的白蛋白，較少的離心時間導(dǎo)致較少的白蛋白移出。不希望被任何理論所約束，看來，通過降低樣品的密度，更容易使白蛋白和甚至其它非脂蛋白血漿蛋白質(zhì)分層且因此更容易從脂蛋白中分離。因此，在優(yōu)化脂蛋白的純化中關(guān)鍵因素是縮短離心的時間，以最大化白蛋白和其它血漿蛋白的損失同時保留HDL。在考慮離心分離含有脂蛋白和非脂蛋白成分的樣品的本文提供方面的一些實施方式中，樣品還包括可以作為其中的選定脂蛋白成分的沉淀劑的化合物，如在本領(lǐng)域已知的。"沉淀劑"指當(dāng)加入到生物分子的溶液時，可以引起或促進這種生物分子沉淀的化合物。沉淀劑可以要求提供沉淀的另外試劑。"提供沉淀的另外試劑"和類似術(shù)語指與沉淀劑作用且可以被要求來通過沉淀劑提供沉淀的化合物。示例性沉淀劑包括但不限于，帶電荷無機離子的鹽，優(yōu)選地為硫酸銨；抗體；任選地在離子種類(例如，二價陽離子)存在下的帶電荷聚合物(例如DS等)、凝集素等。在一些實施方式中，即使在其中脂蛋白不被沉淀的條件下(例如，PH、濃度、缺少必要的其他試劑等)，沉淀劑也存在。在一些實施方式中，沉淀劑是DS。在一些實施方式中，沉淀劑是DS和必要的其他試劑是二價陽離子。在一些實施方式中，含有脂蛋白的樣品包括DS，但是缺少二價陽離子。不希望被任何理論所約束，相信在二價陽離子存在下DS結(jié)合到含有脂質(zhì)的微粒，并且DS結(jié)合可以阻止非特異性結(jié)合相互作用，產(chǎn)生某些脂蛋白回收率的提高。例如但不限于，觀察到，包含DS顯著提高了從本文描述的一些制劑中LDL的回收率。在考慮離心含有脂蛋白和非脂蛋白成分的樣品的本文提供方面的一些實施方式中，在適合于使包括白蛋白和白蛋白結(jié)合化合物的復(fù)合物形成的條件下，樣品還包括白蛋白結(jié)合化合物。代表性白蛋白結(jié)合化合物包括但不限于芳香族的白蛋白結(jié)合染料。芳香族的白蛋白結(jié)合染料可以包括重氮染料；堿金屬鹽，堿土金屬鹽或所述重氮染料的胺鹽；磺酸染料；生理上可接受的堿金屬鹽、堿土金屬鹽或所述磺酸染料的胺鹽；或其混合物。在本發(fā)明中特別有用的芳香族的白蛋白結(jié)合染料包括活性藍(lán)2、伊文思藍(lán)(EvansBlue)、臺盼藍(lán)(TrypanBlue)、溴甲酚綠(BromcresolGreen)、溴甲酚紫(BromcresolPurple)、甲基橙、普施安紅(Procionred)HE3B等。在某些實施方式中，白蛋白結(jié)合化合物是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的類似物。適合于用作白蛋白結(jié)合化合物的代表性的NAD類似物包括但不限于RG19和汽巴藍(lán)(CibacromBlue)3GA(CB3GA)。在考慮使用白蛋白結(jié)合化合物的方法的實施方式中，在白蛋白結(jié)合化合物與含有脂蛋白的樣品混合后，樣品如本文描述進行離心。在一些實施方式中，白蛋白結(jié)合化合物與層析介質(zhì)結(jié)合，該結(jié)合促進與白蛋白結(jié)合化合物復(fù)合的白蛋白容易例如但不限于通過過濾移出。在一些實施方式中，觀察到結(jié)合的白蛋白結(jié)合化合物在離心管的底部分層，由此有利于移出(例如通過吸出等)含有脂蛋白的組分。在其中白蛋白結(jié)合化合物與層析介質(zhì)結(jié)合17的一些實施方式中，層析介質(zhì)可以是順磁性微粒、葡聚糖、瓊脂糖或Sephadex⑧，優(yōu)選地為葡聚糖。如在本領(lǐng)域已知的，"順磁性微粒"指具有包覆了配體的磁心的微粒，例如但不限于鏈霉親和素。生物素對鏈霉親和素的親和性(Kd=10—15M)是生物學(xué)中最強和最穩(wěn)定的相互作用之一。因此，順磁性微粒將便利的磁分離技術(shù)與相互作用例如生物素-鏈霉親和素相互作用的多功能性和高親和性結(jié)合起來。觀察到，結(jié)合白蛋白結(jié)合化合物的葡聚糖往往比本文描述的其他結(jié)合層析介質(zhì)保持更長時間可溶。不希望被任何理論所約束，相信白蛋白結(jié)合化合物能夠與在含有脂蛋白的樣品中的白蛋白相互作用越長，含有白蛋白的復(fù)合物將形成得越多，因此增加了脂蛋白的純度和回收率。在考慮使用白蛋白結(jié)合化合物的方法的進一步實施方式中，在離心期間，白蛋白結(jié)合化合物以多達(dá)50mg/mL或甚至更高濃度存在，從血漿樣品中回收的脂蛋白的數(shù)量和相對比例沒有顯著變化。例如，參考圖4，在離心之前包括不同量RG19的含有脂蛋白的樣品的差分帶電荷微粒遷移率分析顯示，包含與葡聚糖結(jié)合的RG19(RGD)導(dǎo)致脂蛋白的回收，其對脂蛋白的分布影響很小——如果有的話；比較圖1與圖4。參考實施例3和圖4，雖然HDL和LDL的差分帶電荷微粒遷移率曲線相似，但是在HDL3峰的開始處峰(白蛋白)的大小減小，伴隨RGD濃度提高。而且，在較高濃度的峰高度與在較低密度鹽和3.7小時旋轉(zhuǎn)的制備物中看見的峰高度相似。在其它實施方式中，白蛋白結(jié)合化合物的濃度是例如但不限于1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或甚至50mg/mL。在某些實施方式中，本發(fā)明提供與DS結(jié)合使用白蛋白結(jié)合化合物。參考圖5，如通過差分帶電荷微粒遷移率分析判斷的，使用RGD、任選地DS和任選地醋酸銨(AA)引起LDL和HDL組分回收率的調(diào)變。參考實施例4和圖5，在圖5中顯示的曲線的HDL區(qū)域存在相似性，當(dāng)在提取物中存在DS時HDL的回收率增加。另外，觀察到低的白蛋白峰高。相信在HDL2a(圖5)中的一個制備中，峰的增加不是典型的再現(xiàn)。也具有意義的是LDL的回收率增加。不希望被任何理論所約束，本文的結(jié)果表明，在提取物和稀釋液中存在DS提供了最佳的回收率和再現(xiàn)性。在某些實施方式中，在差分帶電荷微粒遷移率分析之前，通過本發(fā)明方法獲得的純化的含有脂蛋白的樣品被進一步地稀釋。參考圖6和實施例5，在差分帶電荷微粒遷移率分析之前，評估了在用25mM醋酸銨進行l(wèi):200稀釋步驟中05(+/-51^/11^)存在或不存在的影響。如圖6中顯示，在DS存在時LDL峰高有顯著的增加，而HDL峰輪廓相對地不受影響。在某些方面和實施方式中，本發(fā)明考慮使用白蛋白結(jié)合化合物的方法，該白蛋白結(jié)合化合物與結(jié)合DS的層析介質(zhì)結(jié)合并且進一步地在離心管中與在含有脂蛋白的樣品的下面并鄰近該樣品的020溶液結(jié)合。使用這個方案的典型步驟在實施例6中提供。在考慮離心含有脂蛋白和非脂蛋白成分的樣品的本文提供方面的一些實施方式中，樣品還包括能夠結(jié)合非脂蛋白成分以形成非脂蛋白/非脂蛋白捕獲配體復(fù)合物的非脂蛋白捕獲配體，進一步地，其中離心使非脂蛋白/非脂蛋白捕獲配體復(fù)合物與脂蛋白成分分離。"非脂蛋白捕獲配體"和相似術(shù)語指結(jié)合不是脂蛋白的血漿成分的化合物。示例性非脂蛋白捕獲配體包括但不限于如本領(lǐng)域理解的抗體和適配體。例如但不限于，從抗原(即，非脂蛋白)中分離抗體(即，如非脂蛋白捕獲配體)可以用各種方法包括調(diào)節(jié)溫度、PH、鹽濃度等來實現(xiàn)。進一步例如但不限于，從適配體靶標(biāo)(B卩，非脂蛋白)中分離適配體(即，如非脂蛋白捕獲配體)可以用各種方法包括調(diào)節(jié)溫度、PH、鹽濃度、DNase或RNase等來實現(xiàn)。在考慮離心含有脂蛋白和非脂蛋白成分的樣品的本文提供方面的一些實施方式中，樣品還包括能夠結(jié)合脂蛋白成分以形成脂蛋白/脂蛋白-捕獲配體復(fù)合物的脂蛋白-捕獲配體，進一步地，其中離心使脂蛋白/脂蛋白-捕獲配體復(fù)合物與非脂蛋白成分分離。"脂蛋白-捕獲配體"和相似術(shù)語指能夠結(jié)合脂蛋白的化合物。示例性脂蛋白-捕獲配體包括但不限于如本領(lǐng)域理解的抗體和適配體。在優(yōu)選的實施方式中，脂蛋白-捕獲配體是抗體。在不考慮離心含有脂蛋白和非脂蛋白成分的樣品的本文提供方面的一些實施方式中，該方法考慮能夠結(jié)合脂蛋白成分以形成脂蛋白/脂蛋白-捕獲配體復(fù)合物的脂蛋白-捕獲配體。術(shù)語"適配體"指由核酸例如RNA或DNA組成、緊緊地結(jié)合到特定分子靶標(biāo)的大分子。術(shù)語"結(jié)合(bind,binding)"和類似術(shù)語指產(chǎn)生足夠穩(wěn)定的復(fù)合物以允許分離的相互作用或復(fù)合(絡(luò)合)。在一些實施方式中，適配體特異性地結(jié)合ApoAl、ApoB或Apo(a)。對本發(fā)明有用的適配體的產(chǎn)生和篩選方法在本領(lǐng)域是熟知的；參見例如，Griffin等，美國專利5，756，291，其通過整體引用并入本文并且用于所有的目的。如在本領(lǐng)域所實踐的，適配體的選擇(即，訓(xùn)練(training))的方法需要單鏈隨機DNA寡聚體庫，該庫包括作為隨后的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增的引物結(jié)合位點的隨機序列和已知序列的側(cè)翼區(qū)。使用在本領(lǐng)域熟知的常規(guī)合成方法，生成這些DNA寡聚體。