專利名稱：針對(duì)胃泌素釋放肽前體的抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種針對(duì)胃泌素釋放肽前體的抗體及其應(yīng)用，所述抗體廣泛用于包括 小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的各種疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療監(jiān)測(cè)、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等。
背景技術(shù)：
在日本，死因的第1位是惡性腫瘤，其中肺癌死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，在男性中超 過(guò)胃癌成為死因的第1位，在女性中也占第3位。肺癌在病理組織學(xué)上主要分為以下4種 組織類型，即發(fā)生于肺門部的肺鱗狀上皮細(xì)胞癌(squamous-cell carcinoma)和小細(xì)胞 肺癌(small-cell lungcarcinoma :SCLC)、發(fā)生于肺野部的肺腺癌(adenocarcinoma)和大 細(xì)胞月市癌(Large-cell lung carcinoma)。尤其是小細(xì)胞肺癌，由于增殖快速，早期即發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此初診時(shí)發(fā)現(xiàn)大多已 是全身性轉(zhuǎn)移的進(jìn)行性癌。關(guān)于該類型癌的治愈率，對(duì)于病變局限于一側(cè)肺野的小細(xì)胞肺 癌的局限型(Limited disease :LD)患者，其治愈率為約20%；對(duì)于已經(jīng)轉(zhuǎn)移至兩肺和其他 臟器的擴(kuò)散型(extensive disease :ED)患者，可以說(shuō)事實(shí)上難以治愈。此外，由于小細(xì)胞肺癌對(duì)抗癌劑的敏感性高，因此，化學(xué)療法是首選的治療方法， 相反，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma :non_SCLC)，由于化學(xué)療法的 療效差，因此外科療法是首選的治療方法。因此，小細(xì)胞肺癌是肺癌中特別需要早期發(fā)現(xiàn)、早期治療的癌癥，所以，將小細(xì)胞 肺癌和非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行鑒別診斷，對(duì)于確定治療方案極其重要。發(fā)現(xiàn)肺癌的方法之一是痰液檢查。然而，痰液檢查主要適于肺鱗狀上皮細(xì)胞癌的 檢查，對(duì)小細(xì)胞肺癌而言，存在陽(yáng)性率低的問(wèn)題。此外，X射線攝影法也是廣泛使用的發(fā)現(xiàn) 肺癌的方法，但是對(duì)于發(fā)生于肺門部的肺鱗狀上皮細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌，肺門部由于受到 心臟的影響，存在癌組織的陰影非常難以拍到的問(wèn)題。此外，關(guān)于小細(xì)胞肺癌，對(duì)肺野呈現(xiàn) 異常陰影的患者，即使使用痰液細(xì)胞學(xué)診斷、胸部X射線普通攝影、CT掃描、支氣管內(nèi)窺鏡 等，也難以早期發(fā)現(xiàn)該類肺癌。此外，用于診斷癌癥的一些檢查方法，例如放射線照射、活組織檢查或支氣管內(nèi)窺 鏡等，會(huì)對(duì)患者造成痛苦，且需要昂貴的儀器和熟練的技術(shù)等。因此，正在進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物的研究，以便通過(guò)更簡(jiǎn)便的血液檢查，在能夠治愈的時(shí) 期可高效診斷出癌癥。目前，在癌癥的發(fā)現(xiàn)、診斷、病情監(jiān)測(cè)指標(biāo)、復(fù)發(fā)診斷等中使用了 30 種以上的腫瘤標(biāo)志物。由于肺癌組織類型多樣，所以還沒(méi)有報(bào)道過(guò)對(duì)所有類型肺癌的發(fā)現(xiàn)或診斷均有效 的腫瘤標(biāo)志物。因此，目前根據(jù)肺癌的組織類型來(lái)選擇和使用有效的標(biāo)志物。例如，對(duì)于肺腺癌，主要選擇使用癌胚抗原(carcinoembryonicantigen :CEA)或 唾液酸化Lex-i抗原；對(duì)于肺鱗狀上皮細(xì)胞癌，主要選擇使用鱗狀上皮細(xì)胞癌相關(guān)抗原 (squamous-cell carcinoma relatedantigen :SCC)；對(duì)于小細(xì)胞肺癌,主要選擇使用神經(jīng) 元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase :NSE)等。
