專利名稱：：篩選、治療和診斷的制作方法篩選、治療和診斷本發(fā)明涉及炎性疾病的診斷和治療。其還涉及篩選方法，用于鑒定藥物或藥物候選者在治療炎性疾病、尤其是膿毒和炎性腸病(IBD)中的潛在用途。TREM-1是已經(jīng)在人和鼠類多形核嗜中性粒細(xì)胞和成熟的單核細(xì)胞上鑒定到的細(xì)胞表面分子[Bouchon等，J.Immunol.164=4991-4995(2000)]。其屬于免疫球蛋白超家族并在稱為DAP12的銜接蛋白的幫助下激活下游信號(hào)途徑[Bouchon等，上文；Colonna等，J.Infect.Dis.187(Suppl):S297_301(2003),ColonnaNat.Rev.Immunol.6445-453(2003)；Nathan等Nat.Med.7:530_2(2001)]。經(jīng)TREM-1觸發(fā)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、趨化因子、活性氧類別的產(chǎn)生，并導(dǎo)致嗜中性顆粒的快速降解和吞噬。已顯示TREM-1信號(hào)途徑的阻斷抑制膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生(Y.MurakamiInnateImmunitySignalingMechanismsFebruary2008,Keystone,Colorado提出的摘要)。此外，通過抑制LPS誘導(dǎo)的IL-12家族細(xì)胞因子激活TREM-1，可影響體內(nèi)的T細(xì)胞響應(yīng)，因此提示了TREM-1激活在先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的體內(nèi)功能(DowerK,J.Immunol.2008180=3520-3534)。因?yàn)楦蓴_TREM-1銜接導(dǎo)致多種促炎介體的產(chǎn)生和分泌的同時(shí)減少，所以TREM-1代表用于治療慢性炎性疾病的有吸引力的靶標(biāo)。確實(shí)，已經(jīng)在多種炎性疾病，包括急性內(nèi)毒素血癥、幽門螺旋桿菌感染、肝肉芽腫病、腸道沙門氏菌感染、傳染性肺病、Marburg和Ebola病毒感染、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、炎性腸病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒中顯示了TREM-1的作用。膿毒構(gòu)成了重癥監(jiān)護(hù)資源的重大消耗，并一直是重癥監(jiān)護(hù)病房中常見的問題。已經(jīng)估計(jì)在美國和歐洲每年40萬到50萬患者受其感染。盡管支持性療法和抗微生物治療均有改進(jìn)，發(fā)病率和死亡率仍然保持高水平。死亡率從非并發(fā)型膿毒的40%變化至那些患膿毒性休克和多器官異常的患者中的80%。疾病的發(fā)病機(jī)理目前變得更容易理解。對(duì)免疫、炎癥和血液學(xué)介質(zhì)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)更好的理解可允許開發(fā)合理并新穎的治療法。感染后，在促進(jìn)特異性和復(fù)雜性的連續(xù)相中發(fā)生先天的和認(rèn)知的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致感染物質(zhì)的清除和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)。先天的免疫應(yīng)答作為防御的第一道防線起作用并在模式識(shí)別受體如Toll樣受體(TLR)激活時(shí)啟動(dòng)[Aderem等，Nature406=782-786(2000)和Thoma-Uszynski等，Science2911544-1549(2001)]。通過多種病原體相關(guān)微生物模式(PAMP)發(fā)生激活[Medzhitov等，N.Engl.J.Med.343:338_344(2000)]。TLR的激活觸發(fā)大量此類細(xì)胞因子如TNF-a和IL-10的釋放，其在如膿毒的此類大量感染的情況下可加速組織損傷和致死性休克[Cohen，等，Nature420885-91(2002)；Hotchkiss等，N.Engl.J.Med.348138-50(2003)]。尤其是參與響應(yīng)感染的另一受體被稱為“骨髓細(xì)胞-1上表達(dá)的觸發(fā)受體”(TREM-1)。其為最近發(fā)現(xiàn)的受體家族TREM家族的成員，在嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞亞組的表面上表達(dá)。TREM受體通過與銜接分子DAP12結(jié)合激活髓樣細(xì)胞。已經(jīng)報(bào)道TREM-1的銜接在微生物產(chǎn)物存在下引發(fā)促炎細(xì)胞因子的合成。TREM-1是已經(jīng)在人和鼠類多形核嗜中性粒細(xì)胞和成熟的單核細(xì)胞上鑒定的細(xì)胞表面分子[Bouchon等，J.Immunol.164=4991-4995(2000)]。其屬于免疫球蛋白超家族并在稱為DAP12的銜接蛋白的幫助下激活下游信號(hào)途徑[Bouchon等，上文；Colonna等，J.Infect.Dis.187(Suppl):S297_301(2003),ColonnaNat.Rev.Immunol.6445-453(2003)；Nathan等Nat.Med.7:530_2(2001)]。Bouchon和同事已表明在細(xì)胞培養(yǎng)物和來自感染患者的組織樣品中，在如銅綠假Hfilif(Pseudomonasaeruginosa)gmfe^fll王求胃(Staphylococcusaureus)細(xì)胃的存在下，嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上TREM-1的表達(dá)顯著上調(diào)[Bouchon等，Nature4101103-1107(2001)]。截然相反的是，在來自患有非傳染性炎性疾病如免疫復(fù)合物引起的牛皮癬、潰瘍性結(jié)腸炎或血管炎的患者的樣品中TREM-1未被上調(diào)[Bouchon等，Nature4101103-1107(2001)]。此外，當(dāng)TREM-1結(jié)合其配體時(shí)，存在LPS的協(xié)同效應(yīng)和促炎細(xì)胞因子TNF-a和GM-CSF的擴(kuò)大合成，和IL-10產(chǎn)生的抑制[Bleharski等J.Immunol.1703812-3818(2003)]。在LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克的鼠類模型中，TREM-1信號(hào)途徑的阻斷保護(hù)動(dòng)物免于死亡，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了該分子至關(guān)重要的作用[Colonna等，J.Infect.Dis.187(Suppl):S297-301(2003)，Bouchon等，Nature410:1103_1107(2001)]。研究顯示TREM-1在對(duì)感染的炎性反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用[Bouchon等J.Immunol.164=4991-4995(2000)]TREM-1的表達(dá)在人的髓樣細(xì)胞中響應(yīng)細(xì)菌和真菌感染而升高。類似地，在小鼠中，脂多糖(LPS)的休克誘導(dǎo)與TREM-1的升高的表達(dá)有關(guān)。此外，用可溶性TREM-1/Ig融合蛋白作為“誘餌”受體治療小鼠保護(hù)小鼠免于因LPS或大腸桿菌(E.coli)引起的死亡。1991年，美國胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)和美國危重病人護(hù)理醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)公布了系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和膿毒的定義，旨在闡明這些狀況的診斷和治療并幫助解釋該領(lǐng)域中的研究(見表1)。表1系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和膿毒的定義<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在嚴(yán)重患病患者中已顯示響應(yīng)一系列損傷的生理學(xué)變量模式，所述損傷包括創(chuàng)傷、燒傷、胰腺炎和感染。這些包括炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞增多或嚴(yán)重的白血球減少、體溫過高或體溫過低、心動(dòng)過速和呼吸急促，并共同稱作系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。該定義強(qiáng)調(diào)炎性過程在這些狀況的重要性，不管有沒有感染的存在。當(dāng)感染是可疑的或得到證明時(shí)，術(shù)語“膿毒”預(yù)定為SIRS。當(dāng)具有器官血流灌注不足的證據(jù)(器官功能異常的病征如低氧血癥、少尿、乳酸酸中毒或改變的大腦功能使其得到證明)時(shí)，膿毒進(jìn)一步分成嚴(yán)重膿毒。膿毒性休克是低血壓并發(fā)的嚴(yán)重膿毒，低血壓定義為盡管具有足夠的流體復(fù)蘇但低于90mmHg收縮壓。膿毒和SIRS可能與異常的器官灌注和氧合引起的兩個(gè)或更多器官的衰竭并發(fā)，所述衰竭稱作多器官衰竭(M0F)。除了感染的全身效應(yīng)，在嚴(yán)重的炎性狀況如胰腺炎和燒傷中可發(fā)生全身炎性反應(yīng)。在重癥監(jiān)護(hù)病房中，在50到60%膿毒中涉及革蘭氏陰性細(xì)菌，革蘭氏陽性細(xì)菌占其它情況的35到40%。其余情況是由真菌、病毒和原生動(dòng)物引起的更不常見的原因。盡管對(duì)TREM-1受體及其在炎癥和膿毒中作用有巨大興趣，但至今未能鑒定到TREM-1受體的任何生物學(xué)配體。本發(fā)明人目前已經(jīng)創(chuàng)造了巨大突破。他們已經(jīng)鑒定了TREM-1受體的配體并已經(jīng)證明其在來自膿毒患者的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供篩選方法，其包括提供TREM-1配體或其衍生物并測定測試化合物是否影響a)該配體其衍生物與TREM-1受體，或與包含TREM-1配體結(jié)合區(qū)的其衍生物的結(jié)合，和/或b)TREM-1配體與TREM-1受體的結(jié)合調(diào)節(jié)的活性。所述方法優(yōu)選用于篩選用于治療TREM-1相關(guān)炎性病癥，尤其是膿毒和炎性腸病(IBD)的化合物。因此所述方法可用于篩選藥物/藥物候選者。此處所述方法期望地包括步驟測定測試化合物是否阻斷或減少TREM-1配體/其衍生物與TREM-1受體/衍生物的結(jié)合，或是否阻斷或降低通過所述結(jié)合介導(dǎo)的活性。如果是這樣，那么推斷所述化合物可能用于治療TREM-1相關(guān)的炎性病癥，尤其是膿毒和炎性腸病(IBD)。優(yōu)選地，所述方法用于篩選用于治療病原體介導(dǎo)的膿毒的化合物。術(shù)語“病原體”此處用于描述對(duì)人或非人動(dòng)物宿主的健康有害的任何感染性生物體。如下文討論，本發(fā)明人已經(jīng)顯示TREM-1配體是病原體介導(dǎo)膿毒的重要標(biāo)記并可用于將此與其中沒有病原性參與的SIRS狀況區(qū)分。例如，膿毒可能是因微生物感染引起。所述感染可以例如是細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物或病毒感染。然而更優(yōu)選地，其為細(xì)菌或真菌感染。適當(dāng)?shù)?，所述方法使用表達(dá)TREM-1受體或TREM-1受體的至少配體結(jié)合部分的細(xì)胞。(若需要，TREM-1受體的細(xì)胞內(nèi)部分可被通常不與TREM-1受體結(jié)合的異源部分替換。這用于某些基于報(bào)告子的篩選系統(tǒng)。例如可使用CD3(的胞質(zhì)區(qū)，如稍后實(shí)施例11中討論)。細(xì)胞可以是天然表達(dá)受體的那些細(xì)胞。因此它們可以是嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞?？蓮幕加心摱镜幕颊咧蝎@得此類細(xì)胞?；蛘?，所述細(xì)胞可以不是嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞，卻可以是通常不表達(dá)TREM-1受體但已經(jīng)被修飾來表達(dá)TREM-1受體或其TREM-1配體結(jié)合部分的其它細(xì)胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行修飾。例如，可用編碼TREM-1受體或該受體的至少配體結(jié)合部分的載體和合適的啟動(dòng)子(例如誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因此所述細(xì)胞相對(duì)于其中正常表達(dá)受體的細(xì)胞而言可以是異源細(xì)胞。然而TREM-1受體/其配體結(jié)合部分甚至不需要結(jié)合細(xì)胞。可使用可溶性形式。甚至可使用多價(jià)體形式。例如，可使用包含連接鏈霉抗生物素蛋白支架的四個(gè)可溶性形式的四聚體，如本文稍后更詳細(xì)地描述?；蛘撸墒褂冒诤螴gG恒定區(qū)的TREM-1受體胞外域的可溶性形式。該構(gòu)建體描述于W0/2004/081233的實(shí)施例1中。(W0/2004/081233的全部內(nèi)容特此引入作為參考)。也可能例如通過親和柱提供固定形式的受體。可認(rèn)為所有上述形式是受體的衍生物，條件是它們?nèi)员Ａ艚Y(jié)合TREM-1配體的能力?？啥炕蚨ㄐ栽u(píng)估結(jié)合。因此，例如，所述方法可包括測定在缺少測試化合物與存在測試化合物的情況下TREM-1配體或衍生物與TREM-1受體或衍生物結(jié)合的差異?；蛘叨ㄐ苑治隹珊唵蔚販y定結(jié)合是否發(fā)生。用于分析結(jié)合的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。例如，可通過使用如western印跡、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾層”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、凝集反應(yīng)測定、補(bǔ)體結(jié)合測定、免疫放射測定、熒光免疫測定、A蛋白免疫測定、免疫沉淀測定、免疫組織化學(xué)測定、競爭或夾層ELISA、放射免疫測定、Western印跡測定、免疫組織學(xué)測定、免疫細(xì)胞化學(xué)測定、點(diǎn)印跡測定、熒光偏振測定、閃爍迫近測定、均相時(shí)間分辨熒光測定、IAsys分析或BIAcore分析技術(shù)的競爭性免疫測定、非競爭測定系統(tǒng)來檢測結(jié)合。合適的技術(shù)使用可檢測標(biāo)記并測定被檢測標(biāo)記的量的變化。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定⑶177(有時(shí)候稱為NB1或PRV-1)為TREM-1配體。他們也顯示⑶177的單克隆抗體阻斷了包含TREM-1配體的構(gòu)建體與表達(dá)TREM-1受體的膿毒性嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)合。⑶177在本發(fā)明之前已經(jīng)是眾所周知了，但并沒有顯示其為TREM-1配體。的確沒有任何關(guān)于⑶177與TREM-1配體相關(guān)的討論。CD177被討論與自身免疫性疾病相關(guān)。例如，Stroneck等在TranslMed.2004；28中解釋，CD177是Lalezari等在研究新生兒同種免疫嗜中性粒細(xì)胞減少癥的病例時(shí)第一次描述的嗜中性粒細(xì)胞膜糖蛋白[LalezariP，MurphyGB,AllenFHJr.NB1,anewneutrophil-specificantigeninvolvedinthepathogenesisofneonatalneutropeniaJClinInvest.1971；501108-1115)]0偶然地，在妊娠期間，母親產(chǎn)生嗜中性粒細(xì)胞抗原的同種異體抗體，其穿過胎盤，與胎兒中的嗜中性粒細(xì)胞反應(yīng)，并引起新生兒患上嗜中性粒10細(xì)胞減少癥。Lalezari等將此類抗體識(shí)別的一種抗原描述為“NB1”。稍后，該抗原重新命名為人嗜中性粒細(xì)胞抗原-2a(HNA-2a)，并且攜帶該抗原的gp稱作NBlgp[BuxJ,BierlingP,vondemBorneAEGKr,等ISBTGranulocyteAntigenWorkingParty.NomenclatureofGranulocyteAlloantigens.VoxSang.1999；77:251]。2001年，Kissel和同事對(duì)編碼NBlgp的基因進(jìn)行測序并稱作基因NB1[KisselK,SantosoS,HofmannC,StroncekD,BuxJ.MolecularbasisoftheneutrophilglycoproteinNB1(CD177)involvedinthepathogenesisofimmuneneutropeniasandtransfusionreactions.EuropeanJournaloflmmunology.2001;31:1301_1309]。然而，該基因與前年已經(jīng)測序的稱作PRV-1的基因高度同源。Temerinac和同事在2000年搜索在來自患有真性紅細(xì)胞增多癥患者的嗜中性粒細(xì)胞中過表達(dá)的基因時(shí)鑒定并測序了PRV-1[TemerinacS,KlippelS,StrunckE,RoderS,LubbertM,Langeff,AzemarM,MeinhardtG,SchaeferHE,PahlHL.CloningofPRV-1,anovelmemberoftheuPARreceptorsuperfamily,whichisoverexpressedinpolycythemiarubravera.Blood.2000;95:2569-2576]。NB1和PRV-1的編碼區(qū)僅在導(dǎo)致氨基酸改變的4個(gè)核苷酸處不同，Caruccio、Bettinotti和同事已經(jīng)顯示PRV-1和NB1是單個(gè)基因的等位基因[BettinottiMP,OlsenA,StroncekD.TheUseofBioinformaticstoIdentifytheGenomicStructureoftheGenethatEncodesNeutrophilAntigenNB1,CD177.ClinicalImmunology.2002；102138-144；CaruccioL,ffalkovichK,BettinottiM,SchullerR,StroncekD.CD177polymorphisms:correlationbetweenhighfrequencysinglenucleotidepolymorphismsandneutrophilsurfaceproteinexpression.Transfusion.2004；44:77_82]。目前認(rèn)為PRV-1和NB1是相同基因的等位基因，PRV-1是正常人群中更常見的等位基因[CaruccioL,BettinottiM,FraserE,Director-MyskaA,ArthurDC,StroncekDFBlood.2003；102:661a]。如前文表明，⑶177的衍生物可用于本發(fā)明。術(shù)語“衍生物”包括變體、片段和融合蛋白。合適的衍生物在生理?xiàng)l件下結(jié)合TREM-1受體。更適當(dāng)?shù)?，它們不結(jié)合嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞上體內(nèi)存在的任何其它細(xì)胞表面蛋白，尤其不結(jié)合來自膿毒患者的嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞。這使得它們能夠用于高度特異的基于細(xì)胞的結(jié)合測定。最適當(dāng)?shù)?，衍生物在它們不結(jié)合受體來源的物種(例如人類)中常見的任何其它蛋白質(zhì)的意義上對(duì)TREM-1受體是特異的。⑶177的變體包括等位變體。等位變體可以是種內(nèi)或種間等位變體。合適的變體出現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中。更適當(dāng)?shù)?，它們出現(xiàn)在嚙齒類(例如小鼠、大鼠)或兔或人中。也包括非等位變體?？墒褂弥亟MDNA技術(shù)、自動(dòng)合成、定向誘變等制備此類分子。目前已經(jīng)很好地發(fā)展了此類技術(shù)。合適的變體具有與圖18中所示氨基酸序列，或至少與⑶177結(jié)合TREM-1受體需要的圖18部分序列具有至少約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%同一性的氨基酸序列(或至少其部分)。預(yù)計(jì)該部分對(duì)應(yīng)位于圖18中所示22到437位氨基酸，尤其是22到408位的氨基酸的片段內(nèi)。因此，該段氨基酸或(其仍結(jié)合CD177受體的更小部分)可用于本發(fā)明并也可用于序列比較。圖18中所示的氨基酸序列1到22將通常不存在于成熟蛋白質(zhì)中。氨基酸408是用于附著到GPI錨上的氨基酸。切割GPI錨的酶(例如磷脂酶C)可用于將22到408片段釋放為可溶性形式。其它可溶性形式也是可能的并可通過遺傳改造制備，如稍后更詳細(xì)地討論。為了測定兩條肽/氨基酸序列或兩條核酸序列的百分之序列同一性，為最優(yōu)比較目的比對(duì)序列(例如，可在第一條和第二條氨基酸或核酸序列中的一條或兩條中任選地引入空位，用于最佳比對(duì)，并且為了比較目的可忽略非同源序列)。例如，用于比較目比對(duì)的參考序列的長度是參考序列長度，如參考序列全長的至少30%，適當(dāng)?shù)刂辽?0%，更適當(dāng)?shù)刂辽?0%，甚至更適當(dāng)?shù)刂辽?0%，并甚至更適當(dāng)?shù)刂辽?0%、80%或90%(例如當(dāng)?shù)诙l序列與具有例如100個(gè)氨基酸殘基的第一條氨基酸序列比對(duì)時(shí)，至少30個(gè)，適當(dāng)?shù)刂辽?0個(gè)，更適當(dāng)?shù)刂辽?0個(gè)，甚至更適當(dāng)?shù)刂辽?0個(gè)，并甚至更適當(dāng)?shù)刂辽?0、80或90個(gè)氨基酸殘基如100個(gè)氨基酸殘基被比對(duì))。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粭l序列中的位置被第二條序列中相應(yīng)位置處同一氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，那么分子在該位置相同(如此處所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)?？