作為起始和任選的步驟，通過常規(guī)的方法進行PCR擴增，并且留下擴增的庫成為雙螺旋DNA或用作在鏈分離后的單鏈DNA。任選地，可以進行轉(zhuǎn)錄成為RNA。在這種情況下的術(shù)語"寡聚體庫"指這種單鏈或雙螺旋DNA、或從其轉(zhuǎn)錄的RNA。術(shù)語"精制的寡聚體庫"指已經(jīng)進行至少一輪如本文描述的選擇的寡聚體庫。進一步說明前面提到的適配體訓(xùn)練，使用具有靶分子連接在其上的柱或其它載體基質(zhì)(即，耙標(biāo)結(jié)合載體)進行"選擇"步驟。在本領(lǐng)域熟知的連接可以通過共價或非共價的方法。為了允許形成寡核苷酸_靶標(biāo)復(fù)合物，培育寡聚體庫或精制的寡聚體庫和靶標(biāo)結(jié)合載體，并且通過例如本領(lǐng)域熟知方法洗滌，從載體環(huán)境中去除寡聚體庫或精制的寡聚體庫的未復(fù)合組分。隨后通過本領(lǐng)域熟知的方法去除寡核苷酸產(chǎn)生精制的寡聚體庫組分，其相對于前驅(qū)物寡聚體庫或精制的寡聚體庫具有增強的靶標(biāo)特異性?？蛇x地，前面提到的適配體訓(xùn)練可以使用"反向選擇"步驟，其中選擇適配體以結(jié)合到生物樣品的其它成分。在這種情況下，使用具有連接在其上的生物樣品的其它成分的柱或其它載體基質(zhì)(即，成分結(jié)合載體)。為了允許形成寡核苷酸-成分復(fù)合物，培育寡聚體庫或精制的寡聚體和成分結(jié)合載體，并且通過例如本領(lǐng)域熟知方法洗滌，從載體環(huán)境中去除寡聚體庫或精制的寡聚體庫的未復(fù)合組分。隨后通過本領(lǐng)域熟知的方法去除寡核苷酸產(chǎn)生精制的寡聚體庫組分，其相對于前驅(qū)物寡聚體庫或精制的寡聚體庫具有增強的生物樣品其它成分的特異性。在反向選擇步驟中使用的生物樣品的其它成分的例子包括但不限于免疫球蛋白和白蛋白。在典型的生產(chǎn)訓(xùn)練方案中，在與靶標(biāo)或生物樣品的其它成分復(fù)合后，對回收的寡核苷酸進行PCR擴增。隨后重復(fù)選擇/擴增步驟，一般3到6次，以提供對靶標(biāo)或生物樣品19其它成分具有增強的結(jié)合和特異性的精制的寡聚體庫?？梢钥寺『蜏y序如此獲得的擴增序列。任選地，當(dāng)多個對靶標(biāo)特異的個體適配體序列已經(jīng)獲得和被測序時，在本領(lǐng)域熟知的配對和多重比對檢查可以產(chǎn)生"共有序列"的說明，其中任選鄰接核苷酸的核苷酸序列或區(qū)域被識別，其存在與結(jié)合到靶標(biāo)的適配體相關(guān)。當(dāng)共有序列被識別時，可以通過常規(guī)的合成或重組方法產(chǎn)生含有共有序列的寡核苷酸。術(shù)語"抗體"指高親和性和高特異性結(jié)合抗原(例如，脂蛋白或樣品的其它成分)的免疫球蛋白。在這種情況下，"高親和性"指例如但不限于1yM、100nM、10nM、lnM、100pM的解離常數(shù)或甚至更高的親和性，以抗體與該抗體已經(jīng)被培養(yǎng)其中的抗原的結(jié)合反應(yīng)為特征。術(shù)語"培養(yǎng)(raise)"指通過本領(lǐng)域早就知道的方法生產(chǎn)高親和性抗體。對這種情況下進一步地說明，術(shù)語"高特異性"指相對于非靶標(biāo)抗原，試驗抗體優(yōu)先結(jié)合靶標(biāo)抗原，其有利于結(jié)合試驗抗體已經(jīng)被培養(yǎng)其中的靶標(biāo)抗原，以例如但不限于1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、10000或更高的解離常數(shù)的比為特征。本發(fā)明考慮的抗體和適配體的衍生方法包括例如但不限于生物素化。在一些實施方式中，抗體或適配體被生物素化，以便隨后在抗生物素蛋白結(jié)合的基質(zhì)例如但不限于抗生物素蛋白層析柱上的分離使通過生物化學(xué)純化領(lǐng)域熟知的方法容易分離。在一些實施方式中，與脂蛋白復(fù)合的生物素化的抗體或適配體還經(jīng)受鏈霉親和素_結(jié)合的磁珠。三元脂蛋白-生物素化親和性試劑-鏈霉親和素結(jié)合磁珠的復(fù)合物隨后通過本領(lǐng)域熟知的免疫磁性方法來分離。在這個方面的一些實施方式中，通過使用在本領(lǐng)域熟知的合適的連接體，脂蛋白-捕獲配體與固體載體連接。示例性固體載體包括但不限于順磁性微粒、小珠子、凝膠基質(zhì)材料(例如，瓊脂糖、Sephadex⑧:)等。對這個方面的進一步說明，在一些實施方式中，本發(fā)明提供在離心之前，從樣品中移出Lp(a)的方法，該方法包括以下步驟(a)在足以引起Lp(a)沉淀的條件下，通過樣品與含有ApoB的脂蛋白的沉淀劑的混合形成Lp(a)的沉淀物；和(b)從第一溶液中分離含有Lp(a)的沉淀物。"含有ApoB的脂蛋白的沉淀劑"和相似的術(shù)語指沉淀ApoB的已知化合物，如在本領(lǐng)域熟知的。在考慮純化通過本文提供的離心方法收集的脂蛋白的本發(fā)明的一些實施方式中，本發(fā)明提供從收集的脂蛋白中移出Lp(a)的方法，該方法包括以下步驟(a)在足以引起Lp(a)沉淀的條件下，通過收集的脂蛋白與含有ApoB的脂蛋白沉淀劑的混合形成Lp(a)的沉淀物；和(b)從收集的脂蛋白中分離含有Lp(a)的沉淀物。對本文提供的從含有脂蛋白的溶液中移出Lp(a)的方法進一步說明，ApoB的示例性沉淀劑是但不限于二價陽離子存在下的DS。在一些實施方式中，二價陽離子是Mg2+。已經(jīng)觀察到，包含DS引起LDL回收率顯著增加，對HDL的回收率影響很小。DS可以以在大約0.1到50mg/mL范圍的濃度與含有脂蛋白的樣品混合。在一些實施方式中，DS濃度是大約0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0或甚至50.0mg/mL。在進一步的實施方式中，本發(fā)明提供獲得純化的Lp(a)的方法，該方法包括以下步驟(a)溶解依照本文為此提供的任一方法獲得的含有Lp(a)的沉淀物；(b)在適合于允許形成Lp(a)-凝集素復(fù)合物的條件下，使溶解的Lp(a)與含有連接到固體載體的凝集素的20固體載體試劑混合；(c)分離Lp(a)-凝集素復(fù)合物；和(d)從Lp(a)-凝集素復(fù)合物中釋放Lp(a)，由此提供適合例如用于差分帶電荷微粒遷移率分析的純化脂蛋白。對這個方法的進一步說明，凝集素可以選自麥胚凝集素(WGA)、利馬豆凝集素(LGA)、植物凝集素(PHA)和鱟凝集素(HCL)。在一些實施方式中，凝集素是WGA。在一些實施方式中，固體載體包括瓊脂糖。包括與Lp(a)反應(yīng)形成復(fù)合物、分離這種復(fù)合物和連接凝集素到固體載體在內(nèi)的處理這些凝集素的方法在本領(lǐng)域是熟知的。對這個方法的進一步說明，在一些實施方式中，釋放步驟包括用凝集素的競爭性配體洗滌Lp(a)-凝集素復(fù)合物。在一些實施方式中，競爭性配體是N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)。在一些實施方式中，釋放步驟包括使用如在本領(lǐng)域已知的二硫化物還原劑的二硫化物還原，以還原連接apo(a)和ApoB的二硫化物，由此釋放LDL。在考慮進一步純化通過本文提供的離心方法收集的脂蛋白的本發(fā)明的一些實施方式中，本發(fā)明提供從收集的脂蛋白中移出Lp(a)的方法，該方法包括以下步驟(a)溶解依照本文為此提供的任一方法獲得的含有Lp(a)的沉淀物；(b)使溶解的Lp(a)與Y-球蛋白和脯氨酸混合；(c)通過加入沉淀劑沉淀混合物；和(d)從沉淀物中回收Lp(a)，由此提供適合于差分帶電荷微粒遷移率分析的純化脂蛋白。如在本領(lǐng)域已知的，"Y-球蛋白"指Y-類的免疫球蛋白。示例性沉淀劑包括但不限于帶高電荷的無機離子的鹽，優(yōu)選地為硫酸銨。對本實施方式有用的Y-球蛋白的濃度可以是在O.01-0.lug/mL、0.1-1.0ug/mL、1.0-2.0ug/mL、2.0-5.0ug/mL、5.0-10.Oug/mL、10.0-100ug/mL、100-1000ug/mL或更高的范圍內(nèi)。脯氨酸的濃度可以是在10uM-100uM、100-100-uM、l-2mM、2-5mM、5-10mM或甚至更高的范圍中。對考慮收集的脂蛋白的本文提供的方法的進一步說明，在一些實施方式中，含有脂蛋白的溶液與惰性離心基質(zhì)接觸。在本發(fā)明的離心純化方法的情況下，"惰性離心基質(zhì)"和相似的術(shù)語指不與脂蛋白化學(xué)反應(yīng)、但盡管如此增強了純化的材料。不希望被任何理論所約束，相信惰性離心基質(zhì)在離心后起到穩(wěn)定離心管所含之物的作用，使得例如在減速和/或從離心管中吸取脂蛋白或其它組分的期間引入的人為因素被最小化。示例性惰性離心基質(zhì)包括但不限于凝膠漿液(gelslurry)或惰性珠子。在一些實施方式中，凝膠漿液是Sephadex⑧凝膠基質(zhì)。在一些實施方式中，惰性離心基質(zhì)包括惰性珠子。示例性惰性珠子包括但不限于適合于下沉到離心管中第一溶液的底部的玻璃珠、聚苯乙烯珠等。惰性珠子可以是任意合適的大小，例如但不限于大約0.1、0.2、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.3、3.6、3.9、4.Omm或甚至更小或更大。