然而，NSE存在如下缺點(diǎn)(1)針對(duì)可治愈的早期癌的陽(yáng)性率低；( 治療引起測(cè)定 值出現(xiàn)暫時(shí)性上升；C3)采血時(shí)的溶血引起測(cè)定值上升；(4)小細(xì)胞肺癌患者與正常健康者 的測(cè)定差值小等。因此，對(duì)于小細(xì)胞肺癌來(lái)說(shuō)，NSE未必是有效的腫瘤標(biāo)志物。胃泌素釋放肽(Gastrin-Releasing Peptide :GRP)是 McDonald 等在 1978 年 從豬的胃組織中分離出的一種具有促進(jìn)胃泌素分泌作用的、由27個(gè)氨基酸組成的腦腸肽 (brain-gut peptide) 0已證實(shí)人類也存在GRP，并于1984年克隆出編碼人類GRP的基因。日本國(guó)立癌中心的山口等，在認(rèn)為是來(lái)自神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的小細(xì)胞肺癌的生物學(xué) 特性的研究過(guò)程中，測(cè)定了包括促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone =ACTH) 和降鈣素等15種以上的腦腸激素，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的小細(xì)胞肺癌株中，GRP以最高頻率且高濃 度地得到積極分泌(非專利文獻(xiàn)1)。并且，建立了組合有血中GRP濃縮法的放射免疫測(cè) 定法(RIA)，發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌患者與健康人相比，呈現(xiàn)出高的血中GRP濃度。然而，由于GRP 在血中會(huì)快速降解，因此血中濃度低，此外，由于上述測(cè)定需要復(fù)雜的濃縮操作，因此臨床 應(yīng)用困難。根據(jù)此后的研究可知，在各種細(xì)胞中，通過(guò)選擇性RNA剪接(alternative RNA splicing)，產(chǎn)生3種GRP前體(ProGRP)(非專利文獻(xiàn)2)。這3種ProGRP，其第1-98位氨 基酸序列是相同的，而第99位以后，通過(guò)選擇性RNA剪接，變成互不相同的氨基酸序列。該 相同的第1-98位氨基酸序列在序列編號(hào)1中示出。下文只要沒(méi)有特別說(shuō)明，本發(fā)明中的 ftx)GRP、其部分序列、降解物等氨基酸殘基的編號(hào)均用序列編號(hào)1的氨基酸序列的編號(hào)表
7J\ ο3種ftx)GRP的第1-27位氨基酸序列，與具有促胃泌素分泌活性的成熟GRP的該部 分氨基酸序列相同。這3種前體均通過(guò)激素前體切斷酶，降解為由第1-27位氨基酸序列構(gòu) 成的成熟型GRP;以及由第31位以后的氨基酸序列構(gòu)成的、不具有促胃泌素分泌活性的、作 為ftOGRP降解物的C末端片段(ftOGRP-Cfrag)。Holst等(非專利文獻(xiàn)3)報(bào)道通過(guò)對(duì)由ftx)GRP的第42_53位氨基酸序列構(gòu)成 的肽(以下稱為ft~oGRPG2-53))使用抗血清進(jìn)行放射免疫測(cè)定(RIA)，發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌患 者血漿中的ftx)GRP或ftOGRP-Cfrag水平高。然而，該方法需要沉淀萃取操作，靈敏度也不 足。三宅等著眼于ftx)GRP與GRP相比在血中的穩(wěn)定性高、以及作為3種ftx)GRP共同 部分的第31-98位氨基酸序列對(duì)其他蛋白質(zhì)的氨基酸序列沒(méi)有顯示出相同性，使用由該氨 基酸序列構(gòu)成的重組肽(以下稱為ft~oGRP(31-98))作為抗原得到的高效價(jià)抗血清，建立了 無(wú)需沉淀萃取操作的高靈敏度RIA法(非專利文獻(xiàn)1)。通過(guò)該方法，使ftx)GRP成為與GRP 同樣優(yōu)異的腫瘤標(biāo)志物。該方法在無(wú)需萃取操作方面是有利的，但是測(cè)定需要4天時(shí)間，且靈敏度不足，為 IOpM(77. 3pg抗原/mL)，因此不能測(cè)定健康人血清中的ftx)GRP值，尚未得到臨床應(yīng)用。此外，上述Holst等和三宅等的RIA法是抑制法，因此，雖然只要ftx)GRP片段的一 部分具有抗原性就能進(jìn)行測(cè)定，但是其靈敏度比夾心(sandwich)法低，因此難以實(shí)現(xiàn)需要 高靈敏度的ftx)GRP測(cè)定法的臨床應(yīng)用。即為了在臨床上進(jìn)行ftx)GRP檢測(cè)，必須提高檢測(cè) 靈敏度，尤其需要能在夾心法中使用的抗體。山口、青柳等以ftx)GRP的小細(xì)胞肺癌用腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用為目的，開發(fā)了以酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay =ELISA)為原理、使用夾心法的簡(jiǎn) 便且高靈敏度的ftx)GRP測(cè)定試劑(專利文獻(xiàn)1)。