紤]空位的數(shù)量和每個(gè)空位的長度(需要將其引入用于兩條序列的最佳比對(duì))，兩條序列間的百分比同一性是序列共有相同位置數(shù)量的函數(shù)?？墒褂脭?shù)學(xué)算法完成序列的比較和兩條序列間百分比同一性的測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用已經(jīng)整合到在GCG軟件包(可在http://V驟.rcr.com獲得)中GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444_453(1970))算法，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的空位加權(quán)和1、2、3、4、5或6的長度加權(quán)測定兩條氨基酸序列間的百分比同一性。在另一實(shí)施方案中，使用GCG軟件包(可在http://www.rcr.com獲得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位加權(quán)和1、2、3、4、5或6的長度加權(quán)測定兩條核苷酸序列間的百分比同一性。在另一實(shí)施方案中，使用已經(jīng)整合到ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(CABI0S，411-17(1989))的算法，使用PAM120加權(quán)殘基表，12的空位長度罰分和4的空位罰分測定兩條氨基酸或核苷酸序列間的百分比同一性。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可進(jìn)一步用作“查詢序列”針對(duì)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索以鑒定例如其它家族成員或相關(guān)序列?？墒褂肁ltschul，等(1990)J.Mol.Biol.215:403_10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)進(jìn)行此類搜索?？衫肗BLAST程序，得分=100，字長=12進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明NIP2b、NIP2cL和NIP2cS核酸分子同源的核苷酸序列?？衫肵BLAST程序，得分=50，字長=3進(jìn)行BLAST蛋白搜索，以獲得與本發(fā)明NIP2b、NIP2cL和NIP2cS蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位對(duì)比，可如Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389_3402中描述使用空位BLAST。當(dāng)利用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。(參閱http//www,ncbi.nlm.nih.gov)。因?yàn)榧夹g(shù)人員理解可對(duì)具有期望性質(zhì)(如結(jié)合受體)的多肽的氨基酸序列進(jìn)行多種改變而仍保留該性質(zhì)，覆蓋寬范圍變體用于本發(fā)明當(dāng)然是完全合理的。此類改變概述于下文部分(i)到(iv)⑴替代技術(shù)人員知道多種氨基酸經(jīng)常具有相似的性質(zhì)，使得它們可經(jīng)常地進(jìn)行互換，而不消除該多肽的期望性質(zhì)(如維持至少20%，適當(dāng)?shù)刂辽?0%，更適當(dāng)?shù)刂辽?5%的期望活性)。例如，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸可經(jīng)常地相互替代(具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸)。在這些可能的替代中，最常見的是甘氨酸和丙氨酸用于相互替代(它們具有相對(duì)短的側(cè)鏈)，并且纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸用于相互替代(它們具有更長的疏水脂肪族側(cè)鏈)?？山?jīng)常相互替代的其它氨基酸通常包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族側(cè)鏈的氨基酸)；賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)；和半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)。該性質(zhì)的替代經(jīng)常稱為“保守”或“半保守”氨基酸替代。適當(dāng)?shù)兀凅w可含有10個(gè)或更少的替代(例如5個(gè)或更少，更適當(dāng)?shù)?或2個(gè))。(ii)缺失可對(duì)多肽不必要或不想要的部分可進(jìn)行缺失。這可用于減小多肽的大小。如稍后討論，如果多肽正常條件下結(jié)合膜，缺失也可用于產(chǎn)生可溶性多肽。適當(dāng)?shù)?，所述變體可含有一個(gè)或兩個(gè)缺失，每個(gè)缺失是參考序列長度的20%或更低(如10%或更低)。(iii)插入也可進(jìn)行氨基酸插入。可進(jìn)行氨基酸插入以改變多肽的性質(zhì)(例如幫助鑒定、純化或表達(dá))。適當(dāng)?shù)?，所述變體可含有一個(gè)或兩個(gè)插入，其每個(gè)是參考序列長度的20%或更低(如10%或更低)?？墒褂萌魏魏线m技術(shù)提供相對(duì)于給定序列摻入氨基酸改變(無論是替代、缺失和/或插入)的多肽。例如，可通過位點(diǎn)定向誘變提供摻入序列改變的核酸序列。然后這可用于允許在其氨基酸序列中具有相應(yīng)改變的多肽的表達(dá)。(iv)上述的組合當(dāng)然可以組合一種或更多種缺失、插入和/或替代。也包括其它變體。例如可使用包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸類似物(包括非天然發(fā)生的氨基酸)的多肽。因此本發(fā)明包括mimetopes和擬肽。術(shù)語“mimetope”和“擬肽”此處可互換使用。化合物X的“mimetope”指這樣的化合物，其中X的功能活性必需的X的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被模擬X構(gòu)象的其它化學(xué)結(jié)構(gòu)替換。擬肽的實(shí)例包括肽化合物，其中肽骨架被一個(gè)或更多個(gè)苯并二氮雜革分子(參閱例如James，G.L.等(1993)Science2601937-1942)和“逆-反”肽(參閱Sisto的美國專利號(hào)4，522，752)替代。術(shù)語“mimetope”和“擬肽”也指一部分，而不是天然發(fā)生的氨基酸，其在構(gòu)象和功能上作為含肽化合物中特定氨基酸的替代起作用，但在很大程度上不負(fù)面干擾所述肽的功能。氨基酸模擬物的實(shí)例包括D-氨基酸?？墒褂帽娝苤碾暮铣煞椒ㄖ苽湟粋€(gè)或更多個(gè)D-氨基酸替代的肽。額外的替代包括具有變體側(cè)鏈的氨基酸類似物，所述變體側(cè)鏈具有官能團(tuán)，所述類似物例如b_氰基丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、正亮氨酸、3-磷酸絲氨酸、高絲氨酸、二羥基苯丙氨酸、5-羥色氨酸、1-甲基組氨酸、或3-甲基組氨酸。制備mimetope和擬肽的方法為本領(lǐng)域所熟知。如先前說明，現(xiàn)在轉(zhuǎn)到片段，可在篩選方法中利用片段。它們也可用于其它目的，例如用于產(chǎn)生抗體，用于結(jié)合研究；用于治療目的(如稍后討論)等。片段適當(dāng)?shù)匕▓D18中所示氨基酸序列或其變體的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)氨基酸。合適的片段是可溶性形式。術(shù)語“可溶性的”此處用于與膜結(jié)合的多肽區(qū)分開。通常將缺少信號(hào)序列(斜體字所示，氨基酸1-22，圖18)。可通過合適的酶切割GPI錨定蛋白質(zhì)制備可溶性形式，如先前討論?；蛘?，遺傳改造技術(shù)可用于提供分泌的且不具有GPI錨的蛋白質(zhì)?？商峁┎煌L度的可溶性形式，并且其可來自TREM-1配體或變體的胞外部分。然而適當(dāng)?shù)兀缤ㄟ^結(jié)合研究容易地測定，存在至少TREM-1受體結(jié)合部分。如果需要，上述變體或片段可連接異源部分(即它們在自然界中通常不連接的部分)。適當(dāng)?shù)?，所述連接通過共價(jià)鍵，盡管非共價(jià)鍵也在本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，例如，可提供融合蛋白。本發(fā)明包括融合蛋白，其中TREM-1配體或其衍生物(尤其是片段)重組融合到或化學(xué)綴合到(包括共價(jià)和非共價(jià)綴合)異源多肽(即，不相關(guān)多肽或其部分，適當(dāng)?shù)厮龆嚯牡闹辽?0個(gè)、至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少40個(gè)、至少50個(gè)、至少60個(gè)、至少70個(gè)、至少80個(gè)、至少90個(gè)或至少100個(gè)氨基酸)，以產(chǎn)生融合蛋白。所述融合不必是直接的，而可通過接頭序列產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)例中，融合是融合來自多種類型的免疫球蛋白的序列。例如，可融合到人IgGl或IgM分子的恒定區(qū)(例如，鉸鏈，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)，(例如，由Hudson&Souriauso(2003)NatureMedicine9(1)129-134描述)，以制備在體內(nèi)可溶性更高且更穩(wěn)定的融合多肽或其片段。也可通過融合到聚乙二醇上的'聚乙二醇化'延長抗體片段的短的半衰期(參閱Leong，S.R.等(2001)Cytokine16:106-119)。在W001/83525中描述的此類融合的一個(gè)實(shí)例中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域與生物活性肽融合。通過共價(jià)連接Fc結(jié)構(gòu)域與所選肽的至少一個(gè)氨基酸產(chǎn)生藥理學(xué)上有活性的化合物。連接到載體上增加了肽的半衰期，否則所述肽將在體內(nèi)快速降解。或者，可以制備包含非典型可選蛋白支架的融合蛋白(例如參閱Nygren&Skerra(2004)JImmunolMethods290(1-2):3_28或W003049684)。此類融合蛋白可用作制備識(shí)別本發(fā)明多肽或其片段的特異性抗體的免疫原。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，可向受試者施用融合蛋白，以抑制TREM-1配體與其受體在體內(nèi)的相互作用。如果需要可提供N末端信號(hào)序列與信號(hào)序列的融合。可通過商業(yè)途徑獲得多種信號(hào)序列。例如，蜂毒肽的分泌序列和人胎盤堿性磷酸酶(Stratagene；LaJolla,CA)可用作真核異源信號(hào)序列?？闪谐鲈水愒葱盘?hào)序列的實(shí)例，可列出phoA分泌信號(hào)(Sambrook等，上文；禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,1992,Ausubel,等，編輯，Johnffiley&Sons)和A蛋白分泌信號(hào)(PharmaciaBiotech；Piscataway，NJ)。另一實(shí)例是桿狀病莫胃白的歹lj(CurrentProtocolsinMolecularBiology,1992,Ausubel,等，編輯，JohnWiley&Sons)。在另一實(shí)施方案中，融合是融合標(biāo)簽序列，例如六組氨酸肽，如pQE載體中提供的標(biāo)簽(QIAGEN,Inc.，9259EtonAvenue,Chatsworth,CA，91311)，其中許多所述標(biāo)簽是可以商業(yè)途徑獲得的。如Gentz，等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821_824中描述，例如六組氨酸為融合蛋白提供便利的純化。肽標(biāo)簽的其它實(shí)例是血凝素“HA”標(biāo)簽，其對(duì)應(yīng)來自流行性感冒血凝素蛋白的表位(Wilson，等，1984，Cell37:767)和“flag”標(biāo)簽(Knappik,等，1994，Bi0techniques17(4):754_761)。這些標(biāo)簽尤其用于重組產(chǎn)生多肽的純化。可通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)或通過蛋白質(zhì)合成技術(shù)，例如通過肽合成儀產(chǎn)生融合蛋白。例如，可通過包括自動(dòng)DNA合成儀的常規(guī)技術(shù)合成編碼融合蛋白的核酸。或者，可使用在兩個(gè)連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)性突出端的錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述兩個(gè)連續(xù)基因片段隨后可退火并重新擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(參閱，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，1992，Ausubel，等，編輯，Johnffiley&Sons)編碼融合蛋白的核苷酸序列可插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。合適的融合蛋白在其具有可結(jié)合TREM-1受體的多個(gè)部分(或配體)意義上是多價(jià)的。因此例如，多個(gè)可溶性⑶177配體(即能夠特異性結(jié)合⑶177的蛋白質(zhì))可連接在一起。這例如可通過將可溶性形式與多價(jià)支架連接來實(shí)現(xiàn)。分子如免疫球蛋白可用于提供便利的多聚體支架。在實(shí)施例中討論了基于TREM-1配體編碼區(qū)融合編碼IgG的Fc部分的突變形式的區(qū)域的二聚體(所述Fc部分被修飾，使得其不結(jié)合Fc受體)。一旦融合蛋白多肽已經(jīng)分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中，結(jié)合Fc區(qū)域后則產(chǎn)生二聚體。然而不必使用免疫球蛋白來源的支架?？赏ㄟ^任何想要的結(jié)構(gòu)提供所述支架。例如可使用鏈霉抗生物素蛋白。如先前討論，這已經(jīng)被本發(fā)明人成功作為支架提供TREM-1受體的四聚體。類似的技術(shù)可用于提供TREM-1配體或其衍生物的四聚體。可通過將不同數(shù)量的TREM-1配體/其衍生物連接適當(dāng)?shù)闹Ъ芴峁┎煌亩嗑垠w(例如，二聚體、三聚體、四聚體、七聚體、六聚體等)。無論使用哪種類型的支架，期望其基本上不干擾與TREM-1受體的結(jié)合。合適的結(jié)構(gòu)至少能夠結(jié)合TREM-1受體，如野生型TREM-1配體一樣。更適當(dāng)?shù)兀鼈兏赡芙Y(jié)合TREM-1受體。如果待在治療中使用結(jié)構(gòu)，那么期望所述支架不顯著增加哺乳動(dòng)物(適當(dāng)?shù)厝祟?宿主中的炎癥。早已經(jīng)在給定物種中存在的蛋白質(zhì)可用作合適支架的基礎(chǔ)，只要這些蛋白質(zhì)較不可能引起免疫應(yīng)答。從上文描述中將理解多種融合蛋白可用于本發(fā)明。然而TREM-1配體、片段或變體不需要連接另一多肽，如融合蛋白的情況下，但可連接到表面上。這允許固定到表面上。例如平板、芯片、柱子、珠子、基質(zhì)、膜、孔等經(jīng)常用于提供固定表面。接頭可用于將配體、片段或變體附著到表面上，如固定領(lǐng)域所熟知。固定化形式可用于許多目的，包括純化、診斷、篩選(尤其是高通量篩選)、表征、儲(chǔ)存、方便操作等。從上文描述中將理解許多類型的TREM-1配體或其衍生物可用于本發(fā)明，包括變體、片段、融合蛋白等?？梢浴胺蛛x的”形式提供配體或衍生物。為本發(fā)明目的，認(rèn)為“分離的”多肽基本上沒有來自蛋白質(zhì)來源的細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞材料或其它污染多肽，或當(dāng)經(jīng)化學(xué)合成時(shí)基本上沒有化學(xué)前體或其它化學(xué)試劑。措辭“基本上沒有細(xì)胞材料”包括多肽制劑，其中所述多肽與分離或重組產(chǎn)生多肽的細(xì)胞的細(xì)胞組分分開。因此，基本上沒有細(xì)胞材料的多肽/蛋白質(zhì)包括多肽/蛋白質(zhì)的制劑，其以干重計(jì)具有低于約50%、40%、30%、20%、10%、5%、2.5%或的污染蛋白質(zhì)。當(dāng)多肽是重組產(chǎn)生的時(shí)，其也適當(dāng)?shù)鼗旧蠜]有培養(yǎng)基，即所述培養(yǎng)基低于蛋白質(zhì)制劑體積的約50%、40%、30%、20%、10%或5%。當(dāng)所述多肽通過化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，其適當(dāng)?shù)鼗旧蠜]有化學(xué)前體或其它化學(xué)試劑，即，其與參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)試劑分開。因此，多肽/蛋白質(zhì)的此類制劑具有低于約50%、40%、30%、20%、10%或5%(以干重計(jì))的化學(xué)前體或化合物，而不是目的多肽片段。當(dāng)然用于本發(fā)明的其它物質(zhì)也可以分離形式提供。分離形式可用于結(jié)構(gòu)/功能的分析，用于結(jié)合研究，用于篩選，用于產(chǎn)生或選擇抗體等。具有相對(duì)較少或沒有其它蛋白質(zhì)污染的事實(shí)表示結(jié)果不太可能被污染負(fù)面影響。現(xiàn)在轉(zhuǎn)到本發(fā)明的醫(yī)藥用途上，本發(fā)明包括阻斷或減少TREM-1配體結(jié)合TREM-1受體的化合物在制備用于治療疾病的藥劑中的用途，所述疾病特征在于一種或更多種促炎細(xì)胞因子或趨化因子的釋放。所述疾病可以是由TREM-1配體結(jié)合TREM-1受體介導(dǎo)的任何炎性疾病(或其它疾病)。炎性疾病的實(shí)例包括(但不限于)急性和慢性炎性疾病、膿毒、急性內(nèi)毒素血癥、腦炎、炎性腸病(IBD)、慢性阻塞肺病(C0PD)、變應(yīng)性炎性疾病、哮喘、肺纖維化、肺炎、社區(qū)獲得性肺炎(CAP)、呼吸器相關(guān)性肺炎(VAP)、急性呼吸道感染、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、傳染性肺病、胸膜滲漏、消化性潰瘍、幽門螺旋桿菌感染、肝肉芽腫病、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、炎性骨質(zhì)溶解、潰瘍性結(jié)腸炎、牛皮癬、血管炎、自身免疫性疾病、甲狀腺炎、類鼻疽、(腸系膜)局部缺血再灌注、纖絲病毒感染、尿路感染、細(xì)菌性腦膜炎、腸道沙門氏菌感染、Marburg和Ebola病毒感染。另外，在其中單核細(xì)胞血小板和嗜中性粒細(xì)胞血小板聚集物起重要作用的疾病中涉及TREM-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Haselmayer等Blood2007110:1029_1035)。例如，循環(huán)白細(xì)胞-血小板聚集物，尤其是單核細(xì)胞_血小板聚集物促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變形成，在急性冠狀動(dòng)脈綜合征、中風(fēng)和周圍血管疾病中增加，并是急性心肌梗塞的早期標(biāo)記。在許多其它狀況，包括糖尿病、囊性纖維化、哮喘、先兆子癇、胎盤閉鎖不全、偏頭痛、腎病綜合征、血液透析、鐮狀紅細(xì)胞病、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒性多器官功能障礙綜合征、多器官功能障礙綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、骨髓增生病、Kawasaki病和阿爾茨海默氏病中也已經(jīng)報(bào)道了增加的循環(huán)單核細(xì)胞-血小板和嗜中性粒細(xì)胞-血小板聚集物(Michelson禾口Newburger，Blood2007110794-795)。然而優(yōu)選地，所述疾病是膿毒并由病原體介導(dǎo)。更優(yōu)選地其為微生物介導(dǎo)的膿毒。最優(yōu)選地其為真菌或細(xì)菌介導(dǎo)的膿毒。微生物介導(dǎo)的膿毒的實(shí)例是肺炎。或者，優(yōu)選地所述疾病是炎性腸病。如此處定義，術(shù)語“肺炎”表示由胞外病原體感染，如細(xì)菌感染和非細(xì)菌感染(例如皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、夾膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)、球抱子菌(Coccidioides)、申氏抱子絲菌(Sporothrixschenckii)、卡氏月市囊蟲(Pneumocystiscarinii)、隱球菌(Cryptococcus)、曲霉(Aspergillus)或毛霉(Mucorsp.)感染)、原生動(dòng)物感染或寄生蟲感染(鼠弓形蟲(Toxoplasmagondii)、糞類圓線蟲(Strongyloidesstercoralis)、蟲回蟲(Ascaris)、十二指腸蟲(hookworm)、惡絲蟲(Dirofilaria)、并殖吸蟲(Paragonimus)或溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica)弓丨起的那些)引起的肺部炎癥，其中可檢測到sTREM-1的增強(qiáng)表達(dá)。肺炎包括“大葉性肺炎”(其發(fā)生在肺的一片肺葉中)和支氣管肺炎(趨向于不規(guī)則地定位在肺部)。另外，肺炎經(jīng)常分為兩類，其可幫助預(yù)測最可能是罪魁禍?zhǔn)椎纳??！吧鐓^(qū)獲得性(醫(yī)院外感染的肺炎)肺炎”在該背景中經(jīng)常伴隨病毒性呼吸道感染。其每年影響接近400萬成年人。其很可能是由最常見的肺炎引起細(xì)菌肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)引起。其它生物，如稱為衣原體(Chlamydia)或肺炎支原體(Mycoplasma)的非典型細(xì)菌也是社區(qū)獲得性肺炎的常見起因。在醫(yī)院內(nèi)感染的“醫(yī)院獲得性肺炎”經(jīng)常稱作醫(yī)院性肺炎。住院患者特別易感染革蘭氏陰性細(xì)菌和葡萄球菌(staphylococci)。寬范圍的化合物可用于上述疾病的治療。此類化合物的一個(gè)實(shí)例是抗體。適當(dāng)?shù)兀隹贵w結(jié)合TREM-I配體(或變體、片段或適當(dāng)時(shí)其融合蛋白)。最適當(dāng)?shù)?，其結(jié)合負(fù)責(zé)結(jié)合TREM-I受體的TREM-I配體的部分?？贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體。當(dāng)TREM-I配體或衍生物作為免疫原注射到動(dòng)物中時(shí)，可通過在合適動(dòng)物宿主(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、綿羊、山羊或猴子)中刺激它們的產(chǎn)生來產(chǎn)生多克隆抗體。如需要，佐劑與本發(fā)明物質(zhì)一起施用。這些抗體由于結(jié)合本發(fā)明物質(zhì)而可被純化。例如，所述免疫原可以為CD177或其片段或變體?；蛘撸雒庖咴梢允潜磉_(dá)TREM-I配體的細(xì)胞，如表達(dá)TREM-I配體的嗜中性粒細(xì)胞，如⑶177。更適當(dāng)?shù)兀雒庖咴侨祟愋偷拿庖咴?例如表達(dá)TREM-I配體的人CD177或人類細(xì)胞)?？蓮碾s交瘤制備單克隆抗體。這些可通過融合來自動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞形成，雜交瘤產(chǎn)生想要的抗體以形成無限增殖細(xì)胞系。因此，可使用基于該技術(shù)的眾所周知的Kohler&Milstein技術(shù)(Nature，256，52-55(1975))或變型。目前在本領(lǐng)域中很好地發(fā)展了用于制備單克隆和多克隆抗體的技術(shù)，所述抗體結(jié)合特定多肽。在標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)教科書，例如Roitt等，Immunology第二版(1989)，ChurchillLivingstone,London中對(duì)它們進(jìn)行了討論。除了完全抗體，術(shù)語“抗體”此處用于包括其衍生物，其能夠結(jié)合本發(fā)明多肽。因此本發(fā)明包括抗體片段和合成構(gòu)建體。通過Dougall等在Tibtechl2372-379(S印tember1994)中給出了抗體片段和合成構(gòu)建體的實(shí)例?？贵w片段包括例如Fab、F(ab'片段?？尚揎桭v片段以產(chǎn)生稱為單鏈Fv(SCFV)分子的合成構(gòu)建體。這包括共價(jià)連接促進(jìn)分子穩(wěn)定性的Vh和V1區(qū)的肽接頭?？墒褂玫钠渌铣蓸?gòu)建體包括CDR肽。這些是包含抗原結(jié)合決定簇的合成肽。也可使用肽模擬物。這些分子是通常構(gòu)象受限的有機(jī)環(huán)，其模擬⑶R環(huán)的結(jié)構(gòu)并且包括抗原相互作用的側(cè)鏈。合成構(gòu)建體包括嵌合抗體。此處抗體的一個(gè)或更多個(gè)部分來自一種動(dòng)物(通常是嚙齒類)，而一個(gè)或更多個(gè)部分來自另一動(dòng)物(通常是人類)。事實(shí)上，通過重組技術(shù)方法產(chǎn)生此類抗體，由此克隆編碼想要的融合蛋白的DNA并將其插入合適的表達(dá)系統(tǒng)中。優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物(例如CHO細(xì)胞)。優(yōu)選的嵌合抗體是人源化抗體，有時(shí)稱為CDR移植抗體。這些是更多傳統(tǒng)嵌合抗體的備選。此處僅來自非人(通常是嚙齒類)抗體V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)與來自人V區(qū)的構(gòu)架區(qū)組合。認(rèn)為這些抗體比老式嵌合抗體免疫原性更低，其中全部可變區(qū)來自非人動(dòng)物。因此不想要的副作用更少。也可制備完全人抗體。出于倫理原因，不期望直接從人中制備這些抗體。然而，它們可通過本領(lǐng)域已知的多種方法，包括使用來自人免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示制備。(參閱美國專利號(hào)4，444，887和4，716，111；和PCT公開WO98/46645；WO98/50433；WO98/24893；W098/16654；WO96/34096；WO96/33735;和WO91/10741)。也可使用轉(zhuǎn)基因小鼠制備人抗體(參閱Lonberg和Huszar(1995)，Int.Rev.Immunol.1365-93)。對(duì)于制備人抗體和人單克隆抗體的該技術(shù)的詳細(xì)討論和用于制備此類抗體的方案，參閱例如PCT公開WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；歐洲專利號(hào)0598877；美國專利號(hào)5，413，923；5，625，126；5，633，425；5，569，825；5，661，016；5，545，806；5，814，318；5，885，793；5，916，771；和5，939，598；此處以其整體引入作為參考。此夕卜，如Abgenix,Inc.(Freemont,CA),Medarex(NJ)禾口Genpharm(SanJose,CA)公司可參與使用與上述類似的技術(shù)提供針對(duì)所選抗原的人抗體?？墒褂梅Q作“引導(dǎo)選擇”的技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別所選表位的完全人抗體。在該方法中，所選非人單克隆抗體，例如小鼠抗體用于引導(dǎo)識(shí)別相同表位的完全人抗體的選擇(Jespers等，1988，Bio/technology12=899-903)。當(dāng)然可以提供具有額外部分的任何上述抗體/構(gòu)建體，所述額外部分為分子提供除抗原結(jié)合外的一些期望性質(zhì)。例如，所述部分可以是可檢測的標(biāo)記，其為在體內(nèi)提高抗體穩(wěn)定性/半衰期等的化合物。修飾如脂化可用于穩(wěn)定抗體并提高吸收和組織穿透力(例如進(jìn)入腦)。Cruikshank,等，1997,J.AcquiredImmuneDeficiencySyndromesandHumanRetrovirology14193描述了用于抗體脂化的方法。也可參考Leong，S.R.等(2001)Cytokine16:106_1。此處解釋為也可通過'聚乙二醇化'延長抗體片段的半衰期，所述'聚乙二醇化'為融合到聚乙二醇上。如從上述討論中顯而易見的是，寬范圍的抗體/構(gòu)建體可用于阻斷或降低TREM-I配體與TREM-I受體的結(jié)合。然而適當(dāng)?shù)?，使用單克隆抗體(例如抗體R33)。本發(fā)明方面包括獲得抗TREM-I配體抗體的方法，包括提供TREM-I配體或其衍生物并使用其在非人宿主中產(chǎn)生抗體，例如通過用TREM-I配體或其衍生物作為免疫原免疫所述非人宿主(例如兔或嚙齒類，如小鼠或大鼠)；以及獲得抗TREM-I配體抗體的方法，所述方法包括提供細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞(在其表面上存在TREM-I或其衍生物)并使用它們在非人宿主中產(chǎn)生抗體，例如通過用細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞(在其表面上存在TREM-I配體或其衍生物)作為免疫原免疫所述非人宿主(例如兔或嚙齒類，如小鼠或大鼠)。阻斷或降低TREM-I配體與TREM-I受體結(jié)合的備選方法是使用TREM-I配體的可溶性形式或其可溶性變體，例如前文所述的多聚體。這可結(jié)合TREM-I受體，使得其不再物理上可用于結(jié)合天然發(fā)生的膜結(jié)合形式配體，或至少降低其可用性。這可防止或降低細(xì)胞因子和趨化因子的促炎癥反應(yīng)釋放。也可阻斷或降低TREM-I配體的表達(dá)，而不依賴于阻斷配體與受體的結(jié)合。這可通過阻斷或降低轉(zhuǎn)錄或通過阻斷或降低翻譯來完成。因此例如可提供TREM-I配體的基因的轉(zhuǎn)錄阻斷劑或下調(diào)物?；蛘?，TREM-I配體的基因可失活(例如通過使用靶向同源重組技術(shù)破壞基因/啟動(dòng)子)。在其它備選中，可提供反義分子。這些可與TREM-1RNA雜交，以防止或降低其翻譯。適當(dāng)?shù)兀s交是特異性的，使得對(duì)體內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞天然產(chǎn)生的不同RNA分子沒有顯著雜交。如果需要，可在體外檢測雜交。因此可提供嚴(yán)格的條件，并且然后可測定雜交是否發(fā)生。合適的反義分子在嚴(yán)格條件下雜交。嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)實(shí)例包括使用5XSSC,0.5%SDS、1.OmMEDTA(pH8.0)的預(yù)洗滌溶液，并在55°C使用5XSSC嘗試雜交過夜。然而，有許多其它可能性。例如，這些中的一些列于W098/45435的表1中。(尤其參閱該表A-F下闡明的條件，并更少適當(dāng)?shù)兀贕到L或M到R下列出的那些。)雜交條件詳細(xì)討論于Sambrook等[MolecularCloning，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)]第1.101-1.110頁和11.45-11.61?？赏ㄟ^合適的載體(例如脂質(zhì)體)引入反義分子。它們甚至可以例如直接通過使用基因槍技術(shù)引入?；蛘呖商峁┰隗w內(nèi)產(chǎn)生此類分子的載體。作為反義分子的備選，也可使用參與RNA干擾(RNAi)的雙鏈RNA分子。此處靶RNA物理上被切割，因此RNAi作用機(jī)制與反義分子的作用機(jī)制截然不同，所述反義分子簡單地通過結(jié)合RNA起作用，使得其不能再用于翻譯。2006年，AndrewFire和CraiRC.Mello因他們在線蟲C.elegans中RNA干擾的工作分享了生理學(xué)或醫(yī)學(xué)的諾Jil/K^[FireA,XuS,MontgomeryΜ,KostasS,DriverS,MelloC(1998)."Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans".Nature391(6669):806_11·]自從那時(shí)起，多位作者討論了RNAi降低/阻斷基因表達(dá)的實(shí)際應(yīng)用。相關(guān)文章包括Dorsett，Y和Tuschl，T(2004).siRNAsApplicationsinfunctionalgenomicsandpotentialastherapeutics.NatureReviews3,318—329;Hannon,GJ禾口Rose,JJ(2004)·UnlockingthepotentialofthehumangenomewithRNAinterference.Nature431,371-378;Soutschek,J等(2004).TherapeuticsilencingofanendogenousgenebysystematicadministrationofmodifiedsiRNAs.Nature432,173-178;Morrisey,DV等(2005).Potentandpersistentinvivoanti-HBVactivityofchemicallymodifiedsiRNAs.Nat.Biotechnol.23,1002-1007；Palliser,D(2006).AnsiRNA—basedmicrobicideprotectsmicefromlethalherpessimplexvirusinfection.Nature439,89-94；禾口ZimmermannTS等(2006).RNAi-mediatedgenesilencinginnon-humanprimates.Nature441，111—114。也可使用核酶。這些是具有酶促活性的單鏈RNA分子(通常具有雙鏈發(fā)夾區(qū))?？筛脑旖Y(jié)合并切割靶RNA分子的核酶。例如，這由Citti和Rainaldi在CurrGeneTher.2005Feb；5(1):ll_24“Synthetichammerheadribozymesastherapeutictoolstocontroldiseasegenes“中討論。從上文描述中將理解許多不同的化合物可用于本發(fā)明的醫(yī)學(xué)用途方面。的確，除了上文討論的化合物，也可使用通過前文討論的篩選方法鑒定的化合物。(術(shù)語“化合物”以非限制性方式使用并可以是適合于本文所述用途的任何生物或合成部分。)化合物可以作為藥物組合物與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑一起施用。如此處所用，措辭“藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑”旨在包括與藥物施用相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。此類介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域所熟知。除了與活性化合物不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑，涵蓋其在組合物中的用途。補(bǔ)充活性化合物也可摻入組合物中。本發(fā)明包括用于制備含有本發(fā)明肽或多肽的藥物組合物的方法。此類組合物可進(jìn)一步包括額外的活性劑。因此，本發(fā)明還包括通過配制藥學(xué)上可接受載體與本發(fā)明肽或多肽和一種或更多種額外活性化合物制備藥物組合物的方法。將本發(fā)明藥物組合物配制成與其預(yù)期施用途徑相容。施用途徑的實(shí)例包括腸胃夕卜，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)皮膚(局部)、經(jīng)粘膜、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹膜內(nèi)和胸膜內(nèi)，以及口腔、吸入和直腸施用。用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可包括以下組分無菌稀釋齊U，如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)整張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖?？捎盟峄驂A如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整pH。腸胃外制劑可包裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量管形瓶中。適合于注射用途的藥物組合物包括無菌水溶液(其中為水溶性的)或分散劑和用于無菌注射溶液或分散劑的臨時(shí)制備的無菌粉劑。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorEL(BASF；Parsippany,NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，所述組合物必須是無菌的并應(yīng)該是流體以致于用注射器容易注射。其在制備和儲(chǔ)存條件下必須穩(wěn)定，并且必須受到保護(hù)防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。所述載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其適當(dāng)混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如可通過包衣如卵磷脂，在分散的情況下通過維持所需顆粒大小并通過使用表面活性劑維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？赏ㄟ^多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等完成對(duì)微生物活動(dòng)的預(yù)防。在許多情況下，在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉將是典型的?？赏ㄟ^在所述組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠引起可注射組合物的延長吸收。可通過在適當(dāng)溶劑中摻入所需量的活性化合物(例如，多肽或抗體)與上文列舉的成分的組合來制備無菌可注射溶液，如需要隨后進(jìn)行過濾滅菌。通常，通過將活性化合物摻入含有基本分散介質(zhì)和來自上文列舉的所需其它成分的無菌載體中來制備分散劑。在無菌粉劑用于制備無菌可注射溶液的情況下，更合適的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分和來自前述其無菌過濾溶液的任何額外想要的成分的粉劑。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可密封在明膠膠囊中或壓縮成片劑。為了口服治療施用的目的，活性化合物可與賦形劑混合并以片劑、含片或膠囊劑的形式使用?？砂ㄋ帉W(xué)上相容的結(jié)合劑和/或佐劑材料作為所述組合物的一部分。所述片齊U、丸劑、膠囊劑、含片等可含有任何以下成分或類似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖；崩解劑，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，如二氧化硅膠體；甜味劑，如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或桔子調(diào)味料。對(duì)于通過吸入施用，以來自加壓容器或分配器或霧化器的氣溶膠噴霧形式遞送化合物，所述加壓容器或分配器含有合適的推進(jìn)劑，例如氣體，如二氧化碳或噴霧器。全身施用也可以是通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚的手段。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚施用，在制劑中使用適合于待穿透屏障的滲透劑。此類滲透劑通常為本領(lǐng)域已知并包括，例如，用于經(jīng)粘膜施用的去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物?？赏ㄟ^鼻腔噴霧或栓劑完成經(jīng)粘膜施用。對(duì)于經(jīng)皮膚施用，將活性化合物配制成本領(lǐng)域通常已知的軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或霜?jiǎng)?。所述化合物也可制備成栓?例如使用常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂和其它甘油酯)或保留灌腸劑的形式用于直腸遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，用保護(hù)所述化合物免于從身體中快速清除的載體制備活性化合物，所述載體如控釋制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備此類制劑的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。也可通過商業(yè)途徑從AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc.獲得材料。脂質(zhì)體懸浮液(包括靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體，其具有針對(duì)病毒抗原的單克隆抗體)也可用作藥學(xué)上可接受的載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如美國專利號(hào)4，522，811描述的方法來制備。以劑量單位形式配制口服或腸胃外組合物以易于施用和劑量均一性是尤其有利的。如此處所用的劑量單位形式指適合作為待治療受試者的單元?jiǎng)┝康奈锢黼x散單位；各單位含有預(yù)定量的活性化合物，計(jì)算該預(yù)定量以與需要的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生想要的治療效果。本發(fā)明劑量單位形式的說明書受控于并直接取決于活性化合物的獨(dú)特特性和待實(shí)現(xiàn)的特定治療效果，和配制該活性化合物用于治療個(gè)體的領(lǐng)域中內(nèi)在的限制。如此處定義，治療有效量的多肽(即有效劑量)適當(dāng)?shù)卦诩s0.001到30mg/kg體重，適當(dāng)?shù)丶s0.01到25mg/kg體重，更適當(dāng)?shù)丶s0.1到20mg/kg體重，并甚至更適當(dāng)?shù)丶s1到10mg/kg、2到9mg/kg、3到8mg/kg、4到7mg/kg或5到6mg/kg體重范圍內(nèi)變化。對(duì)于抗體，合適劑量是0.lmg/kg到100mg/kg體重(通常是10mg/kg到20mg/kg)。如果所述抗體待作用于大腦，50mg/kg到100mg/kg的劑量通常合適。通常，部分人抗體和完全人抗體在人體中具有比其它抗體更長的半衰期。因此，更低的劑量和更不頻繁的施用經(jīng)常是可以的。當(dāng)然，實(shí)際劑量將由醫(yī)師決定。需要時(shí)，可使用低的起始劑量，并可逐漸增加，直至獲得有益的效果。如果出現(xiàn)了副作用，那么可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)踐減少劑量?？稍谌萜?、包裝和分配器中包括藥物組合物以及用于施用的說明書。本發(fā)明還具有多種診斷應(yīng)用。其包括用于在診斷病癥中提供信息的方法步驟，所述病癥特征在于一種或更多種促炎細(xì)胞因子或趨化因子的釋放。所述病癥可以是在之前醫(yī)學(xué)用途方面討論的任何病癥。因此，例如，本發(fā)明包括方法，所述方法包括獲得生物學(xué)樣品并分析所述樣品的TREM-I配體或TREM-I配體mRNA。所述樣品可以是全血、血清、血漿、尿、血液的細(xì)胞級(jí)分、組織樣品等的樣品。如果想要分析膜結(jié)合的TREM-I配體，所述樣品適當(dāng)?shù)厥前?xì)胞(適當(dāng)?shù)厥戎行粤＜?xì)胞和/或單核細(xì)胞)的樣品。類似地，如果想要分析mRNA，那么通常使用細(xì)胞。如果想要分析可溶性TREM-I配體，所述樣品適當(dāng)?shù)厥前?xì)胞外液(例如血清、血漿或尿)的樣品。這是因?yàn)樗隹扇苄孕问搅鬟M(jìn)細(xì)胞外液。通常從認(rèn)為患有，或處于患有任何上文討論病癥風(fēng)險(xiǎn)的患者中收集樣品?？扇菀椎罔b定配體或相應(yīng)mRNA的存在或缺失。如果在健康個(gè)體中根本不存在或僅以難以檢測的非常低的水平存在，那么這可以是有用的。然而適當(dāng)?shù)?，所述方法包括?duì)生物學(xué)樣品中TREM-I配體或TREM-I配體mRNA進(jìn)行定量的步驟。其還包含陰性對(duì)照，其比較配體或相應(yīng)RNA的水平與對(duì)照水平或?qū)?yīng)健康個(gè)體期望的范圍。如果TREM-I配體或TREM-I配體mRNA的水平顯著高于對(duì)照的水平，這可能是個(gè)體很可能患有該病癥的指示。其可包含陽性對(duì)照，其比較配體或相應(yīng)mRNA的水平與對(duì)照水平或?qū)?yīng)患有病癥的個(gè)體期望的范圍。如果TREM-I配體或TREM-I配體mRNA的水平十分接近陽性對(duì)照的水平，那么這可能是個(gè)體很可能患有所述病癥的指示。所述方法例如可使用針對(duì)配體的抗體。