在涉及通過使用多陰離子化合物和一種或多種二價陽離子，純化用于差分帶電荷微粒遷移率分析的脂蛋白的本發(fā)明的方面的一些實施方式中，多陰離子化合物選自DS、支鏈淀粉和聚硫酸乙烯酯(polyvinylsulfate)，優(yōu)選地為DS。在一些實施方式中，二價陽離子選自Mg2+和Ca2+，優(yōu)選地為Mg2+。在一些實施方式中，本發(fā)明提供純化用于差分帶電荷微粒遷移率分析的脂蛋白的方法，該方法不包括離心。在一些實施方式中，包括脂蛋白和非脂蛋白的溶液與一種或多種能夠結(jié)合脂蛋白以形成脂蛋白/脂蛋白-捕獲配體復(fù)合物的脂蛋白-捕獲配體混合。在一些實施方式中，在脂蛋白/脂蛋白_捕獲配體復(fù)合物的形成后，通過本領(lǐng)域已知的方法包括但不限于免疫磁性方法分離如此形成的復(fù)合物。在一些實施方式中，在脂蛋白脂蛋白_捕獲配體復(fù)合物的分離后，通過本領(lǐng)域已知和本文描述的方法，脂蛋白從脂蛋白/脂蛋白_捕獲配體復(fù)合物中釋放。在另一方面，本發(fā)明提供通過差分帶電荷微粒遷移率分析進行分析脂蛋白的大小分布的方法。在一些實施方式中，從體液例如個體的血漿樣品中獲得一種或多種脂蛋白。在一些實施方式中，一種或多種脂蛋白選自HDL、LDL、Lp(a)、IDL和VLDL。在一些實施方式中，方法還包括使用測定的脂蛋白大小分布進行個體評估的步驟，評估選自脂質(zhì)相關(guān)的健康風(fēng)險、心血管狀況、心血管疾病的風(fēng)險和對治療性介入的反應(yīng)性。在脂質(zhì)相關(guān)的健康風(fēng)險、心血管狀況和心血管疾病的風(fēng)險的情況下，"評估"指生成的脂蛋白大小分布與人群的死亡率和危險因子的統(tǒng)計相關(guān)性，如本領(lǐng)域所熟知的。在對治療性介入的反應(yīng)性的情況下，評估指比較在進行治療性介入之前和之后的脂蛋白大小分布。示例性治療性介入包括但不限于為了降低膽固醇、降低LDL、IDL和VLDL、Lp(a)和/或提高HDL的目的，給與藥物到個體，如在本領(lǐng)域已知的。在一些實施方式中，在分析報告中報告脂蛋白分析物的結(jié)果。在由本發(fā)明考慮的脂蛋白和其它脂質(zhì)分析物的情況下，"分析報告"指提供給例如臨床醫(yī)生、其它保健提供者、流行病學(xué)家等的報告，該報告包括個體的生物樣品例如血漿樣品的分析結(jié)果。分析報告可以以打印或電子形式、或任何方便分析、綜合和/或歸檔其中數(shù)據(jù)的形式出現(xiàn)，如在本領(lǐng)域已知的。分析報告可以包括關(guān)于報告的個體受試者的識別信息，包括但不限于姓名、地址、性別、標(biāo)識信息(例如，社會安全號、保險號)等。分析報告可以包括樣品中脂質(zhì)的生物化學(xué)特征，樣品中脂質(zhì)例如但不限于三酸甘油脂、總膽固醇、LDL膽固醇和/或HDL膽固醇等，如在本領(lǐng)域已知和/或本文描述的。分析報告還可以包括在通過本文提供的方法制備的樣品上實施的脂蛋白的特征和由此得出的參考范圍。術(shù)語"參考范圍"和相似的術(shù)語指在本領(lǐng)域已知的生物樣品的成分的濃度，以反映在個體群中一般正常觀察到的范圍。分析報告中脂蛋白的示例性特征可以包括通過差分帶電荷微粒遷移率測定的非-HDL脂蛋白和Lp(a)的濃度。進一步的脂蛋白示例性特征——例如通過本發(fā)明方法制備的樣品上實施的差分帶電荷微粒遷移率分析測定——包括VLDL、IDL、Lp(a)、LDL和HDL以及它們的亞類的濃度和參考范圍。分析報告還可以包括通過本發(fā)明的方法制備的樣品的脂蛋白大小分布，例如通過差分帶電荷微粒遷移率分析獲得。在實施例7中提供了在示例性分析報告中包括的項目。實施例實施例1-使用020和低鹽溶液純化脂蛋白的比較使用低密度鹽溶液(1.151g/mL)(即，"低密度鹽樣品")或020(各200uL)處理血清樣品(25uL)。樣品在223，000XG離心3.7小時(低密度鹽樣品)或2小時(D20)。離心后移出頂部的100uL之后，用醋酸銨溶液透析低密度鹽樣品，并且在差分帶電荷微粒遷移率分析之前稀釋到l:200。在差分帶電荷微粒遷移率分析之前，020樣品在離心后用醋酸銨直接稀釋到l:200。差分帶電荷微粒遷移率分析的結(jié)果在圖2中顯示。實施例2-純化對ApoA、ApoB和TC回收的影響為了評估HDL(ApoAl)在使用D20的步驟中是否優(yōu)先損失，如圖3中顯示的三個樣品(即，749、1043U4:任意和惟一的患者標(biāo)識號)經(jīng)受脂蛋白分離，使用D20連同RGD/DS225mg/mL)溶液移出白蛋白。以六份制備每個樣品。分析每個分離的各頂部100uL的ApoAl(HDL)、ApoB(LDL、IDL、VLDL)和總膽固醇(TC)的含量。使用商購的單克隆捕獲抗體(BiodesignInternational,Saco，MN)和抗人山羊多克隆檢測抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)的ELISA測量血漿或血清脫脂載脂蛋白AI和B，在非競爭性夾心式免疫測定中純化和生物素化(InternationalImmunologyCorp.，Murrieta，CA)脫脂載脂蛋白AI和B。通過加入鏈霉親和素連接的過氧化物酶、接著使用鄰苯二胺(ortho-phenyline-diamine)顯色來測量濃度。使用CDC#1883血清參照材料(CenterforDiseaseControl，Atlanta,GA)和混合的參照血清(NorthwestLipidResearchClinic,Seattle,WA)，使脂蛋白校準(zhǔn)器標(biāo)準(zhǔn)化。依照制造商的說明書，使用商購的測定試劑盒試劑(BayerHealthCare，Tarrytown,NY)測量總膽固醇，并修改用于分析每個微量滴定板孔的251血清或血漿加上2001膽固醇試劑。在顯色后，使用微量滴定板讀出器，測量標(biāo)準(zhǔn)、對照、樣品和試劑背景。結(jié)果(圖3)顯示與在每個血清中存在的總數(shù)比較的每個樣品的平均回收率。不希望被任何理論所約束，純化步驟沒有引起HDL優(yōu)先損失，如通過ApoAl和ApoB的相等回收率所判斷的。實施例3-不同RGD對脂蛋白組分回收的影響在被鋪在D20墊層上面之前，血清樣品與不同量的RGD(10、15、20、25mg/mL)混合并在冰上培育15分鐘。在223，000XG離心120分鐘后，頂部lOOuL被移出并用醋酸銨溶液l:200稀釋。隨后通過差分帶電荷微粒遷移率分析，分析樣品。結(jié)果在圖4中顯示。實施例4-使用RG19、DS、AA純化脂蛋白參考圖5，為了評估在提取/純化和稀釋中DS對白蛋白移出和脂蛋白回收的影響，用只有20uL的7.5mg/mLRGD(圖5中圖例"C/D")或7.5mg/mLRGD和2.5mg/mLDS的20uL組合(圖5中圖例"A/B")，提取血清樣品(5uL)。用于提取和稀釋的DS分子量是10K。在冰上培育15分鐘后，在l(TC，每個樣品在223，000XG離心2小時15分鐘。頂部lOOuL被移出，并且用25mM醋酸銨溶液(圖5中的圖例"B/D")或含有5ug/mLDS的25mM醋酸銨(圖5中的圖例"A/C")1:200稀釋。實施例5-在稀釋劑中使用DS的脂蛋白純化結(jié)果參考圖6，使用本領(lǐng)域已知的方法，由18小時密度分離制備的含有脂蛋白的血清樣品在透析后用于評估稀釋液中DS對LDL回收的影響。離心的血清樣品的等分試樣用不存在DS的25mM醋酸銨l:200稀釋，并且進行差分帶電荷微粒遷移率分析。另一個等分試樣用存在5ug/mLDS的25mM醋酸銨1:200稀釋。每個樣品的重復(fù)試驗在圖6中顯示。實施例6-使用RG19、DS、D20純化脂蛋白從血漿獲得的含有脂蛋白的樣品通過渦旋短暫地混合。5uL的樣品或任選地對照與20uL的含有7.5mg/mLRGD(Sigma)、2.5mg/mLDS(Sigma)和0.5mg/mLEDTA(SpectrumChemicals)的白蛋白去除試劑混合，并在冰上培育15分鐘。培育后，樣品的混合物被置于Ti42.2超離心管(Beckmann)中200uL的D20(MedicalIsotopes)上。樣品隨后在10。C、223，000XG(42，OOOrpm)超離心135分鐘。超離心后，脂質(zhì)組分(85yL)被從離心管的頂部移出。在通過差分帶電荷微粒遷移率分析之前，樣品用pH7.4的25mM醋酸銨、0.5mM氫氧化銨稀釋到l:800的最終稀釋度，用于HDL分析。對于LDL分析，樣品用含有5ug/mLDS的相同稀釋液l:200稀釋。在差分帶電荷微粒遷移率分析之前，在深孔96孔板中產(chǎn)生最終的稀釋物，并放置在維持6t:的具有冷卻管組(coolstack)的自動進樣器中。23實施例7_血清樣品中脂蛋白純化和分析的結(jié)果血清從經(jīng)過靜脈穿剌收集的全血中分離。分離后，血清分成三部分，一個等分試樣使用在本領(lǐng)域熟知的傳統(tǒng)方法用于分析HDL、三酸甘油脂和總膽固醇含量。由這些結(jié)果計算LDL。在優(yōu)選的實施方式中，如果三酸甘油脂大于400mg/dL，那么直接測量LDL。使用本領(lǐng)域熟知的免疫測定，分析第二等分試樣的Lp(a)含量。對第三等分試樣，應(yīng)用差分帶電荷微粒遷移率分析，以分級脂蛋白。.