專利名稱：對(duì)丙型肝炎病毒(hcv)感染具有抑制活性的抗體和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性的抗體和其用途。背景領(lǐng)域丙型肝炎病毒(HCV)被發(fā)現(xiàn)和鑒定為非甲型和非乙型肝炎的主要致病病毒(非專 利文獻(xiàn)1)。此外，近年來已建立了用于檢測(cè)HCV的高靈敏性方法，并且由于輸血引起的新 HCV患者的人數(shù)急劇減少。然而，日本的病毒攜帶者人數(shù)據(jù)推測(cè)超過2，000，000人，世界范 圍的數(shù)字超過170，000，000人，包括還未發(fā)生肝炎癥狀的所謂病毒攜帶者。這主要是因?yàn)?由于HCV感染引起的肝炎的慢性率高達(dá)70%至80%，目前除了干擾素外還不存在有效的抗 病毒劑。此外，丙型肝炎是具有不良預(yù)后的嚴(yán)重感染，因?yàn)榇蠹s一半的慢性丙型肝炎患者將 無例外地經(jīng)歷從丙型肝炎至肝硬化和肝癌的癥狀的惡化。因此，目的在于預(yù)防肝炎攜帶者 發(fā)生疾病或消除病毒的抗病毒劑或疫苗的開發(fā)還在等待中。當(dāng)具有包膜的病毒例如HCV感染細(xì)胞時(shí)，病毒首先需要結(jié)合細(xì)胞表面上的特定蛋 白質(zhì)(即，病毒受體)。之后，病毒膜與細(xì)胞膜融合，然后病毒基因被注入細(xì)胞。HCV的治療 和預(yù)防需要可抑制細(xì)胞感染的抗體的開發(fā)。特別地，可阻止HCV結(jié)合細(xì)胞表面上的病毒受 體和侵入細(xì)胞的抗體是非常重要的。HCV包膜蛋白被認(rèn)為在HCV與細(xì)胞表面的結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用。因此，進(jìn) 行了關(guān)于患者的血清中與包膜蛋白反應(yīng)的抗體的檢測(cè)的研究。展示與ClOO抗體(NS4-NS5 抗體)或核心抗體陽(yáng)性反應(yīng)和展示與包膜蛋白抗體陽(yáng)性反應(yīng)的患者的百分比發(fā)現(xiàn)為大約 10%。因?yàn)?1位展示與包膜蛋白抗體陽(yáng)性反應(yīng)的患者中只有3位被天然治愈，因此認(rèn)為這 3位患者中產(chǎn)生了中和抗體(非專利文獻(xiàn)2)。經(jīng)歷中和抗體的產(chǎn)生的患者的百分比低至所 有患者的1%。然而，在急性乙型肝炎的情況下，抗乙型肝炎病毒的包膜蛋白的抗體的產(chǎn)生是 100%，并且病毒被破壞。在HIV的情況下，以很高的頻率檢測(cè)到抗HIV包膜蛋白的抗體。只 在10%的患者中檢測(cè)到抗HCV包膜蛋白的抗體的事實(shí)據(jù)推斷是由于存在可使抗HCV包膜蛋 白的抗體的產(chǎn)生復(fù)雜化的機(jī)制而引起的。(非專利文獻(xiàn)3).同時(shí)，已顯示，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的HCV E2蛋白可特異性結(jié)合存在于人細(xì)胞表 面上的CD81 (非專利文獻(xiàn)4)。通過利用這樣的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，已嘗試展示中和E2蛋白與來自丙 型肝炎患者的CD81的結(jié)合的活性(即，結(jié)合的中和，稱為“NOB”)的抗體的開發(fā)。代表性實(shí)例是展示NOB活性的抗體，其可通過從基因型Ia的慢性丙型肝炎患者的 骨髓淋巴細(xì)胞制備抗體基因文庫(kù)和通過噬菌體展示獲得目的抗體來獲得(專利文獻(xiàn)1)。另 一個(gè)研究小組從基因型Ib的丙型肝炎患者的外周B細(xì)胞制備了雜交瘤并且獲得展示NOB 活性的抗體(非專利文獻(xiàn)5，專利文獻(xiàn)2)。然而，根據(jù)從HCV患者獲得單克隆抗體的上述方法，患者的數(shù)量是有限的，并且來 源限制于其中存在抑制HCV感染的抗體的患者。因此，難以增加抑制感染的抗體的庫(kù)和發(fā) 現(xiàn)用作抗HCV試劑的抗體。此外，已嘗試了其中對(duì)小鼠施用重組包膜蛋白以誘導(dǎo)抗體的方法(專利文獻(xiàn)3)和其中將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以制備產(chǎn)生抗體的雜交瘤從而獲得抗包膜蛋白的抗體 的方法(專利文獻(xiàn)4，非專利文獻(xiàn)6)。然而，抑制HCV感染的抗體仍然未被證實(shí)。作為至于仍然沒有通過用包膜蛋白免疫動(dòng)物來制備中和HCV感染的抗體的原因， 有人認(rèn)為是用于免疫的重組包膜蛋白具有與病毒本身固有的包膜蛋白的結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)。 已有報(bào)導(dǎo)重組包膜蛋白可能經(jīng)歷聚集，從而不能形成天然構(gòu)象(非專利文獻(xiàn)7)。也已證明展示NOB活性的抗體將不總是抑制感染(非專利文獻(xiàn)8)。因此，從通過 使用抗體來治療和預(yù)防HCV的觀點(diǎn)來看，用于有效誘導(dǎo)抗包膜蛋白的能夠抑制病毒感染的 抗體和抑制病毒感染的抗體的方法的開發(fā)是必需的。在上述情況下，近年來已開發(fā)了用于在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中制備感染性HCV顆粒的方 法(專利文獻(xiàn)5，專利文獻(xiàn)6和專利文獻(xiàn)7)。與其中包膜蛋白通過基因重組技術(shù)表達(dá)并且所 得的產(chǎn)物用作抗原的情況相比，HCV顆粒展示傳染性，從而認(rèn)為HCV抗原的構(gòu)象得到維持。 因此，此類HCV顆?？蛇m合作為產(chǎn)生用于抑制HCV感染的抗體的抗原。[專利文獻(xiàn)1]日本專利公開案(kohyo)No. 2005-531286A[專利文獻(xiàn)2]日本專利公開案(kohyo)No. 2006-504645A[專利文獻(xiàn)3]日本專利公開案(kohyo)No. 2004-500366A[專利文獻(xiàn)4]日本專利公開案(kohyo)No. H-06-505389A[專利文獻(xiàn) δ] WO O5O8O575Al[專利文獻(xiàn) 6]W0 06022422A1[專利文獻(xiàn) 7]W0 06096459A2[非專利文獻(xiàn) IjChoo 等，Science, 1989，第 244 卷，pp. 359-362[非專利文獻(xiàn) 2]Matsuura 等，J. Virol.，1992，第 66 卷，pp. 1425-1431[非專利文獻(xiàn) 3] Saito 等，Jikken Igaku, 1991，第 9 卷，pp. 2075-2080[非專利文獻(xiàn) 4]Pileri 等，Science, 1998，第 282 卷，pp. 938-941[非專利文獻(xiàn) 5]Hadlock 等，J. Virol.，2000，第 74 卷，pp. 10407-10416[非專利文獻(xiàn) 6] Suzuki 等，Saishin Igaku, 2003，第 58 卷，pp. 2017-2022[非專利文獻(xiàn)7] Op de Beeck 等，J. Gen. Virol.，2001，第 82 卷，pp. 2589-2595[非專利文獻(xiàn) 8]Burioni 等，J. Virol.，2002，第 76 卷，pp. 11775-11779發(fā)明的公開內(nèi)容發(fā)明解決的問題本發(fā)明的目的是提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染的抗體。解決問題的方法本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)小鼠施用JFH-I株的丙型肝炎病毒(HCV)顆?；騄6CF株與 JFH-I株的嵌合病毒作為抗原，然后測(cè)量已對(duì)其施用了 HCV的小鼠的血清中對(duì)HCV感染的抑 制活性。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)此類HCV顆粒具有對(duì)HCV感染的抑制活性。此外，從已對(duì)其施用了 HCV顆粒的小鼠制備脾細(xì)胞，將脾細(xì)胞融合至小鼠骨髓瘤 細(xì)胞系來制備產(chǎn)生抗體的雜交瘤，評(píng)估由這些雜交瘤產(chǎn)生的抗體對(duì)HCV感染的抑制活性， 并且獲得抑制HCV感染的單克隆抗體。這已導(dǎo)致本發(fā)明的完成。具體地，本發(fā)明包括下列。[1]抗體，其識(shí)別獲自丙型肝炎病毒(HCV)的基因組的丙型肝炎病毒(HCV)顆粒 作為抗原并且對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性的抗體，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)的基因組包括彼此連接的下列(i)和(ii)(i) (a)丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、El蛋 白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列或(b)丙型肝炎病毒(HCV)的J6CF株的 5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列； 禾口(ii) JFH-I株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B 蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(qū)。[2]根據(jù)上述[1]的抗體，其中丙型肝炎病毒(HCV)基因組是包含序列表的SEQ ID NO :1或2中所示的核苷酸序列的核酸(條件是當(dāng)核酸是RNA時(shí)，將核苷酸序列中的“T”讀 作“U”)。[3]根據(jù)上述[1]或[2]的抗體，其中所述抗體類別是IgM。[4]根據(jù)上述[1]至[3]的任一項(xiàng)的抗體，其識(shí)別序列表的SEQ IDNO 24中所示 的氨基酸序列的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。[5]根據(jù)上述[4]的抗體，其具有含有序列表的SEQ ID NO 52中所示的氨基酸序 列的重鏈可變區(qū)。[6]根據(jù)上述[4]至[5]的抗體，其具有含有序列表的SEQ ID NO 54中所示的氨 基酸序列的輕鏈可變區(qū)。[7]根據(jù)上述[4]至[6]的任一項(xiàng)的抗體，其由登錄號(hào)為FERMBP-10982的雜交瘤 細(xì)胞系產(chǎn)生。[8]根據(jù)上述[1]至[3]的任一項(xiàng)的抗體，其識(shí)別含有序列表的SEQID NO 44或 45中所示的氨基酸序列中的至少10連續(xù)氨基酸。[9]根據(jù)上面[8]的抗體，其由登錄號(hào)為FERM BP-10980的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。[10]根據(jù)上述[1]至[3]的任一項(xiàng)的抗體，其識(shí)別含有序列表的SEQID NO :36、 45、46、47或48中所示的氨基酸序列中的至少10連續(xù)氨基酸。[11]根據(jù)上面[10]的抗體，其由登錄號(hào)為FERM BP-10981的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。[12]用于丙型肝炎病毒(HCV)感染的抑制劑，其包含上述[1]至11]的任一項(xiàng)的 抗體作為活性成分。[13]藥物，其包含上述[1]至11]的任一項(xiàng)的抗體作為活性成分。[14]用于丙型肝炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含上述[1]至11]的任一項(xiàng)的抗體作 為活性成分。[15]用于檢測(cè)丙型肝炎病毒(HCV)的方法，其包括使用根據(jù)上述[1]至11]的任 一項(xiàng)的抗體檢測(cè)丙型肝炎病毒(HCV)顆粒。發(fā)明效果本發(fā)明的對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗體和其用途可用于治療或預(yù)防丙型肝炎 以及闡明HCV感染的機(jī)制的研究。附圖概述圖IA顯示已對(duì)其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清抑制基因2a HCV的感 染的活性。圖IB顯示已對(duì)其施用了 J6/JFH-1-HCV的小鼠的血清抑制基因型lb HCV的感 染的活性。
圖2顯示已對(duì)其施用了 JFH-I-HCV顆粒的小鼠的血清抑制基因2aHCV的感染的活性。圖3A顯示已對(duì)其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清IgG級(jí)分抑制HCV感染 的活性。圖3B顯示已對(duì)其施用了 J6/JFH-1-HCV的小鼠的血清IgM級(jí)分抑制HCV感染的活性。圖4顯示抗J6/JFH-1-HCV單克隆抗體對(duì)HCV感染的抑制活性。在圖中，“P. C”表 示未向其中加入抗體的陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果；“N. C”表示未向其中加入感染性HCV顆粒的陰性 對(duì)照的結(jié)果；和“IgG”表示對(duì)照抗體的結(jié)果。圖5顯示抗JFH-I-HCV單克隆抗體對(duì)HCV感染的抑制活性。在圖中，“P. C”表示 未向其中加入抗體的陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果；和“N. C”表示未向其中加入感染性HCV顆粒的陰性 對(duì)照的結(jié)果。圖6A顯示JF/M1-4單克隆抗體對(duì)具有來源于JFH-1E1 (包膜蛋白1)的序列的肽 的結(jié)合強(qiáng)度。圖6B顯示JF/M1-4單克隆抗體對(duì)具有來源于JFH-1E2(包膜蛋白2)的序列 的肽的結(jié)合強(qiáng)度。代表圖6A中的肽編號(hào)53至56和圖6B中肽編號(hào)11和112的條線圖 (vehicles)顯示通過加入PBS而非肽進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。圖7A顯示當(dāng)與具有來源于J6 El (包膜蛋白1)的序列的肽結(jié)合時(shí)，J6/1G11-25 單克隆抗體的結(jié)合強(qiáng)度。圖7B顯示當(dāng)與具有來源于J6E2(包膜蛋白2)序列的肽結(jié)合時(shí)， J6/1G11-25單克隆抗體的結(jié)合強(qiáng)度。代表圖7A中肽編號(hào)53至56和圖7B中肽編號(hào)111和 112的條線圖(vehicles)顯示通過加入PBS而非肽進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。圖8A顯示當(dāng)與具有來源于J6 El (包膜蛋白1)的序列的肽結(jié)合時(shí)，J6/4D4-2單 克隆抗體的結(jié)合強(qiáng)度。圖8B顯示當(dāng)與具有來源于E2(J6包膜蛋白2)的序列的肽結(jié)合時(shí)， J6/4D4-2單克隆抗體的結(jié)合強(qiáng)度。代表圖8A中肽編號(hào)53至56和圖8B中肽編號(hào)111和 112的條線圖(vehicles)顯示通過加入PBS而非肽進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。圖9顯示JF/M1-4單克隆抗體的H鏈可變區(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)和構(gòu)架區(qū)的結(jié)構(gòu) 和其氨基酸序列。該H鏈V區(qū)從N端至C端按順序包含構(gòu)架1 (SEQ ID NO 55)、⑶Rl (SEQ ID NO 56)、構(gòu)架 2 (SEQ ID NO :57)、CDR2 (SEQ ID NO :58)、構(gòu)架 3 (SEQ ID NO :59)、CDR3 (SEQ IDNO 60)和構(gòu)架4 (也稱為J區(qū)段，J區(qū)或J鏈)(SEQ ID NO 61)區(qū)域。

圖10顯示JF/M1-4單克隆抗體的L鏈可變區(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)和構(gòu)架區(qū)的結(jié)構(gòu) 和其氨基酸序列。該L鏈V區(qū)從N端至C端按順序包含構(gòu)架1 (SEQ ID NO 62)、⑶Rl (SEQ ID N0:63)、構(gòu)架2(SEQ ID NO :64)、CDR2 (SEQ ID NO :65)、構(gòu)架 3 (SEQ ID NO :66)、CDR3 (SEQ IDNO 67)和構(gòu)架4 (也稱為J區(qū)段，J區(qū)或J鏈)(SEQ ID NO 68)區(qū)域。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明涉及可通過使用從特定HCV基因組產(chǎn)生的感染性HCV顆粒作為抗原誘導(dǎo)的 并且可抑制HCV感染的抗體。本發(fā)明可通過本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)來進(jìn)行。此類技 術(shù)完整地描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning :ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory (第 3 版，2001)或 EdHarlow 等，Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratoryjIgSS0本文中引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)以全文引用的形式合并入本文。