該方法在約2小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果，并且具有 高靈敏度Opg/mL)，因此目前在臨床上得到廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)與NSE相比，該方法對(duì)于小細(xì)胞 肺癌的靈敏度高并具有特異性。此外，發(fā)現(xiàn)使用該測(cè)定法，除了小細(xì)胞肺癌以外，在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(甲狀腺髓樣 癌等)、顯示神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤特征的癌(小細(xì)胞食道癌、小細(xì)胞胰腺癌、小細(xì)胞前列腺癌等) 中，血清ftx)GRP值也上升，認(rèn)為今后也可以應(yīng)用于這些腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療監(jiān)測(cè)等中。然而，雖然ftx)GRP比GRP在血中的穩(wěn)定性高，但是與其他通常的腫瘤標(biāo)志物相比， 卻發(fā)現(xiàn)測(cè)定值分散。因此，以ftx)GRP為檢測(cè)對(duì)象的方法，存在下述制約，即測(cè)定用樣品必須 在采血后迅速冷凍保存直至測(cè)定時(shí)為止(非專利文獻(xiàn)4)。青柳開發(fā)了使用識(shí)別作為ftx)GRP(31-98)內(nèi)部區(qū)域的ftx)GRP的第40_75位的氨 基酸殘基或ftx)GRP的第40-79位的氨基酸殘基的2種以上的抗體的夾心測(cè)定法(專利文 獻(xiàn)3)。該方法在測(cè)定于4°C保存的樣品時(shí)獲得比較穩(wěn)定的結(jié)果，并且顯示與專利文獻(xiàn)2記 載的方法大致相同的檢測(cè)靈敏度。然而，該方法如專利文獻(xiàn)3的實(shí)施例4所示的那樣，需要 100 μ L樣品量，該量比通常的免疫測(cè)定法多。專利文獻(xiàn)1 專利第3210994號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 特開平6-98794號(hào)專利文獻(xiàn)3 國(guó)際專利公開W02006/117994號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)1 =Cancer Research, 1994 年，第 M 卷，第 2136-2140 頁(yè)非專利文獻(xiàn)2 =Spindel 等，Mol. Endocrinol.，1987 年，第 1 卷，第 224-232 頁(yè)非專利文獻(xiàn)3 =Holst 等，J. Clin. Oncol.，1989 年，第 7 卷，第 1831-1838 頁(yè)非專利文獻(xiàn)4:臨床檢查(日文原文臨床検查)，1995年，第39卷，第981-986頁(yè)

發(fā)明內(nèi)容
在專利文獻(xiàn)3記載的方法中，如果在維持檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，能夠進(jìn)一步減少所 需要的樣品量，則在臨床上能夠削減測(cè)定所需的成本，減輕患者的負(fù)擔(dān)。此外，由樣品保存 引起的測(cè)定靈敏度下降更小的測(cè)定方法，能夠更加簡(jiǎn)便地進(jìn)行樣品的處理。本發(fā)明提供一 種新的ftx)GRP的測(cè)定方法，該測(cè)定方法中，由樣品保存引起的檢測(cè)靈敏度下降小，能夠用 更少量的樣品量進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，使用針對(duì)ftx)GRP的特定區(qū)域的抗體的免疫測(cè)定法能夠解決上述課 題，從而完成了以下各發(fā)明。(1) 一種測(cè)定胃泌素釋放肽前體和/或其降解物的方法，所述方法使用2種以上的 不同抗體，所述的抗體識(shí)別序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈 示的抗原表位。(2)如⑴所述的方法，其中，該方法為夾心免疫測(cè)定法。(3) 一種識(shí)別序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的 抗原表位的單克隆抗體。(4)如(3)所述的單克隆抗體，其中，該抗體由按照保藏編號(hào)FERMP-21308保藏的 雜交瘤(hybridoma)GCY9 產(chǎn)生。