(目前已經(jīng)鑒定了配體，其可用于通過如上文討論的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生抗體。)合適的抗體對(duì)所述配體特異。其可以是單克隆抗體(例如R33)。如果所述方法檢測樣品中的TREM-lmRNA，那么可使用與TREM-ImRNA雜交的核酸分子(例如探針或引物)?；蛘?，所述mRNA可用于產(chǎn)生cDNA并且可使用與cDNA雜交的核酸分子。如果需要，可使用擴(kuò)增技術(shù)如反向PCR，盡管這些并非至關(guān)重要。適當(dāng)?shù)?，所述核酸分子能夠在?yán)格條件下雜交，如上所述。用于診斷的其它方法是提供TREM-I配體的可溶性形式或其可溶性變體以結(jié)合TREM-I受體。這可用于檢測所述TREM-I受體和/或定量樣品中存在的受體的量。除了上述方法，本發(fā)明還提供診斷試劑盒。其提供用于診斷病癥的試劑盒，所述病癥特征在于一種或更多種促炎細(xì)胞因子或趨化因子的體內(nèi)釋放，其中所述試劑盒包含結(jié)合TREM-I配體或編碼該配體的DNA或RNA的化合物?；蛘?，所述試劑盒包含結(jié)合TREM-I受體的TREM-I配體或其變體(適當(dāng)?shù)乜扇苄孕问?。所述化合物可以是例如結(jié)合TREM-I配體的抗體或與TREM-1RNA或DNA雜交的核酸。所述試劑盒適當(dāng)?shù)匕ò瑱z測和/或定量結(jié)合的手段。該手段例如是一種或更多種指標(biāo)，如果所述病癥存在，指標(biāo)提供可見的變化。所述指標(biāo)例如提供顏色變化或標(biāo)記中的變化。所述試劑盒本身包括一個(gè)或更多個(gè)對(duì)照。例如，其包含對(duì)照，所述對(duì)照包含來自健康患者的生物學(xué)樣品。所述樣品可包含如上討論的細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞和/或單核細(xì)胞)?；蛘?，它們可以是不含細(xì)胞的。例如如果想要篩選以尋找TREM-I配體的可溶性形式，那么可提供血清、血漿或尿樣品。所述對(duì)照甚至不需要是物理樣品。它們可能簡單地是期望健康患者的指標(biāo)?？稍谡f明書、包裝、標(biāo)簽等上面提供此類指標(biāo)。它們可以是圖表、圖形、范圍等形式。試劑盒的組分可封裝在不同容器內(nèi)，其可以密封且是無菌形式。所述容器可以與測定受試者是否處于發(fā)生如上所述病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的說明書一起處于試劑盒的包裝內(nèi)。除了上述試劑盒，本發(fā)明還包括用于鑒定TREM-I配體突變體形式存在的試劑盒。術(shù)語“突變體形式”此處用于與給定物種中已知天然存在的通常稱為“野生型”的最常見形式區(qū)分開。因此，在編碼突變體形式的基因的情況下，這將與編碼所述野生型形式的基因相差一個(gè)或更多個(gè)編碼核苷酸。在多肽的情況下，突變體形式可相差一個(gè)或更多個(gè)氨基酸。突變體形式因而包括等位變體。該試劑盒例如可包含比結(jié)合配體的野生型形式更強(qiáng)地結(jié)合突變體形式的抗體，或可包含比結(jié)合編碼所述野生型形式的核酸更強(qiáng)地結(jié)合編碼所述突變體形式的核酸的核酸。如果需要，所述試劑盒可包含對(duì)照，其允許結(jié)合與對(duì)野生型配體或編碼所述野生型配體的核酸的結(jié)合相比較。所述抗體對(duì)TREM-I配體的突變體形式是特異的。核酸對(duì)編碼TREM-I配體突變體形式的核酸可以是特異的(在嚴(yán)格的雜交條件下)。因?yàn)榭设b定比具有野生型基因的個(gè)體更易于或更不易于患特定病癥(尤其是此處討論的病癥)的個(gè)體，突變體形式具有價(jià)值。它們還可用于研究、細(xì)胞或組織分型、法醫(yī)、診斷等。本發(fā)明的其它方面是非人動(dòng)物，例如用作動(dòng)物模型，其相對(duì)于野生型動(dòng)物具有降低表達(dá)的TREM-I和/或TREM-I配體。優(yōu)選地，其沒有TREM-I和/或TREM-I配體的表達(dá)。本發(fā)明的其它方面是非人動(dòng)物，其相對(duì)于野生型動(dòng)物也具有降低表達(dá)的TREM-3，并優(yōu)選沒有TREM-3表達(dá)。此類動(dòng)物可用作與野生型動(dòng)物比較的對(duì)照。它們可用于分析通過上文所述的篩選方法鑒定的物質(zhì)的有效性。它們也可用于評(píng)估副作用。提供合適的動(dòng)物模型可用于減少需要篩選副作用、藥物功效等的測試動(dòng)物的總數(shù)。因此，這些模型可以有利于減少總的動(dòng)物受難。優(yōu)選地，非人動(dòng)物是TREM-I配體或TREM-I受體的完全敲除的動(dòng)物。因此，其不產(chǎn)生功能TREM-I配體或功能TREM-I受體。可這通過使用重組技術(shù)缺失或失活TREM-I基因的必要區(qū)來完成。育種技術(shù)然后可用于產(chǎn)生修飾純合的小鼠系。在一些情況下，可提供轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其相對(duì)于野生型，多個(gè)基因被敲除，尤其是TREM-3?？商峁├鏣REM-1TREM-3雙敲除嚙齒類動(dòng)物，尤其是小鼠(TREM-1-3-/-小鼠)，如稍后討論。發(fā)明背景和實(shí)施例現(xiàn)在僅通過實(shí)施例，參考附圖來描述本發(fā)明，其中圖1(上面部分)顯示人和小鼠TREM基因簇。TREM基因簇位于人染色體6p.21.1和小鼠染色體17C上。兩個(gè)基因簇包括編碼Treml、Trem2、Treml1(編碼TLT-1)和Treml2(編碼TLT-2)的基因。Trem-I和Trem_2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過含ITAM的接頭DAP12。TLTl含有用于募集胞質(zhì)溶膠磷酸酶的胞質(zhì)ITIM。TLT-2編碼潛在的SH3結(jié)合基序(+xPxxP，其中+是精氨酸，χ是任何氨基酸，并且P是脯氨酸)。人TREM基因簇也包括Ncr2，其編碼NK細(xì)胞受體NKp44，但并未鑒定到鼠類NKp44同源物。仍然未知兩個(gè)額外的人基因Treml3和Treml4是否編碼功能蛋白質(zhì)。小鼠TREM基因簇包括編碼功能Trem-3和Trem-L4蛋白質(zhì)的基因。Trem3是人中的假基因。圖2(下面部分)顯示規(guī)范的DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。類似于其它含基于免疫受體酪氨酸的激活基序的接頭蛋白質(zhì)，受體結(jié)合DAP12的交聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)ITAM基序中酪氨酸通過Src激酶進(jìn)行磷酸化。這導(dǎo)致SYK(或ZAP70)的募集和隨后支架分子LAT和/或NTAL的磷酸化和PI-3K的激活。LAT/NTAL募集幾個(gè)效應(yīng)子PLCγ；TEC家族成員；與Vav復(fù)合的接頭SLP76；與Sos復(fù)合的接頭Grb2。PI-3K產(chǎn)生PtdIns(3，4，5)P3(PIP3)，其促進(jìn)PLCγ、TEC、Vav募集到細(xì)胞膜上。所有這些中間信號(hào)分子導(dǎo)致Akt、c-CBL和ERK的募集/激活，以及導(dǎo)致細(xì)胞骨架重建(肌動(dòng)蛋白)。PLCy產(chǎn)生二級(jí)信使DAG和IP3，分別導(dǎo)致PKCθ和鈣動(dòng)員(Ca2+)的激活。圖3比較了DAP12的激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在該模型中，我們提出使用高LPS劑量(右)的膿毒或簡單的內(nèi)毒素血癥通過TREM-I配體導(dǎo)致TREM-I在嗜中性粒細(xì)胞上的多價(jià)銜接，產(chǎn)生與TLR在不同水平上協(xié)同的信號(hào)級(jí)聯(lián)。這導(dǎo)致增加的細(xì)胞因子分泌，和可能的細(xì)胞黏著和細(xì)胞存活。相反，非膿毒狀況如D-半乳糖胺加強(qiáng)的內(nèi)毒素血癥通過TREM-2配體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞上TREM-2的低占據(jù)，導(dǎo)致DAP12的部分磷酸化和磷酸酶SHP-I或降低對(duì)TLR的細(xì)胞應(yīng)答的其它抑制分子的募集。圖4顯示DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加內(nèi)毒素血癥過程中的死亡率和炎性細(xì)胞因子水平。(A)在三種不同劑量5mg/kg、6.25mg/kg和10mg/kg測定內(nèi)毒素血癥后WT和DAP12-/-小鼠的存活。在5和6.25mg/kg,DAP12-/"小鼠與WT相比具有提高的存活(Log-Rank檢驗(yàn)ρ彡0.05)。在10mg/kg兩小鼠系均死亡。(B)注射5mg/kgLPS后2、4或24小時(shí)從WT禾口DAP12-/-小鼠收集血漿。2小時(shí)時(shí)，WT小鼠具有升高水平的TNF-α和IL-IO(Mann-Whitney檢驗(yàn)*=ρ<0.05相比于WT)。圖5顯示DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加細(xì)菌性膿毒過程中的死亡率和炎性事件。WT和DAP12-/-小鼠經(jīng)受CLP并且評(píng)估(A)存活和(B)細(xì)胞因子產(chǎn)生。DAP12-/-小鼠與WT相比對(duì)CLP有抗性(Log-Rank檢驗(yàn)ρ<0.001)。CLP后6或24小時(shí)從WT或DAP12-/-小鼠中收集血漿，并測定細(xì)胞因子水平。6小時(shí)時(shí)，我們在WT和DAP12-/-小鼠中發(fā)現(xiàn)等同水平的MCP-UIL-6和TNF-α。24小時(shí)時(shí)，WT小鼠具有顯著更高水平的MCP-1、IL_6、TNF-α禾口IL-IO(Mann-Whitney檢驗(yàn)ρ<0.05)。圖6顯示DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不促進(jìn)細(xì)胞募集或殺菌活性。CLP后24小時(shí)，通過腹腔灌洗收集腹膜滲出液。測定總的細(xì)胞數(shù)量(A)、細(xì)胞類型的分布(B)和細(xì)菌負(fù)荷(C)。我們在WT和DAP12-/-小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)差異。圖7顯示DAP12在膿毒而不是無菌腹膜炎后增加了通過巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生。(A)WT和DAP12-/-小鼠經(jīng)受CLP并在24小時(shí)后收集腹膜細(xì)胞。在LPS(1μg/ml)刺激或沒有LPS刺激下離體培養(yǎng)細(xì)胞，并測定上清液中細(xì)胞因子的水平。沒有刺激時(shí)，WT細(xì)胞(實(shí)心條形)比DAP12-/-細(xì)胞(陰影線條形)產(chǎn)生更多的IL-6、MCP-l、TNF-a和IL-IO(Mann-Whitney檢驗(yàn)ρ<0.05)。LPS刺激后，WT細(xì)胞產(chǎn)生增加量的TNF-α、MCP-I和IL-IO0(B)也在腹腔內(nèi)注射巰基乙酸培養(yǎng)基并在LPS(10、100或lOOOng/ml)(B)存在或不存在情況下離體培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞。盡管最大刺激的DAP12-/-細(xì)胞具有增加IL-10的趨勢，但在WT和DAP12-/"細(xì)胞之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。圖8顯示在體外用LPS刺激腹膜腔滲出細(xì)胞(PES)后的ERK磷酸化。CLP后24小時(shí)，收集PEC，用LPS在不同時(shí)間點(diǎn)刺激，并通過SDS-PAGE和免疫印記分離細(xì)胞裂解物的磷酸化ERK1/2?？偟腅RK確定為上樣對(duì)照。刺激30分鐘后，WT小鼠比DAP12-/-小鼠顯示顯著更高的磷酸化水平。圖9說明了TREM-1/TREM-3缺陷小鼠的產(chǎn)生。圖10顯示用新產(chǎn)生的抗TREM-3抗體獲得的染色結(jié)果。用mAb87.1或mAb12.7(填充柱狀圖)或?qū)φ湛贵w(空白柱狀圖)對(duì)TREM-3(左)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞進(jìn)行染色。兩抗體均特異性識(shí)別TREM-3受體。圖11顯示W(wǎng)T和TREM-1/-3小鼠的骨髓粒細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。用抗⑶llb、-Ly6G-C(GR-I)、-TREM-I和-TREM-3抗體對(duì)全骨髓進(jìn)行染色。通過流式細(xì)胞術(shù)分析染色的細(xì)胞。所有小鼠顯示CDllb+/Ly6G-C+粒細(xì)胞的相似群體(左邊列)。WT粒細(xì)胞表達(dá)TREM-I和TREM-3(中間列和右邊列，上圖)，而TREM-1/3-/-不能表達(dá)TREM-I和TREM-3。圖12顯示TREM-1/3-/-小鼠的存活。TREM-1/3+/+和TREM-1/3-/-小鼠(兩者均來自平行育種，以產(chǎn)生同質(zhì)的70%C57BL/6/30%12901a背景)經(jīng)受CLP膿毒攻擊。小鼠經(jīng)受2x#25CLP損傷并監(jiān)測其存活。TREM-1/3-/-小鼠與野生型(WT)相比對(duì)CLP具有抵抗力。圖13顯示使用肺炎鏈球菌或綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)攻擊的肺膿毒的鼠類模型的％存活。WT小鼠通過氣管內(nèi)注入的肺炎鏈球菌(2xl07CFU的菌株99.55，左圖)或綠膿假單胞菌(2-4xl07CFU的ATCC菌株27853，右圖)而患上肺炎。用相同體積的無菌鹽水注射假小鼠(η=9-10)。觀察小鼠的存活。曲線代表滴定90%存活的劑量。圖14顯示在膿毒或體外PMA/離子霉素激活過程中TREM-I配體在嗜中性粒細(xì)胞上的表達(dá)。圖14(A)顯示TREM-I四聚體構(gòu)建體。TREM-I外功能區(qū)的羧基末端與BirA標(biāo)簽和6組氨酸標(biāo)簽融合。BirA序列生物素化后，使用PE標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白將TREM-I單體裝配成熒光四聚體。圖14(B)提供從血液中純化的并用TREM-I四聚體和抗CD16抗體染色的嗜中性粒細(xì)胞的FACS分析。TREM-I四聚體結(jié)合來自膿毒患者的⑶16+嗜中性粒細(xì)胞的亞群，而不結(jié)合來自健康供體的嗜中性粒細(xì)胞。作為TREM-I四聚體結(jié)合特異性的證據(jù)，對(duì)照四聚體(CD69)不能結(jié)合從患有膿毒的患者中獲得的人嗜中性粒細(xì)胞。注意膿毒患者的嗜中性粒細(xì)胞與健康供體的嗜中性粒細(xì)胞相比表達(dá)更低水平的CD16。圖14(C)顯示用PMA/I激活的嗜中性粒細(xì)胞的FACS分析。TREM-I四聚體在用PMA/I處理后結(jié)合健康供體的嗜中性粒細(xì)胞，而它們不能結(jié)合未刺激的嗜中性粒細(xì)胞。對(duì)照四聚體不結(jié)合用PMA/離子霉素刺激的嗜中性粒細(xì)胞。圖15顯示從膿毒患者分離的嗜中性粒細(xì)胞的hTREM-Ι配體陽性亞群的FACS分析。這些細(xì)胞對(duì)⑶lib、⑶10、⑶66b、⑶55和⑶35(其為已知在循環(huán)的成熟嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)的所有標(biāo)記)是陽性的。來自健康供體的嗜中性粒細(xì)胞也表達(dá)這些標(biāo)記，但不結(jié)合hTREM-Ι四聚體。圖16顯示單克隆抗體R33阻斷膿毒嗜中性粒細(xì)胞上TREM-I四聚體的結(jié)合。從膿毒患者分離的嗜中性粒細(xì)胞與R33或同種型匹配的對(duì)照抗體(T2ctr)預(yù)溫育。R33的預(yù)溫育消除了TREM-I四聚體的結(jié)合，而同種型匹配的對(duì)照對(duì)四聚體結(jié)合沒有影響。因此mAbR33識(shí)別細(xì)胞表面上的TREM-I配體。圖17顯示使用R33單克隆抗體篩選膿毒患者血沉棕黃層cDNA文庫R33抗原表達(dá)的結(jié)果。圖A=FACS分選R33陽性細(xì)胞后，用分離自人血沉棕黃層cDNA文庫的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的FACS分析。這些細(xì)胞用R33，接著用綴合PE的山羊抗大鼠Ig染色。圖B用分離自平板F(149個(gè)菌落)的質(zhì)粒進(jìn)行293轉(zhuǎn)染后R33陽性細(xì)胞的富集。圖C:來自平板F的R33陽性細(xì)胞的進(jìn)一步富集。圖18顯示人⑶177氨基酸序列。信號(hào)肽(氨基酸1_21)以斜體字顯示。AGPI錨酰胺化甘氨酸以粗體顯示并加下劃線(氨基酸408)。圖19顯示小鼠⑶177氨基酸序列。信號(hào)肽(氨基酸1_21)以斜體字顯示。小鼠序列是人序列的大約2兩倍長(不包括前導(dǎo)序列)。這很可能因基因復(fù)制事件產(chǎn)生，因?yàn)樗鲂蛄械膬蓚€(gè)部分彼此之間以及與人CD177序列具有高度的序列同一性，如圖20中最清楚地說明。圖20顯示人⑶177氨基酸序列與小鼠序列兩部分每一部分的比對(duì)。可見人序列與小鼠序列每一部分具有顯著的序列同一性。這可表明在小鼠中存在基因復(fù)制事件。圖21A顯示編碼如圖18中所示人⑶177氨基酸序列的cDNA核苷酸序列。圖21B顯示編碼圖19中所示小鼠⑶177氨基酸序列的cDNA核苷酸序列。圖22顯示TREM-I四聚體結(jié)合膿毒患者嗜中性粒細(xì)胞，但不結(jié)合靜息的嗜中性粒細(xì)胞。圖23顯示抗mCD-177抗體Y176結(jié)合鼠類外周血中的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的亞群。圖24A顯示TREM-I配體在膿毒患者的外周嗜中性粒細(xì)胞上特異性表達(dá)。報(bào)道了利用TREM-1/IgM和人IgM染色的幾何平均熒光之間的比例(GMF比例)。黑色正方形代表入住I⑶時(shí)的患者。黑色三角形代表臨床恢復(fù)時(shí)的相同患者。白色三角形代表具有SIRS并且沒有感染跡象的患者。黑色菱形代表健康個(gè)體。各數(shù)據(jù)點(diǎn)代表單個(gè)患者的GMF比例。水平條形代表平均GMF值。通過Kruskal-Wallis和Dunn’s檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖24B顯示從膿毒恢復(fù)后TREM-I配體表達(dá)被下調(diào)。在入住ICU后并在臨床恢復(fù)不久評(píng)估患有膿毒患者中TREM-I配體的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表述為hTREM-1/IgM染色的細(xì)胞相比于對(duì)照hlgM染色的細(xì)胞的幾何平均熒光(GMF)之間的比例。圖25顯示R33(抗人CD177)阻斷mTREM-1結(jié)合hCD177轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞。圖26顯示小鼠⑶177在嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)。圖27提供mTREM-1結(jié)合mCD177的證據(jù)(見實(shí)施例20中的討論)。在詳細(xì)討論實(shí)施例之前，在TREM-I功能及其重要性方面提供更多的背景知識(shí)是有利的。這在下文中進(jìn)行實(shí)施例背景1.TREM-I在膿毒中的作用響應(yīng)組織損傷或微生物產(chǎn)物，先天免疫系統(tǒng)起始炎癥應(yīng)答，任務(wù)是消滅侵入微生物H。在擴(kuò)散感染或廣泛的組織損傷背景中，該免疫應(yīng)答可變得失調(diào)，加速全身炎癥應(yīng)答和補(bǔ)償性抗炎癥應(yīng)答5Λ該不適當(dāng)免疫激活的臨床結(jié)果是膿毒綜合征，其特征在于低血壓、器官衰竭和死亡5’7’9。在膿毒過程中調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的努力得到了有限的成功，并且仍然未鑒定到膿毒的“魔術(shù)彈”調(diào)節(jié)物“1’11。目前，我們的小組發(fā)現(xiàn)髓樣細(xì)胞ι上表達(dá)的觸發(fā)受體(TREM-I)，其為在嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)的分子12。我們最初觀察到當(dāng)TREM-I與激動(dòng)抗體結(jié)合時(shí)，促炎細(xì)胞因子被釋放13。在隨后的研究中，我們發(fā)現(xiàn)TREM-I的阻斷減弱了炎癥，并極大降低了膿毒臨床相關(guān)試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械乃劳雎?4。額外的研究發(fā)現(xiàn)起始對(duì)微生物產(chǎn)物的響應(yīng)不需要TREM-1，而是揭示了這樣的模型，其中TREM-I與其配體的連接引起免疫應(yīng)答的擴(kuò)大，與Toll樣受體(TLR)和Nod樣受體(NLR)協(xié)同引起過量的細(xì)胞因子釋放12’15a6O這些數(shù)據(jù)提示在膿毒過程中，調(diào)節(jié)TREM-I可減弱炎癥，而不引起免疫麻痹或抑制抗微生物功能，并要求系統(tǒng)性檢查TREM-I在膿毒中的作用。2.TREM家族TREM-I是在粒細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)、破骨細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的受體家族的基本成員，稱為在髓樣細(xì)胞上表達(dá)的觸發(fā)受體(TREM)12’17—19。TREM是對(duì)應(yīng)人染色體6p21和小鼠染色體17C3的基因簇編碼的免疫球蛋白(Ig)超家族的跨膜糖蛋白，所述基因簇與MHC連鎖(圖1)12’19’2°。所述TREM基因簇編碼激活和抑制受體。激活TREM-I、TREM-2和TREM-3受體含有V型單個(gè)胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域、具有帶電殘基(賴氨酸)的跨膜區(qū)和短的胞質(zhì)尾區(qū)(圖1)。TREM-3在人中僅作為假基因存在(圖1)。TREM-I、TREM-2和TREM-3結(jié)合蛋白質(zhì)接頭DAP12，用于細(xì)胞表面表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能(圖2)。DAP12的胞質(zhì)區(qū)含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)，其作為蛋白質(zhì)酪氨酸激酶Syk和ZAP70停泊位點(diǎn)起作用21_23。