本說明書包括本申請(qǐng)要求其優(yōu)先權(quán)的日本專利申請(qǐng)案2007-193413中公開的部 分或所有內(nèi)容。(1)感染性HCV顆粒的制備可在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生在本發(fā)明中可用作抗原的感染性HCV顆 粒。用于進(jìn) 行目的的基本技術(shù)描述于 WO 04104198A1、WO 06022422A1、WO 06096459 A2、Wakita， Τ.等，Nat. Med. 11 :791_796，2005，Lindenbach, B. D.等，Science 309 :623_626，2005，和 Pietschmann, T.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，103 :7408_7413，2006。可用于產(chǎn)生感染性HCV顆粒(所述顆粒用于產(chǎn)生本發(fā)明的對(duì)HCV感染具有抑制活 性的抗體)的HCV基因組的特定實(shí)例是基因型2aJFH-l株的病毒基因組RNA，其從5’末端 至3’末端按順序包含5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序 列、P7蛋白編碼序列、NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋 白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(qū)。備選地，此類HCV基 因組可由兩個(gè)或更多類型的HCV株的病毒基因組RNA組成，其從5末端至3’末端按順序包 含除JFH-I外的HCV株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼 序列、P7蛋白編碼序列和NS2蛋白編碼序列和JFH-I株的NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編 碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(qū)。此 夕卜，HCV基因組可由兩個(gè)或更多類型的HCV菌株的病毒基因組RNA組成，其從5’末端至3’ 末端按順序包含除JFH-I株外的HCV株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序 列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列和JFH-I株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序 列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’ 非翻譯區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，HCV基因組是嵌合基因組，其從5’末端至3’末端按 順序包含來源于基因型2a的JFH-I株的全長(zhǎng)基因組(例如，包含如SEQ ID NO=I中所示的 核苷酸序列的基因組)和J6CF株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼區(qū)、El蛋白編碼區(qū)、E2蛋白 編碼區(qū)、P7蛋白編碼區(qū)、NS2蛋白編碼區(qū)的直至N端上氨基酸16的區(qū)域、NS2蛋白編碼區(qū)的 從N端上氨基酸17至C端的區(qū)域、來源于基因型2aJFH-l株的NS3蛋白編碼區(qū)、NS4A蛋白 編碼區(qū)、NS4B蛋白編碼區(qū)、NS5A蛋白編碼區(qū)、NS5B蛋白編碼區(qū)和3’非翻譯區(qū)。其特別優(yōu)選 實(shí)例是被克隆入J6/JFH-1的核酸，包含如SEQ ID NO 2中所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選實(shí)施方案，HCV基因組是包含如SEQ IDNO :1或2中所示的 核苷酸序列的核酸，條件是當(dāng)核酸是RNA時(shí)，將核苷酸序列中的核苷酸“T”讀作“U”。本發(fā) 明的感染性HCV顆粒可通過使用HCV基因組RNA或HCV基因組DNA來產(chǎn)生。特別地，本發(fā)明涉及對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗體，其與作為抗原的HCV顆粒反 應(yīng)，所述HCV顆?？色@自(a)HCV基因組，其從5’末端至3’末端按順序包含JFH-I株的5’ 非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列、NS2 蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼 序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(qū)，或(b)HCV基因組，其從5’末端至3’末端按順序 包含HCV的J6CF株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序 列、P7蛋白編碼序列和JFH-I株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序 列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(qū)(優(yōu)選所述HCV基因組從5’末端至3’末端按順序包含J6CF株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、El 蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列和編碼NS2蛋白編碼區(qū)的直至N端上氨 基酸16的區(qū)域的序列和JFH-I株的編碼NS2蛋白編碼區(qū)的從N端上氨基酸17至C端的區(qū) 域的序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、 NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(qū))。 當(dāng)評(píng)估本發(fā)明的抗體抑制感染的活性時(shí)，除了上述HCV顆粒(a)或(b)夕卜，還可使 用從HCV基因組(c)獲得的HCV顆粒，所述HCV基因組(c)包含按下列順序連接的JFH-I 株的5’非翻譯區(qū)，基因型lb TH株的核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序 列和 p7 蛋白編碼序列(ffakita,T.等，J. Biol. Chem.，269，14205-14210，1994，JP 專利公開 案(kokai)No. 2004-179A)，JFH-I株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編 碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(qū)(優(yōu)選 HCV基因組包含按下列順序連接的來源于JFH-I株的5’非翻譯區(qū)，TH株的核心蛋白編碼序 列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列和編碼NS2蛋白編碼區(qū)的直至N 端上氨基酸33的區(qū)域的序列、編碼NS2蛋白編碼區(qū)的從N端上氨基酸34至C端的區(qū)域的序 列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B 蛋白編碼序列和3’非翻譯區(qū)域)?？赏ㄟ^從包含克隆入轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下游離位點(diǎn)的根據(jù)上述(a)至(C)的任一項(xiàng)的全 長(zhǎng)HCV基因組RNA的cDNA的載體(例如，含有在T7啟動(dòng)子的控制之下的克隆的HCV基因組 RNA的載體)合成RNA，然后將RNA導(dǎo)入細(xì)胞來制備上述感染性HCV顆粒?？墒褂迷噭┖欣?如MEGAscript T7試劑盒(Ambion)，利用含有在Tl啟動(dòng)子的控制之下的克隆的HCV cDNA 的核酸在體外合成RNA。可將RNA導(dǎo)入任何細(xì)胞，只要此類細(xì)胞允許HCV顆粒產(chǎn)生。其實(shí)例 包括Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、IMY-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和293細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞。更優(yōu)選實(shí)例 是肝來源的培養(yǎng)細(xì)胞例如Huh7細(xì)胞。更優(yōu)選實(shí)例包括Huh7細(xì)胞和來源于Huh7細(xì)胞的細(xì)胞 (即，Huh7. 5細(xì)胞和Huh7. 5. 1細(xì)胞)。此外，可使用通過在Huh7細(xì)胞、H印G2細(xì)胞、IMY-N9 細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或293細(xì)胞中表達(dá)CD81和/或密蛋白1基因獲得的細(xì)胞。Huh7細(xì)胞或來 自Huh7細(xì)胞的衍生株細(xì)胞是特別優(yōu)選的。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“衍生株”是指來源于相關(guān)細(xì) 胞的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何已知的方法將RNA導(dǎo)入細(xì)胞。此類方法的實(shí)例包括磷酸沉淀法、 DEAE-葡聚糖法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(lipofection)、顯微注射和電穿孔。脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法 是優(yōu)選的并且電穿孔是更優(yōu)選的。細(xì)胞產(chǎn)生病毒顆粒的能力可利用與釋放在培養(yǎng)液中的構(gòu)成HCV顆粒的因子例如 核心蛋白、El蛋白或E2蛋白反應(yīng)的抗體來評(píng)估。此外，還可使用特異性引物擴(kuò)增培養(yǎng)液中 HCV顆粒中包含的HCV基因組RNA來間接檢測(cè)HCV顆粒的存在?？赏ㄟ^培養(yǎng)以上述方式向其中導(dǎo)入了 HCV RNA的細(xì)胞，向HCV允許細(xì)胞 (permissive cell)(例如，Huh7細(xì)胞)施用(加入)所得的上清液，然后在48小時(shí)后用抗 核心抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色以計(jì)數(shù)被感染的細(xì)胞的數(shù)目來評(píng)估制備的病毒是否具有感 染性。備選地，可通過將細(xì)胞提取物在SDS聚丙烯酰胺凝膠上經(jīng)歷電游，然后通過Western 印跡檢測(cè)核心蛋白來進(jìn)行評(píng)估。
(2)感染性HCV顆粒的純化
將含有在上述(1)中獲得的感染性HCV顆粒的病毒溶液經(jīng)歷例如離心和/或通過 過濾器的過濾來除去細(xì)胞和細(xì)胞殘?jiān)??？墒褂镁哂?00，000至500，000的分子截?cái)嘀档某?濾性膜將已從其除去殘?jiān)娜芤簼饪s大約10至100倍?？梢砸匀我饨M合或單獨(dú)地通過層 析和密度梯度離心純化已從其除去殘?jiān)暮蠬CV的溶液。此后，描述了代表性的層析或 密度梯度離心技術(shù)，雖然技術(shù)不限于此。優(yōu)選使用含有丙烯基葡聚糖和N，N' _亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物作為凝膠 基質(zhì)的層析載體來進(jìn)行凝膠過濾層析，更優(yōu)選通過使用Sephacryl s-300、s-400和s-500 層析來純化HCV顆粒?？墒褂?，優(yōu)選Q_Sepharose 作為陰離子交換樹脂以及SPSepharose 作為陽(yáng)離
子交換樹脂進(jìn)行離子交換層析來純化HCV顆粒。優(yōu)選可使用樹脂作為載體進(jìn)行親和層析，所述樹脂包含與其結(jié)合的選自肝素、 硫酸化cellulofine、凝集素和各種染料的基質(zhì)作為純化HCV顆粒的配體。更優(yōu)選，可 通過使用載體來純化HCV顆粒，所述載體包含與其結(jié)合的HiTrapH印arin HP , HiTrap Blue HP s HiTrapBenzamidine FF 、硫酸化 cellulofine、LCA、ConA、RCA_120 和 WGA。最 優(yōu)選方法是通過使用硫酸化cellulofine作為載體來純化HCV顆粒。根據(jù)HCV RNA拷貝數(shù) 對(duì)溶液中總蛋白質(zhì)量的比率，HCV顆?？杀患兓?0倍或更多倍。優(yōu)選可利用糖聚合物例如氯化銫、蔗糖、Nycodenz 、Ficoll 或pereQii 作
為產(chǎn)生密度梯度的溶質(zhì)來進(jìn)行通過密度梯度離心的純化。優(yōu)選還可使用蔗糖。優(yōu)選，可使 用水或緩沖液例如磷酸鹽緩沖液、Tris、乙酸鹽或甘氨酸緩沖液。在通過密度梯度離心進(jìn)行 純化時(shí)使用的離心力優(yōu)選是1 X IO4至1 X IO9g,更優(yōu)選5 X IO4至1 X IO7g,和最優(yōu)選5 X IO4 至 5X105g。優(yōu)選在0°C至40°C，更優(yōu)選0°C至25°C和最優(yōu)選0°C至10°C下進(jìn)行純化。當(dāng)通過密度梯度離心與柱離層析組合進(jìn)行純化時(shí)，此類技術(shù)可以以任何順序進(jìn) 行。優(yōu)選，首先通過復(fù)數(shù)個(gè)層析柱，然后進(jìn)行密度梯度離心來純化HCV顆粒。更優(yōu)選，將 通過陰離子交換柱層析，然后親和層析獲得的HCV顆粒經(jīng)歷通過密度梯度離心進(jìn)行純化。 最優(yōu)選，通過將用Q-Sepharose 柱獲得的含有HCV顆粒的級(jí)分進(jìn)一步使用基于硫酸化 cellulofine的柱子進(jìn)行純化，然后通過密度梯度離心純化所得的含有HCV顆粒的級(jí)分。在 柱層析和密度梯度離心的步驟過程中，可進(jìn)行透析或超濾以置換含有HCV顆粒的溶液的溶 質(zhì)和/或濃縮HCV顆粒。(3)感染性HCV顆粒的滅活本發(fā)明的抗體與作為抗原的HCV顆粒反應(yīng)。當(dāng)產(chǎn)生本發(fā)明的抗體時(shí)，HCV顆粒的感染性與抗原性無關(guān)，雖然滅活的HCV顆粒的使用是優(yōu)選的?？赏ㄟ^在例如病毒懸浮液中 加入和混合滅活劑例如福爾馬林、β-丙內(nèi)酯或戊二醛并且讓滅活劑與病毒反應(yīng)來滅活感 染性HCV顆粒(Appaiahgari等，Vaccine, 22 =3669-3675,2004)。此外，可用紫外線照射感 染性HCV顆粒以消除病毒的感染性，病毒可被立即滅活。利用紫外線的照射實(shí)現(xiàn)了病毒的 滅活而對(duì)構(gòu)成病毒的蛋白質(zhì)幾乎沒有影響。用于滅活的紫外線的來源可以是商購(gòu)獲得的殺 菌燈(germicidallamp)。具體地，可使用15w殺菌燈，盡管來源不限于其。在本發(fā)明中，使用通過上述方法純化的HCV顆粒，滅活的方法不受純化的或未純化的狀態(tài)限制。優(yōu)選，可在室溫下以20mW/cm2的紫外線照射含有感染性HCV顆粒的溶液，進(jìn)行至少5分鐘以滅活感染 性HCV顆粒。(4)動(dòng)物的免疫可通過對(duì)動(dòng)物施用HCV顆粒以通過免疫反應(yīng)誘導(dǎo)抗體來獲得本發(fā)明的抗體。任何 可產(chǎn)生能夠產(chǎn)生雜交瘤的脾細(xì)胞的非人動(dòng)物(非人哺乳動(dòng)物)例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠或兔子 可用于免疫。在本發(fā)明中，小鼠是優(yōu)選的，牽涉小鼠的使用的實(shí)例在下面進(jìn)行了描述。通常，可用上述步驟⑴至(3)中獲得的HCV顆?？乖庖?至10周齡的小鼠。根 據(jù)情況，可改變或省略純化步驟，以及可省略病毒滅活。通常，通過皮下或腹膜內(nèi)施用具有 佐劑的抗原數(shù)次來進(jìn)行免疫。佐劑的實(shí)例包括但不限于弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑、含 有百日咳疫苗的S氧化招凝膠(aluminum hydroxide gel with pertussisvaccine)、Titer Max Gold(Vaxel)和GERBU佐劑(GERBU Biotechnik)。在不使用佐劑的情況下進(jìn)行終免疫， 靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用抗原，然后按照已知的方法(Antibodies =A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory，1988)在HCV顆粒的最終施用后3至10天，優(yōu)選4天從免疫小 鼠的血清中獲得多克隆抗體。免疫動(dòng)物是否產(chǎn)生本發(fā)明的抗體可通過在終免疫前通過從免 疫動(dòng)物的眼底或尾靜脈(caudal vein)的靜脈叢采集血液樣品，然后測(cè)量抑制用作抗原的 HCV的感染的活性來檢察。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。此外，本發(fā) 明的抗體可來源于任何生物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。本發(fā)明的抗體可以是嵌合抗體(例 如人抗體與來源于其他哺乳動(dòng)物的嵌合抗體)。特別優(yōu)選嵌合抗體的實(shí)例是通過將小鼠抗 體的高變區(qū)上的序列移植入人抗體獲得的人源化抗體。本發(fā)明的抗體可以是具有人抗體的 構(gòu)架區(qū)和來源于其他哺乳動(dòng)物的抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)(包括高變區(qū))的嵌 合抗體。(5)產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備當(dāng)制備本發(fā)明的抗體，特別地當(dāng)制備單克隆抗體時(shí)，從免疫動(dòng)物取出脾，將脾細(xì)胞 與骨髓瘤細(xì)胞融合以制備雜交瘤細(xì)胞。可在體外繁殖的任何骨髓瘤細(xì)胞都可用于細(xì)胞融 合。其實(shí)例包括小鼠來源的已建立的細(xì)胞例如抗8-氮雜鳥嘌呤小鼠(BALB/c-來源的) 骨髓瘤細(xì)胞 P3-X63Ag8-Ul (P3-U1)、SP2/0_Agl4 (SP2/0)、P3_X63_Ag8653 (653)、P3_X63_Ag 8 (X63)禾口 P3/NSl/l-Ag4-l (NSl)。此類細(xì)胞系可從 RIKENBioResource Center，ATCC (美 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)或ECACC(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心商購(gòu)獲得。按照常規(guī)技術(shù) (Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988, Selected Methods inCellular Immunology W. H. Freeman and Company, 1980)進(jìn)行培養(yǎng)禾口傳代培養(yǎng)。清洗上面獲得的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞以1 1至10的 比例混合，將聚乙二醇加入其中以進(jìn)行細(xì)胞融合。聚乙二醇能夠融合細(xì)胞，具有較小細(xì)胞 毒性的聚乙二醇是優(yōu)選的，例如，優(yōu)選可使用聚乙二醇-1500(PEG-1500)。在細(xì)胞融合后， 在培養(yǎng)基中懸浮和清洗細(xì)胞。使用用于骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基例如Dulbecco' s改良 MEN培養(yǎng)基或RPMI-1640清洗細(xì)胞。選擇用于融合的細(xì)胞的培養(yǎng)基以選擇性獲得目的融合 細(xì)胞，這樣的培養(yǎng)基的實(shí)例是通過向HAT培養(yǎng)基(通過向用于骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基例 如Dulbecco' s改良MEN培養(yǎng)基中加入2-巰基乙醇(5X I(T5M)、青霉素(100單位/ml)、鏈霉素(lOOyg/ml)和牛血清(FCS) (10%, Invitrogen)制備的培養(yǎng)基)中加入次黃嘌呤 (IO-4M)、胸苷(1.5 X IO-5M)和氨基蝶呤(4X IO-7M)而制備的培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)后，分離部分培養(yǎng)上清液，通過HCV感染檢測(cè)選擇產(chǎn)生抑制HCV感染的抗體 的細(xì)胞。備選地，可通過酶免疫測(cè)定選擇產(chǎn)生與HCV蛋白反應(yīng)的抗體的細(xì)胞。隨后，通過在 甲基纖維素培養(yǎng)基中有限稀釋(limiting dilution)或集落形成來進(jìn)行克隆，選擇已被證 明產(chǎn)生與HCV蛋白反應(yīng)的抗體和對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗體的細(xì)胞作為單克隆產(chǎn)生抗 體的雜交瘤細(xì)胞系。(6)對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗HCV單克隆抗體的選擇可通過如下或如下面實(shí)施例中所描述的使用感染性HCV顆粒測(cè)定對(duì)HCV感染的抑 制活性的方法來選擇產(chǎn)生對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗HCV單克隆抗體的雜交瘤。開始時(shí)，將感染性HCV顆粒(用于產(chǎn)生所述顆粒的方法描述于上文)與抗體樣品 混合，使反應(yīng)在37°C下進(jìn)行1小時(shí)。向前一天以5 X IO3個(gè)細(xì)胞/孔在96孔板上培養(yǎng)的Huh7 細(xì)胞中加入樣品(50 μ 1)，然后在37°C下進(jìn)行培養(yǎng)2. 