(5)如(3)所述的單克隆抗體，其中，該抗體由按照保藏編號(hào)FERMP-21309保藏的 雜交瘤GCY17產(chǎn)生。(6)按照保藏編號(hào)FERM P-21308保藏的雜交瘤GCY9。(7)按照保藏編號(hào)FERM P-21309保藏的雜交瘤GCY17。(8)如⑴所述的方法，其中，所述的2種以上的不同抗體的至少一種是⑷或 (5)中任一項(xiàng)所述的抗體。(9) 一種用于測(cè)定胃泌素釋放肽前體或其降解物的試劑盒，所述試劑盒含有 (3) (5)中任一項(xiàng)所述的抗體。(10)如(9)所述的試劑盒，所述試劑盒是用于癌診斷或用于治療效果監(jiān)測(cè)的試劑
品.ο本發(fā)明的方法以在樣品中也能穩(wěn)定保存的ftx)GRP的降解物為測(cè)定對(duì)象，除了能 獲得與現(xiàn)有的測(cè)定方法相同的檢測(cè)靈敏度，還具有采取后的樣品的處理方法不易受到影 響、能夠獲得再現(xiàn)性高的測(cè)定值等效果。據(jù)此，為了診斷小細(xì)胞肺癌等疾病，在采血樣品的 臨床現(xiàn)場(chǎng)，采血后的樣品的處理變得更加容易，ProGRP的測(cè)定值沒(méi)有因樣品的處理而分散， 能夠獲得更穩(wěn)定的結(jié)果，測(cè)定值的可靠性提高。此外，根據(jù)臨床表現(xiàn)，在要求追加試驗(yàn)或需 要再檢查等時(shí)，可以使用冷藏保存的樣品而不是冷凍保存的樣品進(jìn)行測(cè)定，從而可削減測(cè) 定所需的成本。而且，本發(fā)明的方法在維持高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，能夠減少測(cè)定樣品量及縮 短測(cè)定時(shí)間，在臨床上能夠削減成本，減輕患者的負(fù)擔(dān)。


圖1是表示單克隆抗體PGCY9對(duì)由用多中心肽合成法(multipinp印tide)合成的 8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的各多肽的結(jié)合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號(hào)1中的氨 基酸殘基的編號(hào)，縱軸表示吸光度。圖2是表示單克隆抗體PGCY17對(duì)由用多中心肽合成法合成的8個(gè)連續(xù)氨基酸序 列構(gòu)成的各多肽的結(jié)合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號(hào)1中的氨基酸殘基的編號(hào)， 縱軸表示吸光度。圖3是表示單克隆抗體PGCYM對(duì)由用多中心肽合成法合成的8個(gè)連續(xù)氨基酸序 列構(gòu)成的各多肽的結(jié)合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號(hào)1中的氨基酸殘基的編號(hào)， 縱軸表示吸光度。圖4是表示單克隆抗體PGCY12對(duì)由用多中心肽合成法合成的8個(gè)連續(xù)氨基酸序 列構(gòu)成的各多肽的結(jié)合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號(hào)1中的氨基酸殘基的編號(hào)， 縱軸表示吸光度。圖5是表示單克隆抗體PGCY5對(duì)由用多中心肽合成法合成的8個(gè)連續(xù)氨基酸序列 構(gòu)成的各多肽的結(jié)合性的圖。橫軸表示各多肽及其序列編號(hào)1中的氨基酸殘基的編號(hào)，縱 軸表示吸光度。圖6是表示ftx)GRP (31-98)與各種單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位的位置關(guān)系的模 式圖。圖7是表示使用與氨基酸編號(hào)第47-68位的部分肽結(jié)合的抗體PGCY9與PGCY17 的測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。橫軸表示ftx)GRP的濃度，縱軸表示吸光度。
圖8是表示針對(duì)在微量板(microplate)的固相上通過(guò)抗小鼠IgG(Fc)抗體結(jié)合 的ftx)GRP的各單克隆抗體與生物素化ftx)GRP的反應(yīng)性的圖。橫軸表示各單克隆抗體，縱 軸表示吸光度。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是一種使用能夠識(shí)別ftx)GRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表 位的2種以上的不同抗體，通過(guò)夾心免疫測(cè)定法檢測(cè)ftx)GRP或ftx)GRP的降解物的方法，所 述ftx)GRP的降解物具有ftx)GRP的第47-68位的氨基酸殘基。該免疫測(cè)定法具有如下特征 即使在將采取的樣品進(jìn)行冷藏保存的情況下，其檢測(cè)靈敏度也不下降。由此推測(cè)這意味著 具有ftx)GRP的第47-68位的氨基酸殘基的ftx)GRP的降解物對(duì)樣品中含有的蛋白酶或其他 原因引起的樣品保存中的進(jìn)一步降解反應(yīng)比較穩(wěn)定。本發(fā)明的方法中可以使用的抗體為能夠識(shí)別ftx)GRP的第47-68位的氨基酸序列 所呈示的抗原表位的抗體，據(jù)此能夠與具有ftx)GRP的第47-68位的氨基酸殘基的ftx)GRP 的降解物結(jié)合。