這促進(jìn)多個(gè)接頭和下游信號(hào)介體的募集以及酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排、轉(zhuǎn)錄因子的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞激活(圖2)。TREM基因簇包括編碼TREM相關(guān)蛋白質(zhì)的至少兩個(gè)其它基因，稱為TLT-I和TLT-2。TLT-I在血小板中表達(dá)，在其胞質(zhì)尾中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制性基序(ITIM)并且募集蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶24’25(圖1)。TLT-2在B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)，在其胞質(zhì)尾區(qū)含有脯氨酸富集區(qū)并且其功能未知26(圖1)。已經(jīng)通過TREM基因組區(qū)的計(jì)算分析預(yù)測了額外的TREM樣基因和假基因(圖1)。TREM與其它Ig基因超家族成員共有有限的同源性。親緣關(guān)系最接近TREM的是NKp44，其為與TREM基因緊密連鎖的基因編碼的活化NK細(xì)胞受體27。TREM更遠(yuǎn)的親緣包括CMRF-35家族成員28_31。多聚體Ig(pIgR)32的受體與TREM家族的胞外區(qū)也共有同源性。然而，TREM受體CMRF35或NKp44均不結(jié)合Ig。事實(shí)上，所有這些受體的配體均未知。在TREM中，TREM-I和TREM-2是進(jìn)行表征最深入的。TREM-2主要在前破骨細(xì)胞和小膠質(zhì)中表達(dá)12。TREM-2的遺傳缺陷產(chǎn)生人類疾病Nasu-Hakola疾病(NHD)，其特征在于嚴(yán)重的骨異常和大腦脫髓鞘33。TREM-2也在骨髓衍生巨噬細(xì)胞、巰基乙酸誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，和備選激活的巨噬細(xì)胞中表達(dá)34’35并調(diào)節(jié)其對(duì)微生物產(chǎn)物的細(xì)胞因子應(yīng)答35’36。TREM-I在粒細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中表達(dá)。在人中的初步研究揭示TREM-I在體外激活這些細(xì)胞并促進(jìn)全身炎癥應(yīng)答和體內(nèi)微生物感染過程中的膿毒13’14。3.TREM-I放大炎癥并促進(jìn)膿毒發(fā)病人TREM-I在血液嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞亞組中表達(dá)。在正常組織中，TREM-I選擇性地表達(dá)于肺泡巨噬細(xì)胞中。這些是肺中長壽的效應(yīng)細(xì)胞，專門識(shí)別和清除病原體、吞噬凋亡或損傷的細(xì)胞及去除大分子。此外，TREM-I高水平表達(dá)于受革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌以及真菌感染的人皮膚和淋巴結(jié)中的嗜中性滲出液及類上皮細(xì)胞中14’37。TREM-I表達(dá)的組織分布已提示在炎癥中的作用。與之一致的是，我們已顯示在人粒細(xì)胞及單核細(xì)胞上TREM-I與激動(dòng)劑mAb銜接刺激了促炎趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。嗜中性粒細(xì)胞有效的化學(xué)引誘物IL-8受TREM-I銜接的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。單核細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白質(zhì)1(MCP-I)、MCP-3和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白質(zhì)1α(ΜΙΡ-1α)也受其誘導(dǎo)。TREM-I觸發(fā)誘導(dǎo)了粒細(xì)胞釋放髓過氧化物酶而不吞噬。此外，TREM-I和TLR在誘導(dǎo)炎癥中相互協(xié)同作用。當(dāng)將TREM-ImAb用作共刺激物時(shí)，響應(yīng)LPS，單核細(xì)胞的TNF-α和IL-Iα分泌顯著上調(diào)，證實(shí)了TLR起始TREM-I放大炎癥應(yīng)答的能力13’15。此外，LPS和其它TLR配體上調(diào)TREM-I表達(dá)，加強(qiáng)其促炎功能13’15。為了強(qiáng)調(diào)TREM-I在體內(nèi)作為炎癥放大器的作用，我們產(chǎn)生了與人IgGl的Fc部分融合的重組小鼠可溶性TREM-I(mTREM-1-Fc)。該TREM-I-Fc應(yīng)與內(nèi)源的TREM-I競爭結(jié)合TREM-I配體，中和內(nèi)源TREM-I的生物學(xué)活性。在LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥的動(dòng)物模型中，用mTREM-1-Fc阻斷TREM-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低了高應(yīng)答性和死亡14。在包括腹腔內(nèi)注射活大腸桿菌和盲腸結(jié)扎及穿刺(CLP)的膿毒性休克的模型中，阻斷TREM-I也保護(hù)小鼠免于休克及死亡14。進(jìn)一步確證了TREM-I的促炎作用，過表達(dá)TREM-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)接頭DAP12的轉(zhuǎn)基因小鼠在肺中產(chǎn)生了大量血液嗜中性粒細(xì)胞以及大量的巨噬細(xì)胞滲透物，并且對(duì)LPS誘導(dǎo)的休克高度敏感38。該表型可部分解釋為TREM-1/DAP12依賴性途徑的組成型激活。此外，DAP12的過表達(dá)增加了由酵母多糖A引發(fā)的肝肉芽腫性炎癥，而阻斷TREM-I降低了肉芽腫的形成39。綜上，這些結(jié)果突顯了TREM-I在通過粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答的放大作用中的關(guān)鍵作用，尤其是對(duì)微生物組分的應(yīng)答，并且揭示了TREM-I作為由對(duì)感染(如膿毒性休克)的過度炎癥性應(yīng)答引起的人疾病的治療介入中的潛在靶標(biāo)。4.可溶性TREM-I模擬物調(diào)節(jié)炎癥已在膿毒4°患者血清以及參與膿毒性休克41實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膭?dòng)物血清中鑒定到了TREM-I的可溶性形式(sTREM-Ι)。此外，在肺炎患者的支氣管肺泡灌洗(BAL)中也檢測到sTREM-Ι42。存在兩種可能的sTREM-1來源。一種可能性是由表面表達(dá)的TREM-I的蛋白水解裂解或膜脫落來產(chǎn)生sTREM-Ι。或者，可由編碼TREM-I分泌形式的TREM-ImRNA剪接變體的從頭翻譯來產(chǎn)生sTREM-Ι。支持后一種假說的是，已報(bào)道了缺少編碼跨膜區(qū)的3號(hào)外顯子的可變TREM-I轉(zhuǎn)錄物43’44。對(duì)sTREM-Ι的生物學(xué)作用仍不完全了解。該分子可能清除不立即結(jié)合表面展示的TREM-I的TREM-I配體，由此在炎癥背景下鈍化了免疫應(yīng)答并提供了局部控制4°。的確，已描述對(duì)于免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及炎癥應(yīng)答至關(guān)重要的多種受體的可溶性形式的受控釋放。這些包括IL-I受體(IL-1誘餌RII)45’46、TNF-α受體47_5°和L-選擇蛋白受體51的可溶性形式。與sTREM-Ι的調(diào)節(jié)功能一致的是，模擬sTREM-Ι的短的高度保守結(jié)構(gòu)域的合成肽(LP17，TDSRCVIGLYHPPLQVY)減弱了體外人單核細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生并在體內(nèi)保護(hù)膿毒動(dòng)物免受高應(yīng)答性及死亡41。該肽不僅在預(yù)防膿毒中有效，還在一旦產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的有害作用后治療膿毒中有效。這些數(shù)據(jù)揭示sTREM-Ι肽體內(nèi)調(diào)節(jié)TREM-I可以作為治療膿毒的適當(dāng)治療工具。5.TREM-I/DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)TREM-I如何引發(fā)炎癥反應(yīng)？人TREM-I跨膜區(qū)包含允許與接頭DAP12結(jié)合的帶電殘基(賴氨酸)52。DAP12包含基于胞質(zhì)免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)(圖2)。DAP12結(jié)合的受體的銜接誘導(dǎo)ITAM通過Src激酶進(jìn)行酪氨酸磷酸化。磷酸化的ITAM募集蛋白酪氨酸激酶Syk和ZAP70，引發(fā)了如LAT、NTAL、與Vav復(fù)合的Slp76及與Sos復(fù)合的Grb_2的多種接頭的磷酸化。DAP12還誘導(dǎo)了磷脂酰肌醇_3激酶(PI3-K)、磷酸酶Cγ1/2(PLCγ1/2)、TEC激酶、c-Cbl和其它下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介體的激活作用21_23。這些胞質(zhì)介體引發(fā)了細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2和轉(zhuǎn)錄因子的激活，最終激活了細(xì)胞效應(yīng)子功能(圖2)。測定細(xì)胞對(duì)DAP12結(jié)合受體的連接作用的應(yīng)答的研究揭示單獨(dú)的DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)僅引發(fā)有限的炎癥反應(yīng)。然而，DAP12與其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑強(qiáng)烈地協(xié)同作用，激活炎癥，尤其是那些由TLP引發(fā)的炎癥。通常，TLP經(jīng)接頭MyD88和TRIF傳導(dǎo)信號(hào)(圖3)。MyD88募集IRAK4、IRAKI和TRAF6，起始信號(hào)級(jí)聯(lián)，最終導(dǎo)致NF_kB的激活作用4。TRIF募集TBK-I和IKKε，其介導(dǎo)了IRF-3的磷酸化和IFN-β的轉(zhuǎn)錄激活4。此外，TLR經(jīng)MyD88依賴和不依賴的途徑由Src酪氨酸激酶傳導(dǎo)信號(hào)53。DAP12介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)清楚地使體外和體內(nèi)的TLP介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)加強(qiáng)。然而，該協(xié)同作用的機(jī)制目前仍知之甚少。已顯示持續(xù)的ERK激活對(duì)于激活轉(zhuǎn)錄復(fù)合體AP-I尤其是C-Fos是必需的54’55。此外，DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)持續(xù)的胞內(nèi)鈣動(dòng)員，其激活了Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的磷酸酶鈣依賴磷酸酶56’57。鈣依賴磷酸酶將激活的T細(xì)胞(NAFT)轉(zhuǎn)錄因子的核因子去磷酸化，導(dǎo)致它們的核易位56’57。因此，DAP12介導(dǎo)的AP-I和NFAT激活可能與TLR誘導(dǎo)的NF_kB激活協(xié)同作用，導(dǎo)致編碼炎癥調(diào)節(jié)子的基因的轉(zhuǎn)錄激活增強(qiáng)(圖3)。近來在破骨細(xì)胞中證實(shí)了相似的模型，其中DAP12和其它含ITAM的接頭產(chǎn)生了Ca2+信號(hào)，其允許NF-kB(RANK)的受體激活子誘導(dǎo)NFATcl(NFAT2)，其為破骨細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子58。在粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面上表達(dá)的β1和β2整聯(lián)蛋白也通過介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用及與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的粘連來促進(jìn)炎癥59’6°。整聯(lián)蛋白的粘連功能依賴于由趨化因子受體產(chǎn)生的胞內(nèi)信號(hào)，其中所述趨化因子受體修飾整聯(lián)蛋白的構(gòu)象和表面分布61。有可能DAP12還產(chǎn)生了胞內(nèi)信號(hào)，例如Vav磷酸化，其促進(jìn)了整聯(lián)蛋白的激活(圖3)。通過額外受體如IgGFe、甲酰肽、炎性細(xì)胞因子IL-I和TNF、⑶40L和其它TNF超家族成員的受體來引發(fā)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的促炎癥反應(yīng)應(yīng)答。還未研究DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)這些不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。6.構(gòu)建TREM-I的小鼠模型人和小鼠基因間的顯著差異DAP12是與活化免疫受體家族結(jié)合的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)接頭，所述免疫受體不僅包括TREM，還包括SIRP-β1、CD200R、MDL-UKIRs,Ly49s、NKG2C/E及其它成員62。這些受體在粒細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞、DC、破骨細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和NK細(xì)胞的表面上表達(dá)。為了在體內(nèi)驗(yàn)證TREM-I在膿毒中的作用，必須產(chǎn)生TREM-I敲除小鼠。然而，在小鼠的情況下，TREM-I基因與高度同源的TREM-3基因相鄰，類似基因復(fù)制事件的結(jié)果。TREM-3與TREM-I僅相隔4kb，在小鼠巨噬細(xì)胞中表達(dá)并在對(duì)LPS的響應(yīng)中高度上調(diào)19。與TREM-I相似，TREM-3通過DAP12促進(jìn)細(xì)胞激活19。有理由推測鑒于它們序列同源性及結(jié)構(gòu)相似性，這兩個(gè)基因產(chǎn)物在小鼠中具有相似或重疊的功能并可能識(shí)別相同的配體或緊密相關(guān)的配體。相反，在人中，TREM-3是假基因，它在蛋白質(zhì)水平上不表達(dá)并因此在TREM-I和TREM-3間不存在潛在重疊。因此，為了模仿在人中阻斷TREM-I的效果，我們已產(chǎn)生了TREM-1/TREM-3雙敲除(TREM-1/3-/-)小鼠。我們的結(jié)果顯示TREM-1/3-/-小鼠比野生型小鼠對(duì)CLP更具抗性，說明在真正膿毒的情況下TREM-1/3-DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體會(huì)加劇炎癥。7.活化對(duì)抑制性DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)TREM_1和TREM-3的相反作用與DAP12在激活細(xì)胞中顯示的作用相反，Hamerman等近來已報(bào)道了在骨髓起源的巨噬細(xì)胞中，DAP12可以抑制TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，并且當(dāng)LPS與TNF-α敏化劑D半乳糖胺共同施用時(shí)，DAP12-/-小鼠比野生型小鼠對(duì)LPS更為敏感63。因此，這些結(jié)果自相矛盾地提示DAP12在調(diào)節(jié)TLP對(duì)LPS的應(yīng)答過程中的抑制作用。在我們的數(shù)據(jù)以及在參考文獻(xiàn)中64，我們證實(shí)了在細(xì)菌誘導(dǎo)型炎癥的生理模型中，DAP12-/-小鼠比野生型小鼠對(duì)CLP更具有抗性。此外，從膿毒小鼠中回收的DAP12-/-腹膜腔滲出細(xì)胞(PEC)比野生型PEC產(chǎn)生更少量的細(xì)胞因子。這些結(jié)果證實(shí)DAP12至少在存在細(xì)菌感染的情況下的促炎癥功能。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，TREM-1/3-/-小鼠對(duì)CLP具有抗性，揭示TREM-1/3-DAP12顯著促進(jìn)了體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。近來，Hamerman等的新研究36以及我們研究組35鑒定了用低濃度LPS在體外刺激骨髓來源巨噬細(xì)胞的過程中作為受體的TREM-2(與TREM-1/3相反)，介導(dǎo)DAP12的抑制作用，并且該作用也可能存在于D半乳糖胺加強(qiáng)的內(nèi)毒素血癥中。使用體外轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，Hamerman等發(fā)現(xiàn)小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的TREM-2表達(dá)的抑制作用增加了巨噬細(xì)胞對(duì)TLR激動(dòng)劑的應(yīng)答，并且TREM-2的這種功能需要完整的ITAM36。我們研究組的研究從野生型小鼠(WT)和TREM2-/-小鼠的分析中得到了相同的結(jié)論，觀察到來自TREM2-/-小鼠的巨噬細(xì)胞與來自野生型小鼠的巨噬細(xì)胞相比，具有增加的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子應(yīng)答，并且該作用完全解釋了之前在DAP12-/-小鼠中觀察到的增加的細(xì)胞因子的產(chǎn)生35。綜上，這些數(shù)據(jù)最終鑒定TREM-2在巨噬細(xì)胞中介導(dǎo)了DAP12的抑制作用。這些數(shù)據(jù)解決了數(shù)據(jù)中關(guān)于在單一內(nèi)毒素血癥相對(duì)于D半乳糖胺賦予內(nèi)毒素血癥中DAP12作用上明顯的矛盾。我們假設(shè)DAP12的激活相對(duì)于抑制作用反映了TREM-I相對(duì)于TREM-2的參與作用及這些受體對(duì)其配體的親和性或親合力上的差異。在單一內(nèi)毒素血癥及CLP的情況下，高劑量的LPS(劑量范圍為5-10mg/kg)和真正的細(xì)菌感染誘導(dǎo)了高親和力TREM-I配體的表達(dá)及全部TREM-1/DAP12磷酸化，導(dǎo)致了粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的激活及炎癥反應(yīng)強(qiáng)度上的增加(圖3)。在D半乳糖胺加強(qiáng)的內(nèi)毒素血癥的情況下，低濃度的LPS(20-100ng，較單一內(nèi)毒素血癥低IOOOx)誘導(dǎo)了低親和力TREM-2配體，其引發(fā)抑制性TREM-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、衰減了炎癥反應(yīng)并提高了存活率(圖3)。支持該模型的是，近期數(shù)據(jù)證實(shí)TREM-235和假定低親和力的TREM-2配體36均在巨噬細(xì)胞的表面上表達(dá)，揭示TREM-2可以向巨噬細(xì)胞提供加強(qiáng)的抑制信號(hào)。抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可由不完全的DAP12磷酸化及隨后的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶SHP-I(抑制作用的主要胞質(zhì)溶膠介體)的募集來調(diào)節(jié)65’66。實(shí)施例1DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)毒素血癥的炎癥和死亡率之前已顯示DAP12結(jié)合受體TREM-I在粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上的抗體連接放大了LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-8的釋放13’15。在體內(nèi)，DAP12結(jié)合受體TREM-I的阻斷與內(nèi)毒素血癥或膿毒性腹膜炎的降低的炎癥及提高的存活率相關(guān)14。這些觀察揭示TREM-I及其結(jié)合接頭DAP12在擴(kuò)大病原體及其組分誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用。為了確證該假說，我們試圖理解DAP12在炎癥生理學(xué)相關(guān)模型中的功能。為了該目的，我們測定了DAP12對(duì)內(nèi)毒素血癥和CLP誘導(dǎo)的膿毒性休克的貢獻(xiàn)。為了確定DAP12是否促進(jìn)了對(duì)內(nèi)毒素的體內(nèi)應(yīng)答，我們對(duì)WT小鼠和DAP12-/-小鼠進(jìn)行LPS的腹膜內(nèi)注射并監(jiān)測其存活。DAP12-/-小鼠耐受5mg/kg和6.25mg/kg劑量的內(nèi)毒素，該劑量在WT小鼠中導(dǎo)致60-100%的死亡率(圖4A)。然而，由于DAP12-/-小鼠在10mg/kg的劑量時(shí)死亡，所以它們并不完全抗內(nèi)毒素。因此，盡管DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于LPS的應(yīng)答并非必需，但其促進(jìn)了內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和其它促炎細(xì)胞因子引起休克67。為測定DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是否通過增加細(xì)胞因子產(chǎn)生來加劇內(nèi)毒素血癥，我們在用5mg/kg內(nèi)毒素處理的小鼠中測定了細(xì)胞因子水平。已顯示炎性細(xì)胞因子水平在內(nèi)毒素血癥的1-3小時(shí)內(nèi)達(dá)到峰值68。我們發(fā)現(xiàn)注射LPS兩小時(shí)后，WT小鼠和DAP12-/-小鼠都具有升高的TNF-α、IL-6、MCP-I和IL-10循環(huán)水平。當(dāng)與DAP12-/-小鼠相比時(shí)，WT動(dòng)物具有顯著更高水平的TNF-α和IL-IO0到4小時(shí)時(shí)，WT小鼠中TNF-α和IL-10下降且水平等于DAP12-/"動(dòng)物的水平(圖4Β)。