5小時(shí)。在培養(yǎng)后，除去樣品，用PBS 清洗細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。48小時(shí)后除去培養(yǎng)上清液，用PBS清洗細(xì)胞一次， 加入100 μ 1ISOGEN (Nippon Gene)，從細(xì)胞制備RNA，定量RNA，然后測(cè)量HCV基因組RNA的 量。按照 Takeuchi 等(TakeuchiT.等，Gastroenterology，116 :636_642，1999)的方法通 過定量RT-PCR，通過檢測(cè)HCV RNA的5'末端非翻譯區(qū)的RNA來檢測(cè)HCV RNA。備選地，可通過下列方法評(píng)估對(duì)HCV感染的抑制活性。開始時(shí)，將抗體樣品與感染 性HCV顆?；旌希缓髮⑺玫幕旌衔镌?7°C下經(jīng)歷反應(yīng)，進(jìn)行1小時(shí)。隨后，向前一天已以 1 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔在96孔板上培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞中加入樣品(50 μ 1)，然后在37°C下進(jìn)行培 養(yǎng)2.5小時(shí)。在培養(yǎng)后，除去樣品，用PBS清洗細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在72小時(shí) 后除去上清液，向板中引入冰冷的甲醇，固定細(xì)胞。之后，通過空氣干燥除去甲醇，通過使用 ^Wo. 3%Triton -χ 100 (GE Healthcare)白勺 Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)透化細(xì)胞。使用克隆 2H9 抗 HCV-核心抗體(Nat Med.，2005，11 :ρρ· 791-6)和 山羊抗小鼠 IgG-Alexa488 (Molecular Probes)，在熒光顯微鏡 IX-70 ；Olympus)下計(jì)數(shù)HCV 感染的細(xì)胞的數(shù)目，其中HCV感染被抑制的孔中的樣品稱為陽(yáng)性克隆。從而，可選擇靶雜交 瘤。所選擇的由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的抗體。產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的雜交瘤不受特別限制，只要此類雜交瘤可以以上述方式選 擇。登錄號(hào)為FERM BP-10980、登錄號(hào)為FERM BP-10981和登錄號(hào)為FERM BP-10982的雜 交瘤細(xì)胞系是優(yōu)選的。將雜交瘤細(xì)胞系J6/1G11_25(登錄號(hào)FERM BP-10980 ；從2007年 7 月 19 日保藏的登錄號(hào)=FERM P-21318(受理號(hào)(Receipt Number) =FERM AP-21318)轉(zhuǎn)移 至國(guó)際保藏的)、J6/4D4-2(登錄號(hào)FERM BP-10981 ；從2007年7月19日保藏的登錄號(hào) FERM P-21319(受理號(hào)FERM AP-21319)轉(zhuǎn)移至國(guó)際保藏的)和JF/M1_4(登錄號(hào)FERM BP-10982 ；從2007年7月19日保藏的登錄號(hào)FERM P_21320(受理號(hào)FERM AP-21320)轉(zhuǎn)移 至國(guó)際保藏的)從2007年7 月 19 日起保藏在 International Patent Organism Depositary ofthe National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6，l-l-lHigashi，Tsukuba，Ibaraki,305-8566，Japan)。優(yōu)選可將此類雜交瘤細(xì)胞系在 37°C 下培養(yǎng)于通過向Dulbecco' s改良Eagle培養(yǎng)基(高葡萄糖)中加入ImM丙酮酸鈉、55 μ M 2-巰基乙醇和10%胎牛血清而制備的培養(yǎng)基中。
為了分析以上述方式選擇的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的本發(fā)明的抗體的表位，可使用基 于HCV蛋白的酶免疫測(cè)定(EIA)、Western印跡法、斑點(diǎn)印跡法或其他方法。通過進(jìn)行用于 抗HCV單克隆抗體的初篩的此類表位分析，可有效地篩選靶向給定的HCV蛋白的抗HCV單 克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗體識(shí)別氨基酸序列 WLTPKCLVHYPYRLffHYPC(SEQ ID NO 24)或包含 HCV(特別地，HCV 的 Ji7H-I 株)的 E2 蛋白的 WLTPKCLVHYPYRLffHYPC(SEQ ID NO 24)的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列為表位。包 含WLTPKCLVHYPYRLWHYPC中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列優(yōu)選是LVHYPYRLWH (SEQ ID NO :18)、WLTPKCLVHY(SEQ ID NO 19), PKCLVHYPYR (SEQ ID NO 20)或 YPYRLWHYPC (SEQ ID NO 21)，以LVHYPYRLWH (SEQ ID NO 18)為更優(yōu)選。識(shí)別HCV E2蛋白的氨基酸序列的 NFTIFKIRMY(SEQ ID NO 22)或 IFKIRMYVCG(SEQID NO 23)為表位的抗體是根據(jù)本發(fā)明的 更優(yōu)選的對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗體。在本說明書中，例如，術(shù)語(yǔ)“E1蛋白的氨基酸1 至162”是指El蛋白質(zhì)的氨基酸序列中從氨基酸1至162的區(qū)域。同樣地，要類似地理解 代表蛋白質(zhì)或核酸的一部分的相似表述。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的抗體的實(shí)例是具有含有如SEQ IDNO 52中所示的 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體。此外，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的抗體的另一個(gè)實(shí)例 是具有含有如SEQ ID NO :54中所示的氨基酸的輕鏈可變區(qū)的抗體。具有含有如SEQ ID NO :52中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有如SEQ ID NO :54中所示的氨基酸序列的 輕鏈可變區(qū)的抗體(優(yōu)選單克隆抗體)是更優(yōu)選的。這樣的單克隆抗體的實(shí)例在下面的實(shí) 施例中被描述為JF/M1-4單克隆抗體。具有含有如SEQ ID NO :52中所示的氨基酸序列的 重鏈可變區(qū)和/或含有如SEQ ID NO :54中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體可以是 來源于任何生物的抗體，優(yōu)選來源于哺乳動(dòng)物的抗體，更優(yōu)選人抗體或嵌合抗體。可使用通 過將來源于任意生物(例如可容易地進(jìn)行基因工程改造的小鼠)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū) 或其互補(bǔ)決定區(qū)(高變區(qū))移植入來源于有待對(duì)其施用目的抗體的生物(例如，人)的抗 體(優(yōu)選單克隆抗體)的等同位置獲得的嵌合抗體。嵌合抗體的特別優(yōu)選實(shí)例是通過將小 鼠抗體的高變區(qū)(也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) ”)的序列移植入人抗體的相關(guān)位置而獲得的 人源化抗體。本發(fā)明的抗體可包含來源于JF/M1-4單克隆抗體的分別具有SEQID NOs :56、58 和60的氨基酸序列的CDRl、CDR2和CDR3作為H鏈V區(qū)(即，重鏈可變區(qū))的互補(bǔ)決定區(qū) (⑶R)。同樣地，本發(fā)明的抗體可包含來源于JF/M1-4單克隆抗體的分別具有SEQ ID NOs 63,65和67的氨基酸序列的⑶R1、⑶R2和⑶R3作為L(zhǎng)鏈V區(qū)(S卩，輕鏈可變區(qū))的互補(bǔ) 決定區(qū)(⑶R)。根據(jù)另外的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體可包含分別具有SEQ ID NOs :56、 58和60的氨基酸序列的⑶R1、⑶R2和⑶R3作為H鏈V區(qū)(即，重鏈可變區(qū))的互補(bǔ)決定 區(qū)(CDR)，和分別具有SEQ ID NOs :63、65和67的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3作為L(zhǎng) 鏈V區(qū)(即，輕鏈可變區(qū))的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此類抗體可在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中包含任何構(gòu)架1至4區(qū)。此類抗體也包含來源于除了小鼠以外的生物的任何抗體類型的 構(gòu)架1至4區(qū)(例如，人來源的構(gòu)架1至4區(qū))。具有來源于JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V 區(qū)的⑶Rl至⑶R3和/或L鏈V區(qū)的⑶Rl至⑶R3的此類抗體顯示抑制基因型2a HCV顆 粒的感染的活性。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，對(duì)HCV感染具有抑制活性的更優(yōu)選抗體識(shí)別包含 HCV (特別地，J6CF株的HCV)的E2蛋白的氨基酸序列NVTNPEDMPRPYCW(SEQ ID NO 44)或 NYTIHQRMYVGG(SEQ ID NO 45)中至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列為表位。包含氨 基酸序列 NVTNPEDMPRPYCW(SEQ ID NO :44)或NYTIFKIRMYVGG(SEQ ID NO 45)中至少 10 個(gè) 連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列的實(shí)例包括NVTNPEDMRP (SEQ ID NO 29)、NPEDMRPYCff (SEQ ID NO :30)、NYTIFKIRMY(SEQ ID NO 31)禾口 IFKIRMYVGG(SEQ ID NO :32)。根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施方案，對(duì)HCV感染具有抑制活性的更優(yōu)選抗體識(shí)別這樣 的氨基酸序列為表位，所述氨基酸序列包含HCV(特別地，J6CF株的HCV)的El蛋白的氨 基酸序列 FIVSPQHHWFVQDCNC (SEQ ID NO :46)或 MAWDMMMNWS (SEQID NO 36)中至少 10 個(gè) 連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列或E2蛋白的氨基酸序列LIDYPYRLWHYPC(SEQ ID NO 47)、 NPEDMRPYCffHYPPRQ (SEQ ID NO :48)或 NYTIFKIRMYVGG (SEQID NO :45)。各自包含 E2 蛋白 的 FIVSPQHHWFVQDCNC(SEQ ID NO 46), MAffDMMMNWS(SEQ ID NO 36), LIDYPYRLffHYPC(SEQ IDNO 47), NPEDMRPYCffHYPPRQ (SEQ ID NO 48)或 NYTIFKIRMYVGG (SEQ ID NO 45)中的氨 基酸序列的至少10個(gè)氨基酸的氨基酸序列的實(shí)例包括El來源的表位的FIVSPQHHWF(SEQ IDNO :33)、SPQHHWFVQD(SEQ ID NO 34) ,HHWFVQDCNC (SEQ IDNO 35)和 MAWDMMMNWS (SEQ ID NO :36)。E2-來源的表位的實(shí)例包括 LIDYPYRLWH(SEQ ID NO 37) ,YPYRLffHYPC (SEQ ID NO: 38),DMRPYCffHYP(SEQ ID NO 39),NPEDMRPYCff(SEQ ID NO 40)和 PYCWHYPPRQ(SEQ ID NO: 41)。
為了選擇本發(fā)明的抗體，更特別地，將HCV蛋白固定在載體(S卩，固相化)上，然后 向其加入抗體樣品，然后讓反應(yīng)在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件下進(jìn)行一定的時(shí)間。 隨后，將所形成的復(fù)合物與識(shí)別已與信號(hào)酶、染料或放射性同位素結(jié)合的抗體樣品的抗體 (即，二抗)接觸從而形成第二混合物。將第二混合物在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件 下經(jīng)歷反應(yīng)進(jìn)行一定的時(shí)間。借助于酶、染料或放射性同位素檢測(cè)識(shí)別HCV蛋白的抗體的 存在?？扇鐚CV蛋白固定至載體上那樣使用HCV顆粒。備選地，可使用利用包含HCV 基因組的核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列、NS2蛋 白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序 列或NS5B蛋白編碼序列的cDNA在大腸桿菌(E. Coli)、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等中 表達(dá)的蛋白質(zhì)。此外，可化學(xué)合成和使用此類蛋白。有待用于固定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列 的長(zhǎng)度不受限制，這樣的長(zhǎng)度是3個(gè)或更多個(gè)氨基酸，更優(yōu)選8個(gè)氨基酸。其中作為JFH-株或J6CF株的包膜蛋白的El蛋白和E2蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表 達(dá)的實(shí)例在下面進(jìn)行了描述。當(dāng)氨基酸1如于全長(zhǎng)JFH-I蛋白的氨基酸序列(NCBI蛋白質(zhì) 登錄號(hào)BAB32872)的起始甲硫氨酸時(shí)，JFH-株或J6CF株的El蛋白始于氨基酸192和終于 氨基酸383。El蛋白的從氨基酸353至氨基酸383的區(qū)域被認(rèn)為是跨膜結(jié)構(gòu)域(也稱為“C 末端疏水結(jié)構(gòu)域”)(Cocquerel, L.等，J. Virol. 74 :3623_3633，2000)。JFH-I株或J6CF株的E2蛋白始于上述氨基酸序列的氨基酸384并且終于氨基酸 750。E2蛋白的從氨基酸722至氨基酸750的區(qū)域被認(rèn)為是跨膜結(jié)構(gòu)域(Cocquerel，L.等， J. Virol. 74 :3623_3633，2000)。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)分泌入和表達(dá)于培養(yǎng)上清液時(shí)，此類蛋白質(zhì)必需具有信號(hào)肽，但它們不必具有跨膜結(jié)構(gòu)域。因此，不具有El或E2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)包含從氨基酸192至氨基酸352 的區(qū)域或從氨基酸384至氨基酸721的區(qū)域。氨基酸位置的偏移不是問題，只要氨基酸在性 質(zhì)上等同即可。在本發(fā)明中，JFH-I株的El蛋白的從氨基酸192至氨基酸352的序列，E2 蛋白的從氨基酸384至氨基酸720的序列(和優(yōu)選從氨基酸384至氨基酸714的序列)，和 J6CF株的El蛋白的從氨基酸192至氨基酸352的序列，和E2蛋白的從氨基酸384至氨基 酸720的序列可用作不包含跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。當(dāng)此類氨基酸編號(hào)用于其他序列時(shí)，可 用在與全長(zhǎng)JFH-I蛋白的氨基酸序列的比對(duì)(alignment)中相應(yīng)的氨基酸編號(hào)命名序列?；贕enBank中給定的JFH-I的氨基酸序列，可使用JFH-I的cDNA作為模板通過 PCR合成編碼不含有El或E2蛋白的任何跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的核酸，或可完全合成此類核 酸。可通過比對(duì)序列(進(jìn)行比對(duì))來容易地確定除了 JFH-I外的HCV株的相應(yīng)的 El和E2蛋白區(qū)域，從而在考慮HCV株的序列的置換或缺失的情況下，比對(duì)的序列的長(zhǎng)度 在與JFH-I序列比較中變得最長(zhǎng)。可使用遺傳信息處理軟件(例如，GENETYX, Software Development Co.，Ltd.)進(jìn)行此類分析。當(dāng)不包含El或E2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被分泌和表達(dá) 時(shí)，將編碼此類蛋白質(zhì)的核酸以使密碼子的讀框正確排列(即，符合讀框)的方式與編碼 信號(hào)肽的核酸的下游位點(diǎn)連接，將終止密碼子加至3'末端，然后將所得的核酸插入表達(dá)載 體。信號(hào)肽主要由疏水氨基酸組成，其包含位于分泌蛋白的N端的至少15至30個(gè)氨基酸 殘基，信號(hào)肽與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜的機(jī)制相關(guān)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌和表達(dá)的信號(hào)肽可以是分泌蛋白的信號(hào)肽。 具有信號(hào)肽的載體的實(shí)例包括具有小鼠GM-CSF的信號(hào)肽序列的載體(日本專利公開案 (kokai)No. S63-276490A (1988))、具有 IgG κ 鏈的信號(hào)肽序列的 pSecTag/FRT/V5_His 載 體(Invitrogen)、具有前原胰蛋白酶(pr印rotrypsin)的信號(hào)肽序列的p3xFLAG_CMV13載 體(Sigma)、具有IL-2的信號(hào)肽序列的pFUSE_Fc2載體(InvivoGen)和具有IgM的信號(hào)肽 序列的 pTriEx-7 載體(Novagen)。當(dāng)表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，此類蛋白以靶蛋白與標(biāo)記蛋白的融合蛋白的形式表達(dá)，可利用 與標(biāo)記蛋白或分子反應(yīng)的抗體(所述標(biāo)記蛋白或分子特異性結(jié)合至其)來檢測(cè)或純化融合 蛋白。此類標(biāo)記蛋白也稱為“標(biāo)簽(tag)”。標(biāo)記蛋白不受限制，其實(shí)例包括FLAG肽(也稱 為 flag 肽或 Flag 肽)、3x FLAG 肽(也稱為 3x FLAG 肽、3x Flag 肽或 3x flag 肽)、HA 肽、 3x HA肽、myc肽、6x His肽、GST多肽、MBP多肽、PDZ結(jié)構(gòu)域多肽、堿性磷酸酶、免疫球蛋白 和抗生物素蛋白。通常將此類肽或多肽融合至靶蛋白的N或C末端，但也可根據(jù)需要將此 類肽或多肽插入靶蛋白內(nèi)。具有前原胰蛋白酶信號(hào)肽和3x FLAG肽的融合多肽的載體可以 p3xFLAG-CMV-9載體的形式從Sigma商購(gòu)獲得。