在典型的生產(chǎn)操作中，樣品(一種或多種)與對照一起，如在本領(lǐng)域已知的，一種樣品已知是LDL類型A(對照A)和一種樣品已知是類型B(對照B)，被放置在PerkinElmerJANUS多功能探針(multiprobe)上。30uL的對照和樣品(一種或多種)轉(zhuǎn)移到分離試管并被混合，并加入120uL的RG19葡聚糖、DS、EDTA溶液。試管隨后轉(zhuǎn)移到冰上培育15分鐘。15分鐘培育后，試管回到到多功能探針。同時，離心管已經(jīng)具有加入它們的兩個4mm珠子，這些隨后放置在其中120uL的D20被加到每個離心管中的多功能探針上。隨后在被轉(zhuǎn)移到超離心轉(zhuǎn)頭(Ti42.2)之前，對照和樣品(一種或多種)通過多功能探針被鋪在020上。樣品隨后在10°C、223，000XG(42，OOOrpm)旋轉(zhuǎn)135分鐘。在離心后，小心地移去離心管并放置在多功能探針上，其中移走在試管中頂部85^(+/-51^)到分離的試管中。一旦收集了所有的樣品，多功能探針產(chǎn)生每種對照和樣品的兩種稀釋物。一種稀釋物是用含有5ug/mLDS的醋酸銨溶液i:200的最終稀釋；第二種是用只有醋酸銨的溶液的i:800稀釋。兩種稀釋物隨后在差分帶電荷微粒遷移率儀器上運行。分析后，微粒數(shù)量使用本領(lǐng)域熟知的換算轉(zhuǎn)化為nmol/L。合并HDL試驗(1:800)和較大的脂蛋白(1:200)的數(shù)據(jù)，并且該數(shù)據(jù)與等分試樣1和2的生物化學(xué)數(shù)據(jù)一起被報告。也報告脂蛋白的曲線以及總的LDL微粒濃度和LDL峰值微粒大小，用于確定LDL表型。合并這些數(shù)據(jù)得到的示例性評估報告在表2(數(shù)字表示)和圖7(脂蛋白曲線的圖形表示)中提供。表2.就離子遷移率而言的脂蛋白組分<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>*"高"和"低"分別指在范圍以上或以下。**"類型"指通過微粒大小確定的表型，其中大約在LDL11(215.4A)處截斷，如本領(lǐng)域已知的。為了使用如上討論的差分帶電荷微粒遷移率分析獲得更準(zhǔn)確的脂蛋白曲線，可以在差分帶電荷微粒遷移率儀器之前，在處理(例如樣品離心、吸量和稀釋)期間針對脂蛋白的任何損失調(diào)整結(jié)果。這可以通過加入一種或多種類型的標(biāo)記脂蛋白到樣品作為內(nèi)標(biāo)來實現(xiàn)。通過在處理期間跟蹤標(biāo)記，標(biāo)記脂蛋白的回收率可以用于向上調(diào)整在原始的樣品中存在的相同但未標(biāo)記的脂蛋白的濃度。例如，測量在離心之后分離的等分試樣脂蛋白的熒光信號，并與直接來自于起始的儲用樣品(沒有離心)的等分試樣比較。信號的不同表示回收的未知樣品的比例，并且允許更準(zhǔn)確計算在血漿或血清中的脂蛋白濃度。使用以下的方法連接熒光分子到HDL亞組分。這個方法可以應(yīng)用于其它類型的脂蛋白。通過順序的漂浮從血漿中分離HDL以獲得密度區(qū)間1.063-1.20g/mL的脂蛋白。隨后透析總HDL組分到1.184g/mL的鹽背景密度，并且在固定角度50.3Beckman轉(zhuǎn)頭中以40，000rpm、l(TC下離心28小時。隨后吸量6ml離心管以主要獲得大、中等和小的HDL亞組分，各自為T[O-l]、T[l-3]和T[3-6]。隨后亞組分對pH8.5的lOOmMNaHC03在4。C透析過夜。使用Lowry方法測量每個亞組分中的蛋白質(zhì)濃度。隨后依照制造商的說明書，用熒光探針AlexaFluor488(羧酸、琥珀酰亞胺酯"混合異構(gòu)物"，MolecularProbesCat#A-2000，分子量643.42，Abs@494nm/Em517nm)標(biāo)記HDL亞組分。簡單地說，維持分別為>2mg/ml和10mg/ml的HDL和AF488的最適濃度，HDL亞組分與AF488以建議的最適比例10:l(wt:wt)結(jié)合。使用溶液的方案和數(shù)量在以下的表3中列出。表3:培育混合物25儲用配體濃度儲用AF488濃度總體積終止液mg/mlmgmg/mlmgHiHDL亞組分T3,595602.011020.1040.201058040T[l-3]3.186251.991019.8750.198864540T[3-6]6.397855.021050.1620.5016835100總計卯.14050.9014051-加HDL亞組分到帶有磁力攪拌棒的玻璃管形瓶中2-在室溫攪拌的同時，緩慢加AF488體積到配體中。3-培育混合物1小時，同時繼續(xù)攪拌。4-加終止液(1.5MTris，pH8.0)。在室溫培育30分鐘。5-透析標(biāo)記的HDL亞組分至pH8的20mMTris、150mMNaCl、0.27mMEDTA[在冷箱中，避光]對比1升過夜(overnite)，和2X1L透析物體積改變。隨后在從250到>30000的緩沖液中不同稀釋度下測試AF488標(biāo)記的HDL亞組分的信號靈敏度。在離心分離脂蛋白之前和之后，當(dāng)用各種血漿制劑稀釋時，也測試標(biāo)記的HDL亞組分的信號靈敏度。在第二次離心分離密度<1.23g/mL的標(biāo)記HDL亞組分以從HDL:AF488結(jié)合物中去除未結(jié)合的熒光標(biāo)記之后，進行另外的稀釋和靈敏度測試。從MolecularProbes(Cat#F_6130)獲得的熒光探針熒光素_5_EX琥珀酰亞胺酯被用于以與以上描述的針對AF488的相同方式標(biāo)記HDL亞組分。也可以使用以上的方法熒光標(biāo)記VLDL和LDL。對于含有甲狀腺球蛋白、脫鐵鐵蛋白、過氧化氫酶、乳酸脫氫酶和白蛋白的結(jié)合熒光標(biāo)記的高分子量標(biāo)準(zhǔn)(PharmaciaHMWStandardMix)，進行另外的檢測。在考慮脂蛋白分布的分析和/或顯示的本發(fā)明方面的實施方式中，例如但不限于圖1、圖7等，在提供以便臨床解釋之前，可以處理用離子遷移率分析儀獲得的差分帶電荷微粒遷移率數(shù)據(jù)。除非另有規(guī)定，在差分帶電荷微粒遷移率分析的原始數(shù)據(jù)或提供以便臨床解釋的加工數(shù)據(jù)的情況下，"差分帶電荷微粒遷移率數(shù)據(jù)"和相似的術(shù)語指具有與微粒直徑相關(guān)的自變量和與觀察的微粒計數(shù)相關(guān)的因變量的差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布。在一些實施方式中，自變量是電壓或由電壓產(chǎn)生的相應(yīng)的電場(參見等式3)。在一些實施方式中，自變量是微粒直徑。在一些實施方式中，因變量是微粒計數(shù)。在一些實施方式中，因變量是在規(guī)定的時間期間計數(shù)的微粒數(shù)量，該規(guī)定的時間期間例如但不限于0.001-0.01、0.01-0.1、0.l-l、l-2秒或甚至更長。在一些實施方式中，規(guī)定的時間期間是0.1秒。"差分帶電荷微粒遷移率數(shù)據(jù)的加工"和相似的術(shù)語指這樣處理數(shù)據(jù)，當(dāng)整個地考慮時，該處理可以提供準(zhǔn)確和可重現(xiàn)地反映樣品中脂蛋白分布和/或各脂蛋白類和其亞類的濃度的圖形和/或數(shù)字結(jié)果。在差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)的加工中有用的示例性處理包括但不限于乘以常數(shù)、與函數(shù)巻積、加和/或減去常數(shù)數(shù)值或函數(shù)——包括但不限于校正雜質(zhì)的供量、數(shù)值積分、平滑和本領(lǐng)域已知的其它算術(shù)處理。因此，可以由于各種原因應(yīng)用差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)的加工，其包括但不限于，校正以準(zhǔn)確反映樣品中脂蛋白的生理濃度、調(diào)節(jié)以校正特定的儀器和方法的有效性、去除代表雜志供量的數(shù)據(jù)等。"特定的儀器和方法的有效性"和相似的術(shù)語指在處理和分析期間分析物(例如，脂蛋白)濃度的變化的檢測和校正。示例性特定的儀器有效性包括在電霧化期間引入的明顯的稀釋，其中在形成的載微粒的氣流中泰勒錐(Taylorcone)的形成產(chǎn)生了脂蛋白的明顯稀釋。通過使用具有本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的量化有效性的儀器的方法，測量有效性。在差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)的情況下，"雜質(zhì)的供量"和相似的術(shù)語指例如但不限于離子遷移率儀器的微粒計數(shù)，其產(chǎn)生于在差分帶電荷微粒遷移率儀器中計算的和在從中獲得的差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)中包括的非脂蛋白種類的數(shù)據(jù)。在這種情況下，示例性非脂蛋白種類包括但不限于本文公開的任意試劑和單體和/或多體形式的白蛋白。