我們推斷DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以急劇增加炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。實(shí)施例2DAP12增加膿毒性腹膜炎的死亡率和炎癥盡管來自內(nèi)毒素的死亡率由炎癥和細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生介導(dǎo)，存活的真正膿毒需要衰減炎癥反應(yīng)以及獲得細(xì)菌對(duì)照69。為了測定膿毒存活中DAP12的作用，我們使WT小鼠和DAP12-/-小鼠經(jīng)受CLP，其是細(xì)菌性腹膜炎的臨床相關(guān)模型。我們發(fā)現(xiàn)DAP12-/-小鼠對(duì)CLP具有高度抵抗力(WT，η=20，無存活；DAP12-/-，η=19，60%存活，圖5Α)。膿毒與促進(jìn)休克的高循環(huán)細(xì)胞因子水平相關(guān)69。為了測定DAP12是否在膿毒中促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，我們在CLP后6小時(shí)和24小時(shí)測定了WT小鼠和DAP12-/-小鼠的血清中細(xì)胞因子的水平。6小時(shí)時(shí)，WT小鼠和DAP12-/-小鼠具有可測定血清水平的IL-6、MCP-I和TNF-α，但兩組中并無差別。在6小時(shí)和24小時(shí)之間，WT血清細(xì)胞因子水平顯著增加，使得在膿毒開始后24小時(shí)時(shí)，WT小鼠比DAP12-/-小鼠具有顯著更高水平的IL_6、MCP-I、TNF-α和IL-IO(圖5B)。這些數(shù)據(jù)說明DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)膿毒過程中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。為了測定是否存在其它DAP12調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)WT小鼠與DAP12-/-動(dòng)物相比提高的膿毒死亡率，我們使用二維差異凝膠電泳(2DDIGE)比較了來自這些小鼠的血漿蛋白質(zhì)7°。從CLP處理24小時(shí)后的WT和DAP12-/-小鼠中分離血漿，并且通過等電點(diǎn)和大小來分離血漿蛋白質(zhì)。在兩個(gè)基因型中比較各凝膠特征的相對(duì)豐度，并且通過質(zhì)譜來分離和鑒定在4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中顯著不同的特征。我們在13個(gè)凝膠特征中鑒定到了7個(gè)差異調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)(一些蛋白質(zhì)在多張凝膠特征中出現(xiàn))。數(shù)據(jù)表述為DAP12-/-相對(duì)于WT的平均熒光倍數(shù)變化(表I)。在該無偏差方法中鑒定的蛋白質(zhì)之前描述為急性期反應(yīng)物。陽性急性期蛋白質(zhì)(已知在應(yīng)答炎癥中上升的蛋白質(zhì)，即載脂蛋白A-IV71、血紅素蛋白72和補(bǔ)體成分372)占鑒定蛋白質(zhì)的3/7。陰性急性期蛋白質(zhì)(已知隨炎癥下降的蛋白質(zhì))占鑒定蛋白質(zhì)的4/7(主要的泌尿蛋白質(zhì)73、抗纖維蛋白酶III74、凝溶膠蛋白75和MHCQlO76)。對(duì)于每一單個(gè)蛋白質(zhì)而言，急性期應(yīng)答在DAP12-/-小鼠中衰減。這顯示為較低水平的陽性急性期蛋白質(zhì)及更高水平的陰性急性期蛋白質(zhì)。總之，這些數(shù)據(jù)表明在DAP12-/-小鼠中降低的血漿細(xì)胞因子水平和降低的急性期應(yīng)答，說明了DAP12在引發(fā)炎癥中的作用。實(shí)施例3DAP12對(duì)于細(xì)胞募集或細(xì)菌殺傷不是必需的我們假定缺乏DAP12也能導(dǎo)致對(duì)腹膜炎降低的細(xì)胞應(yīng)答。為了確定該問題，我們測定了在膿毒中募集到腹膜的細(xì)胞數(shù)目和類型。膿毒開始24小時(shí)后我們在WT小鼠和DAP12-/-小鼠的腹膜中發(fā)現(xiàn)等量的細(xì)胞(圖6A)。通過分析這些細(xì)胞上的表面標(biāo)記，我們發(fā)現(xiàn)在WT小鼠和DAP12-/-小鼠中，50-60%的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞(定義為CDllb+GRl1。)及30-40%的細(xì)胞是粒細(xì)胞(定義為⑶Ilb+GRlhi)(圖6B)。DAP12的缺乏似乎沒有改變膿毒中細(xì)胞向腹膜的募集。我們還提出是否在缺乏DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)存在細(xì)菌控制上的不足。為了測定DAP12是否介導(dǎo)細(xì)菌控制，我們在24小時(shí)時(shí)測定了腹膜中的細(xì)菌負(fù)荷量。我們發(fā)現(xiàn)WT小鼠和DAP12-/-小鼠間腹膜感染中沒有顯著差異(圖6C)，說明在膿毒中控制腹膜感染不需要DAP12。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例4DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加體外細(xì)胞因子產(chǎn)生和從患膿毒小鼠中獲得的腹膜腔滲出細(xì)胞的ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)我們的結(jié)果表明體內(nèi)DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加細(xì)胞因子產(chǎn)生。為了研究這些觀察結(jié)果的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，我們測定了受膿毒誘導(dǎo)的腹膜腔滲出細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。通過腹腔灌洗分離腹膜腔細(xì)胞并檢測其在存在或不存在LPS刺激的情況下離體產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力。我們發(fā)現(xiàn)從CLP處理后的WT小鼠和DAP12-/-小鼠腹膜中分離的細(xì)胞在不存在任何額外刺激的情況下產(chǎn)生細(xì)胞因子(圖7A)。然而，與從DAP12-/-小鼠中分離的細(xì)胞相比，從WT小鼠中分離的細(xì)胞產(chǎn)生更多的MCP-l、TNF-a和IL-10。盡管在存在抗生素的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，我們不能測定該細(xì)胞因子的分泌是否反映空白膿毒性腹腔灌洗液中帶有的細(xì)菌產(chǎn)物的刺激，或是否該細(xì)胞因子的產(chǎn)生反映之前體內(nèi)刺激誘導(dǎo)的激活。為了歸一化經(jīng)TLR的刺激并排除微生物產(chǎn)物的差異殘留上的可能性，我們用1μg/mlLPS處理細(xì)胞，其導(dǎo)致了最大刺激并增加了WT細(xì)胞和DAP12-/-細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。在這些條件下，我們發(fā)現(xiàn)WT細(xì)胞在細(xì)胞因子產(chǎn)生上比DAP12-/-細(xì)胞明顯更為有效(圖7A)。值得注意的是，當(dāng)我們比較WT小鼠和DAP12-/-小鼠中巰基乙酸誘導(dǎo)腹膜腔滲出細(xì)胞的離體細(xì)胞因子產(chǎn)生時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)盡管存在DAP12-/-細(xì)胞在產(chǎn)生IL-10上具有上升趨勢，但11^-10、11^-6、103-1或1順-0并無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(圖7B)。我們推斷DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)僅在膿毒性腹膜炎進(jìn)行體內(nèi)刺激的PEC中增加細(xì)胞因子產(chǎn)生。我們進(jìn)一步研究了在膿毒性腹膜炎誘導(dǎo)的PEC中DAP12介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生上的增加潛在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。為此目的，在CLP后24小時(shí)收集PEC并用LPS刺激多次。通過SDS-PAGE分離細(xì)胞裂解物并進(jìn)行磷酸-ERK1/2的免疫印跡，隨后對(duì)總ERK2進(jìn)行再印跡(圖8)。WT小鼠在刺激30分鐘和60分鐘后顯示出增加的ERK磷酸化。這些數(shù)據(jù)說明DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加了LPS介導(dǎo)的ERK激活。這些研究明確地說明DAP12通過增加炎癥導(dǎo)致膿毒性腹膜炎引起的死亡。在彌漫性腹膜炎和內(nèi)毒素血癥的模型中，向腹膜募集細(xì)胞或介導(dǎo)抗微生物應(yīng)答不需要DAP12。我們發(fā)現(xiàn)DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過擴(kuò)大炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生加重炎癥反應(yīng)。實(shí)施例5TREM-1/TREM-3雙缺陷(TREM1/3-/-)小鼠比WT小鼠對(duì)CLP更不易感我們的數(shù)據(jù)(圖4-7)清楚地確定了DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在促炎癥中的作用。然而，在小鼠中缺失DAP12影響在炎癥細(xì)胞上表達(dá)的多種細(xì)胞表面受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些不僅包括TREM-1，還包括SIRPβI77'78、CD200R7"2、IREM283、MDL-I84和其它表面受體62。因此，DAP12-/-小鼠不能用于體內(nèi)發(fā)現(xiàn)TREM-I的特異功能。解決TREM-I的體內(nèi)功能必須產(chǎn)生敲除模型。在小鼠中，TREM-I基因與非常相似的基因TREM-319相鄰，其可能編碼與TREM-I可能具有重疊功能并可識(shí)別相同配體或緊密相關(guān)配體的蛋白質(zhì)。與之相反，在人中TREM-3是假基因。因此，為了最佳模擬體內(nèi)人TREM系統(tǒng)，我們已產(chǎn)生了TREM-1-TREM-3雙敲除小鼠(TREM-1-3-/-)。設(shè)計(jì)TREM-1-3靶定構(gòu)建體來缺失編碼TREM-I與DAP12結(jié)合需要的跨膜及胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的3號(hào)和4號(hào)外顯子，和編碼TREM-3的引導(dǎo)序列的TREM-3的1號(hào)外顯子(圖9)。我們將所述構(gòu)建體電穿孔到Ε14.IES細(xì)胞中，注入正確定向克隆至C57BL/6胚泡中并獲得嵌合體，且用于繁殖轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠表達(dá)在CMV啟動(dòng)子下的Cre85。嵌合體傳遞新霉素抗性基因缺失的TREM-1-3突變。通過TREM-1/3-/+小鼠雜交，我們產(chǎn)生了該缺失純合的小鼠。為了說明在我們的小鼠中缺少TREM-1/3表達(dá)，我們制備了來自TREM-1/3-/-小鼠和WT同窩仔鼠的血液和骨髓粒細(xì)胞并用我們最近制備的抗mTREM-lmAb(50Dl)14)和抗mTREM-3mAb對(duì)其染色(圖10)。流式細(xì)胞分析顯示盡管WT粒細(xì)胞表達(dá)高水平的TREM-I和TREM-3，但在TREM-1/3-/-型粒細(xì)胞中TREM-I和TREM-3均完全缺失(圖11)。為了確定該可能性，將TREM-1/3-/-小鼠回交至C57B1/6背景，然后當(dāng)>70%基因組來自C57BL6品系時(shí)進(jìn)行雜交(如通過SSLP定型來測定)?？紤]小鼠的遺傳背景是關(guān)鍵的，因?yàn)槠渲性摶蜃话卸ǖ腅S細(xì)胞來自小鼠的129/Ola品系并且在小鼠129品系中的DAP12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中存在未表征的缺陷86。為了測定TREM-1/3在膿毒存活中的作用，我們比較了TREM-1/3+/+小鼠和TREM-1/3-/-小鼠(均來自平行育種以提供純系的70%C57BL/6/30%12901a背景)對(duì)CLP膿毒攻擊的應(yīng)答；監(jiān)測存活14天。研究限于雄性小鼠以避免發(fā)情周期對(duì)膿毒存活的混雜影響。我們發(fā)現(xiàn)TREM-1/3-/-小鼠相比于WT小鼠對(duì)CLP具有抗性(圖12)。我們的數(shù)據(jù)顯示消除TREM-1/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在該CLP的鼠類模型中提供了保護(hù)作用，證實(shí)了我們之前發(fā)表的數(shù)據(jù)，即TREM-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻斷在CLP中是有益的。70%的C57BL/6小鼠比其WT同窩仔鼠對(duì)CLP更具有抗性，說明TREM信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)在膿毒中是有益的。一旦這些敲除小鼠處于純C57BL/6背景下，我們期望TREM-1/3-/-的表型保護(hù)甚至更為重要?？僧a(chǎn)生已缺失單一受體的小鼠品系并用于進(jìn)一步分析。實(shí)施例6建立肺膿毒的鼠類模型之前我們已顯示阻斷TREM-I可以在盲腸結(jié)扎及穿刺(CLP)誘導(dǎo)的膿毒后提高存活率。CLP是腹部膿毒的臨床相關(guān)模型并概括了內(nèi)源細(xì)菌繼發(fā)的多種微生物革蘭氏陰性膿毒的發(fā)病機(jī)理。然而，腹部起源的膿毒包含僅一小部分臨床疾病。在美國，超過50%的臨床膿毒是從社區(qū)獲得性病原體或醫(yī)院病原體的原發(fā)肺部感染發(fā)展而來。此外，人TREM-I主要在肺泡巨噬細(xì)胞中表達(dá)37并可能在肺部感染的宿主應(yīng)答中具有重要作用。為了更好地模擬臨床條件，我們已采用了單一臨床相關(guān)病原體感染引發(fā)的肺部膿毒的模型。之前，Coopersmith和Hotchkiss博士已發(fā)表了來自綠膿假單胞菌肺炎中的革蘭氏陰性膿毒的模型87_89。最近，該模型已擴(kuò)展到來自肺炎鏈球菌肺炎的革蘭氏陽性膿毒。在兩種模型中，已滴定細(xì)菌接種物以在WT小鼠中給出90%死亡率。圖13顯示了這兩種膿毒模型的存活曲線(左圖為肺炎鏈球菌模型并且右圖為綠膿假單胞菌模型)。實(shí)施例7人TREM-I配體在激活的嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)至今，在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室中鑒定TREM-I配體的努力均無結(jié)果。在本發(fā)明人看來，這可能是由于低親和力受體-配體相互作用與快速的解離速率。已在自然免疫文獻(xiàn)中描述了該現(xiàn)象。例如，NK受體NKG2D具有從微摩爾到納摩爾變化的親和力的多種配體9°。為了鑒定免疫受體的低親和力配體，本發(fā)明人已開發(fā)了新方法。已設(shè)計(jì)多種四聚體及多聚體構(gòu)建體來通過多價(jià)性產(chǎn)生更高的受體配體親和力及更合適的解離速率91_94。為此目的，我們產(chǎn)生了四聚體TREM-I構(gòu)建體。將編碼人TREM-I胞外域的cDNA克隆至細(xì)菌表達(dá)載體Pet28(由DavedFremont,WashingtonUniversitySchoolofMedicine友情提供)中，其在目的蛋白質(zhì)的羧基末端上摻入BirA標(biāo)簽和6個(gè)組氨酸標(biāo)簽(圖14)。將BirA序列用重組生物素連接酶有效地生物素化。多組氨酸標(biāo)簽可用于通過鎳瓊脂糖層析來純化重組蛋白質(zhì)。將該蛋白質(zhì)(TREM-1胞外域BirA-6H)從細(xì)菌包含體中純化，重折疊并隨后用FPLC分離。隨后，將該蛋白質(zhì)生物素化。未摻入的生物素經(jīng)FLPC去除。隨后將生物素化的TREM-I與偶聯(lián)藻紅蛋白(PE)的鏈霉抗生物素蛋白溫育。由于鏈霉抗生物素蛋白包含4個(gè)不同的高親和力(10_12M)生物素結(jié)合位點(diǎn)，生物素化的TREM-I胞外域及PE鏈霉抗生物素蛋白形成PE標(biāo)記的四聚體。所獲分子hTREM-Ι四聚體具有在偶聯(lián)PE的中心鏈霉抗生物素蛋白分子上展示的四個(gè)hTREM-Ι胞外域。使用該P(yáng)E標(biāo)記的四聚體TREM-1，我們通過流式細(xì)胞術(shù)篩選了現(xiàn)存的細(xì)胞系(檢查了超過30種人及鼠的品系)及外周血單核細(xì)胞(PBMC)、小鼠淋巴結(jié)、脾臟和腹膜腔細(xì)胞。由于我們的初步數(shù)據(jù)說明TREM-I在放大炎癥信號(hào)中是關(guān)鍵的，本發(fā)明人在BarnesJewishHospital的特護(hù)病房(I⑶)中檢查了從膿毒患者中獲得的細(xì)胞。在獲得來自InstitutionalReviewBoard的篩選患者樣本的許可后，他們鑒定了適當(dāng)?shù)腎CU患者及ICU醫(yī)務(wù)人員采集的血液。使用菲可梯度接著葡聚糖富集來分離嗜中性粒細(xì)胞95。用最低速離心迅速謹(jǐn)慎地進(jìn)行分離并將細(xì)胞置于4°C以避免人為激活96?；诖嬖诳梢筛腥炯靶枰糜谥С盅獕旱难苌龎侯愃幬飦砗Y選患者。采集血液并隨后將嗜中性粒細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。同時(shí)，獲得來自自由行動(dòng)的志愿者的對(duì)照嗜中性粒細(xì)胞并與患者樣品平行處理用于結(jié)合實(shí)驗(yàn)。hTREM-Ι四聚體構(gòu)建體結(jié)合來自膿毒患者的嗜中性粒細(xì)胞亞群上，而不與健康志愿者的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合(圖14)。這些數(shù)據(jù)揭示假定的TREM-I配體在膿毒患者中的嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)。為了驗(yàn)證hTREM-Ι四聚體結(jié)合的特異性，對(duì)照四聚體(⑶69)及SA-PE單獨(dú)用于結(jié)合試驗(yàn)中并且兩者均無法與從膿毒患者獲得的人嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合(圖14)。使用針對(duì)細(xì)胞譜系標(biāo)記的mAb來對(duì)結(jié)合hTREM-Ι四聚體的嗜中性粒細(xì)胞亞群進(jìn)行表征。該亞群為與受體的嗜中性粒模式一致的⑶56-、⑶3_、⑶19-和⑶16high。進(jìn)一步分析顯示該嗜中性粒細(xì)胞的亞群對(duì)⑶lib、⑶10、⑶66b、⑶55和⑶Ilc所有已知在循環(huán)成熟嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)的標(biāo)記是陽性的96(圖15)。由于已報(bào)道⑶35受體是在嗜中性粒細(xì)胞發(fā)育的帶和節(jié)段階段中出現(xiàn)的抗原，該群體也明顯是CD35(補(bǔ)體受體1)陽性的，說明這些細(xì)胞是成熟分段的嗜中性細(xì)胞，而不是早期應(yīng)答脅迫從骨髓釋放出來的未成熟粒細(xì)胞97。之前已報(bào)道在炎癥和感染的背景中⑶16水平異常低98。與這些研究一致的是，膿毒患者的嗜中性粒細(xì)胞中的⑶16(Feγ受體III)水平與對(duì)照相比下降(圖14)。有趣的是，對(duì)TREM-I配體陽性的嗜中性粒細(xì)胞百分比在患者中從約25%變化至高達(dá)90%。此時(shí)該變化的病理學(xué)還不清楚，但可能代表嗜中性粒細(xì)胞激活的不同狀態(tài)、患者間遺傳差別或不同的翻譯后蛋白質(zhì)修飾。TREM-I配體的鑒定允許進(jìn)一步的遺傳變異分析。已在膿毒的發(fā)病率及結(jié)果中發(fā)現(xiàn)此類差異。實(shí)施例8PMA/離子霉素上調(diào)假定的hTREM-Ι配體為了評(píng)估經(jīng)體外刺激處理的嗜中性粒細(xì)胞是否上調(diào)假定的配體，檢查了對(duì)照嗜中性粒細(xì)胞。HumanStudiesCommitteeProtocolBarnesHospitalMSEHS^^f^^從膿毒患者采集血液。通過標(biāo)準(zhǔn)方案分離嗜中性粒細(xì)胞。簡述之，用2部分PBS滴定血液并隨后覆蓋在50ml錐形瓶中15ml菲可上。以1400rpm將該管旋轉(zhuǎn)30分鐘。隨后用3%的葡聚糖溶液進(jìn)一步分離與紅細(xì)胞混合的嗜中性粒細(xì)胞。隨后收集富集嗜中性粒細(xì)胞的層并用0.2%的NaCl進(jìn)行低滲溶解30秒紅細(xì)胞然后用等體積的1.6%的NaCl進(jìn)行。隨后沉淀嗜中性粒細(xì)胞并在冷的PBS中重懸浮。從血液中分離后，用包括fMLP、TNF_a、LPS、IL-I及PMA/離子霉素在內(nèi)的多種刺激物處理嗜中性粒細(xì)胞。選擇這些試劑是由于它們均可刺激人嗜中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致嗜中性粒的優(yōu)先脫粒。嗜中性粒細(xì)胞具有幾種獨(dú)特類型的顆粒，包括特異的、嗜苯胺藍(lán)的、白明膠酶和分泌小泡。各類型的顆粒包括特征蛋白質(zhì)。一旦顆粒進(jìn)行胞吐作用，動(dòng)員顆粒的膜保留部分質(zhì)膜，因此展示之前在胞內(nèi)的分子“。這就是嗜中性粒細(xì)胞在刺激下快速展示新受體的機(jī)理。通過用不同化合物刺激細(xì)胞，我們希望確定該配體是否在激活下從頭合成或在顆粒中進(jìn)行。當(dāng)用以上化合物刺激對(duì)照嗜中性粒細(xì)胞時(shí)，僅PMA/離子霉素處理的細(xì)胞結(jié)合人TREM-I(圖14)。之前已顯示PMA/離子霉素提供此類強(qiáng)激活(通過鈣通量和蛋白激酶C激活)，其中超過50%的嗜中性粒細(xì)胞的總粒狀含量被胞吐出去■。在這些條件下，幾乎所有嗜中性粒細(xì)胞群對(duì)hTREM-Ι四聚體結(jié)合呈遞為陽性。在暴露至PMA/離子霉素僅3分鐘后就開始檢測到該結(jié)合。這些數(shù)據(jù)說明至少一部分hTREM-Ι配體已形成，并且在適當(dāng)刺激后，嗜中性粒細(xì)胞將配體轉(zhuǎn)移至表面，其隨后可用于四聚體結(jié)合。還不清楚該上調(diào)的一些組分是否在翻譯水平上被驅(qū)動(dòng)，因?yàn)樵赑MA/離子霉素暴露后30-45分鐘發(fā)生最大hTREM-Ι四聚體結(jié)合。此時(shí)我們不能就預(yù)形成配體的細(xì)胞質(zhì)定位得到任何推論。