(7)單克隆抗體的制備使上述(6)中選擇的雜交瘤適應(yīng)無血清培養(yǎng)基例如雜交瘤-SFM(Invitrogen),可 將無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的上清液指定為單克隆抗體樣品?？墒褂脽俊⑴囵B(yǎng)皿、旋動(dòng)培養(yǎng) 瓶、轉(zhuǎn)瓶或高密度培養(yǎng)瓶(CELLine, Becton, Dickinson and Company)進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)從動(dòng)物制備單克隆抗體時(shí)，將上面獲得的抗HCV單克隆產(chǎn)生抗體的雜交瘤以2X IO7至5X IO6個(gè)細(xì)胞/小鼠腹膜內(nèi)注射入姥鮫烷(pristane)處理的8至10周齡的小鼠、裸小鼠或SCID小鼠(腹膜內(nèi)注射0.5ml 2，6，10，14-四甲基五烯(姥鮫烷)并且生長(zhǎng)2 周)。雜交瘤在10至21天內(nèi)經(jīng)歷腹水瘤形成。從小鼠或裸小鼠中采集腹水樣品來制備單 克隆抗體樣品。將獲得的抗體樣品離心以除去細(xì)胞或破碎的細(xì)胞，使樣品經(jīng)歷使用40%至 50%的飽和硫酸銨的鹽析，辛酸沉淀、DEAE-瓊脂糖柱、A蛋白柱、G蛋白柱、HiTrap IgM純 化HP-柱(GE Healthcare)、甘露聚糖結(jié)合蛋白-柱(Pierce)或凝膠過濾注，單獨(dú)地或以適 當(dāng)?shù)慕M合進(jìn)行此類技術(shù)來回收IgG或IgM級(jí)分。從而獲得純化的單克隆抗體。可使用例如 小鼠單克隆抗體分型試劑盒(Pierce)來確定純化的單克隆抗體亞類。上述(4)至(7)中 獲得的本發(fā)明的對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗體的種類不受特別地限制。在本發(fā)明中，IgG 或IgM是優(yōu)選的，IgM抗體為更優(yōu)選。(8)人源化抗HCV單克隆抗體的制備人源化抗體也稱為改型(reshaped)人抗體，此類改型人抗體通過將哺乳動(dòng)物而 非人(例如，小鼠抗體)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植入人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)來獲得，一般基因 重組技術(shù)是已知的(EP專利公開案EP 125023)。特別地，使用經(jīng)制備從而具有在⑶R和FR 的末端區(qū)域重疊的區(qū)域的幾種寡核苷酸引物，通過PCR來合成被設(shè)計(jì)來將小鼠抗體的⑶R 連接至人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)的DNA序列。選擇通過互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)連接的人抗體(其中⑶R形成良好的抗原結(jié)合位點(diǎn)) 的構(gòu)架區(qū)。根據(jù)需要，可置換抗體可變區(qū)中構(gòu)架區(qū)中的氨基酸，以使改型人抗體的CDR形成 適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合位點(diǎn)(Sato, K.，等，Cancer Res. 53 :851_856，1993)。當(dāng)制備本發(fā)明的對(duì)HCV感染具有抑制活性的人源化抗HCV單克隆抗體時(shí)，例如，首 先以下列方式獲得編碼抗HCV單克隆抗體的H鏈V區(qū)(VH)和L鏈V區(qū)(VL)的cDNA。從產(chǎn) 生抗HCV單克隆抗體的雜交瘤提取mRNA以合成cDNA。將合成的cDNA插入噬菌體或質(zhì)粒載 體以制備cDNA文庫(kù)。利用小鼠的C或V區(qū)作為探針從所得的文庫(kù)分離具有編碼VH的重組 噬菌體或質(zhì)粒以及具有編碼VL的cDNA的重組噬菌體或質(zhì)粒。確定重組噬體或質(zhì)粒上靶抗 體的VH和VL的完整核苷酸序列，基于核苷酸序列推導(dǎo)VH和VL的完整氨基酸序列。備選地，可通過PCR克隆編碼VH和VL的cDNA。將以上述方式制備的雜交瘤的 cDNA用作模板，使用復(fù)數(shù)個(gè)基于在相關(guān)基因中保守的氨基酸序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增模板，將 cDNA片段克隆入克隆性載體。從而，可獲得編碼VH和VL的cDNA?？蓪⒕幋a抗HCV抗體的VH和VL的cDNA插入編碼人抗體的H鏈C區(qū)(CH)和L鏈 C區(qū)(CL)的基因的上游區(qū)域來構(gòu)建編碼人源化抗HCV單克隆抗體的cDNA。在CH中，可使 用Cy1、CY2、CY3禾口 CY4，在CL中，可使用CK禾口 C λ。為了提高抗體的穩(wěn)定性或其產(chǎn) 量，可修飾C區(qū)。在哺乳動(dòng)物的情況下，可將在哺乳動(dòng)物中表達(dá)目的基因的啟動(dòng)子、待表達(dá)的抗體 和poly A信號(hào)與3’末端下游位點(diǎn)有效連接。可使用其表達(dá)目的基因?？墒褂玫膯?dòng)子的 實(shí)例包括病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，例如人巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴 病毒40 (SV40)和來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子例如延伸因子1 α (EFl α )。在大腸桿菌的情況下，可將可在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)目的基因的啟動(dòng)子、用于抗 體分泌的信號(hào)序列和待表達(dá)的抗體基因有效連接來表達(dá)目的基因。啟動(dòng)子的實(shí)例包括Iacz 啟動(dòng)子、araB啟動(dòng)子、Trp啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子。在昆蟲細(xì)胞的情況下，可將可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)目的基因的啟動(dòng)子、待表達(dá)的抗體基因和poly A信號(hào)與3’末端的下游位點(diǎn)有效連接 來表達(dá)目的基因?？墒褂玫膯?dòng)子的實(shí)例包括多角體蛋白啟動(dòng)子和桿狀病毒OpNMPV來源 的立即早期0pIE2啟動(dòng)子?？梢砸耘c上述用于制備人源化單克隆抗體的方法相似的方法制備根據(jù)本發(fā)明的 具有含有如SEQ ID NO 52中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和/或含有如SEQ ID NO 54 中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體。(9)用作HCV感染的抑制劑當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗體用作HCV感染的抑制劑時(shí)，抗 體用作闡明HCV感染機(jī)制的研究工具。此外，其優(yōu)選用作藥物(例如，藥物組合物)，其更優(yōu) 選用作抗丙型肝炎的治療劑或預(yù)防劑。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的抗體用作抗丙型肝炎的治療劑或預(yù) 防劑時(shí)，其用于預(yù)防由來自供體器官的器官移植引起的HCV感染。此外，其可與現(xiàn)有的抗病 毒劑例如干擾素和三氮唑核苷(ribavirin)組合使用。根據(jù)本發(fā)明的對(duì)HCV感染具有抑制活性的抗體對(duì)于任意形式的丙型肝是有效的。 例如，其對(duì)于慢性肝炎或暴發(fā)性肝炎是有效的，其對(duì)由基因型2a或lb HCV誘導(dǎo)的丙型肝炎 尤其有效。當(dāng)對(duì)患者施用本發(fā)明的抗丙型肝炎的治療劑或預(yù)防劑時(shí)，作為活性成分的本發(fā)明 的抗體的有效量為0. OOlmg至1，000mg/kg的體重。備選地，劑量可以是0. 01至100，OOOrng/ kg患者的體重，雖然劑量不限于此。此外，可在患者發(fā)生疾病的臨床癥狀之前或之后施用治 療劑或預(yù)防劑。按照常規(guī)技術(shù)(Remington，s Pharmaceutical Science, the latestedition,Mark Publishing Company, Easton, U. S. A.)制備本發(fā)明的抗丙型肝炎的治療劑或預(yù)防劑，此類 試劑可包含藥學(xué)上可接受的載體或添加劑。此類藥學(xué)上可接受的載體和添加劑的實(shí)例包括水、藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑、膠 原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯(carboxyvinylpolymer)、羧甲基纖維素鈉、聚丙 烯酸鈉、s海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠 (xanthan gum)、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、；二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟 油、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和表面活性劑，其作為藥物 添加劑是可接受的。實(shí)際的添加劑根據(jù)本發(fā)明的抗丙型肝炎的治療劑或預(yù)防劑的劑型選自上述添加 劑，此類添加劑可單獨(dú)地或以適當(dāng)?shù)亟M合使用，雖然添加劑不限定于上述添加劑。當(dāng)添加劑 用于注射制劑時(shí)，例如，將純化的抗HCV抗體溶解于溶劑例如生理鹽水、緩沖液或葡萄糖溶 液中時(shí)，向其中加入吸附抑制劑例如Tween SO.Tween 20、明膠、人血清白蛋白等，可使用所 得的混合物。備選地，可凍干添加劑以使其以允許其在使用前被溶解和重建的劑型存在。可 用于冷凍干燥的賦形劑的實(shí)例包括糖醇例如甘露醇或葡萄糖以及糖。(10)抗體用于HCV檢測(cè)的用途可將本發(fā)明的抗體用于用于HCV檢測(cè)的診斷組合物。例如，使已將本發(fā)明的抗體固定在其上的載體或板與可包含HCV抗原的受試樣品 接觸，以產(chǎn)生混合物。將所得的混合物在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件下經(jīng)歷反應(yīng)，進(jìn) 行一段時(shí)間。然后，將所產(chǎn)生的復(fù)合物與識(shí)別已結(jié)合信號(hào)酶、染料或放射性同位素的HCV抗原的抗體接觸，從而產(chǎn)生第二混合物。將第二混合物在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的條件 下經(jīng)歷反應(yīng)，進(jìn)行一段時(shí)間。借助于酶、染料或放射性同位素的信號(hào)，檢測(cè)HCV抗原的存在。備選地，將可含有HCV抗原的受試樣品點(diǎn)在可將蛋白質(zhì)固定至其上的膜(例如，硝 酸纖維素膜或PVDF膜)上以固定受試樣品中含有的蛋白質(zhì)。然后，將該膜浸漬于5%脫脂 牛奶或BSA溶液中以封閉膜。在清洗膜后，將膜浸漬于已結(jié)合酶、染料或放射性同位素 的本發(fā)明的抗體的溶液中，讓反應(yīng)在足以允許固定在膜上的抗原與本發(fā)明的抗體形成復(fù)合 物的條件下進(jìn)行一段時(shí)間。在清洗膜后，然后借助于酶、染料或放射性同位素的信號(hào)檢測(cè)固 定在膜上的HCV抗原A的存在。(11)用于抗HCV抗體檢測(cè)作為本發(fā)明的另一個(gè)用途，可檢測(cè)識(shí)別與本發(fā)明的抗體識(shí)別的表位相同的表位的 抗HCV抗體。本發(fā)明可用作與針對(duì)本發(fā)明的與HCV抗原反應(yīng)的抗體和受試抗體的競(jìng)爭(zhēng)性探 針。例如，將HCV抗原固定在板或膜上，加入已結(jié)合酶、染料或放射性同位素的本發(fā)明的抗 體和受試抗體，讓反應(yīng)在足以允許HCV抗原與抗體形成復(fù)合物的條件下進(jìn)行一定的時(shí)間。 通過分析酶、染料或放射性同位素信號(hào)與固相的結(jié)合的減少，可檢測(cè)受試抗體是否可檢測(cè) 由本發(fā)明的抗體識(shí)別的相同表位。實(shí)施例在下文中，參照實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出這些實(shí)施例被提供用于舉 例說明目的，本發(fā)明的技術(shù)范圍不限定于這些實(shí)施例。[實(shí)施例1] JFH-1-HCV 顆粒、J6/JFH-1-HCV 顆粒和 TH/JFH-1-HCV 顆粒的制備如Wakita，T.等，Nat. Med.，11，2005，pp. 791-796 和國(guó)際公開案 W02004/104198 中所述，制備作為通過克隆cDNA (基因組長(zhǎng)度的cDNA)獲得的質(zhì)粒DNA的pJFH_l，所述cDNA 是通過逆轉(zhuǎn)錄PUC19質(zhì)粒的T7RNA啟動(dòng)子序列下游的丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株(基 因型2a)(所述病毒株是從暴發(fā)性肝炎患者分離的)的整個(gè)基因組RNA區(qū)域獲得的。來源 于JFH-1株的被插入pJFH-1的基因組長(zhǎng)度的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO 1中所示。 用EcoRI消化pJFH-1，然后用Bell部分消化以制備質(zhì)粒DNA片段，該片段缺少?gòu)腅coRI位 點(diǎn)至第一個(gè)Bell位點(diǎn)的大約2，840bp的片段，純化所得的片段。如國(guó)際公開案W0 2006/022422所述，制備作為通過克隆pUC19質(zhì)粒的T7RNA啟動(dòng) 子序列下游的來源于HCV J6CF株的基因組長(zhǎng)度的cDNA(GenBank登錄號(hào)AF177036，Yanagi， M.，等，Virology 262 =250-263,1999)獲得的 pJ6CF。用 EcoRI 和 Bell 部分消化 pJ6CF，純 化所得的大約2，840bp的片段，將所得片段連接至缺少上述EcoRI-BclI的pJFH-1片段，從 而制備質(zhì)粒DNA pJ6/JFH-l。克隆入PJ6/JFH-1的DNA(SEQ IDN0 2)是嵌合病毒基因組長(zhǎng) 度的cDNA，其包含J6CF株的基因組長(zhǎng)度的cDNA的5，非翻譯區(qū)、編碼核心的序列、E1、E2和 P7蛋白和編碼NS2蛋白的從N末端至氨基酸16的區(qū)域的序列；和與其連接的JFH-1株的 基因組長(zhǎng)度的cDNA的編碼NS2蛋白的從氨基酸殘基17至C末端的區(qū)域的序列、按順序編 碼NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3，非翻譯區(qū)的序列。然后以下列方式制備質(zhì)粒DNA pTH/JFH-1。開始時(shí)，向作為模板的JFH-1中 的基因組長(zhǎng)度的 cDNA 中加入 10 ii 1 的 Phusion High-FidelityDNA Polymerase 試劑 盒(FINNZYMES)提供的10x緩沖液、4 yl 2mMdNTP混合物、1 yl的各自10 y M的引物 JFH-1-A(SEQ ID NO 4 TGTAAAACGACGGCCAGT)禾口 JFH-l-B(SEQ ID NO 5 :GGTTTAGGATTCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)，然后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 yl。然后，向其 中加入0. 5 ii 1 PhusionDNA聚合酶(FINNZYMES)，進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，所述DNA片段， 除了 JFH-1株的5’非翻譯區(qū)以外，還包含JFH-1-B引物序列中含有的HCV TH株的核心蛋 白編碼序列的一部分。使用30個(gè)循環(huán)(98°C下進(jìn)行10秒，55°C下進(jìn)行15秒和72°C下進(jìn)行 30秒)來進(jìn)行PCR。所得的PCR產(chǎn)物稱為1號(hào)PCR產(chǎn)物。然后，向作為模板的包含來源于 HCV TH 株的基因組長(zhǎng)度的 cDNA 的 pTH 質(zhì)粒(Wakita 等，J. Biol. Chem.，269 14205-14210， 1994 ；禾口 Moradpour 等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，246 :920_924，1998)中加入 10 u 1 的 Phusion High-FidelityDNA Polymerase 試劑盒(FINNZYMES)提供的 lOx 緩沖液、 2mMdNTP 混合物和 1 u 1 的各自 10 ii M 的引物 TH-C (SEQ ID NO 6 GGTCTCGTAGACCGTGCACCA TGAGCACGAATCCTAAACC)禾口 TH_D(SEQ ID NO :7 :AGATAGCACAACCACCACAGGAGCTTGGCGAGGAATG CCT)，然后加入去離子水以使總量最終達(dá)到49. 5 ill。向其中加入0.5 ill Phusion DNA聚 合酶(FINNZYMES)，進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，除了包含TH株的從核心蛋白編碼序列的大部 分至NS2蛋白編碼序列的一部分的區(qū)域的序列外，所述DNA片段還包含TH-C引物序列中含 有的JFH-1株的5’非翻譯區(qū)的一部分和YH-D引物序列中含有的JFH-1株的NS2蛋白編碼 序列的一部分。使用30個(gè)循環(huán)(98°C下進(jìn)行10秒，55°C下進(jìn)行15秒和72°C下進(jìn)行30秒) 來進(jìn)行PCR。所得的PCR產(chǎn)物命名為2號(hào)PCR產(chǎn)物。此外，向作為模板的上述pJFH-1中加 AlOu 1 由 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒(FINNZYMES)提供的 lOx 緩沖 液、4 u 1 2mM dNTP 混合物和 1 u 1 的各自 10 ii M 的引物 JFH-1-E (SEQ ID NO 8 :AGGCATTCC TCGCCAAGCTCCTGTGGTGGTTGTGCTATCT)和 JFH_1_F(SEQ ID NO :9 :CAGCTACCGAGGGGTTAAGC)， 然后加入去離子水以使最終總量達(dá)到49. 5 ill。向其中加入0.5 ill Phusion DNA聚合酶 (FINNZYMES)，進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，除了 JFH-1株的NS2和NS3蛋白編碼序列的一部 分外，所述片段還包含JFH-1-E引物序列中含有的TH株的NS2蛋白編碼序列的一部分。使 用30個(gè)循環(huán)(98°C下進(jìn)行10秒，55°C下進(jìn)行15秒和72°C下進(jìn)行30秒)來進(jìn)行PCR。將所 得的PCR產(chǎn)物命名為3號(hào)PCR產(chǎn)物。然后，使用如上制備的1號(hào)PCR產(chǎn)物、2號(hào)PCR產(chǎn)物和3號(hào)PCR產(chǎn)物，利用JFH-1-A 引物(SEQ ID NO 4)和JFH-1-E引物(SEQ ID NO 8)進(jìn)行PCR。從而，獲得包含彼此連接 的JFH-1株的5’非翻譯區(qū)、TH株的從核心蛋白編碼序列至NS2蛋白質(zhì)編碼序列的一部分 的區(qū)域和JFH-1株的從NS2蛋白編碼序列的一部分至NS3蛋白質(zhì)編碼序列的一部分的區(qū)域 的片段(4號(hào)PCR產(chǎn)物)。