這種抗體優(yōu)選為單克隆抗體。本發(fā)明的方法中可以使用的抗體，優(yōu)選為能夠識(shí)別ftx)GRP的第47-68位的氨 基酸序列中的N末端部分所呈示的抗原表位和C末端部分所呈示的抗原表位的2種以 上的不同單克隆抗體。特別優(yōu)選使用單克隆抗體PGCY9和PGCY17，所述的單克隆抗體分 別由雜交瘤GCY9和雜交瘤GCY17產(chǎn)生，所述雜交瘤GCY9和雜交瘤GCY17分別以保藏編 號(hào)FERM P-21308和FERM P-21309保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保 藏中心。這2種雜交瘤細(xì)胞是以利用大腸桿菌生產(chǎn)的重組ftx)GRP的第31-98位的氨基 酸序列構(gòu)成的多肽(以下表示為ftx)GRP(31-98))作為抗原，由免疫小鼠的抗體產(chǎn)生細(xì)胞 (antibody-producingcell)按通常的方法制備的雜交瘤細(xì)胞。這2種雜交瘤細(xì)胞是通過(guò)使 用ftx)GRP (31-98)內(nèi)部的肽的篩選而進(jìn)行挑選的、產(chǎn)生識(shí)別ftx)GRP的第47-68位的氨基酸 所呈示的抗原表位的抗體的細(xì)胞。這樣，本發(fā)明中可以使用的抗體可以通過(guò)下述方法得到以ft~oGRP(31-98)作為 抗原，由將小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、雞、山羊、綿羊、牛等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫后回收的抗體產(chǎn)生細(xì) 胞，按通常的方法制備產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，使用ftx)GRP的第47-68位的氨基酸 殘基構(gòu)成的多肽(以下表示為ftx)GRPG7-68))可以篩選產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。此 外，也可以將ftx)GRPG7-68)作為抗原使用。另外，上述多肽也可以與甲狀腺球蛋白或匙孔 血藍(lán)蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)等載體結(jié)合后使用。以小鼠為例來(lái)說(shuō)明對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫的方法。將ft~oGRP(31-98)等多肽與弗氏完全 佐劑、TiterMax Gold(CytRx公司)等佐劑以1 1混合，使用互相流通的接頭連接的兩個(gè) 注射器，使其反復(fù)通過(guò)接頭，或通過(guò)超聲波處理等方法制備乳劑。在皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹 腔內(nèi)的任一部位或多個(gè)部位注入制備的含有抗原的乳劑。第一次免疫結(jié)束后，間隔1 4 周，以同樣的方式進(jìn)行第二次免疫。然后，同樣繼續(xù)免疫，直至抗體對(duì)血中的ftx)GRP的抗體 效價(jià)上升?？贵w效價(jià)的測(cè)定可以按照以下方式進(jìn)行。以IP g/mL的濃度在PBS中溶解 ProGRP (31-98)，以每孔50 μ L的容量添加到96孔微量滴定板(micro-titer plate)的 各孔中，于4°C下吸附過(guò)夜。用含0.05%吐溫20的PBS(PBS-T)將各孔洗滌后，用于測(cè)
7定。測(cè)定前，也可以用含BSA的PBS等進(jìn)行封閉。從眼窩靜脈叢、尾靜脈或尾動(dòng)脈等 處采血，用PBS-T稀釋到30倍后進(jìn)行離心。將所得上清液用PBS-T進(jìn)行系列稀釋，涂覆 ProGRP (31-98)，在微量滴定板的各孔中分別添加50 μ L。在室溫下反應(yīng)30分鐘后，用PBS-T 洗滌，在各孔中分別添加50 μ L辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG溶液，該溶液使 用PBS-T等進(jìn)行過(guò)適當(dāng)稀釋。再在室溫下反應(yīng)30分鐘后，添加過(guò)氧化氫、鄰苯二胺底物溶 液進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，添加50 μ L 2Ν H2SO4,使反應(yīng)停止，測(cè)定各孔的吸光度。在免疫過(guò)的小鼠中，證實(shí)對(duì)所給予的抗原的抗體效價(jià)充分上升后，取出脾臟，分離 脾臟細(xì)胞。使用另外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤(例如SP2/0-Agl4等)和聚乙二醇等進(jìn)行融合。