在一些實施方式中，在數(shù)據(jù)的加工期間，將由于本文描述的試劑帶來的對差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)的供量從差分帶電荷微粒遷移率大小分布數(shù)據(jù)中減去。例如，不希望被任何理論所約束，相信在差分帶電荷微粒遷移率分析的微粒大小分布數(shù)據(jù)(即，具有微粒計數(shù)對微粒直徑的差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù))中RGD引起的供量可以在選擇的直徑區(qū)間由一種或多種指數(shù)衰減函數(shù)表示。因此，在一些實施方式中，將差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)在選擇區(qū)間中擬合至具有等式4形式的函數(shù)yi=k一(-07*d)(4)其中yi是由本領(lǐng)域熟知的方法測定的對差分帶電荷微粒遷移率的供量的最佳擬合，、是擬合的經(jīng)驗常數(shù)，和d是微粒直徑。上式4對于大于2nm的微粒直徑是有效的。在一些實施方式中，擬合區(qū)間是3-6、3-4、3-5、3-6、4-6或5_6nm(微粒直徑)，優(yōu)選地為3_4nm。在一些實施方式中，通過產(chǎn)生于等式4的擬合的函數(shù)，校正整組的差分帶電荷微粒遷移率數(shù)據(jù)。在一些實施方式中，進一步加工差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)，以說明在差分帶電荷微粒遷移率分析的取樣中白蛋白包含物的供量。在一些實施方式中，首先通過具有以下形式的分段函數(shù)，提供對白蛋白校正(即，"白蛋白校正曲線")的解釋<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>其中y2和y3分別是區(qū)間2和3中的函數(shù)值，k2和k3是通過本領(lǐng)域熟知的方法測定的經(jīng)驗常數(shù)，和d是微粒直徑。"經(jīng)驗值(來自錐形白蛋白數(shù)據(jù))"指從分布中減去等于所測量分布中白蛋白量的白蛋白量對差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)的影響。在一些實施方式中，白蛋白校正曲線被進一步地修改以說明白蛋白二聚體的存在。已經(jīng)經(jīng)驗地發(fā)現(xiàn)，白蛋白二聚體一般在用于差分帶電荷微粒遷移率分析的樣品中以1-10%、1-8%、2-8%、2-7%、2-6%、2_5%的范圍存在，優(yōu)選地為2%，并且發(fā)現(xiàn)在特定的區(qū)間中可以調(diào)節(jié)白蛋白校正曲線，以說明和逐漸地抑制白蛋白二聚體的存在。在一些實施方式中，這種特定區(qū)間的直徑下限是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或者甚至12nm。在一些實施方式中，這種特定區(qū)間的直徑上限是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或者甚至15nm。在一些實施方式中，這種特定區(qū)間的范圍是0-15、5-10、7-9，優(yōu)選地為7.9_8.4nm。因此，可以由具有式7形式的函數(shù)修改白蛋白校正曲線y，=7*(((1-下限)*2*二聚體+(上限-(1)*2)(7)其中y是白蛋白校正曲線，y'是在逐漸抑制白蛋白二聚體的存在后的白蛋白校正曲線，d是微粒直徑，下限和上限分別是用于校正的大小下限和上限，和二聚體是選擇的百分比二聚體濃度。在一些實施方式中，二聚體的存在被抑制的區(qū)間在7.9nm(下限)和8.4nm(上限)之間。在一些實施方式中，使用本領(lǐng)域熟知的曲線擬合方法，將代表白蛋白單體的理論曲線與在特定區(qū)間的樣品的差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布擬合。在一些實施方式中，這種理論曲線由具有等式8形式的函數(shù)代表_ym=、(一、*力(8)其中ym是白蛋白單體的理論數(shù)量分布，km和ka是經(jīng)驗導(dǎo)出常數(shù)。在一些實施方式中，、是在0.l-10、l-5、2-4或2-3的范圍內(nèi)。在一些實施方式中，ka是2.56。在一些實施方式中，該特定區(qū)間是0-15、5-10、6-9、7-8nm的范圍，優(yōu)選地為7.3-7.5nm。在一些實施方式中，在確定導(dǎo)致與等式8最佳擬合的白蛋白單體的供量后，通過從其中減去等式7，由同一供量進行調(diào)節(jié)的，校正差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)。在一些實施方式中，在特定區(qū)間中實施通過減去等式7進行的校正，該特定區(qū)間例如但不限于0-15、2-12、4-10，優(yōu)選地為6-10nm。在其中校正不考慮范圍10-llnm的一些實施方式中，通過以(ll-直徑)的因子乘以等式7和減去差分帶電荷微粒遷移率微粒大小分布數(shù)據(jù)的結(jié)果，在10-llnm區(qū)間進行相應(yīng)校正。舉例而言，可以用各種電子裝置執(zhí)行以上描述的過程，例如臺式機或筆記本電腦或手持式裝置。這些裝置為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。另外，結(jié)果可以被顯示在顯示器上、被打印或被儲存在存儲設(shè)備上，例如硬盤、CDROM、CDR/W、閃存等。進一步地，通過網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果可以提供給其它裝置，網(wǎng)絡(luò)可以是私人網(wǎng)絡(luò)或公用網(wǎng)絡(luò)，例如Internet。就這點而言，電子設(shè)備和/或存儲設(shè)備可以通過網(wǎng)絡(luò)進入。在一種實施方式中，將測量的值與經(jīng)驗確定的范圍比較，以便基于落入或超出范圍的患者血清或血漿值進行診斷。下面的圖表說明這種診斷的一組示例性范圍<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>nmol/LUDLIVLDLIIILDLIILDLI女性33-12982-44291-57451-186男性38-164136-627200-59648-164LDL微粒大小(A)女性215.4-232.9男性212.3-230.9nmol/LIDL2IDL1女性11-4810-38男性12-5911-41nmol/LVLDL小VLDL中等VLDL大女性5.8-26.6L0-5/70.2-1.8男性5.0-23.01.1-7.30.2-2.5差分帶電荷微粒遷移率光譜法提供了基于氣相微粒電遷移率測量納米顆粒的大小分布的方法。這種方法適于測量脂蛋白微粒的大小分布。對該方法自動化并在大約l分鐘內(nèi)產(chǎn)生微粒數(shù)量和微粒質(zhì)量對微粒直徑的曲線。首先通過超離心富集脂蛋白(去除血漿蛋白)，并且隨后在揮發(fā)性緩沖液中稀釋以及電霧化。電中和過程留下帶有單電荷的微粒的充分表征的組分。通過差分遷移率分析儀(DMA)抽出帶電荷微粒，這使窄小尺寸的微粒穿過作為施加于DMA上電壓的函數(shù)的微粒計數(shù)器。通過掃描施加的電壓，獲得HDL、LDL、IDL和VLDL的微粒數(shù)量分布。測量基于第一原理并且該測量不需要相對于微粒大小進行校正。將微粒數(shù)量分布轉(zhuǎn)化為微粒質(zhì)量分布。使用這種方法，LDL直徑的分析內(nèi)變化量(intra-assayvariation)<0.6%、HDL禾PLDL濃度的分析內(nèi)變化量<10%，以及IDL和VLDL濃度的分析內(nèi)變化量〈15%。LDL微粒大小的分析之間重復(fù)性〈1.0X，HDL和LDL濃度的分析之間重復(fù)性<15%，和IDL濃度的分析之間重復(fù)性〈20X，VLDL濃度的分析之間重復(fù)性<25%。以下的表顯示概括數(shù)據(jù)，表示為均值和SD，用于產(chǎn)生個體脂蛋白組分的參考范圍。在研究中使用了總數(shù)259個健康個體(191女、68男)，他們滿足目前的最適脂質(zhì)/脂蛋白水平的NCEPATPIII標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇(chol)<200、LDLchol<100、HDLchol>40(男)>50(女)、三酸甘油脂<150mg/dL。結(jié)果顯示出預(yù)期的性別之間差異，男性具有較高濃度的較小LDL微粒而女性具有增加的HDL2b。29<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>確定一個或多個標(biāo)準(zhǔn)在ATPIII準(zhǔn)則之外的人群剩余部分(異常)的范圍。這些顯示出預(yù)期的區(qū)別——較小LDL的濃度增加、以及HDL2b(B)的大小減小且濃度下降，而HDL2a和3的變化很小?？梢杂酶鞣N儀器完成以上描述的方法。例如，Be皿er等的美國專利7，259，018描述了一種儀器，通過該儀器，離心管中的樣品溶液經(jīng)過毛細(xì)管被排出，當(dāng)從毛細(xì)管出來時，它通過電霧化過程離子化。