然后，用EcoRI和Spel限制性內(nèi)切酶處理pJFH-1和4號(hào)PCR產(chǎn)物，將所得的片段 連接以獲得質(zhì)粒DNA pTH/JFH-1?？寺∪胨玫膒TH/JFH-1的嵌合病毒基因組長(zhǎng)度的cDNA 的核苷酸序列示于SEQ IDN0 3中。用Xbal切割pJFH-1、pJ6/JFH_l和pTH/JFH-1，然后將其經(jīng)歷酚/氯仿提取和乙 醇沉淀。將切割的質(zhì)粒各自用作模板，使用MEGAscriptT7試劑盒(Ambion)合成RNA (參見 W0 2006/022422)。如下所述將所合成的HCV RNA各自用于導(dǎo)入細(xì)胞。將Huh-7 細(xì)胞(3 X 106 個(gè)細(xì)胞)和 5 ii g HCV RNA 懸浮于 400 u ICytomix 溶液 (120mM KC1、0. 15mM CaCl2、10mM K2HP04/KH2P04、25mM H印es、2mM EGTA、5mM MgCl2、20mM ATP 和50mM谷光甘肽)中，將懸浮液轉(zhuǎn)移至4-mm小杯中，使用Gene Pulser (BioRad)以260V 和950 ii F將其經(jīng)歷HCV RNA至Huh-7細(xì)胞內(nèi)的電穿孔。然后，將已向其中導(dǎo)入HCV RNA的細(xì)胞接種在10cm2皿中，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)時(shí)，使用HCV antigen ELISA test 試劑盒(0RTH0)定量培養(yǎng)上清液中含有的HCV核心蛋白以確認(rèn)HCV顆粒的產(chǎn)量。選擇含有 大量核心蛋白和具有高HCV顆粒產(chǎn)生活性的培養(yǎng)上清液并且以病毒原液的形式貯存。向已在10-cm培養(yǎng)皿中于10% FCS-DMEM培養(yǎng)基(1 % MEM非必需氨基酸溶液 (Invitrogen) UOmM HEPES-Tris (pH7. 3)和ImM丙酮酸鈉)中培養(yǎng)的Huh_7細(xì)胞中加入上 述獲得的大約100 u 1 JFH-1或J6/JFH-1病毒原液以用HCV病毒感染Huh_7細(xì)胞。將細(xì)胞充分地傳代培養(yǎng)，同時(shí)避免細(xì)胞培養(yǎng)物變得匯合，將其在225cm2的培養(yǎng)瓶 中從一個(gè)培養(yǎng)瓶至4個(gè)培養(yǎng)瓶，然后至12個(gè)培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。然后，從8個(gè)這樣的 225-cm2培養(yǎng)瓶中分離細(xì)胞，將其接種在兩個(gè)5層Cellstacks (Corning)中，以650ml/ cellstack的量向其中加入培養(yǎng)基。將獲自另外4個(gè)瓶中的細(xì)胞接種在12個(gè)瓶中，繼續(xù)有 效地產(chǎn)生病毒。在傳代培養(yǎng)的第二天，棄去培養(yǎng)基，加入650ml的2% FCS-DMEM培養(yǎng)基(1% MEM 非必需氨基酸溶液(Invitrogen)、10mM HEPES-Tris (pH7. 3)、ImM丙酮酸鈉)。在培養(yǎng)基更 換后3天回收培養(yǎng)基，將其通過0. 45- u m過濾器，然后將所得產(chǎn)物貯存于低溫冰箱中。此 外，在回收培養(yǎng)上清液后向Cellstack中加入650ml的2% FCS-DMEM培養(yǎng)基(1% MEM非必 需氨基酸溶液、10mM HEPES-Tris (pH7. 3)和ImM丙酮酸鈉)，然后繼續(xù)培養(yǎng)。在更換培養(yǎng)基 后2天重復(fù)相似的方法，回收培養(yǎng)上清液。然后再重復(fù)一次相似的方法。將如此回收的培 養(yǎng)上清液用于下面的實(shí)施例。由此，證明了在已向其中導(dǎo)入了各自從pJFH-1、pJ6/JFH-1和pTH/JFH_l合成的 RNA的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生了感染性HCV顆粒。[實(shí)施例2] JFH-1、J6/JFH-1 和 TH/JFH-1HCV 顆粒的純化通過下列4個(gè)步驟純化實(shí)施例1中產(chǎn)生的病毒顆粒。1)濃縮通過使用Pellicon 2Mini Ultrafiltration Module PLCMK V 0. lm2 (300kDa 截 斷值，登錄號(hào)P2C300V01，Millipore，在下文中稱為"pellicon 2 mini ”)，將上述實(shí)施例中 獲得的含有HCV顆粒的培養(yǎng)上清液濃縮大約30至50倍。將濃縮物通過0. 45-um過濾器 過濾，然后于-80°C下貯存。2)密度梯度超速離心向 Ultra-clear 25 X 89mm 離心管(登錄號(hào) 344058，Beckman Coulter)中力口入 3ml 含有冷 60%蔗糖的 TNE 緩沖液(10mM Tris-HCl (pH7. 4)、150mM NaCl,lmM EDTA)，然后在上 面覆蓋7ml含有20%蔗糖的TNE緩沖液。此外，將25ml樣品覆蓋在含有20%蔗糖的TNE 緩沖液上。使用SW-28 (Beckman Coulter)以28，OOOrpm在4°C進(jìn)行超速離心4小時(shí)。使用25G注射針頭(Terumo)穿透管的底部，連續(xù)地獲得2. 5ml、3ml、4. 5ml和25ml 的級(jí)分。3)肝素柱子的純化用20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡5_ml Hi Trap Heparin HP柱子。將稀釋的級(jí)分 (不超過6個(gè)柱子)以5ml/分鐘或更慢的流速用于HiTrapH印arin。通過流過50ml 20mM 磷酸鹽緩沖液(PH7)清洗柱子。通過對(duì)其使用25ml含有500mM NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液 (pH7)來獲得洗脫級(jí)分。此外，通過流過50ml含有3. 8M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)來清洗柱子，然后用20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡柱子，并且貯存柱子。4)濃縮和緩沖液交換使用Amicon Ultra-15 離心式過濾器單位(Centrifugal Filter Unit) (Millipore)和TNE緩沖液將洗脫級(jí)分經(jīng)歷濃縮和緩沖液交換。在下述的免疫步驟中，將所 獲得的濃縮物用作含有感染性病毒顆粒的病毒溶液。[實(shí)施例3]病毒滅活通過紫外線照射滅活通過實(shí)施例2中的步驟1)至4)獲得的濃縮的丙型肝炎病 毒。關(guān)于紫外線的來源，可使用GL-15 (Toshiba)。將含有純化的丙型肝炎病毒顆粒(JFH-1 株)的溶液(其具有l(wèi)X106ffu/ml的感染效價(jià))引入硅涂鋪的聚乙烯Eppendorf管(Assist Co.，Ltd，)中，將管以與紫外線源相距使得可以以20mW/cm2的強(qiáng)度使用紫外線的距離放置， 使用UV-C進(jìn)行5分鐘。在紫外線照射后，將丙型肝炎病毒顆粒于Dulbecco’ s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM) 中系列稀釋 50 倍、250 倍、1，250 倍、6，250 倍、31，250 倍、156，250 倍和 781，250 倍。在前一天，將Huh-7細(xì)胞以1 X 104個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔多聚L賴氨酸涂鋪的板 (Corning 96孔透明平底多聚L賴氨酸涂鋪的微量培養(yǎng)板，Corning)，將系列稀釋的病毒顆 粒接種于其中，在37°C下培養(yǎng)72小時(shí)。在除去培養(yǎng)上清液后，將板浸漬于冰冷的甲醇中以固定細(xì)胞。然后，通過空氣干
燥除去甲醇，使用含有 0. 3%Trit()n -X lOO(GEHealthcare)的 Block Ace (Dainippon
Pharmaceutical Co.，Ltd.)透化細(xì)胞。使用克隆 2H9 抗 HCV 核心抗體(Wakita，T.等，Nat. Med. 11 791-796,2005)和山羊抗小鼠 IgG_Alexa488 (Molecular Probes)檢測(cè) HCV 感染的 細(xì)胞，在熒光顯微鏡(IX-70 ；Olympus)下計(jì)數(shù)HCV感染的細(xì)胞的數(shù)目。發(fā)現(xiàn)紫外照射的丙 型肝炎病毒的感染效價(jià)低于檢測(cè)極限。在下列實(shí)施例中將被證明已完全喪失感染性的HCV 顆粒用于對(duì)小鼠施用。[實(shí)施例4]使用滅活的HCV顆粒進(jìn)行的小鼠的免疫首先制備佐劑。向lOOiU含有已如實(shí)施例3中所述滅活的J6/JFH-1-HCV顆粒 (相當(dāng)于1.4iig HCV核心蛋白；相當(dāng)于lOyg總HCV蛋白)的溶液中加入等量的弗氏完全 佐劑(Difco)以產(chǎn)生乳劑。乳劑的產(chǎn)生通過在燒杯中制備足夠量的水，將相關(guān)混合物的小 滴滴在液體表面，然后觀察液體將不擴(kuò)散來確認(rèn)。用醚麻醉Balb/c小鼠(7周齡，雌性)，然 后對(duì)其腹膜內(nèi)施用所制備的含有滅活的J6/JFH-1-HCV顆粒的乳劑來免疫小鼠。兩周后，向lOOiU含有J6/JFH-1-HCV顆粒的溶液(相當(dāng)于1. 4 y gHCV核心蛋白； 相當(dāng)于10yg總HCV蛋白)中加入等量的弗氏不完全佐劑(Difco)以產(chǎn)生乳劑，然后如上 所述通過腹膜內(nèi)施用乳劑再次免疫小鼠。3周后再對(duì)小鼠腹膜內(nèi)施用乳劑以進(jìn)一步免疫。同樣，也以相同的方式按照上述免疫方案使用實(shí)施例3中滅活的JFH-1-HCV顆粒 來免疫小鼠。[實(shí)施例5]來源于用滅活的HCV顆粒免疫的小鼠的血清中對(duì)HCV感染的抑制活性 的測(cè)量在已在實(shí)施例4中免疫的小鼠中，將血清樣品經(jīng)歷對(duì)HCV感染的抑制活性的測(cè)量， 所述血清樣品通過從用具有基因型2a的結(jié)構(gòu)蛋白的滅活的HCV顆粒(J6/JFH-1-HCV顆粒 或JFH-1-HCV顆粒)免疫的小鼠部分血樣取樣獲得。
將Huh7細(xì)胞以5X 103個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板上，然后將細(xì)胞培養(yǎng)過夜。向?qū)?施例2的步驟1)中獲得的濃縮的J6/JFH-1-HCV病毒溶液中加入血清和肝素(10個(gè)單位/ ml)，將所得物在37°C下溫育1小時(shí)。在使用前用培養(yǎng)基(含有10%FCS(Invitrogen)、l% MEM 非必需氨基酸溶液(Invitrogen)、10mM HEPES-Tris (pH7. 3)和 ImM 丙酮酸鈉的 DMEM) 將血清稀釋20倍和100倍。在棄去培養(yǎng)基后，以50iU/孔加入病毒溶液，然后在37°C下 溫育3小時(shí)。在棄去培養(yǎng)基后，用PBS清洗板一次，以100 yl/孔加入培養(yǎng)基，然后在37°C 下溫育48小時(shí)。在棄去培養(yǎng)基后，用PBS清洗板一次，以lOOiil/孔加入Is0gen(Wak0 PureChemical Industries, Ltd.)，按照所附說明書提取總RNA。通過定量RT-PCR對(duì)總RNA 進(jìn)行定量，測(cè)定每1 P g總RNA的RNA拷貝數(shù)。此外，以下列方式檢查來源于用具有基因型2a的結(jié)構(gòu)蛋白的J6/JFH-1-HCV顆 粒免疫的小鼠的血清是否具有抑制具有基因型lb的結(jié)構(gòu)蛋白的HCV的感染的活性。為 此目的，以與上所述方式相同的方式將實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的嵌合HCV顆粒(TH/ JFH-1-HCV)(其具有基因型lb的TH株的結(jié)構(gòu)蛋白)和嵌合J6/JFH-1-HCV顆粒(其具有基 因型2a的結(jié)構(gòu)蛋白)用作感染劑來測(cè)量血清抑制感染的活性。除了使用在施用HCV顆粒 之前取樣的正常小鼠的血清外，以相同的方式進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在用J6/JFH-1-HCV顆粒對(duì)小鼠免疫后62天從其獲得的稀釋20倍的血 清具有與對(duì)照實(shí)驗(yàn)(100% )相比較下降至15%的J6/JFH-1-HCV的感染水平，從而發(fā)現(xiàn)血 清具有抑制具有基因型2a (圖1A)的結(jié)構(gòu)蛋白的HCV顆粒的感染的活性。此外，與對(duì)照實(shí) 驗(yàn)(100% )相比較，稀釋20倍的血清使TH/JFH-1-HCV的感染水平下降至34%，從而發(fā)現(xiàn) 血清具有抑制具有基因型lb (圖1B)的結(jié)構(gòu)蛋白的HCV顆粒的感染的活性。這些結(jié)果顯示 通過用基因型2a進(jìn)行的HCV免疫誘導(dǎo)的抗體包括抑制基因型lb HCV的感染的抗體以及抑 制基因型2a HCV的感染的抗體。甚至當(dāng)將從用JFH-1-HCV顆粒免疫后42天獲得的兩只小鼠獲得的血清稀釋100 倍以進(jìn)行使用時(shí)，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)中HCV顆粒施用前收集的血清(100%)相比較，基因型2a JFH-1-HCV的感染水平降低，從而確認(rèn)血清具有抑制感染的活性(圖2)。然后，將200 ill來自已對(duì)其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清和從HCV顆 粒施用前的正常小鼠收集的血清各自用于1-mlG蛋白瓊脂糖柱(GE Healthcare)，以1ml/ 級(jí)分的量用0. 1M甘氨酸緩沖液(pH3. 0)洗脫樣品，然后進(jìn)行柱清洗。洗脫的蛋白質(zhì)峰級(jí)分 命名為IgG級(jí)分，將IgG級(jí)分和非吸附級(jí)分(IgM級(jí)分)分別制備為純化的級(jí)分。如下，以 與上所述方式相似的方式測(cè)量它們對(duì)其HCV感染的抑制活性。以100 u g/ml或10 ii g/ml使用從已對(duì)其施用了 HCV顆粒的小鼠的血清獲得的純 化的IgG而非用于上述測(cè)量的血清樣品，或以100 y g/ml使用從正常小鼠血清獲得的純化 的IgG。將HCV顆粒(病毒溶液中的)與IgG等混合以獲得107個(gè)拷貝/ml，讓其在室溫下 靜置1小時(shí)。然后，棄去用于Huh-7細(xì)胞(所述細(xì)胞已在前一天以4X104個(gè)細(xì)胞/孔接種 在24孔板中并且在其中進(jìn)行培養(yǎng))的培養(yǎng)基，以200 u 1/孔向細(xì)胞加入上述病毒顆粒與 IgG抗體的混合物。將細(xì)胞在37°C下溫育3小時(shí)，棄去含有病毒顆粒的溶液，用PBS清洗孔 一次。向其中加入新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)2天，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗孔一次，然后使用 Trizol試劑(Invitrogen)從細(xì)胞提取RNA。測(cè)定提取的RNA中含有的HCV RNA的拷貝數(shù)。 按照 Takeuchi 等(Gastroenterology，1999，116，pp. 636-42.)的方法測(cè)定 RNA 的拷貝數(shù)。
然后，以相同的方式測(cè)量不吸附至G蛋白瓊脂糖的級(jí)分(即，IgM級(jí)分)的抑制感 染的活性。作為陽(yáng)性對(duì)照，使用獲自已對(duì)其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清(未純 化的)樣品。測(cè)量從已對(duì)其施用J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠獲得的血清樣品中的蛋白質(zhì)含 量和IgM級(jí)分中蛋白質(zhì)的含量，然后在向樣品加入相同量的蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行抑制感染 的活性的測(cè)量的實(shí)驗(yàn)。特別地，將獲自已對(duì)其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清混合 以達(dá)到5%，將HCV顆混合以成為107個(gè)拷貝/ml的混合物。以這樣的量混合IgM級(jí)分，以 使包含與上述5%的小鼠血清中的量相同的量的蛋白，混合HCV顆粒以成為107個(gè)拷貝/ml。 讓混合物在室溫下靜置1小時(shí)。棄去用于Huh-7細(xì)胞(已在前一天將所述細(xì)胞以4X 104個(gè) 細(xì)胞/孔接種于24孔板上并且在其中進(jìn)行培養(yǎng))的培養(yǎng)基，將病毒顆粒和血清或IgM的混 合物以200 yl/孔加入其中。將細(xì)胞于37°C下溫育3小時(shí)，棄去含有病毒顆粒的溶液，用 PBS清洗孔一次。加入新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗孔一次，使用Trizol 試劑(Invitrogen)從細(xì)胞提取RNA。測(cè)定提取的RNA中含有的HCV RNA的拷貝數(shù)。按照 Takeuchi 等(Gastroenterology，1999,116, pp. 636-42.)的方法測(cè)定 RNA 拷貝數(shù)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)來源于獲自已對(duì)其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清的IgM級(jí)分 對(duì)HCV感染具有抑制活性，如圖3中所示。[實(shí)施例6]雜交瘤的制備在含有5X10_5M 2-巰基乙醇、100個(gè)單位/ml青霉素、100 iig/ml鏈霉素和10%胎 牛血清(FCS，Invitrogen)的Dulbecco，s改良MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)小鼠骨髓瘤 細(xì)胞系SP2/0細(xì)胞(獲自ECACC)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中獲得SP2/0細(xì)胞。用無血清Dulbecco’s 改良MEM清洗細(xì)胞3次。然后，從已對(duì)其施用了實(shí)施例4的HCV顆粒(JFH-1顆?；騄6/JFH-1顆粒)的小 鼠制備脾細(xì)胞，用無血清Dulbecco’ s改良MEM清洗3次。將SP2/0細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞以 1 5的比例導(dǎo)入50-ml離心管，以l，000rpm離心細(xì)胞10分鐘。將上清液完全吸出，用手 指輕敲管底以使細(xì)胞沉淀松散。向細(xì)胞中加入lml 50%的于37°C下加熱的聚乙二醇-1500 溶液(Roche)，進(jìn)行1分鐘，讓反應(yīng)在37°C下繼續(xù)進(jìn)行1分鐘。然后，逐漸加入lml無血清 Dulbecco，s改良MEM進(jìn)行1分鐘，再逐漸地加入lml無血清Dulbecco，s改良MEM，進(jìn)行1 分鐘。最后，加入7ml無血清Dulbecco，s改良MEM進(jìn)行3分鐘以稀釋聚乙二醇溶液。以 1，OOOrpm離心稀釋劑中的細(xì)胞10分鐘，向其中加入50ml HT培養(yǎng)基(含有5X 10_5M 2-巰 基乙醇、100個(gè)單位/ml青霉素、100 u g/ml鏈霉素、10% FCS，10_4M次黃嘌呤和1. 5X 10_5M 胸苷的Dulbecco's改良MEM培養(yǎng)基)，通過移液器吸打使細(xì)胞沉淀松散。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至兩 個(gè)75-cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C下于5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。以1，OOOrpm離心細(xì)胞10分鐘，回收細(xì)胞。通過輕敲松散細(xì)胞沉淀，重懸浮于10ml 的Dulbecco，s改良MEM中。將細(xì)胞懸浮液加入至且充分混合于90ml甲基纖維素HAT選擇 培養(yǎng)基(Stem CellTechnology)中，將所得的混合物以10ml/皿的量加入至10-cm培養(yǎng)皿， 將培養(yǎng)物在37°C下于5% C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)10至14天后，用移液器尖頭吸出各自被認(rèn)為長(zhǎng)自單個(gè)細(xì)胞的雜交瘤集落， 將其各自導(dǎo)入已向其中加入了 200 ill的含有10%雜交瘤生長(zhǎng)因子(Bio Veris)的各HT培 養(yǎng)基的96孔板的孔，然后繼續(xù)培養(yǎng)。[實(shí)施例7]產(chǎn)生抑制HCV感染的抗體的雜交瘤的篩選