綜上，這些數(shù)據(jù)說明hTREM-Ι的配體在膿毒患者的嗜中性粒細(xì)胞亞群和PMA/離子霉素激活的嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)。這些數(shù)據(jù)與TREM-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在炎癥和膿毒發(fā)展中的作用是一致的。的確，期望因?yàn)門REM-I受體在嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中組成型表達(dá)，期望其將是配體表達(dá)，其在炎癥背景中是動(dòng)態(tài)的。配體表達(dá)的調(diào)節(jié)能在最初炎癥觸發(fā)后在膿毒發(fā)展中起關(guān)鍵作用。實(shí)施例9產(chǎn)生TREM-I配體阻斷抗體為了鑒定推定的配體，產(chǎn)生抗人嗜中性粒細(xì)胞抗體。用從膿毒患者分離的配體陽性嗜中性粒細(xì)胞免疫大鼠。經(jīng)三輪免疫后，處死大鼠并將其脾臟與小鼠SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。篩選所獲的雜交瘤用于產(chǎn)生抗體，其a)與PMA/離子霉素刺激的嗜中性粒細(xì)胞或膿毒患者嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合；b)不會(huì)廣泛地結(jié)合對(duì)照嗜中性粒細(xì)胞；c)不結(jié)合TREM-I轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；d)去除TREM-I四聚體與激活的嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)合。按照該篩選步驟，鑒定到命名為R33的mAb(IgG2a)。由R33識(shí)別的抗原在來自膿毒患者的嗜中性粒細(xì)胞和用PMA/離子霉素預(yù)處理的嗜中性粒細(xì)胞上被上調(diào)。重要的是，來自膿毒患者的嗜中性粒細(xì)胞與mAbR33的預(yù)溫育去除了TREM-I四聚體結(jié)合，而與同種型匹配的對(duì)照mAb的預(yù)溫育不干擾四聚體的結(jié)合(圖16)?；谶@些數(shù)據(jù)，本發(fā)明人推斷R33抗原是TREM-I的配體。實(shí)施例10構(gòu)建來自膿毒患者嗜中性粒細(xì)胞的cDNA表達(dá)文庫和該文庫鑒定TREM-I配體的用途制備來自重癥監(jiān)護(hù)病房中達(dá)到膿毒標(biāo)準(zhǔn)的膿毒患者的血沉棕黃層的總細(xì)胞RNA。篩選這些患者中的大部分的R33抗原結(jié)合活性以及TREM-I四聚體結(jié)合。(圖22顯示TREM-I四聚體結(jié)合膿毒患者的嗜中性粒細(xì)胞但不結(jié)合休眠的嗜中性粒細(xì)胞。)為了純化RNA，我們利用之前在PerrenCobbs博士的實(shí)驗(yàn)室中驗(yàn)證為InflammationandHostResponsetoInjuryLargeScaleCollaborativeResearchProgram的一部分的方案1(11。簡述之，在生成的兩小時(shí)內(nèi)處理樣品。將血液以900xg不停止地離心10分鐘。隨后去除血清并保存于-80°C。在EL緩沖液(InVitrogen)中重懸浮細(xì)胞沉淀物并在冰上溫育15分鐘。溫育后收集細(xì)胞并重復(fù)該步驟。一旦樣品中不存在紅細(xì)胞，加入RNA貯存緩沖液并在_80°C將樣品冷凍。隨后用來自InVitrogen的RNAEASY試劑盒分離總細(xì)胞RNA。通過Agilent生物分析器(bioanalyzer)評(píng)估RNA的質(zhì)量。一旦純化到足量的高品質(zhì)RNA，合并樣品并用OpenBiosystems按我們的用途來構(gòu)建定制非擴(kuò)增的cDNA文庫。隨后我們將純化的cDNA轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物293細(xì)胞中并使用熒光細(xì)胞分選儀分選這些細(xì)胞。我們從一千萬個(gè)分選細(xì)胞中收集了約100，000個(gè)細(xì)胞(圖17，A圖)。我們使用Hirt緩沖液從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA。將該DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。用氨芐青霉素選擇來平板接種轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。一旦看見菌落，將菌落重復(fù)平板接種。我們從24塊獨(dú)立平板上收集并純化質(zhì)粒，將其復(fù)制物保存于4°C。使用lipofectamin(InVitrogen)將這些質(zhì)粒池轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞的獨(dú)立孔中。24小時(shí)后，從各孔中收集細(xì)胞并用mAbR33及適合的二級(jí)綴合抗體染色。隨后將細(xì)胞進(jìn)行FACS分析(圖17)。鑒定到兩塊陽性平板F(圖17，B圖)和H。F平板有約149個(gè)獨(dú)立菌落。將這些菌落分為4群并分離質(zhì)粒DNA。在將DNA轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞后，經(jīng)FACS染色進(jìn)行另一輪的篩選，進(jìn)行染色。通過該方法將R33抗原的范圍最終縮小到單個(gè)菌落(圖17，C圖)。發(fā)現(xiàn)該菌落表達(dá)⑶177，其為表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的亞組上的分子。該分子的氨基酸序列顯示于圖18中。此處可見所述分子具有GPI錨。它還具有參與結(jié)合TREM-I受體的胞外部分。該cDNA序列顯示于圖21A中。GPI連接蛋白經(jīng)常從細(xì)胞表面脫落并以可溶性蛋白質(zhì)的形式發(fā)現(xiàn)于血漿和血清中。已顯示，這是該蛋白質(zhì)家族的成員中的情況。例如Klippel等(Blood，100，No7，2441-2448[2002])報(bào)道了PRV-1的該現(xiàn)象。實(shí)施例11TREM-I配體的可溶性形式的產(chǎn)生及其分析可產(chǎn)生可溶性形式的配體并且其對(duì)在表達(dá)TREM-I的細(xì)胞上進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)是有用的。這可使用我們實(shí)驗(yàn)室中編碼IgG的Fc部分的突變形式(不能與Fc受體結(jié)合)的構(gòu)建體來完成。TREM-I配體基因可與Fc框內(nèi)融合。能將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。該蛋白質(zhì)產(chǎn)物將被分泌至培養(yǎng)基中，經(jīng)Fc相互作用形成二聚體。所獲蛋白質(zhì)產(chǎn)物將是具有兩個(gè)配體頭部的Fc融合蛋白質(zhì)。可收集分泌該分子的細(xì)胞的上清液并用G蛋白柱來純化所述分子。該構(gòu)建體用于評(píng)估受體與配體在雙方向上的結(jié)合，即可溶性TREM-I結(jié)合表面表達(dá)的R33抗原以及可溶性R33抗原結(jié)合表面表達(dá)的TREM-1。我們的實(shí)驗(yàn)室在過去已使用該策略對(duì)幾個(gè)配體受體相互作用進(jìn)行了表征13’14’114。隨后將可溶性TREM-I配體Fc蛋白質(zhì)與天然表達(dá)TREM-I的細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)以及轉(zhuǎn)染有TREM-I編碼質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行溫育?？墒褂镁Y合PE的抗人Fc及FACS分析來檢測Fc融合蛋白的結(jié)合。也可進(jìn)行相反的實(shí)驗(yàn)，其中可評(píng)估人TREM-I四聚體與轉(zhuǎn)染有TREM-I配體的細(xì)胞系結(jié)合的能力?？蓮腸DNA文庫質(zhì)粒擴(kuò)增TREM-I配體并將其亞克隆至pcDNA3載體。該載體包含新霉素選擇，允許產(chǎn)生穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染子?？蓪⒃撡|(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中并置于抗生素選擇下?？呻S后在FACS中用R33抗體染色來分析抗性細(xì)胞?？煽寺「弑磉_(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子并隨后與我們實(shí)驗(yàn)室之前制備的TREM-I四聚體分子以及TREM-IFc分子用于結(jié)合試驗(yàn)中。已構(gòu)建T細(xì)胞雜交瘤報(bào)告細(xì)胞系，其表達(dá)融合至⑶3ζ胞質(zhì)區(qū)的TREM-I分子。如果TREM-I分子以功能性方式銜接，將ΖΑΡ70募集到CD3ζ并且一系列胞內(nèi)磷酸化事件導(dǎo)致PLCg的激活和增加的胞內(nèi)鈣。報(bào)告細(xì)胞包含編碼融合至編碼綠色熒光蛋白(GFP)的序列的NFAT啟動(dòng)子的質(zhì)粒。NFAT受胞內(nèi)鈣動(dòng)員激活。這允許將表達(dá)GFP報(bào)告子的TREM-I與推定的配體共溫育并隨后通過FACS分析細(xì)胞的GFP表達(dá)。我們實(shí)驗(yàn)室和其他人已使用該系統(tǒng)來確定其它受體配體相互作用的生物學(xué)關(guān)聯(lián)115。該功能性試驗(yàn)系統(tǒng)可用作TREM-1/TREM-1配體相互作用的生物學(xué)關(guān)聯(lián)的另一種度量?？扇苄訲REM-I配體分子以及無關(guān)的對(duì)照Fc融合蛋白可以與新分離的人嗜中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞溫育。可將IL-1、IL-8和MPO活性測定為嗜中性粒細(xì)胞中炎癥的代用標(biāo)志。除R33抗原結(jié)合對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的影響外，還將評(píng)估吞噬作用。在單核細(xì)胞中，可測定TNFa、IL-8和MCP-I的分泌來確定TREM-I銜接對(duì)這些分子的影響。我們預(yù)期銜接會(huì)導(dǎo)致這些促炎細(xì)胞因子的分泌。野生型小鼠和TREM1/3缺乏小鼠可用作評(píng)估可溶性TREM-I配體對(duì)鼠類膿毒的影響?？稍谶@些小鼠中評(píng)估存活率、血清細(xì)胞因子產(chǎn)生、腹膜滲透以及局部和全身細(xì)菌負(fù)荷量。我們預(yù)期在敲除小鼠中過量的TREM-I配體應(yīng)對(duì)存活無影響，而過量的TREM-I配體如果是刺激性的，將在野生型小鼠中提高細(xì)胞因子產(chǎn)生及死亡率。我們期望TREM-I配體的結(jié)合觸發(fā)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。我們期望在體內(nèi)施用可溶性TREM-I配體將導(dǎo)致野生型小鼠在CLP之后提高的細(xì)胞因子產(chǎn)生及升高的死亡率，而敲除小鼠將不受該分子的影響。實(shí)施例12作為膿毒標(biāo)記的TREM-I配體本研究中包括的患者是26位新進(jìn)入的患者，其具有臨床可疑感染并滿足系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SystemicInflammatoryResponseSyndrome(SIRS))的至少兩條標(biāo)準(zhǔn)[BoneRC,SibbaldWJ禾口SprungCL.TheACCP-SCCMconsensusconferenceonsepsisandorganfailure.Chestl992;101:1481-3]。將患者如下回顧性分類12位患有膿毒及14位患有SIRS。包括4名健康個(gè)體作為對(duì)照。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上評(píng)估TREM-I配體表達(dá)1)急性期，緊接在送入重癥監(jiān)護(hù)病房(溫度>38°C、心跳>90/分鐘、WBC>12X1071)后；及2)恢復(fù)期，對(duì)應(yīng)于臨床出院時(shí)間(以上臨床參數(shù)正?；?。進(jìn)入時(shí)的臨床特征在膿毒患者及那些不患膿毒的患者間不存在顯著差異在膿毒及SIRS中分別為男性n°8(66%)和9(69%)；年齡48.6和58.5。在所有12位膿毒患者中，在微生物水平上證明了血流感染(5位Gram+、5位GranT、1位多重感染、1位白色念珠菌感染)。僅在膿毒患者而不是在SIRS患者中檢測到TREM-I配體表達(dá)(圖24A)。來自健康受試者的外周粒細(xì)胞不表達(dá)可檢測水平的TREM-I配體(圖24A)。在TREM-I配體表達(dá)水平和從血流中分離的微生物菌株間未觀察到相關(guān)性或任何其它臨床或生物學(xué)特征。我們還評(píng)估了TREM-I配體的表達(dá)水平與膿毒患者的臨床狀態(tài)間的關(guān)系。在所有分析的膿毒患者中，TREM-I配體表達(dá)水平在從重癥監(jiān)護(hù)病房中出院時(shí)下降(圖24B)。在一位患者中，由于患者死于膿毒性休克而不能進(jìn)行TREM-I配體的第二次測定。在另兩位患者中，盡管記載了具有全身性細(xì)菌感染，但無法在入住重癥監(jiān)護(hù)病房時(shí)檢測TREM-I配體表達(dá)。這可能是因?yàn)檫@樣的事實(shí)，沒有向?qū)嶒?yàn)室中遞送充足的具有高細(xì)胞死亡率的血液樣品。我們的結(jié)果說明僅在膿毒患者而不是患有非微生物起源的SIRS患者的外周嗜中性粒細(xì)胞中檢測到TREM-I配體表達(dá)，因此其代表了膿毒的有用標(biāo)記。可溶性TREM-I的血漿水平的測定也已顯示其在區(qū)分膿毒與SIRS中的診斷準(zhǔn)確率[GibotS，Kolopp-SardaMN,BeneMC，等AnnInternMed2004；141:9_15]。確實(shí)，膿毒研究中的進(jìn)展需要比目前可得的標(biāo)記更好的標(biāo)記，以在嚴(yán)重患者的高度異質(zhì)組中描繪更同質(zhì)的患者亞群，并用于鑒定這樣的患者，所述患者具有所提出治療針對(duì)的特定生物學(xué)異常。我們的數(shù)據(jù)提示TREM-I配體可代表預(yù)測膿毒存在及嚴(yán)重性的有用的診斷標(biāo)記，其在確定診斷中提供信息，以鑒定患有疾病并因此可能響應(yīng)具體治療的患者；對(duì)膿毒嚴(yán)重性進(jìn)行定量，以鑒定更可能經(jīng)歷有益結(jié)果的患者；測定對(duì)治療的應(yīng)答，以測定患者如何響應(yīng)介入。此外，TREM-I配體是膿毒中重要的介體并且在膿毒患者中特異表達(dá)。由于介入不應(yīng)僅僅針對(duì)TREM-I但它必需在適合的時(shí)候給予，在膿毒的炎癥反應(yīng)的發(fā)展過程中分析TREM-I配體的表達(dá)對(duì)于膿毒的有效治療方法是非常重要的。實(shí)施例13顯示如何進(jìn)行篩選防止/降低TREM-I配體與其受體結(jié)合的化合物的第一個(gè)實(shí)施例單獨(dú)的293細(xì)胞或轉(zhuǎn)染鼠類CD177的293細(xì)胞與不同濃度的測試化合物在冰上預(yù)溫育30分鐘并隨后與可溶性鼠類TREM-I分子(lOOug/ml)在冰上溫育45分鐘，隨后用FACS緩沖液(PBS，2%BCS)洗滌細(xì)胞，與抗人FC生物素在冰上溫育20分鐘，用FACS緩沖液洗滌一次，并與鏈霉抗生物素蛋白APC溫育20分鐘，隨后用FACS緩沖液洗滌，立刻將細(xì)胞用于分析。去除死細(xì)胞。柱狀圖向左的遷移說明測試化合物抑制了TREM-I分子與CD177的結(jié)合。實(shí)施例14顯示如何進(jìn)行篩選防止/降低TREM-I配體與其受體結(jié)合的化合物的第二個(gè)實(shí)施例已構(gòu)建了T細(xì)胞雜交瘤報(bào)告細(xì)胞系，其表達(dá)與⑶3ζ的胞質(zhì)區(qū)融合的TREM-I分子。如果TREM-I分子以功能性方式銜接，ΖΑΡ70募集到CD3(并且一系列胞內(nèi)磷酸化事件導(dǎo)致PLCg的激活和增加的胞內(nèi)鈣。報(bào)告細(xì)胞包含編碼NFAT啟動(dòng)子的質(zhì)粒，所述NFAT啟動(dòng)子與編碼綠色熒光蛋白(GFP)的序列融合。NFAT受胞內(nèi)鈣動(dòng)員激活。這允許共溫育表達(dá)GFP報(bào)告基因的TREM-I與CD177-以可溶性形式或由轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表達(dá)-在存在或不存在不同濃度的測試化合物，并隨后通過FACS分析細(xì)胞的GFP表達(dá)。CD177抑制TREM-I報(bào)告細(xì)胞系的激活說明測試化合物結(jié)合TREM-1。可使用不同報(bào)告系統(tǒng)如IacZ修飾以上系統(tǒng)。實(shí)施例15顯示如何基于TREM-I配體的鑒定進(jìn)行診斷性篩選膿毒患者的實(shí)施例可以以純化形式獲得TREM-I配體(例如⑶177)或其TREM-I配體結(jié)合部分。然后這可以接種至動(dòng)物中并用于產(chǎn)生一系列產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。隨后可使用本發(fā)明的篩選方法篩選抗體，以鑒定阻斷或降低TREM-I配體與TREM-I受體結(jié)合的抗體。此類抗體然后可用于診斷測試中，以診斷膿毒(尤其是微生物起源，例如細(xì)菌或真菌起源)。如需要，可基于來自健康患者的嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞使用對(duì)照。如果抗體結(jié)合被認(rèn)為是在顯著高于對(duì)照程度上處于膿毒風(fēng)險(xiǎn)的患者，則其為膿毒的指示劑。該檢測也可區(qū)分微生物起源的膿毒和非微生物起源的SIRS。在后一種情況下(與前一種情況不同)，在抗體與從患者獲得的嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞之間不存在實(shí)質(zhì)結(jié)合。實(shí)施例16顯示如何鑒定特異阻斷TREM-I配體與其受體結(jié)合的抗體并用于膿毒治療中的實(shí)施例可如實(shí)施例13-14中討論，產(chǎn)生并篩選針對(duì)TREM-I配體的單克隆抗體。隨后將通過篩選為成功地阻斷TREM-I與其受體結(jié)合所鑒定的抗體用于進(jìn)一步檢測。例如可使用它們來觀察它們是否與患有微生物膿毒的患者的外周嗜中性粒細(xì)胞而不與非微生物起源的SIRS患者的外周嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合(見實(shí)施例12)?？蛇x擇該檢測中成功的抗體用于進(jìn)一步分析，包括安全性檢測和可能的最后的臨床試驗(yàn)?？赏ㄟ^比較抗體在微生物膿毒患者組和非微生物起源的患者組中的結(jié)果來進(jìn)行臨床試驗(yàn)。如果每個(gè)組都不存在明顯副作用并且微生物膿毒的患者組相對(duì)于非微生物起源的SIRS患者組的狀況存在顯著改善，試驗(yàn)將是成功的。也可使用適合的對(duì)照組，例如施用安慰劑的微生物膿毒患者、施用安慰劑的非微生物起源的SIRS患者、施用安慰劑的健康志愿受試者組以及施用抗體的健康志愿受試者組?？梢砸越档徒徊娣磻?yīng)性的形式來提供抗體。例如它們可以是如前討論的“人源化的”或者甚至是“完全人”抗體。可以與一種或更多種有助于延長體內(nèi)半衰期的物質(zhì)(例如如前所述可使用聚乙二醇化)一起在無菌藥物組合物中提供它們。它們可以用任何合適的途徑施用，但優(yōu)選以注射組合物的形式提供。之前給出了劑量范圍，但完全可以在對(duì)人施用前通過動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果來優(yōu)化。如果在某一劑量上存在副作用，適當(dāng)時(shí)當(dāng)然可以降低劑量。實(shí)施例17提供針對(duì)非人TREM-I配體的抗體的實(shí)施例當(dāng)然存在⑶177和其它TREM-I配體的種內(nèi)和種間變體(例如PRV-1)。針對(duì)不同變體的抗體可用于純化、診斷、治療、組織分型、比較研究、特異性評(píng)估等。已討論了由人表達(dá)的針對(duì)⑶177的單克隆抗體(R33)。該實(shí)施例闡述了針對(duì)鼠類⑶177的抗體的產(chǎn)生。使用blast同源性檢索鑒定了鼠類⑶177。產(chǎn)生特異引物并從鼠類cDNA中擴(kuò)增CD177序列。將所獲片段亞克隆至表達(dá)載體PCDNA6中。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中并使用高效細(xì)胞分選儀來分離穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞。然后用這些細(xì)胞免疫大鼠。隨后將大鼠淋巴結(jié)與SP2/0細(xì)胞融合并接著進(jìn)行HAP選擇，分離并篩選單個(gè)抗體生產(chǎn)克隆與重組小鼠CD177分子的結(jié)合。鑒定到40個(gè)陽性克隆。隨后純化這些抗體中的一個(gè)抗體并將其生物素化(Y176)以用于確認(rèn)小鼠中表達(dá)⑶177的部位。收集骨髓并與FcBlocking上清液溫育。室溫溫育20分鐘后，使用生物素化的Y176(接著是鏈霉抗生物素蛋白APC)、抗⑶libfitc和抗GRlPE來對(duì)⑶177陽性群進(jìn)行表征。骨髓檢查顯示⑶177在炎性單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)。實(shí)施例18R33(抗人CD177)阻斷了mTREM-1與hCD177轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的結(jié)合如圖25中所示，通過細(xì)胞熒光測定分析來分析人CD177全長轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞?；疑匦螆D代表存在同種型對(duì)照MAb的情況下用可溶性小鼠TREMl/IgG染色的結(jié)果。陰影矩形圖代表存在R33MAb的情況下用可溶性小鼠TREMl/IgG染色的結(jié)果。用對(duì)照可溶性小鼠TLT/IgG染色的結(jié)果用白色矩形圖顯示。數(shù)據(jù)顯示R33MAb特異地阻斷了可溶性小鼠TREMl/IgG與⑶177轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合。實(shí)施例19小鼠⑶177在嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)通過細(xì)胞熒光測定分析來分析小鼠的外周血。該結(jié)果示于圖26中。左圖點(diǎn)狀圖代表小鼠外周血中單核細(xì)胞forwards相對(duì)于大小散布的散點(diǎn)圖。