因此，由壓力艙產(chǎn)生的壓差將離子化樣品轉(zhuǎn)移到氣流中，氣流隨后運載樣品到遷移率分析儀。在分析離心管中的樣品之后，另一管樣品被放置在壓力艙里面。然而，在這種安排中，由于在離心管中任何時間僅提供小體積的樣品，所以經(jīng)過毛細(xì)管的樣品的流速可以隨著時間大幅度地變化，即使保持壓力艙中的壓力，因而影響離子遷移率分析儀基于預(yù)測的流速進行定量測定。本發(fā)明的實施方式解決這些問題。依照發(fā)明的實施方式，在流到離子遷移率分析儀期間，通過泵送樣品穿過毛細(xì)管和通過在毛細(xì)管里面離子化樣品(或使其帶電荷)，獲得恒定的流速。圖8圖解依照本發(fā)明的實施方式的用于離子遷移率分析的示例性儀器。圖8的離子遷移率分析儀器10包括類似于美國專利7，259，018中說明的離子遷移率分析儀20。離子遷移率分析儀20能夠計數(shù)從其中流過的微粒。離子遷移率分析儀20可以設(shè)有能夠依照例如以上描述的算法處理(加工)數(shù)據(jù)的電子裝置(沒有顯示)，例如計算機。由自動進樣器22提供樣品的帶電荷微粒流到離子遷移率分析儀20。自動進樣器22可以是自動提供樣品的機器人系統(tǒng)。一種這樣的自動進樣器是型號HTCPAL，由Le即TechnologiesofCarrboro，NorthCarolina制造。在一種實施方式中，自動進樣器是僅提供純化樣品從一機架試管或從多孔板到泵(一個或多個)的機器人裝置。自動進樣器22在不需要大量人介入的情況下，可以提供基本連續(xù)的樣品供應(yīng)，用于離子遷移率分析。來自自動進樣器22的樣品經(jīng)過注射口24被提供到第一泵26。就這點而言，自動進樣器22可以包括容納純化樣品的儲蓄器(沒有顯示)。注射口24可以是第一泵26的一部分。第一泵26是能夠以相對高的流速(例如，大于或等于1.0微升/分鐘)泵送來自自動進樣器22的樣品的高流速(或高流量)泵。在一種實施方式中，高流量泵以大約5-20微升/分鐘的速度泵送來自自動進樣器22的樣品。最優(yōu)選地，高流量泵以大約10微升/分鐘的速度泵送樣品。從EksigentTechnologies,2021LasPositasCtSuite161，Livermore，CA獲得合適的高流量泵。由第一泵26，樣品被提供到第二泵30。第二泵30是能夠以相對低的速度(例如，小于或等于1.0微升/分鐘)泵送樣品到毛細(xì)管34的低流速(或納流量(nanoflow))泵，使得樣品的微粒能夠適當(dāng)?shù)碾x子化或帶電荷，如以下描述。在一種實施方式中，納流量泵以大約100-200納升/分鐘的速度泵送樣品到毛細(xì)管。最優(yōu)選地，納流量泵以大約200納升/分鐘的速度泵送樣品。從EksigentTechnologies,2021LasPositasCtSuite161，Livermore，CA獲得合適的納流量泵。在一種實施方式中，可以使用聯(lián)合泵組件代替兩個泵。例如，泵組件可以包括高流量元件和一種或多種納流元件。示例性聯(lián)合泵組件是NanoLC1_D，可以從EksigentTechnologies,2021LasPositasCtSuitel61，Livermore，CA獲得。在一種實施方式中，經(jīng)過單個閥28或多個閥，第一泵26可以提供樣品給多個納流量泵。通過閥32可以控制到和經(jīng)過毛細(xì)管34的流量，閥32可以是第二泵的一部分或者可以是位于毛細(xì)管34里面的單獨的閥。閥32保證了經(jīng)過在閥32下游的毛細(xì)管34的樣品的恒定流速?？梢噪娮拥乜刂崎y32以維持恒定流速。就這點而言，對放置在閥32下游的傳感器或儀表做出反應(yīng)，可以控制閥。樣品微粒在它們流過毛細(xì)管34期間通過電離器40使其帶電荷。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，當(dāng)微粒離開毛細(xì)管進入離子遷移率分析儀時，微粒的實際電離或帶電荷可以發(fā)生。在一種實施方式中，電離器40是位于一部分毛細(xì)管34周圍的傳導(dǎo)性連接器組件。傳導(dǎo)性連接器(也稱為傳導(dǎo)性接頭)在極細(xì)流周圍施加電流以提供電荷到該流體。一個示例性的傳導(dǎo)性連接器組件在美國專利7，075，066中描述，其通過整體引用并入本文。隨后經(jīng)過毛細(xì)管34提供帶電荷樣品微粒到離子遷移率分析儀20。圖9A和9B圖解在使經(jīng)過毛細(xì)管的樣品微粒流帶電荷中使用的傳導(dǎo)性連接器的示例性實施方式。先參考圖9A，在毛細(xì)管34周圍形成傳導(dǎo)性連接器組件40a。毛細(xì)管34的電離區(qū)35被傳導(dǎo)性連接器42包圍。施加到傳導(dǎo)性連接器42上的電壓引起經(jīng)過毛細(xì)管34的電離區(qū)35的流體中微粒帶電荷。對于操作傳導(dǎo)性連接器組件40a的詳細(xì)說明，可以參考美國專利7，075，066?，F(xiàn)在參考圖9B，傳導(dǎo)性連接器組件的另一個實施方式被圖解。在圖9B的實施方式中，傳導(dǎo)性連接器組件40b在樣品流過其中的一部分毛細(xì)管34中形成微量滴定區(qū)37。微量滴定區(qū)37可以在毛細(xì)管的兩個截面之間形成接頭或封接。微量滴定區(qū)37具有樣品微粒在其中被帶電荷的小的死體積。在一種實施方式中，微量滴定區(qū)37具有大約5-50納升的死體積。在最優(yōu)選的實施方式中，微量滴定區(qū)37具有大約10-15納升的死體積。微量滴定區(qū)37優(yōu)選地由不銹鋼形成。傳導(dǎo)性連接器組件40b包括在微量滴定區(qū)37周圍形成的傳導(dǎo)性連接器44。施加到傳導(dǎo)性連接器44上的電壓使經(jīng)過微量滴定區(qū)37的流體中微粒帶電荷。因此，離子遷移率分析儀20被提供了基本不隨時間變化(substantiallytime-invariant)的速率下的樣品的受控制納流。就這點而言，流速優(yōu)選地從正常速率的變化小于5%、更優(yōu)選地小于2%、最優(yōu)選地小于1%。這允許通過離子遷移率分析儀20進行更一致和可靠的分析。通過整體地引用，并入在說明書中引用的所有專利和其它文獻(xiàn)，包括任何表格和圖，其引用程度如同每篇文獻(xiàn)通過整體引用被單獨地并入一樣。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地意識到，本發(fā)明非常適合于獲得提到的結(jié)果和優(yōu)勢以及在其中固有的結(jié)果和優(yōu)勢。本文作為現(xiàn)在代表性的優(yōu)選實施方式描述的方法、變化和組合物是示例性的而不意欲限制本發(fā)明范圍。包括在本發(fā)明精神內(nèi)的、本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到的其中的改變和其它用途由權(quán)利要求的范圍限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將非常顯而易見的是，不偏離本發(fā)明的范圍和精神，可以對本文公開的發(fā)明進行各種替代和修改。因此，這些另外的實施方式在本發(fā)明和所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在缺少未被本文具體公開的任何元件或多個元件、限定或多個限定的情況下，可以合適地實施本文圖解描述的發(fā)明。因此，例如，在本文的每種情況下，術(shù)語"包括"、"基本由......組成"和"由......組成"中任一個可以用其它兩個術(shù)語替換。已經(jīng)使用的術(shù)語和表達(dá)被作為描述而不是限制的術(shù)語使用，并且在這些術(shù)語和表達(dá)的使用中不意欲排除所顯示或描述的特征的任何等同物或其部分，而是認(rèn)識到在要求保護的發(fā)明的范圍內(nèi)各種修改是可能的。因此，應(yīng)該理解，雖然本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選的實施方式和任選的特征具體地公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取本文公開的概念的修改和變化，并且這些修改和變化被考慮在所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，在按照馬庫什組或其它替代性方案組描述本發(fā)明的特征或方面的地方，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，由此也按照馬庫什組或其它組的任何個體成員或成員的亞組描述本發(fā)明。同時，除非有相反的說明，在提供實施方式各種數(shù)值的地方，通過采用任何兩個不同的值作為范圍的端點描述另外的實施方式。這些范圍也在所描述的發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，另外的實施方式在本發(fā)明的范圍內(nèi)和在所附權(quán)利要求之內(nèi)。