當(dāng)實(shí)施例6中制備的雜交瘤已充分增殖時(shí)，回收培養(yǎng)上清液，如下對(duì)其進(jìn)行篩選。通過將E1蛋白和E2蛋白固定在板上，通過EIA評(píng)估雜交瘤上清液中的抗體是否 結(jié)合固定在板上的蛋白質(zhì)，并且評(píng)估雜交瘤上清液中的抗體是否能夠抑制HCV感染。1)來源于J6CF株的E1和E2蛋白的制備如下制備J6CF菌株的E1和E2蛋白。通過使用來源于基因型2aJ6CF株的基 因組長(zhǎng)度的cDNA(GenBank登錄號(hào)AF177036)作為模板，使用Advantage GC2PCR試劑盒 (Takara Bio)，禾lj 用 J6EldTM_s(SEQ IDN0 10 :CACAAGCTTGCCGAAGTGAAGAACATCAGT)及 J6EldTM-as(SEQ ID NO 11 :GCTCTAGATTAATGAGCCCCGCTAATGATGTC)通過 PCR 擴(kuò)增編碼 缺少跨膜區(qū)的E1蛋白的基因，當(dāng)氨基酸1始于J6CF株的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列(S卩，由J6CF 株的基因組序列KenBank登錄號(hào)AF177036編碼的連續(xù)蛋白質(zhì)序列)的N端上起始甲 硫氨酸時(shí)，所述跨膜區(qū)相當(dāng)于從氨基酸192至352的區(qū)域。將擴(kuò)增的DNA片段克隆入 pCR-TOPO(Invitrogen)，將3個(gè)克隆經(jīng)歷核苷酸序列分析。包含具有正確核苷酸序列的插 入物的克隆被命名為pT0P0-J6EldTM。用Hindlll和Xbal部分消化pT0P0_J6EldTM，切取含有大約500bp的所得的DNA片 段(E1片段)的凝膠。使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。類似地，用Hindlll 和Xbal消化p3xFLAG-CMV-9 (SIGMA)，將所得產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，切取含有 大約6，400bp的片段的凝膠，使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。使用T4連接 酶(Takara Bio)將純化的DNA片段彼此連接，從而獲得已將J6CF E1片段整合入其中的動(dòng) 物細(xì)胞表達(dá)載體CMV-3xFLAGJ6EldTM。然后，使用Advantage GC2PCR 試劑盒(Takara Bio)，利用 J6E2dTM_s (SEQ ID NO: 12 CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)和 J6E2dTM_as(SEQ ID NO 13 :GCTCTAGATTACCATCGG ACGATGTATTTTGT)通過PCR克隆編碼缺少跨膜區(qū)的E2蛋白的基因，當(dāng)氨基酸1始于J6CF株 的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列的N端上的起始甲硫氨酸時(shí)，所述跨膜區(qū)相當(dāng)于從氨基酸384至720的 區(qū)域。將擴(kuò)增的DNA片段克隆入pCR-TOPO (Invitrogen)，將3個(gè)克隆經(jīng)歷核苷酸序列分析。 包含具有正確核苷酸序列的插入物的克隆被命名為pT0P0-J6E2dTM。然后，借助于T4DNA連接酶將通過用Hindlll和Xbal消化p3xFLAG-CMV_9 (SIGMA) 而獲得的DAN連接至用Hindlll和Xbal從pT0P0_J6E2dTM切取的大約1，000bp的DNA片 段以進(jìn)行環(huán)化。所得的載體被命名為CMV-3xFLAGJ6E2dTM。如下所述，將CMV-3xFLAGJ6E ldTM和CMV_3xFLAGJ6E2dTM導(dǎo)入來源于猴腎細(xì)胞 (登錄號(hào)RCB0143，獲自Riken細(xì)胞庫(kù))的C0S1細(xì)胞以在其中表達(dá)蛋白質(zhì)。將C0S1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(Invitrogen)、100U/ml青霉素和100 ii g/ ml硫酸鏈霉素的Dulbecco’ s MEM(D_MEM Invitrogen)。將C0S1細(xì)胞在基因?qū)氲那耙?天以1 2的分流比(splitratio)接種在150-cm2培養(yǎng)瓶(Corning Coaster)中，將細(xì)胞 在37°C下于5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。分別地，向D-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中加入DEAE葡聚糖(Pharmacia)和氯奎 (SIGMA)以分別形成400iig/ml和100 y M的終濃度，每13ml的溶液以0. 1 y g/yl加入 50 u g表達(dá)載體(CMV-3xFLAGJ6EldTM或CMV_3xFLAGJ6E2dTM)，然后進(jìn)行培養(yǎng)。然后吸除培 養(yǎng)的COS 1細(xì)胞的上清液，向其中加入10ml PBS(-) (Nissui)，清洗細(xì)胞一次。在將PBS(-) 吸除后，每150-cm2培養(yǎng)瓶向其中加入13ml的DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后在5% C02存在的情況下于37°C進(jìn)行溫育4小時(shí)。4小時(shí)后，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后用10ml PBS清洗細(xì)胞一次。以每 瓶50ml的量向其中加入CH0-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)，在5% C02存在的情況下于37°C 進(jìn)行培養(yǎng)。4天后將培養(yǎng)上清液收集在50-ml離心管(Corning Coaster)中。在4°C下以 6，OOOrpm(通過使用HITACHI RPR9-2轉(zhuǎn)子)離心收集的上清液，然后通過0. 2-y m過濾器 (Whatman)進(jìn)行過濾。如下使用抗FLAG M2瓊脂糖(SIGMA)來純化培養(yǎng)上清液。向500ml培養(yǎng)上清液中 加入1ml抗FLAG M2瓊脂糖，讓反應(yīng)在4°C (在低溫艙)中進(jìn)行2小時(shí)，同時(shí)在轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行 攪拌。2小時(shí)后，將上清液與抗FLAG M2瓊脂糖的混合物轉(zhuǎn)移至Econo-Column (BI0-RAD)， 收集流過級(jí)分。然后，用10ml TBS(50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH7. 4)清洗柱子2次。通 過使用0. 1M甘氨酸-HC1 (pH3. 5)洗脫6個(gè)級(jí)分(每一個(gè)級(jí)分1ml)。在洗脫后立即加入1M Tris-HCl (pH9. 5)進(jìn)行中和。將級(jí)分(各20 yl)在還原條件下經(jīng)歷SDS-聚丙烯酰胺凝膠 電泳，使用考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)來源于J6CF株的E1和E2蛋白被純化2)來源于JFH-1株的E1和E2蛋白的制備如下制備JFH-1株的E1和E2蛋白。通過使用來源于基因型2aJFH_l株的基因組 長(zhǎng)度的 cDNA 作為模板，使用 Advantage GC2PCR試劑盒(Takara Bio)利用 JFHEldTM-s (SEQ ID NO 14 :CACAAGCTTGCCCAGGTGAAGAATACCAGT)和 JFHEldTM-as(SEQID NO :15 :GCTCTAGAT TAGTGAGCCCCGCTAACGATGTC)通過PCR擴(kuò)增編碼El蛋白的基因，當(dāng)氨基酸1始于J6CF株的 全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列(即，由JFH-1株的基因組序列編碼的連續(xù)蛋白質(zhì)序列氨基酸序列公開于 GenBank 登錄號(hào) AB047639 ；Kato, T.等，Gastroenterology, 125，2003，pp. 1808-1817)的 N 端上的起始甲硫氨酸時(shí)，所述El蛋白相當(dāng)于從氨基酸192至352的區(qū)域。將擴(kuò)增的DNA片 段克隆入pCR-TOPOanvitrogen)，將3個(gè)克隆經(jīng)歷核苷酸序列分析。包含具有正確核苷酸 序列的插入物的克隆被命名為pTOPO-JFHEldTM。用Hindlll和Xbal消化pTOPO-JFHEldTM，切取含有大約500bp的所得的DNA片 段(E1片段)的凝膠。使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。類似地，用Hindlll 和Xbal消化p3xFLAG-CMV-9 (SIGMA)，將所得產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，切取含有 大約6，400bp的片段的凝膠，使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。使用T4連接 酶(Takara Bio)將純化的DNA片段彼此連接，從而獲得已將JFH-1E 1片段整合入其中的 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體CMV-3xFLAGJFHEldTM。然后，使用Advantage GC2PCR 試劑盒(Takara Bio)利用 JFE2dTM_s (SEQ ID NO 16 CACAAGCTTGGCACCACCACCGTTGGAG)和 JFE2dTM_as (SEQ ID NO 17 :GCTCTAGATTATGTGATA GCAGGTGAGAGGCC)通過PCR克隆編碼缺少跨膜區(qū)的E2蛋白的基因，氨基酸1始于JFH-1株 的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列的N端上的起始甲硫氨酸時(shí)，所述跨膜區(qū)相當(dāng)于從氨基酸384至714的 區(qū)域。將擴(kuò)增的DNA片段克隆入pCR-TOPO (Invitrogen)，將3個(gè)克隆經(jīng)歷核苷酸序列分析。 包含具有正確核苷酸序列的插入物的克隆被命名為pT0P0-JFHE2dTM。用Hindlll和Xbal消化pT0P0_JFHE2dTM，切取含有大約1，000bp的所得的E2片 段的凝膠。使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。類似地，用Hindlll和Xbal消 化p3xFLAG-CMV-9載體(SIGMA)，將所得產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，切取含有大 約6，400bp的片段的凝膠，使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。使用T4連接酶(Takara Bio)將純化的DNA片段彼此連接，從而獲得已將JFH-1E2片段整合入其中的動(dòng)物 細(xì)胞表達(dá)載體 CMV-3xFLAGJFHE2dTM。如下所述，將CMV-3xFLAGJFHEldTM和CMV_3xFLAGJFHE2dTM導(dǎo)入來源于猴腎細(xì)胞 (登錄號(hào)RCB0143，獲自Riken細(xì)胞庫(kù))的C0S1細(xì)胞以在其中表達(dá)蛋白質(zhì)。將C0S1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(Invitrogen)、100U/ml青霉素和100 ii g/ ml硫酸鏈霉素的Dulbecco’ s MEM(D_MEM Invitrogen)。將C0S1細(xì)胞在基因?qū)氲那耙?天以1 2的分流比接種在150-cm2培養(yǎng)瓶(Corning Coaster)中，將細(xì)胞在37°C下于5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。分別地，向D-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中加入DEAE葡聚糖(Pharmacia)和氯奎 (SIGMA)以分別形成400 u g/ml和100 u M的終濃度，每13ml的溶液中以0. 1 y g/ yl加 A 50u g 表達(dá)載體(CMV-3xFLAGJFHEldTM 或 CMV_3xFLAGJFHE2dTM)，然后進(jìn)行培養(yǎng)。隨后， 吸除培養(yǎng)的COS 1細(xì)胞的上清液，向其中加入10ml PBS(-) (Nissui)，清洗細(xì)胞一次。在將 PBS㈠吸除后，每150-cm2培養(yǎng)瓶向其中加入13ml的DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后在5% C02存在的情況下于37°C下溫育4小時(shí)。4小時(shí)后，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后用10ml PBS清洗細(xì)胞一次。以每 瓶50ml的量向其中加入CH0-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)，在5% C02存在的情況下于37°C 進(jìn)行培養(yǎng)。4天后將培養(yǎng)上清液收集在50-ml離心管(Corning Coaster)中。在4°C下以 6，OOOrpm (通過使用HITACHI RPR9-2轉(zhuǎn)子)離心收集的上清液，然后通過0. 2-y m過濾器 (Whatman)過濾。如下使用抗FLAG M2瓊脂糖(SIGMA)來純化培養(yǎng)上清液。向500ml培養(yǎng)上清液中 加入抗FLAG M2瓊脂糖，讓反應(yīng)在4°C下(在低溫艙中)進(jìn)行2小時(shí)，同時(shí)在轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行攪 拌。2小時(shí)后，將上清液與抗FLAGM2瓊脂糖的混合物轉(zhuǎn)移至Econo-Column (BI0-RAD)，收集 流過級(jí)分。然后，用10ml TBS(50mM Tris_HCl、150mM NaCl、pH7. 4)清洗柱子2次。通過 使用0. 1M甘氨酸-HC1 (pH3. 5)洗脫6個(gè)級(jí)分(每一個(gè)級(jí)分1ml)。在洗脫后立即加入1M Tris-HCl (pH9. 5)進(jìn)行中和。將級(jí)分(各20 yl)在還原條件下經(jīng)歷SDS-聚丙烯酰胺凝膠 電泳，使用考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)來源于JFH-1株的E1和E2蛋白被純化。3)E1和E2蛋白固定板的制備用PBS洗脫來源于J6CF菌株的E1和E2蛋白以產(chǎn)生1 y g/ml的兩種蛋白的每一種 蛋白。向免疫板(immunoplate) (NUNC)的孔中加入E1和E2蛋白混合物的溶液(50 yl)，讓 板在4°C下放置過夜，從而使蛋白質(zhì)固定在板上。除去蛋白質(zhì)溶液，向每個(gè)孔中加入150 yl Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)，然后將板在室溫下經(jīng)歷封閉，進(jìn)行4小 時(shí)。用PBS洗脫來源于JFH-1的E1和E2蛋白以產(chǎn)生1 y g/ml的兩種蛋白中的每一種 蛋白。向免疫板(immunoplate) (NUNC)的孔中加入E1和E2蛋白混合物的溶液(50 yl)，讓 板在4°C下放置過夜，從而使蛋白質(zhì)固定在板上。除去蛋白質(zhì)溶液，向每個(gè)孔中加入150 yl Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)，然后將板在室溫下經(jīng)歷封閉，進(jìn)行4小 時(shí)。如下所述將這些板用于篩選雜交瘤的培養(yǎng)上清液中的抗HCV抗體。4)使用J6/JFH-1-HCV顆粒抗原制備的雜交瘤的培養(yǎng)上清液的篩選
用含有0.1% Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗上述步驟3)中制備的已在其上固定 了來源于J6CF株的El和E2蛋白的板4次，向孔中加入50 μ 1實(shí)施例6中獲得的雜交瘤上 清液樣品，讓反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)，同時(shí)用板混合器搖動(dòng)板。在反應(yīng)后，用含有0. 1% Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗板4次，向各孔中加入50 μ 1已用含有0. 1 % Tween 20的 PBS稀釋了 5，000倍的HRP-標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(AmershamBiosciences)，讓反應(yīng)在室 溫下進(jìn)行1小時(shí)，同時(shí)搖動(dòng)板。在反應(yīng)后，用含有0. Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗板 4次，使用針對(duì)過氧化物酶的顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)進(jìn)行顯色，使用 Multi-Scan (Titer-Tech)測(cè)量450nm處的吸光率，并且選擇陽(yáng)性克隆。然后，使用J6/JFH-1-HCV顆粒作為感染劑來評(píng)估對(duì)陽(yáng)性克隆的培養(yǎng)上清液的HCV 的感染的抑制活性。隨后，將含有J6/JFH1-HCV顆粒的具有l(wèi)X106fTu/ml的感染效價(jià)的 溶液與等量的雜交瘤上清液混合，將混合物在37°C下培養(yǎng)1小時(shí)。此后，向已在前一天將 Huh-7細(xì)胞以IX IO4個(gè)細(xì)胞/孔接種入其中的96孔多聚L賴氨酸涂鋪的板(Corning 96 孔透明平底多聚L賴氨酸包被的微量培養(yǎng)板，Corning)中加入J6/JFH-1-HCV顆粒與雜交 瘤培養(yǎng)上清液的混合樣品，在37°C下培養(yǎng)72小時(shí)。在除去樣品后，將板浸漬于冰冷的甲醇中以固定細(xì)胞。然后，通過空氣干燥除 去甲醇，使用含有 0. 3 % Triton -X 100 (GE Healthcare)的 Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co. ,Ltd.)透化細(xì)胞。使用克隆 2H9 抗 HCV 核心抗體(Wakita，T.等，Nat. Med. 11 791-796,2005)和山羊抗小鼠 IgG_Alexa488 (Molecular Probes)檢測(cè) HCV 感染的 細(xì)胞，在熒光顯微鏡(IX-70 ;01ympUS)下計(jì)數(shù)HCV感染的細(xì)胞的數(shù)目。