根據(jù)物理學(xué)參數(shù)，構(gòu)建了鑒定不同亞群的三個(gè)門a)淋巴細(xì)胞、b)單核細(xì)胞、c)嗜中性粒細(xì)胞。右圖右側(cè)三個(gè)圖顯示了細(xì)胞的Y176MAb染色。數(shù)據(jù)顯示了Y176MAb特異地識(shí)別其在外周血嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞而非淋巴細(xì)胞上的表位。實(shí)施例20鼠類TREM-I可溶性分子結(jié)合轉(zhuǎn)染鼠類⑶177的293細(xì)胞將單獨(dú)的293細(xì)胞或轉(zhuǎn)染鼠類⑶177的293細(xì)胞與可溶性鼠類TREM-I分子(100ug/ml)在冰上溫育45分鐘，隨后用FACS緩沖液(PBS，2%BCS)洗滌細(xì)胞，用抗人FC生物素在冰上溫育20分鐘，用FACS緩沖液洗滌一次，并與鏈霉抗生物素蛋白APC溫育20分鐘，隨后用FACS緩沖液洗滌，立即將細(xì)胞用于分析。去除死亡細(xì)胞。結(jié)果顯示于圖27中。在矩形圖中，小鼠TREM-I可溶性分子與293/小鼠⑶177轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合以陰影線顯示，而小鼠TREM-I可溶性分子與僅293的結(jié)合以實(shí)線顯示。這提供了證據(jù)表明mTREM-1與表達(dá)于293細(xì)胞上的mCD177結(jié)合。參考文獻(xiàn)1.BeutlerB.Inferences,questionsandpossibilitiesinToll-Iikereceptorsignalling.Nature.2004；430:257_263·2.PasareC,MedzhitovR.Toll-likereceptors-balancinghostresistancewithimmunetolerance.CurrOpinImmunol.2003；15677-682.3.AkiraS.Tollreceptorfami1ies:structureandfunction.Seminlmmunol.2004；161-2.4.TakedaK,AkiraS.TLRsignallingpathways.SeminImmunol.2004；163-9.5.CohenJ.Theimmunopathogenesisofsepsis.Nature.2002；420885-891.6.MurphyTJ,PatersonHM,MannickJA,LedererJA.Injury,sepsis,andtheregulationofToll-likereceptorresponses.JLeukocBiol.2004；75400-407.7.BeutzMA,AbrahamE.Community-acquiredpneumoniaandsepsis.ClinChestMed.2005；2619-28.8.AyalaA,ChungCS,GrutkoskiPS,SongGY.Mechanismsofimmuneresolution.CritCareMed.2003；31:S558_571.9.HotchkissRS,KarlIE.Thepathophysiologyandtreatmentofsepsis.NEnglJMed.2003；348138-150.10.MinnichDJ,MoldawerLL.Anti-cytokineandanti-inflammatorytherapiesforthetreatmentofseveresepsis:progressandpitfalls.ProcNutrSoc.2004；63437-441.11.OpalSM,CrossAS.Clinicaltrialsforseveresepsis.Pastfailures,andfuturehopes.InfectDisClinNorthAm.1999；13285-297,vii.12.ColonnaΜ.TREMsintheimmunesystemandbeyond.NatRevlmmunol.2003；3:445-453.13.BouchonA,DietrichJ,ColonnaM.Cuttingedge:inflammatoryresponsescanbetriggeredbyTREM-I,anovelreceptorexpressedonneutrophilsandmonocytes.JImmunol.2000；164:4991_4995.14.BouchonA,FacchettiF,WeigandMA,ColonnaM.TREM-Iamplifiesinflammationandisacrucialmediatorofsepticshock.Nature.2001；4101103-1107.15.BleharskiJR,KiesslerV,BuonsantiC,等krolefortriggeringreceptorexpressedonmyeloidcells-1inhostdefenseduringtheearly-inducedandadaptivephasesoftheimmuneresponse.JImmunol.2003；1703812-3818.16.NeteaMG,AzamT，F(xiàn)erwerdaG，GirardinSE,KimSH,DinarelIoCA.Triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells-1(TREM-I)amplifiesthesignalsinducedbytheNACHT-LRR(NLR)patternrecognitionreceptors.JLeukocBiol.2006.17.Klesney-TaitJ，TurnbullIR,ColonnaM·TheTREMreceptorfamilyandsignalintegration.NatImmunol.2006；Inpress.18.DawsMR，LanierLL，SeamanWE,RyanJC.CloningandcharacterizationofanovelmousemyeloidDAP12_associatedreceptorfamily.EurJImmunol.2001；31783-791.19.ChungDH，SeamanWE,DawsMR.CharacterizationofTREM-3,anactivatingreceptoronmousemacrophages-definitionofafamilyofsingleIgdomainreceptorsonmousechromosome17.EurJImmunol.2002;32:59_66.20.AllcockRJ,BarrowAD，F(xiàn)orbesS，BeckS,TrowsdaleJ.ThehumanTREMgeneclusterat6p21.1encodesbothactivatingandinhibitorysingleIgVdomainreceptorsandincludesNKp44.EurJImmunol.2003；33567-577.21.VivierE，NunesJA,VelyF.Naturalkillercellsignallingpathways.Science.2004；306:1517_1519.22.LanierLL.Naturalkillercellreceptorsignalling·CurrOpinlmmunol.2003；15:308_314·23.McVicarDW,BurshtynDN.Intracellularsignallingbythekillerimmunoglobulin-likereceptorsandLy49.SciSTKE.2001；2001:REL24.WashingtonAV,SchubertRL，QuigleyL，等ATREMfamilymember,TLT-I,isfoundexclusivelyinthealpha-granulesofmegakaryocytesandplatelets.Blood.2004；104:1042-1047.25.WashingtonAV,QuigleyL，McVicarDW.InitialcharacterizationofTREM-Iiketranscript(TLT)-1:aputativeinhibitoryreceptorwithintheTREMcluster.Blood.2002；100:3822_3824.26.KingRG,HerrinBR,JustementLB.Trem-Iiketranscript2isexpressedoncellsofthemyeloid/granuloidandBlymphoidlineageandisup-regulatedinresponsetoinflammation.JImmunol.2006；1766012-6021.27.CantoniC，BottinoC，VitaleM，等NKp44，atriggeringreceptorinvolvedintumorcelllysisbyactivatedhumannaturalkillercells，isanovelmemberoftheimmunoglobulinsuperfamily.JExpMed.1999；189:787_796·28.JacksonDG,HartDN,StarlingG，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體的衍生物是可溶的。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述配體的衍生物和/或所述受體的衍生物是多價(jià)的。12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述配體的衍生物包含附著到支架上的多個(gè)TREM-1受體結(jié)合區(qū)。13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述受體的衍生物包含附著到支架上的多個(gè)TREM-1配體結(jié)合區(qū)。14.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其包括權(quán)利要求1的步驟b)。15.權(quán)利要求14的方法，其中權(quán)利要求1的步驟b)中所示的活性是促炎細(xì)胞因子或趨化因子的釋放、胞質(zhì)溶膠Ca2+的動(dòng)員或蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中使用報(bào)告系統(tǒng)測定活性。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述報(bào)告系統(tǒng)利用融合蛋白。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述報(bào)告系統(tǒng)測定胞內(nèi)鈣的變化。19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其用作藥物篩選程序的一部分，以鑒定或選擇目的化合物用于進(jìn)一步的分析。20.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中如果測試化合物減少TREM-1配體/衍生物與TREM-1受體/衍生物的結(jié)合和/或其降低通過所述結(jié)合調(diào)節(jié)的活性，那么推斷測試化合物是用于進(jìn)一步分析的目的化合物。21.權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的方法，其中所述藥物篩選程序用于篩選可用于治療炎性疾病如膿毒的化合物。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述藥物篩選程序用于篩選可用于治療微生物膿毒的化合物。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述膿毒是細(xì)菌性或真菌性膿毒。24.能夠阻斷或減少TREM-1配體與TREM-1受體的結(jié)合的化合物在制備治療疾病的藥物中的用途，所述疾病的特征在于一種或多種促炎細(xì)胞因子或趨化因子的釋放。25.能夠阻斷或減少TREM-1配體與TREM-1受體的結(jié)合的化合物在制備治療炎性疾病如膿毒的藥物中的用途。26.權(quán)利要求25的用途，其中所述疾病是微生物膿毒。27.權(quán)利要求25的用途，其中所述疾病是細(xì)菌性或真菌性膿毒。28.權(quán)利要求24到27任何一項(xiàng)的用途，其中所述化合物結(jié)合CD177。29.權(quán)利要求24到28任何一項(xiàng)的用途，其中所述化合物是抗體。30.權(quán)利要求24到27任何一項(xiàng)的用途，其中所述化合物是可溶性形式的CD177或是其可溶性衍生物。31.權(quán)利要求30的用途，其中所述化合物對(duì)于結(jié)合TREM-1受體是多價(jià)的。32.權(quán)利要求24到31任何一項(xiàng)的用途，其中所述化合物是融合蛋白。33.權(quán)利要求32的用途，其中所述融合蛋白包含至少部分免疫球蛋白。34.權(quán)利要求33的用途，其中所述融合蛋白不結(jié)合Fc受體。35.阻斷或降低TREM-1配體表達(dá)的化合物在制備治療疾病的藥物中的用途，所述疾病的特征在于一種或多種促炎細(xì)胞因子或趨化因子的釋放。36.阻斷或降低TREM-1配體表達(dá)的化合物在制備治療炎性疾病如膿毒的藥物中的用途。37.權(quán)利要求36的用途，其中所述疾病是微生物膿毒。38.權(quán)利要求36的用途，其中所述疾病是細(xì)菌性或真菌性膿毒。39.權(quán)利要求35到38任何一項(xiàng)的用途，其中所述化合物阻斷或降低⑶177的表達(dá)。40.權(quán)利要求35到39任何一項(xiàng)的用途，其中所述化合物是反義分子、RNAi分子或核酶。41.權(quán)利要求35到39任何一項(xiàng)的用途，其中所述化合物是TREM-1配體轉(zhuǎn)錄的下調(diào)物或TREM-1配體基因的破壞物。42.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求24到41任何一項(xiàng)中所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。43.化合物，其對(duì)于結(jié)合TREM-1受體或結(jié)合TREM-1配體是多價(jià)的。44.權(quán)利要求43的化合物，其包含附著到支架上的多種可溶性形式的TREM-1配體，或其可溶性衍生物。45.權(quán)利要求44的化合物，其中所述支架來自免疫球蛋白。46.權(quán)利要求43的化合物，其包含附著到支架上的多種可溶性形式TREM-1受體，或其可溶性衍生物。47.權(quán)利要求46的化合物，其中所述支架來自鏈霉抗生物素蛋白。48.非人動(dòng)物，其中遺傳修飾所述動(dòng)物用于相對(duì)于野生型動(dòng)物降低TREM-1或TREM-1配體的表達(dá)。49.權(quán)利要求48的非人動(dòng)物，其是TREM-1配體或TREM-1受體敲除動(dòng)物。50.權(quán)利要求48或權(quán)利要求49的非人動(dòng)物，其中遺傳改造所述動(dòng)物用于降低TREM-3的表達(dá)。51.權(quán)利要求50的非人動(dòng)物，其是TREM-1/TREM-3雙敲除嚙齒類動(dòng)物。52.方法，包括獲得生物學(xué)樣品并分析所述樣品TREM-1配體或TREM-1配體RNA。53.權(quán)利要求52的方法，其包括對(duì)所述TREM-1配體定量或?qū)REM-1配體mRNA或cDNA定量。54.權(quán)利要求53的方法，其包括將所述水平與對(duì)照水平或?qū)?yīng)于健康個(gè)體期望的范圍進(jìn)行比較。55.權(quán)利要求53或權(quán)利要求54的方法，其包括將所述水平與對(duì)照水平或?qū)?yīng)于患有疾病的個(gè)體期望的范圍進(jìn)行比較，所述疾病特征在于一種或多種促炎細(xì)胞因子或趨化因子的釋放。56.權(quán)利要求53或54的方法，其包括將所述水平與對(duì)照水平或?qū)?yīng)患有炎性疾病如膿毒的個(gè)體期望的范圍進(jìn)行比較。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述疾病是微生物膿毒。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述微生物膿毒是細(xì)菌性或真菌性膿毒。59.權(quán)利要求52到58任何一項(xiàng)的方法，其使用針對(duì)TREM-1配體的抗體。60.權(quán)利要求52到58任何一項(xiàng)的方法，其使用與TREM-1配體RNA或cDNA雜交的核酸分子。61.權(quán)利要求52到59任何一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于分析TREM-1配體的可溶性形式，所述方法在包含細(xì)胞外液的樣品上進(jìn)行。62.權(quán)利要求52到60任何一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于分析膜結(jié)合的TREM-1配體，所述方法在包含嗜中性粒細(xì)胞和/或單核細(xì)胞的樣品上進(jìn)行。63.一種方法，包括獲得生物學(xué)樣品并分析所述樣品的TREM-1受體的存在，其中提供所述TREM-1配體可溶性形式或其可溶性變體，并且分析所述樣品中所述可溶性形式或可溶性變體與所述TREM-1受體的結(jié)合。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述可溶性形式或可溶性變體是CD177的可溶性形式或可溶性變體。65.權(quán)利要求63或64的方法，其中所述可溶性形式或可溶性變體是在權(quán)利要求43到47任何一項(xiàng)中描述的化合物。66.抗體，其結(jié)合TREM-1配體，以防止所述配體結(jié)合TREM-1受體或降低該結(jié)合的效率。67.抗體，其結(jié)合所述TREM-1配體，但不結(jié)合在膿毒性嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞上表達(dá)的任何其它細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。68.抗體，其對(duì)TREM-1配體是特異的。69.抗體，其對(duì)結(jié)合TREM-1受體的TREM-1配體的部分是特異的。70.抗體，其相對(duì)于野生型TREM-1配體優(yōu)先結(jié)合TREM-1配體的突變體形式。71.抗體，其對(duì)TREM-1配體的突變體形式是特異的。72.對(duì)細(xì)胞特異的抗體，所述細(xì)胞在其表面上呈遞TREM-1配體或其衍生物。73.權(quán)利要求66到72任何一項(xiàng)的抗體，其中所述TREM-1配體是⑶177。74.用于診斷疾病的試劑盒，所述疾病的特征在于一種或多種促炎細(xì)胞因子或趨化因子的體內(nèi)釋放，其中所述試劑盒包含結(jié)合TREM-1配體或編碼所述配體的核酸的化合物，或者其中所述試劑盒包含結(jié)合所述TREM-1受體的TREM-1配體或其衍生物。75.用于診斷炎性疾病如膿毒的試劑盒，其中所述試劑盒包含結(jié)合TREM-1配體或編碼所述配體的核酸的化合物，或者其中所述試劑盒包含結(jié)合TREM-1受體的TREM-1配體或其衍生物。76.權(quán)利要求75的試劑盒，其中所述疾病是微生物膿毒。77.權(quán)利要求76的試劑盒，其中所述膿毒是細(xì)菌性或真菌性膿毒。78.權(quán)利要求74到77任何一項(xiàng)的試劑盒，其還包含用于檢測結(jié)合的手段。79.權(quán)利要求74到77任何一項(xiàng)的試劑盒，其還包含用于定量結(jié)合的手段。80.權(quán)利要求74到79任何一項(xiàng)的試劑盒，其還包含一種或更多種指示劑，如果存在疾病，則所述指示劑提供可見的變化。81.權(quán)利要求80的試劑盒，其中所述一種或更多種指示劑提供顏色改變或標(biāo)記中的改變。82.權(quán)利要求74到81任何一項(xiàng)的試劑盒，其還包含一個(gè)或更多個(gè)對(duì)照。83.權(quán)利要求74到82任何一項(xiàng)的試劑盒，其包含針對(duì)所述TREM-1配體的抗體。84.權(quán)利要求74到82任何一項(xiàng)的試劑盒，其包含與TREM-lmRNA或TREM_lcDNA雜交的核酸。85.用于鑒定TREM-1配體的突變體形式存在的試劑盒，其中所述試劑盒包含與結(jié)合所述配體的野生型形式相比更強(qiáng)地結(jié)合突變體形式的抗體，或者其中所述試劑盒包含和與編碼所述野生型形式的核酸的雜交相比更強(qiáng)地與編碼所述突變體形式的核酸雜交的核酸。86.權(quán)利要求85的試劑盒，其中所述抗體對(duì)TREM-1配體的突變體形式是特異的，或者其中所述化合物對(duì)編碼所述TREM-1配體的突變體形式的核酸是特異的。87.權(quán)利要求85或權(quán)利要求86的試劑盒，其還包含對(duì)照，所述對(duì)照允許比較與TREM-1配體野生型形式的結(jié)合或與編碼所述配體的核酸的結(jié)合。88.用于獲得抗TREM-1配體抗體的方法，其包括提供TREM-1配體或其衍生物并使用其在非人宿主中產(chǎn)生抗體。89.用于獲得抗TREM-1配體抗體的方法，其包括提供在其表面呈遞TREM-1配體或其衍生物的細(xì)胞并使用它們在非人宿主中產(chǎn)生抗體。90.權(quán)利要求88或權(quán)利要求89的方法，還包括純化所述抗體的步驟。91.用于獲得產(chǎn)生抗TREM-1配體抗體的雜交瘤的方法，其包括a)提供TREM-1配體或其衍生物；b)使用所述配體或衍生物產(chǎn)生B細(xì)胞，所述B細(xì)胞在非人宿主中產(chǎn)生抗TREM-1配體抗體，c)將所述B細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，以產(chǎn)生所述雜交瘤。92.權(quán)利要求88、90或91任何一項(xiàng)的方法，其中所述TREM-1配體或衍生物是基本純的形式。93.權(quán)利要求88到92任何一項(xiàng)的方法，其中所述TREM-1配體是⑶177。94.產(chǎn)生抗TREM-1配體抗體的雜交瘤，其中所述抗體如權(quán)利要求66到73任何一項(xiàng)中所述。95.產(chǎn)生TREM-1配體的嵌合抗體的方法，其包括提供編碼所述嵌合抗體鏈的一種或多種核酸分子并在合適的表達(dá)系統(tǒng)中使用所述一種或多種核酸分子表達(dá)所述嵌合抗體。96.權(quán)利要求95的方法，其中所述表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。97.基本如上文參考所附實(shí)施例和附圖所述的本發(fā)明。全文摘要鑒定了TREM-1配體。這允許提供/鑒定多種衍生物，所述衍生物能夠結(jié)合所述TREM-1受體。所述TREM-1配體或衍生物可用于篩選藥物/藥物候選物。阻斷或減少所述TREM-1配體/衍生物與TREM-1受體結(jié)合的物質(zhì)可用于治療膿毒，尤其是細(xì)菌或真菌起源的膿毒。所述配體的抗體可用于診斷膿毒，尤其是細(xì)菌或真菌起源的膿毒。文檔編號(hào)G01N33/50GK101821621SQ200880106081公開日2010年9月1日申請日期2008年7月23日優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日發(fā)明者J·科勒斯耐-泰特,M·科隆納,P·帕尼納申請人:拜奧克塞爾有限公司