3權(quán)利要求純化脂蛋白的方法，所述脂蛋白適合于脂蛋白類和亞類的差分帶電荷微粒遷移率分析，所述方法包括(a)制備含有在樣品下面的第一溶液的離心管，所述樣品包括一種或多種脂蛋白和非脂蛋白成分，所述第一溶液具有大于1.00g/mL并小于或等于大約1.21g/mL的第一密度；和(b)使所述離心管受到足以使所述非脂蛋白成分向所述試管的底部遷移并且遠(yuǎn)離所述脂蛋白的離心。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一溶液具有在大約1.15g/mL到大約1.21g/mL范圍的密度。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述離心管還包括第二溶液，其具有大于或等于1.OOg/mL并小于所述第一密度的第二密度，并且其中所述第二溶液在離心之前位于所述樣品上面并且鄰近所述樣品。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種脂蛋白選自HDL、LDL、IDL、Lp(a)和VLDL。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述一種或多種脂蛋白是HDL。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種脂蛋白和非脂蛋白成分來自血漿樣品。7.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其中所述離心沒有達(dá)到平衡。8.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其還包括(c)離心后，從所述離心管的頂部收集所述純化的脂蛋白。9.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其中在所述一種或多種脂蛋白不從所述樣品沉淀的條件下，所述樣品還包括葡聚糖硫酸酯。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品還包括白蛋白結(jié)合化合物，該白蛋白結(jié)合化合物能夠結(jié)合白蛋白，形成白蛋白_白蛋白結(jié)合化合物復(fù)合物，并且其中所述離心使所述白蛋白_白蛋白結(jié)合化合物復(fù)合物與所述純化的脂蛋白分離。11.根據(jù)權(quán)利要求io所述的方法，其中所述白蛋白結(jié)合化合物是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的類似物。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述NAD類似物選自活性綠19和汽巴藍(lán)3GA。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述NAD類似物被結(jié)合到選自順磁性微粒、葡聚糖、瓊脂糖和Sephadex⑧的層析介質(zhì)。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品還包括非脂蛋白捕獲配體，該非脂蛋白捕獲配體能夠結(jié)合非脂蛋白，形成非脂蛋白/非脂蛋白捕獲配體復(fù)合物，并且其中所述離心使所述非脂蛋白/非脂蛋白捕獲配體復(fù)合物與所述脂蛋白成分分離。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述非脂蛋白捕獲配體選自適配體和抗體。16.根據(jù)權(quán)利要求l或3所述的方法，其中在離心之前通過下述步驟將Lp(a)從所述樣品中移出(i)在足以引起Lp(a)沉淀的條件下，通過使所述樣品與含有ApoB的脂蛋白的沉淀劑混合，形成Lp(a)的沉淀物；禾口(ii)從所述樣品分離含有所述Lp(a)的沉淀物。17.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中Lp(a)通過下述步驟從所述收集的脂蛋白中移出(i)在足以引起Lp(a)沉淀的條件下，通過使所述收集的脂蛋白與含有ApoB的脂蛋白的沉淀劑混合，形成含有Lp(a)的沉淀物；禾口(ii)從所述收集的脂蛋白分離含有所述Lp(a)的沉淀物。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述含有ApoB的脂蛋白的沉淀劑包括葡聚糖硫酸酯和二價陽離子。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述二價陽離子是Mg2+。20.獲得純化的Lp(a)的方法，所述方法包括(1)溶解依照權(quán)利要求16或17獲得的含有所述Lp(a)的沉淀物；(2)在適合允許形成Lp(a)-凝集素復(fù)合物的條件下，使所述溶解的Lp(a)與含有連接到固體載體的凝集素的固體_載體試劑混合；(3)分離所述Lp(a)-凝集素復(fù)合物；禾口(4)從所述Lp(a)-凝集素復(fù)合物釋放所述Lp(a)，由此提供適合于差分帶電荷微粒遷移率分析的純化脂蛋白。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述凝集素選自麥胚凝集素(WGA)、利馬豆凝集素(LGA)、植物凝集素(PHA)和鱟凝集素(HCL)。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述凝集素是WGA。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述固體載體包括瓊脂糖。24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述釋放包括用WGA的競爭性配體洗滌所述Lp(a)-凝集素復(fù)合物。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述競爭性配體是N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)。26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述釋放包括所述Lp(a)-凝集素復(fù)合物的二硫化物還原。27.獲得純化的Lp(a)的方法，所述方法包括(1)溶解依照權(quán)利要求16或17獲得的含有所述Lp(a)的沉淀物；(2)使所述溶解的Lp(a)與Y-球蛋白和脯氨酸混合，形成混合物；(3)通過加入沉淀劑沉淀所述混合物；禾口(4)從所述沉淀物中回收Lp(a)，由此提供適合于差分帶電荷微粒遷移率分析的純化脂蛋白。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述沉淀劑是硫酸銨。29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一溶液是水溶液并且包括氧化氖。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述水溶液基本為氧化氖。31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一溶液與惰性離心基質(zhì)接觸。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述惰性離心基質(zhì)包括凝膠漿液或惰性珠子。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述凝膠漿液包括Sephadex⑧凝膠基質(zhì)。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述惰性離心基質(zhì)包括惰性珠子。35.純化脂蛋白的方法，所述方法包括(a)制備含有樣品和位于所述樣品下面并鄰近所述樣品的第一溶液的離心管，所述樣品包括一種或多種脂蛋白和非脂蛋白成分，其中所述樣品還包括活性綠葡聚糖和葡聚糖硫酸酯，其中所述第一溶液包括氧化氖；禾口(b)使所述離心管受到足以使所述非脂蛋白成分向所述試管的底部遷移并且遠(yuǎn)離所述脂蛋白的離心。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述第一溶液具有1.OOg/mL到大約1.21g/mL的密度。37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述第一溶液具有1.OOg/mL到大約1.lOg/mL的密度。38.純化用于差分帶電荷微粒遷移率分析的脂蛋白的方法，所述方法不包括離心，所述方法包括>(a)使含有脂蛋白和非脂蛋白的溶液與一種或多種多陰離子化合物和一種或多種二價陽離子混合；(b)使含有脂蛋白的沉淀物在所述混合的溶液中形成；禾口(c)在步驟(b)后，收集沉淀的脂蛋白并對其進行差分帶電荷微粒遷移率分析。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述多陰離子化合物選自葡聚糖硫酸酯、支鏈淀粉和聚硫酸乙烯酯，并且其中所述二價陽離子選自Mg"和Ca2+。40.分析脂蛋白大小分布的方法，所述方法包括(i)依照權(quán)利要求1、35或38的任一項所述的方法，提供一種或多種脂蛋白；禾口(ii)對所述一種或多種脂蛋白進行差分帶電荷微粒遷移率分析，由此測定所述脂蛋白的大小分布。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述一種或多種脂蛋白來自從個體獲得的血漿樣品。