兩個(gè)各自展示更少 數(shù)目的感染細(xì)胞的樣品被選擇作為產(chǎn)生對(duì)HCV感染活性具有抑制作用的單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞。通過有限稀釋克隆這些細(xì)胞系，獲得克隆J6/1G11_25(登錄號(hào)FERM BP-10980) 和 J6/4D4-2(登錄號(hào)FERM BP-10981)。5)使用JFH-I-HCV顆?？乖苽涞碾s交瘤的培養(yǎng)上清液的篩選用含有0. 1% Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗上述步驟3)中制備的已在其上固定了 來源于JFH-I株的El和E2蛋白的板4次，向孔中加入50 μ 1實(shí)施例6中獲得的雜交瘤上 清液樣品，讓反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)，同時(shí)用板混合器搖動(dòng)板。在反應(yīng)后，用含有0. 1% Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗板4次，向各孔中加入50 μ 1已用含有0. 1 % Tween20的PBS 稀釋了 5，000倍的HRP-標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(AmershamBiosciences)，同時(shí)搖動(dòng)板。在 反應(yīng)后，用含有0. 1 % Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗板4次，使用針對(duì)過氧化物酶的顯色試 劑盒(SumitomoBakelite Co. ,Ltd.)進(jìn)行顯色，使用 Multi-Scan(Titer-Tech)測(cè)量 450nm 處的吸光率。從陽(yáng)性克隆中選擇4個(gè)克隆作為產(chǎn)生識(shí)別JFH-I株的El和/或E2蛋白的 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。然后，使用J6/JFH-1-HCV顆粒作為感染劑以與4)中相同的 方式評(píng)估對(duì)陽(yáng)性克隆的培養(yǎng)上清液的HCV感染的抑制活性。作為結(jié)果，獲得陽(yáng)性克隆JF/ M1-4 (登錄號(hào)FERM BP-10982)。陽(yáng)性克隆JF/M1-4是產(chǎn)生識(shí)別JFH-I株的El和/或E2蛋 白的單克隆抗體和產(chǎn)生抑制J6/JFH-1-HCV感染的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。[實(shí)施例8]抑制HCV感染的單克隆抗體的分析將實(shí)施例7中選擇的3個(gè)雜交瘤細(xì)胞系J6/1G11-25 (登錄號(hào)FERMBP_10980)、 J6/4D4-2(登錄號(hào)FERM BP-10981)和 JF/M1_4(登錄號(hào)FERM BP-10982)從 2007 年 7 月 19 HInternational PatentOrganism Depositary of the National Instituteof Advanced IndustrialScience and Technology(Central 6，1-1-1 Higashi, Tsukuba， Ibaraki,305-8566, Japan)。如下分析從此類雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抑制HCV感染的單克隆抗體的性質(zhì)。1)抗體亞類通過使用ImmunoPure Antibody Isotyping試劑盒(Pierce)分析陽(yáng)性克隆的培養(yǎng)上清液來確定小鼠抗體亞類。作為克隆的同種型分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所有克隆具有μ-型 H鏈和K-型L鏈。因此，發(fā)現(xiàn)這些克隆為IgM亞類。2)分子量將雜交瘤培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)上清液經(jīng)歷使用50%硫酸銨的鹽析，然 后對(duì)PBS進(jìn)行透析。之后，將所得產(chǎn)物在還原條件下經(jīng)歷SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈，用考 馬斯亮藍(lán)染色，估計(jì)抗體的H鏈和L鏈的分子量。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)來自所有克隆的抗體具有 分子量為70kDa的H鏈和分子量為23kDa的L鏈。3)單克隆抗體的對(duì)HCV感染的抑制活性的評(píng)估從各雜交瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)上清液純化單克隆抗體。通過將適應(yīng)于或培養(yǎng)在無血清 培養(yǎng)基雜交瘤-SFM中的雜交瘤的上清液經(jīng)歷50%硫酸銨沉淀和對(duì)PBS的透析來進(jìn)行抗體 的純化。通過使用純化的小鼠IgMK (Sigma)作為標(biāo)準(zhǔn)和使用考馬斯染色進(jìn)行SDS-PAGE來 測(cè)定純化的抗體樣品的濃度。以與上所述方式相同的方式評(píng)估所制備的純化的來源于雜交瘤細(xì)胞系的單克隆 抗體的對(duì)HCV感染的抑制活性。S卩，向細(xì)胞加入抗體和感染性HCV顆粒，進(jìn)行溫育，測(cè)量感 染細(xì)胞中HCV RNA的濃度，分析細(xì)胞中HCV RNA的量。由于細(xì)胞中HCV RNA是從感染性HCV 顆粒復(fù)制而來的，因此如果感染被單克隆抗體抑制，則細(xì)胞中HCV RNA的量應(yīng)當(dāng)減少。特別地，將純化的單克隆抗體各自與感染性HCV顆粒(J6/JFH-1-HCV顆粒)混合 以使單克隆抗體成為10μ g/ml的混合物以及感染性HCV顆粒達(dá)到IO7個(gè)拷貝/ml的混合 物，讓所得的產(chǎn)物在室溫下放置1小時(shí)。棄去用于已在前一天以4X IO4個(gè)細(xì)胞/孔接種于 24孔板并且在其中培養(yǎng)的Huh-7細(xì)胞的培養(yǎng)基，以200 μ 1/孔向其中加入J6/JFH-1-HCV 顆粒和純化的單克隆抗體的混合物。將細(xì)胞在37°C下溫育3小時(shí)，棄去含有病毒顆粒的溶 液，用PBS清洗孔一次。加入新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)2天，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗孔一次， 使用Trizol試劑(Invitrogen)提取RNA。測(cè)定提取的RNA中含有的HCV RNA的拷貝。根 據(jù) Takeuchi 等(Gastroenterology，1999，116，pp. 636-42.)的方法測(cè)定 RNA 拷貝數(shù)目。圖4顯示評(píng)估純化的來源于雜交瘤細(xì)胞系J6/1G11-25、J6/4D4_2和JF/M1-4的單 克隆抗體(分別稱為J6/1G11-25單克隆抗體、J6/4D4-2單克隆抗體和JF/M 1-4單克隆抗 體)和對(duì)照抗體(人IgG)對(duì)J6/JFH-1-HCV感染的抑制活性的結(jié)果。同樣地，圖5顯示評(píng) 估純化的來源于雜交瘤細(xì)胞系J6/JFH-1-HCV的單克隆抗體和對(duì)照抗體對(duì)J6/JFH-1-HCV感 染的抑制活性的結(jié)果。如圖4和圖5中所示，除了對(duì)照抗體外的所有抗體顯示抑制HCV感 染的活性。[實(shí)施例9]JF/M1-4單克隆抗體的表位的分析關(guān)于JFH-I株的El蛋白的氨基酸1至162 (SEQ ID NO 25)和JFH-I株的E2蛋白 的氨基酸1至337 (SEQ ID NO 26)，合成含有具有10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的肽，所 述氨基酸序列被設(shè)計(jì)為各自從N端偏移3個(gè)氨基酸。對(duì)肽的N末端進(jìn)行生物素化，C末端是甘氨酰胺(委托JPT合成肽)。將合成肽溶解于DMSO中，然后以0. Olnmol/μ 1的濃度溶解于PBS中。向鏈霉抗生物素蛋白涂鋪的板(Nunc)的孔中加入肽溶液(50 μ 1)，讓反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。然 后，棄去肽溶液，以200 μ 1/孔加入BlockingOne (Nacalai Tesque)，讓板在室溫下靜置5小 時(shí)。棄去Blocking One溶液，用150 μ 1/孔的含有0. 05% Tween 20的PBS (ρΗ7. 2)清洗板
4次，以 50 μ 1/ 孔加入用含有 0. 05% Tween 20 的 PBS (ρΗ7. 2)稀釋的 1 μ g/ml 的 JF/M1-4 單克隆抗體，讓反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。然后，棄去抗體溶液，用150 μ 1/孔的含有0. 05% Tween 2的PBS (ρΗ7. 2)清洗板5次，加入50 μ 1/孔的用含有0. 05% Tween 20的PBS稀釋 5，000倍的HRP-標(biāo)記的抗小鼠IgG山羊抗體(GE Healthcare)，讓反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小 時(shí)。在反應(yīng)后，棄去抗體溶液，用150 μ 1/孔的含有0. 05% Tween20的PBS (pH7. 2)清洗板 5次。在清洗后，使用針對(duì)HRP的顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)檢測(cè)結(jié)合至 肽的抗體。圖6A顯示JF/M1-4單克隆抗體對(duì)來源于JFH-I株的El蛋白的表位(肽編號(hào)1至 52)的結(jié)合強(qiáng)度，所述結(jié)合強(qiáng)度用如在OD 450nm處測(cè)定的抗體水平來表示。圖6B顯示JF/ M1-4單克隆抗體對(duì)來源于JFH-I株的E2蛋白的肽(肽編號(hào)1至110)的結(jié)合強(qiáng)度，所述結(jié) 合強(qiáng)度用如在OD 450nm處測(cè)定的抗體水平來表示。當(dāng)在OD 450nm處的測(cè)量值(即，圖6A 或6B中沿著垂直軸的值)為高時(shí)，JF/M1-4單克隆抗體對(duì)肽的結(jié)合強(qiáng)度高，這表示抗體識(shí) 別表位。作為結(jié)果，JF/M1-4單克隆抗體不識(shí)別來源于JFH-I株的El蛋白的任何肽(圖 6A)但識(shí)別來源于JFH-I株的E2蛋白的一些肽(圖6B)。特別強(qiáng)的表位是LVHYPYRLWH(SEQ ID NO 18 ；圖6B中的肽編號(hào)77)，與所述強(qiáng)肽重疊的肽WLTPKCLVHY (SEQ ID NO :19 ;p圖6B 中的肽編號(hào) 75)、PKCLVHYPYR(SEQ ID NO 20 ；圖 6B 中的肽編號(hào) 76)和 YPYRLffHYPC(SEQ ID NO 21 ；圖6B中的肽編號(hào)78)是弱表位。此外，肽NFTIH(IRMY(SEQ ID NO 22 ；圖6B中的肽 編號(hào)82)和Ii7KIRMYVCG (SEQ ID NO 23 ；圖6B中的肽編號(hào)83)被鑒定為弱表位。因此，發(fā)現(xiàn)JF/M1-4單克隆抗體能夠識(shí)別JFH-1株的E2蛋白內(nèi)的包含強(qiáng)表位的 WLTPKCLVHYPYRLffHYPC (SEQ ID NO 24)為表位。[實(shí)施例10]J6/1G11-25單克隆抗體和J6/4D4-2單克隆抗體對(duì)J6/JFH-1-HCV顆 粒的表位的分析關(guān)于J6CF株的El蛋白的氨基酸1至162 (SEQ ID NO :27)和J6CF株的E2蛋白的 氨基酸1至337 (SEQ ID NO :28)，合成含有具有10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的肽，所述 氨基酸序列被設(shè)計(jì)為各自從N端偏移3個(gè)氨基酸。對(duì)肽的N末端進(jìn)行生物素化，C末端是 甘氨酰胺(委托JPT合成肽)。將合成的肽溶解于DMSO中，然后以0. Olnmol/μ 1的濃度溶解于PBS中。向鏈霉 抗生物素蛋白涂鋪的板(Nunc)的孔中加入肽溶液(50 μ 1)，讓反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。 然后，棄去肽溶液，以200 μ 1/孔加入Blocking One (Nacalai Tesque)，讓板在室溫下靜置
5小時(shí)。棄去 Blocking One 溶液，用 150 μ 1/孔的含有 0. 05 % Tween 20 的 PBS (ρΗ7. 2) 清洗板4次，以50 μ 1/孔加入用含有0. 05% Tween 20的PBS (ρΗ7. 2)稀釋的1 μ g/ml的 J6/1G11-25或J6/4D4-2單克隆抗體，讓反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。然后，棄去抗體溶液， 用150 μ 1/孔的含有0. 05% Tween2的PBS(pH7. 2)清洗板5次，加入50 μ 1/孔的用含有0. 05% Tween 20的PBS稀釋5，000倍的HRP-標(biāo)記的抗小鼠IgG山羊抗體(GEHealthcare)， 讓反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。在反應(yīng)后，棄去抗體溶液，用150 μ 1/孔的含有0.05% Tween 20的PBS (ρΗ7. 2)清洗板5次。然后，借助于針對(duì)HRP的顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)，使用分光光度計(jì)(在OD 450nm)檢測(cè)結(jié)合至肽的抗體。圖7A顯示J6/1G11-25單克隆抗體對(duì)來源于J6CF株的El蛋白的表位(肽編號(hào)1 至52)的結(jié)合強(qiáng)度。圖7B顯示J6/1G11-25單克隆抗體對(duì)來源于J6CF株的E2蛋白的肽 (肽編號(hào)1至110)的結(jié)合強(qiáng)度。當(dāng)在0D450nm處的測(cè)量值(即，圖7A或7B中沿著垂直軸 的值)高時(shí)，J6/1G11-25單克隆抗體對(duì)肽的結(jié)合強(qiáng)度高，這表示抗體特異性識(shí)別表位。作為結(jié)果，J6/1G11-25單克隆抗體不識(shí)別來源于J6CF的El蛋白的任何肽(圖 7A)但識(shí)別來源于J6CF株的E2蛋白的一些肽(圖7B)。由J6/1G11-25單克隆抗體識(shí)別的 肽是 NVTNPEDMRP (SEQ ID NO 29 ；圖 7B 中的肽編號(hào) 32)和與其重疊的 NPEDMRPYCW(SEQ ID N0:30 ；圖7B中的肽編號(hào)33)、和NYTIFKIRMY(SEQ ID NO :31 ；圖7B中的肽編號(hào)82)和與其 重疊的 IFKIRMYVGG(SEQ ID NO 32 ；圖 7B 中的肽編號(hào) 83)。圖8A顯示J6/4D4-2單克隆抗體對(duì)來源于J6CF株的El蛋白的表位(肽編號(hào)1至 52)的結(jié)合強(qiáng)度。圖8B顯示J6/4D4-2單克隆抗體對(duì)來源于J6CF株的E2蛋白的肽(肽編 號(hào)1至110)的結(jié)合強(qiáng)度。當(dāng)在OD 450nm處的測(cè)量值(S卩，圖8A或8B中沿著垂直軸的值) 高時(shí)，J6/4D4-2單克隆抗體對(duì)肽的結(jié)合強(qiáng)度高，這表示抗體特異性識(shí)別肽。作為結(jié)果，J6/4D4-2單克隆抗體識(shí)別來源于J6CF的El蛋白的一些肽和來源于 J6CF株的E2蛋白的一些肽，如圖8中所示的。El來源的強(qiáng)肽是FIVSPQHHWF(SEQ ID NO: 33 ；圖8A中的肽編號(hào)34)，與所述強(qiáng)肽重疊的SPQHHWFVQD (SEQ ID NO :34 ；圖8A中的肽編 號(hào)35)和HHWFVQDCNC(SEQ ID NO :35 ；圖8A中的肽編號(hào)36)是弱表位。另一個(gè)強(qiáng)表位是 MAffDMMMNWS (SEQ ID NO 36 ；圖 8A 中的肽編號(hào) 43)。E2-來源的強(qiáng)表位是LIDYPYRLWH(SEQ ID NO 37 ；圖8B中的肽編號(hào)77)和與該肽 重疊的 YPYRLffHYPC(SEQ ID NO 38 ；圖 8B 中的肽編號(hào) 78)，禾口 DMRPYCffHYP (SEQ ID NO 39 ； 圖8B中的肽編號(hào)34)。與最后一個(gè)強(qiáng)肽重疊的NPEDMRPYCW(SEQ ID NO 40 ；圖8B中的肽編 號(hào)33)禾口 PYCWHYPPRQ(SEQ ID NO 41 ；圖8B中的肽編號(hào)35)是弱表位。相對(duì)強(qiáng)的表位是NYTinQRMY (SEQ ID NO :31 ；圖8B中的肽編號(hào)82)，與其重疊的 IFKIRMYVGG(SEQ ID NO 32 ；圖8B中的肽編號(hào)83)是弱表位。此外，STRPPLGSffF(SEQ ID NO :42 ；圖 8B 中的肽編號(hào) 54)和 GSffFGCTWMN (SEQ ID NO 43 ；圖8B中的肽編號(hào)56)被鑒定為弱表位。因此，發(fā)現(xiàn)J6/1G11-25單克隆抗體識(shí)別J6CF株的E2蛋白內(nèi)的氨基酸序列 NVTNPEDMPRPYCff (SEQ ID NO 44)和 NYTIFKIRMYVGG(SEQ ID NO 45)為表位。此外，還發(fā)現(xiàn)J6/4D4-2單克隆抗體識(shí)別J6CF株的E1蛋白內(nèi)的氨基酸序列FIVSPQHHWFVQDCNC (SEQ ID NO 46)和 MAWDMMMNWS (SEQ ID NO 36)為表位以及識(shí)別 J6CF 株的 E2 蛋白內(nèi)的氨基酸序列 LIDYPYRLWHYPC(SEQ ID NO 47), NPEDMRPYCffHYPPRQ(SEQ ID NO 48)和 NYTIFKIRMYVGG(SEQID NO 45)作為為表位。[實(shí)施例11]編碼JF/M1-4單克隆抗體的V區(qū)的DNA的克隆如下克隆編碼抗HCV顆粒的JF/M1-4小鼠單克隆抗體的可變區(qū)的DNA。1)總RNA的制備
按照所附手冊(cè)中所述的方法使用PureLink Micro-to-Midi (Invitrogen)從JF/ M1-4雜交瘤細(xì)胞系制備總RNA。特別地，將2 X IO8個(gè)雜交瘤株JF/M1-4細(xì)胞懸浮于2. 4mlRNA 裂解溶液，使用18計(jì)量注射針將細(xì)胞通過注射器數(shù)次來進(jìn)行勻漿。離心所得的勻漿，向相 同量的所得上清液中加入70%的乙醇，將混合物用于RNA旋轉(zhuǎn)藥筒(spincartridge)。通 過加入清洗溶液充分清洗藥筒，使用不含RNA酶的水洗脫RNA。2)單鏈cDNA的合成