將 融合成功的細(xì)胞用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)。7 14天左 右，每隔幾天半量交換培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)后，測(cè)定培養(yǎng)上清液的抗體效價(jià)。通過(guò)有限稀釋法 克隆陽(yáng)性孔的細(xì)胞，得到產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤。通過(guò)分析上述方法所得抗體的抗原表位，可以獲得識(shí)別ftx)GRP的第47-68位的氨 基酸序列所呈示的抗原表位的抗體?？乖砦环治隹梢酝ㄟ^(guò)研究抗體對(duì)使用多中心肽合成 法合成的ftx)GRP (31-98)的連續(xù)8-12個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的多肽或ftx)GRP 07-68)的反應(yīng) 來(lái)進(jìn)行。例如，可以通過(guò)在微量滴定板上涂覆用重組體表達(dá)的ftx)GRP (47-68)、或用Fmoc法 或Boc法進(jìn)行化學(xué)合成的ftx)GRP (47-68)，使用上述免疫測(cè)定法研究抗體對(duì)各肽的反應(yīng)性 來(lái)確定。根據(jù)使用多中心肽合成法合成的ftx)GRP(31-98)的連續(xù)8_12個(gè)氨基酸序列構(gòu)成 的多肽的抗原表位的分析結(jié)果，證實(shí)本發(fā)明特別優(yōu)選的抗體之一 PGCY9為識(shí)別ftx)GRP的第 47-68位的氨基酸所呈示的抗原表位中第55-66位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的單克 隆抗體。此外，證實(shí)本發(fā)明特別優(yōu)選的另一抗體PGCY17為至少識(shí)別第45-57位的氨基酸序 列所呈示的抗原表位的單克隆抗體。本發(fā)明中使用的抗體還可以在載體或微量板(microplate)上固相化、或用生物 素等適當(dāng)?shù)臉?biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記?？梢愿鶕?jù)各實(shí)驗(yàn)方法的說(shuō)明書中記載的方法進(jìn)行固相化或 標(biāo)記的各種操作，本發(fā)明中使用的抗體并不特別需要特殊的操作。本發(fā)明的方法為使用上述抗體的夾心免疫測(cè)定法，具體地說(shuō)，是夾心ELISA法。夾 心ELISA法的基本操作可以根據(jù)《超高靈敏度免疫測(cè)定法》(日文原文超高感度免疫測(cè)定 法)(石川栄治，1993年，學(xué)會(huì)出版力 >々一)或其它各種實(shí)驗(yàn)方法的說(shuō)明書中記載的方法 進(jìn)行，本發(fā)明的實(shí)施中并不特別需要特殊的操作，可以按下述工序進(jìn)行。S卩，ProGRP和/或其降解物可以通過(guò)包括如下工序的測(cè)定法檢測(cè)(1)使識(shí)別 ProGRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的第一抗體與樣品中的ProGRP和/ 或其降解物反應(yīng)的工序；(2)由該抗體捕捉的ftx)GRP和/或其降解物與不同于⑴的抗體 的、識(shí)別ftx)GRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的第二抗體反應(yīng)的工序；以 及C3)檢測(cè)由( 產(chǎn)生的免疫復(fù)合物的工序。本發(fā)明方法的操作法的例子可以表示如下。將以1 10μ g/mL的濃度溶解于緩 沖液(例如，0. IM碳酸緩沖液(pH 9.6))中的第一抗體的溶液等量添加到微量滴定板的各 孔中，于4°C下培養(yǎng)過(guò)夜。用PBS等洗滌用緩沖液將各孔洗滌后，將沒(méi)有結(jié)合第一抗體的各 孔的內(nèi)壁用含有酪蛋白酸鈉等適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)的緩沖溶液培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后進(jìn)行封閉。除去封閉 液后，在各孔中添加含有吐溫20等表面活性劑的反應(yīng)液和樣品。樣品的添加量根據(jù)其測(cè)定法的靈敏度進(jìn)行適當(dāng)變更。在37°C左右的溫度下反應(yīng)約1小時(shí)后，用含有表面活性劑的緩 沖液(例如，含吐溫20的PBS-T)將各孔洗滌，在各孔中添加使用適當(dāng)?shù)臉?biāo)記試劑標(biāo)記的第 二抗體，反應(yīng)幾十分鐘后，將各孔洗滌，使用與標(biāo)記試劑相適應(yīng)的方法檢測(cè)第二抗體。另外， 上述操作法只不過(guò)是個(gè)例子，各步驟的具體操作，例如緩沖液、標(biāo)記試劑、添加量等可以適 當(dāng)調(diào)節(jié)。