42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述一種或多種脂蛋白選自HDL、LDL、Lp(a)、IDL禾卩VLDL。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其還包括(iii)使用所述測定的脂蛋白大小分布，對所述個體進行評估，所述評估選自脂質(zhì)相關(guān)的健康風(fēng)險、心血管狀況、心血管疾病的風(fēng)險和對治療性介入的反應(yīng)性。44.純化用于差分帶電荷微粒遷移率分析的脂蛋白的方法，所述方法不包括離心，所述方法包括(a)使包括脂蛋白和非脂蛋白的溶液與一種或多種脂蛋白-捕獲配體混合，所述脂蛋白-捕獲配體能夠結(jié)合脂蛋白，形成脂蛋白/脂蛋白-捕獲配體復(fù)合物；(b)分離所述脂蛋白/脂蛋白_捕獲配體復(fù)合物；禾口(c)從所述脂蛋白/脂蛋白-捕獲配體復(fù)合物釋放所述脂蛋白和對所述脂蛋白進行差分帶電荷微粒遷移率分析。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述脂蛋白選自HDL、LDL、Lp(a)、IDL和VLDL。46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述脂蛋白-捕獲配體選自適配體和抗體。47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述脂蛋白_捕獲配體是抗體。48.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中步驟(ii)包括(1)在微粒大小的一個或多個區(qū)間中，測定微粒大小分布；(2)減去非脂蛋白試劑或非脂蛋白樣品物質(zhì)對所述微粒大小分布的供量，獲得脂蛋白微粒大小分布；禾口(3)輸出所述脂蛋白微粒大小分布到顯示器、打印機或存儲器。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述測定微粒大小分布包括確定所述一種或多種區(qū)間的最佳擬合。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述最佳擬合是以下形式y(tǒng)i=k其中yi是對所測量的差分遷移率大小分布的供量，、是所述擬合的經(jīng)驗常數(shù)，和d是微粒直徑；其中所述測定最佳擬合包括計算、的值。51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述減去包括應(yīng)用代表所述非脂蛋白試劑或所述非脂蛋白樣品物質(zhì)的微粒大小分布的理論曲線。52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述非脂蛋白試劑是與葡聚糖結(jié)合的活性綠19(RGD)。53.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述非脂蛋白樣品物質(zhì)是白蛋白。54.分析脂蛋白大小分布的方法，其包括(a)對一種或多種進行差分帶電荷微粒遷移率分析的脂蛋白，在微粒大小的一個或多個區(qū)間中，測定差分遷移率微粒大小分布；(b)減去非脂蛋白試劑或非脂蛋白樣品物質(zhì)對微粒大小分布的供量，獲得脂蛋白微粒大小分布；禾口(c)輸出所述脂蛋白微粒大小分布到顯示器、打印機或存儲器。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述測定微粒大小分布包括確定所述一個或多個區(qū)間的最佳擬合。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述最佳擬合具有如下的形式y(tǒng)i=k其中yi是對所測量的差分遷移率大小分布的供量，、是所述擬合的經(jīng)驗常數(shù)，和d是微粒直徑；其中所述確定最佳擬合包括計算、的值。57.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述減去包括應(yīng)用代表所述非脂蛋白試劑或所述非脂蛋白樣品物質(zhì)的微粒大小分布的理論曲線。58.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述非脂蛋白試劑是與葡聚糖結(jié)合的活性綠19(RGD)。59.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述非脂蛋白樣品物質(zhì)是白蛋白。60.計算機可讀媒介，其包括儲存在其上的計算機編碼，用于分析脂蛋白大小分布的所述計算機編碼包括(a)對一種或多種進行差分帶電荷微粒遷移率分析的脂蛋白，在微粒大小的一個或多個區(qū)間中，測定差分遷移率微粒大小分布；(b)減去非脂蛋白試劑或非脂蛋白樣品物質(zhì)對微粒大小分布的供量，獲得脂蛋白微粒大小分布；禾口(c)輸出所述脂蛋白微粒大小分布到顯示器、打印機或存儲器。61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的計算機可讀媒介，其中所述計算機編碼還包括通過確定所述一個或多個區(qū)間的最佳擬合，確定微粒大小分布。62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的計算機可讀媒介，其中所述最佳擬合是以下的形式y(tǒng)i=k其中yi是對所測量的差分遷移率大小分布的供量，、是所述擬合的經(jīng)驗常數(shù)，和d是微粒直徑；其中所述確定最佳擬合包括計算、的值。63.根據(jù)權(quán)利要求60所述的計算機可讀媒介，其中所述減去包括應(yīng)用代表所述非脂蛋白試劑或所述非脂蛋白樣品物質(zhì)的微粒大小分布的理論曲線。64.根據(jù)權(quán)利要求60所述的計算機可讀媒介，其中所述非脂蛋白試劑是與葡聚糖結(jié)合的活性綠19(RGD)。65.根據(jù)權(quán)利要求60所述的計算機可讀媒介，其中所述非脂蛋白樣品物質(zhì)是白蛋白。66.用于差分帶電荷微粒遷移率分析的儀器，其包括(a)—個或多個適合于運輸樣品經(jīng)過毛細(xì)管的泵；(b)適合于在所述樣品流入毛細(xì)管內(nèi)時，使所述樣品的微粒帶電荷的電離器；禾口(c)適合于對帶電荷微粒的所述樣品進行差分帶電荷微粒遷移率分析的離子遷移率分析儀。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的儀器，其還包括適合于提供用于差分帶電荷微粒遷移率分析的樣品到所述一個或多個泵的自動進樣器。68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的儀器，其中所述樣品包括脂蛋白。69.根據(jù)權(quán)利要求66所述的儀器，其中所述一個或多個泵包括適合于提供所述樣品到納流量泵的高流量泵，所述納流量泵適合于提供所述樣品到所述毛細(xì)管。70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的儀器，其中所述高流量泵以大約15-25微升/分鐘的速度泵送所述樣品，和其中所述納流量泵以大約100-200納升/分鐘的速度泵送所述樣品。71.根據(jù)權(quán)利要求66所述的儀器，其中所述電離器包括在一部分所述毛細(xì)管周圍的傳導(dǎo)性連接器。72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的儀器，其中所述傳導(dǎo)性連接器施加電荷到流過其中的所述樣品上，因而使所述樣品的微粒帶電荷。73.根據(jù)權(quán)利要求71所述的儀器，其中所述傳導(dǎo)性連接器在一部分所述毛細(xì)管中形成微量滴定區(qū)并施加電荷到流過其中的所述樣品上，因而使所述樣品的微粒帶電荷。74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的儀器，其中所述微量滴定區(qū)具有大約5-50納升的死體積。75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的儀器，其中所述微量滴定區(qū)具有大約10-15納升的死體積。全文摘要本發(fā)明提供利用差分帶電荷微粒遷移率分析方法，由生物樣品制備用于診斷目的的脂蛋白的儀器和方法，該脂蛋白包括HDL、LDL、Lp(a)、IDL和VLDL。還提供通過差分帶電荷微粒遷移率分析脂蛋白的大小分布的方法，該脂蛋白通過本發(fā)明的方法制備。還提供評估脂質(zhì)相關(guān)的健康風(fēng)險、心血管狀況、心血管疾病的風(fēng)險和對治療性介入的反應(yīng)性的方法，該方法利用通過本發(fā)明的方法測定的脂蛋白大小分布。文檔編號G01N27/26GK101772701SQ200880101850公開日2010年7月7日申請日期2008年6月6日優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日發(fā)明者E·考奈爾,G·K·李,M·P·考菲爾德,P·J·布蘭奇,R·E·賴茨,R·克勞斯,S·李,W·H·班納申請人:奎斯特診斷投資公司