通過使用μ -型H鏈-和κ -型L鏈特異性引物，如下從上述1)中制備的總RNA 合成鏈特異性引物、單鏈cDNA。i)編碼JF/M1-4單克隆抗體的μ -型H的cDNA的合成向 5 μ g RNA 中加入 50pmol 的 μ -型 H 鏈特異性引物 mCHm-as (SEQ ID NO 49 ；5， -AGGCTTACTAGTAGCTGGAATGGGCACATGCAGATC-3，)以進(jìn)行退火，向其中加入 5 μ 1 0. IM DTT、 1. 25μ 1 20mM dNTP溶液和10μ1 SuperScriptII提供的5x RT緩沖液，向其中加入蒸餾水 (Dff)以使終體積達(dá)到49 μ 1。然后，加入1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptII (Invitrogen)，在42°C下進(jìn)行反應(yīng)30分 鐘，和在50°C下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后將反應(yīng)溶液直接用于下一步驟，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)。ii)編碼JF/M1-4單克隆抗體的κ -型L鏈的cDNA的合成向 5 μ g RNA 中加入 50pmol 的 κ -型 L 鏈特異性引物 mCKl-as (SEQ ID NO 50 ；5 ，-CATGTCTAGAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3，)以進(jìn)行退火，向其中加入 5 μ 1 0. IM DTT、 1. 25 μ 1 20mM dNTP溶液和10 μ 1 SuperScriptII提供的5χ RT緩沖液，向其中加入蒸餾 水(Dff)以使終體積達(dá)到49μ1。然后，加入1μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptII (Invitrogen)， 在42°C下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，和在50°C下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，然后將反應(yīng)產(chǎn)物直接用于下一 步驟，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。3)通過PCR法進(jìn)行的編碼JF/M1-4單克隆抗體的可變區(qū)的基因的擴(kuò)增利用GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)，使用 Advantage GC2DNA polymerase 試劑盒(TAKARA)進(jìn)行 PCR。 i)編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA的擴(kuò)增按照所附手冊(cè)中描述的條件使用小鼠Ig引物組(69831-3，Novagen)進(jìn)行PCR。特別地，使用試劑盒提供的MuIgVH5' -A至MuIgVH5' _F引物(與小鼠H鏈的前 導(dǎo)序列雜交的)和MuIgMVH3' -1引物(與小鼠μ -型H鏈C區(qū)雜交的)進(jìn)行PCR。向5μ 1上面制備的因合成成編碼μ _型H鏈的單鏈cDNA而產(chǎn)生的反應(yīng)混合物 中加入10 μ 1試劑盒提供的5x PCR緩沖液、10μ1 GCMelt、4yl 2. 5mM dNTP溶液、1.25 個(gè)單位的 Advantage GC2DNA 聚合酶混合物(TAKARA)、lyl IOpmol/μ 1 MuIgVH5'引物和 1 μ 1 5pmol/y 1 MuIgMVH3' -1引物。再加入蒸餾水(Dff)以使終體積達(dá)到50 μ 1。按如下 順序在94°C下溫育PCR溶液(50 μ 1)進(jìn)行4分鐘，然后在94°C下加熱1分鐘，在50°C (在 MuIgVH5 ‘ -A 和 MuIgVH5 ‘ -B 的情況下)或 60°C (在 MuIgVH5 ‘ -C 至 MuIgVH5 ‘ -F 的情 況下)進(jìn)行1分鐘，在72°C下進(jìn)行2分鐘。重復(fù)該熱循環(huán)40次，然后將反應(yīng)混合物在72°C 下再溫育6分鐘。ii)編碼小鼠L鏈V區(qū)的基因的擴(kuò)增
按照所附手冊(cè)中所述的條件使用小鼠Ig引物組(69831-3，Novagen)進(jìn)行PCR。特別地，使用試劑盒提供的MuIg κ VL5' -A至MuIgKVL5'引物(與小鼠κ-型L 鏈的前導(dǎo)序列雜交的)和MuIg κ VL3' -1引物(與小鼠κ-型L鏈C區(qū)雜交的)進(jìn)行PCR。向5 μ 1上面制 備的因合成編碼κ -型L鏈的單鏈cDNA而產(chǎn)生的反應(yīng)混合物中加 入10 μ 1試劑盒提供的5x PCR緩沖液、10 μ 1 GC Melt,4 μ 1 2. 5mM dNTP溶液、1. 25個(gè)單 位的 Advantage GC2DNA 聚合酶混合物(TAKARA)、1 μ 1 lOpmol/μ 1 MuIgK VL 5'引物和 1 μ 1 5pmol/y 1 MuIg κ VL3' -1引物。再加入蒸餾水(DW)以使終體積達(dá)到50 μ 1。按如 下順序在94°C下溫育PCR溶液(50 μ 1)進(jìn)行4分鐘，然后在94°C下加熱1分鐘，在50°C (在 MuIgVL5 ‘ -A 和 MuIgVL5 ‘ -B 的情況下)或 60°C (在 MuIgVL5 ‘ -C 至 MuIgVL5 ‘ -F 的情 況下)進(jìn)行1分鐘，在72°C下進(jìn)行2分鐘。重復(fù)該熱循環(huán)40次，然后將反應(yīng)混合物在72°C 下再溫育6分鐘。4) PCR產(chǎn)物的純化和其至質(zhì)粒載體的克隆通過瓊脂糖凝膠電泳分離如上所述擴(kuò)增的DNA片段PCR。使用GeneElute (Sigma) 純化長(zhǎng)度為大約450bp的DNA片段。使用TOPO TACloning試劑盒(Invitrogen)克隆DNA 片段。加入試劑盒提供的pCR-TOPO載體、DNA片段和試劑盒提供的鹽溶液，讓所得物在室溫 下靜置5分鐘，向大腸桿菌Machl (Invitrogen)的感受態(tài)細(xì)胞中加入一部分反應(yīng)溶液。將 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上進(jìn)行30分鐘，然后于42°C下加熱30秒，再置于冰上進(jìn)行1分 鐘。向其中加入SOC培養(yǎng)基(室溫)，將細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)1小時(shí)，然后將其接種在瓊脂培 養(yǎng)基上，然后在37°C下培養(yǎng)過夜。從所得的轉(zhuǎn)化株制備質(zhì)粒DNA，按照常規(guī)技術(shù)測(cè)定克隆的 DNA的核苷酸序列。5)編碼JF/M1-4單克隆抗體的V區(qū)的cDNA的核酸序列的分析如下分析克隆在質(zhì)粒中的DNA，在上述步驟4)中確定了其核苷酸序列(其為編碼 JF/M1-4小鼠單克隆抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的cDNA)。i)編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA的核酸序列的分析發(fā)現(xiàn)許多所得的克隆中克隆的H鏈V區(qū)的核酸序列除了小鼠H鏈前導(dǎo)序列的區(qū)域 外都相同。這表明復(fù)數(shù)個(gè)所測(cè)試的克隆來源于使用不同的編碼小鼠H鏈前導(dǎo)序列的引物的 混合物通過PCR獲得的獨(dú)立的分離株。此外，通過就根據(jù)它們的核酸序列推導(dǎo)的編碼的氨 基酸序列搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，推導(dǎo)了來自JF/M1-4小鼠單克隆抗體的H鏈V區(qū)的從構(gòu)架1至J區(qū) 段(構(gòu)架4)的區(qū)域的序列(SEQ ID N0s:55至61)。核酸序列和由其確定的氨基酸序列分 別示于序列表的SEQ ID N0s:51和52中。此外，從氨基酸序列推導(dǎo)的⑶Rl至⑶R3示于圖 9中。已顯示JF/M1-4小鼠單克隆抗體的H鏈V區(qū)(核酸序列SEQ ID NO :51 ；氨基酸序 列SEQ ID NO 52)在抗體對(duì)表位(即，WLTPKCLVHYPYRLWHYPC(SEQID NO 24)或其含有 10 或更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的部分)的識(shí)別起著重要作用。ii)編碼小鼠L鏈V區(qū)的cDNA的核酸序列的分析除了小鼠L鏈的前導(dǎo)序列外，發(fā)現(xiàn)許多所得的克隆中克隆的L鏈的V區(qū)的核酸序 列是相同的。這表明復(fù)數(shù)個(gè)所檢測(cè)的克隆來源于使用不同的編碼小鼠L鏈前導(dǎo)序列的引物 的混合物通過PCR獲得的獨(dú)立的分離株。此外，通過就根據(jù)它們的核酸序列推導(dǎo)的編碼的 氨基酸序列搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，可推導(dǎo)出JF/M 1-4小鼠單克隆抗體的L鏈V區(qū)的從構(gòu)架1至J區(qū) 段(構(gòu)架4)的區(qū)域的序列(SEQ ID N0:62至68)。核酸序列和由其確定的氨基酸序列分別示于序列表的SEQ ID NOs 53和54中。此外，從氨基酸序列推導(dǎo)的⑶Rl至⑶R3示于圖10中。已顯示JF/M1-4小鼠單克隆抗體的L鏈V區(qū)(核酸序列SEQ ID NO 53 ；氨基酸序 列SEQ ID NO 54)在抗體對(duì)表位(即，WLTPKCLVHYPYRLWHYPC(SEQID NO 24)或其含有 10 或更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的部分)的識(shí)別起著重要作用。工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明的具有對(duì)HCV感染的抑制活性的抗體可用作HCV感染的治療性或預(yù)防 性藥物。序列表自由正文SEQ ID NO 1公開了克隆入pJFH-Ι的HCV基因組長(zhǎng)度的cDNA。SEQ ID NO 2公開了克隆入PJ6/JFH-1的嵌合HCV基因組長(zhǎng)度的cDNA序列。SEQ ID NO 3公開了克隆入pTH/JFH-Ι的HCV基因組長(zhǎng)度的cDNA序列。SEQ ID NO :4 公開了引物(JFH-I-A)的序列。SEQ ID NO :5 公開了引物(JFH-I-B)的序列。SEQ ID NO :6 公開了引物(TH-C)的序列。SEQ ID NO :7 公開了引物(TH-D)的序列。SEQ ID NO :8 公開了引物(JFH-I-E)的序列。SEQ ID NO 9 公開了引物(JFH-I-F)的序列。SEQ ID N0:10 公開了引物(J6EldTM_s)的序列。SEQ ID NO 11 公開了引物(J6EldTM_as)的序列。SEQ ID N0:12 公開了引物(J6E2dTM_s)的序列。SEQ ID N0:13 公開了引物(J6E2dTM_as)的序列。SEQ ID N0:14 公開了引物(JFHEldTM-s)的序列。SEQ ID N0:15 公開了引物(JFHEldTM-as)的序列。SEQ ID N0:16 公開了引物(JFHE2dTM_s)的序列。SEQ ID N0:17 公開了引物(JFHE2dTM_as)的序列。SEQ ID NOs 18至24公開了合成肽的序列。SEQ ID NO 25公開了包含JFH-1株的El蛋白的氨基酸1至162的氨基酸序列。SEQ ID NO 26公開了包含JFH-I株的E2蛋白的氨基酸1至337的氨基酸序列。SEQ ID NO 27公開了包含J6CF株的El蛋白的氨基酸1至162的氨基酸序列。SEQ ID NO 28公開了包含J6CF株的E2蛋白的氨基酸1至337的氨基酸序列。SEQ ID NOs 29至48公開了合成肽的序列。SEQ ID N0:49 公開了引物(mCHm-as)的序列。SEQ ID N0:50 公開了引物(mCKl-as)的序列。SEQ ID NO 51公開了編碼JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(qū)(即，重鏈可變區(qū))的 基因的核苷酸序列。SEQ ID NO 52公開了編碼JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(qū)(即，重鏈可變區(qū))的 基因的氨基酸序列。SEQ ID NO 53公開了編碼JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(qū)(即，輕鏈可變區(qū))的 基因的核苷酸序列。
SEQIDNO 54公開了編碼JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(qū)(即，輕鏈可變區(qū))的 基因的氨基酸序列。SEQIDNO 55公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(qū)的構(gòu)架1的氨基酸序列。SEQIDNO 56公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(qū)的CDRl的氨基酸序列。SEQIDNO 57公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(qū)的構(gòu)架2的氨基酸序列。SEQIDNO 58公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(qū)的CDR2的氨基酸序列。SEQIDNO 59公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(qū)的構(gòu)架3的氨基酸序列。SEQIDNO 60公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(qū)的CDR3的氨基酸序列。SEQIDNO :61公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(qū)的構(gòu)架4 (即，J區(qū)段)的氨 基酸序列。SEQIDNO 62公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(qū)的構(gòu)架1的氨基酸序列。SEQIDNO 63公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(qū)的CDRl的氨基酸序列。SEQIDNO 64公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(qū)的構(gòu)架2的氨基酸序列。SEQIDNO 65公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(qū)的CDR2的氨基酸序列。SEQIDNO 66公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(qū)的構(gòu)架3的氨基酸序列。SEQIDNO 67公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(qū)的CDR3的氨基酸序列。SEQIDNO :68公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(qū)的構(gòu)架4 (即，J區(qū)段)的氨 基酸序列。
權(quán)利要求
抗體，其識(shí)別獲自丙型肝炎病毒(HCV)的基因組的丙型肝炎病毒(HCV)顆粒為抗原并且對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)的基因組包括彼此連接的下列(i)和(ii)(i)(a)丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、E1蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列，或(b)丙型肝炎病毒(HCV)的J6CF株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、E1蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列；和(ii)JFH-1株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(qū)。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)基因組是含有序列表的SEQID NO :1或2中所示的核苷酸序列的核酸(條件是當(dāng)所述核酸是RNA時(shí)，將核苷酸序列中的核 苷酸“T”讀為“U”)。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述抗體類別是IgM。
4.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的抗體，其識(shí)別序列表的SEQIDNO 24中所示的氨基酸序 列中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。
5.權(quán)利要求4的抗體，其具有含有序列表的SEQID NO :52中所示的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)。
6.權(quán)利要求4或5的抗體，其具有含有序列表的SEQID NO :54中所示的氨基酸序列 的輕鏈可變區(qū)。
7.權(quán)利要求4至6的任一項(xiàng)的抗體，其由登錄號(hào)為FERMBP-10982的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
8.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的抗體，其識(shí)別序列表的SEQID NO 44或45中所示的氨 基酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。
9.權(quán)利要求8的抗體，其由登錄號(hào)為FERMBP-10980的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
10.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的抗體，其識(shí)別序列表的SEQID NO :36、45、46、47或48 中所示的氨基酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。
11.權(quán)利要求10的抗體，其由登錄號(hào)為FERMBP-10981的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
12.丙型肝炎病毒(HCV)感染的抑制劑，其包含權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)的抗體作為 活性成分。
13.藥物，其包含權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)的抗體作為活性成分。
14.用于丙型肝炎的治療劑或預(yù)防劑，其包含權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)的抗體作為活 性成分。
15.用于檢測(cè)丙型肝炎病毒(HCV)的方法，其包括使用權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)的抗 體檢測(cè)丙型肝炎病毒(HCV)顆粒。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染的抗體。為此目的，本發(fā)明提供了抗體，所述抗體將獲自丙型肝炎病毒(HCV)基因組的丙型肝炎病毒(HCV)顆粒識(shí)別為抗原并且對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性，所述基因組包含下列彼此連接的(i)和(ii)(i)(a)丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株的5’-非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、E1蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列或(b)丙型肝炎病毒(HCV)的J6CF株的5’-非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、E1蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列；和(ii)JFH-1株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’-非翻譯區(qū)。
文檔編號(hào)G01N33/576GK101809033SQ20088010858
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日
發(fā)明者中村紀(jì)子, 尾見法昭, 森川賢一, 脅田隆字, 赤澤大輔, 鈴木哲朗 申請(qǐng)人:日本國(guó)立感染癥研究所;東麗株式會(huì)社