本發(fā)明使用單克隆抗體PGCY9和PGCY17這2種單克隆抗體的方法的檢測(cè)靈敏度 為2. 5pg/mL，樣品量可以使用25μ L左右。該檢測(cè)靈敏度幾乎能夠測(cè)定所有健康人血中的 ftx)GRP，這在臨床上有助于削減檢查成本，減輕患者的負(fù)擔(dān)。本發(fā)明除了上述方法以外，還提供用于測(cè)定樣品中的ftx)GRP或其降解物的試劑 盒，尤其是通過(guò)測(cè)定ftx)GRP和/或其降解物進(jìn)行小細(xì)胞肺癌診斷或化學(xué)療法監(jiān)測(cè)的診斷藥 試劑盒。該試劑盒含有至少2種識(shí)別上述ftx)GRP的第47-68位的氨基酸所呈示的抗原表 位的抗體，其他還可以任意地含有反應(yīng)緩沖液、二抗稀釋液、ProGRP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、說(shuō)明書及其 他組成物。作為試劑盒中含有的抗體的優(yōu)選例，為識(shí)別ftx)GRP的第47-68位的氨基酸所呈 示的抗原表位的2種以上的不同抗體，代表例為單克隆抗體PGCY9和單克隆抗體PGCY17。與ftx)GRP和/或其降解物結(jié)合的抗體，雖然優(yōu)選使用只選擇識(shí)別ftx)GRP的第 47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的抗體，但是，在可以得到再現(xiàn)性高的測(cè)定值的范 圍內(nèi)，測(cè)定體系內(nèi)也可以含有這些抗體以外的抗體。實(shí)施例以下列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1根據(jù)專利第3210994號(hào)的實(shí)施例1記載的方法制備重組體，提純由大腸桿菌表 達(dá)的序列編號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。專利第3210994號(hào)的實(shí)施例1中，該重 組體記載為GRP (31-98)，正確的是GRP前體(ftx)GRP)的(31-98)部分，因此本文記載為 ProGRP(31-98)。將ft~oGRP(31-98)豬甲狀腺球蛋白(TG)以重量比為1 3結(jié)合的抗原蛋白質(zhì) (表示為ftx)GRP-TG)使用含0. 15M NaCl的IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. 0)稀釋，與等量的 TiterMax 混合，制成 ftx)GRP-TG 懸浮液。將配制的 1^061^(31-98)濃度達(dá) 0. 05mg/0. ImL 的該懸浮液按約20天的間隔、在4 6周齡的BALB/c系小鼠的腹腔內(nèi)給藥4 6次。再 于約4周后，作為加強(qiáng)免疫，用配制的ftx)GRP (31-98)的濃度達(dá)0. lmg/0. ImL的生理鹽水給 藥2天。最終加強(qiáng)免疫后第3天，從該免疫動(dòng)物中無(wú)菌性摘除脾臟，用手術(shù)剪剪成切片，再 用篩孔將脾臟弄成一個(gè)個(gè)細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次后，用含8-氮鳥嘌呤的相同 培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天。將完全去除回復(fù)突變體的對(duì)數(shù)增殖期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0-Agl4 用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌后，將該細(xì)胞2. 4 X IO7個(gè)和上述脾臟細(xì)胞2. 0 X IO8個(gè)加入離心管 中混合。將混合的2種細(xì)胞以200Xg離心分離5分鐘，除去上清液后，采用HVJ Envelope Cell Fusion Kit (GenomONE-CF，石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)進(jìn)行細(xì)胞融合。將融合的細(xì)胞用含有 次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷(以下將3種化合物合起來(lái)表示為HAT)、10%胎牛血清(FCS)及 小鼠白介素-6 (R&D Systems)的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，添加到96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)1 2 周。在培養(yǎng)約1 2周后，進(jìn)行使用ft~oGRP(31-98)作為抗原的ELISA法，得到雜交瘤，該 雜交瘤產(chǎn)生對(duì)ftx)GRP(31-98)具有反應(yīng)特異性的本發(fā)明的單克隆抗體。
關(guān)于得到的雜交瘤，通過(guò)常用的有限稀釋法，使用ft~oGRP(31-98)進(jìn)行目標(biāo)抗體 的產(chǎn)生株的檢索和單一克隆化，最終得到5株雜交瘤細(xì)胞，分別命名為GCY9、GCY17、GCY12、 GCYM及GCY5。GCY9和GCY17于2007年6月22日在位于日本國(guó)茨城縣筑波市東1 丁目1 番地1中央第6的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心保藏(GCY9的保藏 編號(hào)FERM P-21308 ；GCY17 的保藏編號(hào)FERM P-21309)。另外，GCY9 和 GCY17 于 2008 年 8 月5日分別獲得國(guó)際保藏(GCY9的國(guó)際保藏編號(hào)FERM BP-1099UGCY17的國(guó)際保藏編號(hào) FERMBP-10992)。實(shí)施例2(1)將通過(guò)實(shí)施例1記載的方法得到的雜交瘤在含有小鼠白介素-6的無(wú)血清培養(yǎng) 基(Hybridoma-SFM，hvitrogen公司)中培養(yǎng)，將產(chǎn)生的單克隆抗體用結(jié)合了蛋白質(zhì)A的 瓊脂糖凝膠柱(Amersham)提純回收。將由各雜交瘤GCY9、GCY17、GCY12、GCYM及GCY5產(chǎn) 生的單克隆抗體分別命名為PGCY9、PGCYl7、PGCYl2、PGCYM及PGCY5。對(duì)于PGCY9、PGCY17、 PGCY12、PGCYM及PGCY5的亞型(subtype)，根據(jù)使用兔抗小鼠Ig各亞型試劑盒(Zymed公 司)的實(shí)驗(yàn),表明 PGCY9、PGCY12、PGCY24 和 PGCY5 為 IgGl，PGCY17 為 IgG2a。(2)基于ftx)GRP(31-98)的氨基酸序列，用多中心肽合成法合成每個(gè)氨基酸進(jìn)行 錯(cuò)位制備的連續(xù)8個(gè)氨基酸構(gòu)成的共61種多肽。再在各肽的N末端結(jié)合生物素。將各生 物素化多肽溶解于二甲基甲酰胺中，并用PBS稀釋成1 μ g/mL的濃度。在抗生物素蛋白 (avidin)固相化的96孔微量滴定板的各孔中分別添加100 μ L稀釋過(guò)的各生物素化多肽溶 液，于4°C培養(yǎng)過(guò)夜。用含0. 05%吐溫20的PBS緩沖液(PBS-T)將各孔洗滌后，在各孔中分 別添加100 μ L將各單克隆抗體稀釋成1 μ g/mL的溶液。在室溫下反應(yīng)30分鐘后，用PBS-T 將各孔洗滌5次，在各孔中分別添加100 μ L辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體 溶液。再在室溫下反應(yīng)30分鐘后，用PBS-T將各孔洗滌5次，在各孔中分別添加IOOyL底 物溶液(含ang/mL鄰苯二胺、0. 9μ L/mL 30%過(guò)氧化氫溶液的0. IM檸檬酸磷酸緩沖液、pH 5.0)，在室溫下反應(yīng)30分鐘后，分別添加IOOyL 2N硫酸，立即測(cè)定492nm處的吸光度。單 克隆抗體PGCY9、PGCY17、PGCYM、PGCY12及PGCY5對(duì)ftx)GRP (31-98)內(nèi)部各肽的反應(yīng)如圖 1 圖5所示。如圖1所示，證實(shí)單克隆抗體PGCY9與ftx)GRP (57_64)的結(jié)合非常弱。此外，如 圖2和圖3所示，證實(shí)單克隆抗體PGCY17及PGCYM與ftx)GRP(31-98)的氨基酸序列中的 8個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成的多肽不結(jié)合。由此推測(cè)，PGCY17及PGCYM不能識(shí)別8個(gè)連續(xù)氨基 酸序列，而能識(shí)別比8個(gè)長(zhǎng)的氨基酸序列構(gòu)成的多肽所呈示的抗原表位。另一方面，如圖 4所示，證實(shí)單克隆抗體PGCY12與ft~oGRP(34-41)結(jié)合強(qiáng)，與其前后的ftx)GRP (33-40)及 ProGRP(35-42)結(jié)合弱。因此推測(cè)，PGCY12能識(shí)別ftx)GRP的第34-41位的氨基酸序列所呈 示的抗原表位。此外，證實(shí)單克隆抗體PGCY5與ft~oGRP(69-76)和ftx)GRP (70-77)結(jié)合強(qiáng)， 與ft~oGRP(71-78)結(jié)合，與ft~oGRP(68-75)結(jié)合非常弱。因此推測(cè)，單克隆抗體PGCT5能識(shí) 別ftx)GRP的第69-76位的氨基酸序列和第70-77位的氨基酸序列所呈示的共同的抗原表 位。(3)通過(guò)Fmoc法合成表1所示的ftx)GRP (31-98)的部分氨基酸序列構(gòu)成的多肽， 進(jìn)行提純。在溶解6M尿素的PBS中，以20 μ g/mL的濃度溶解BSA，在96孔微量滴定板 (NUNC、Maxisorp)的各孔中分別添加100 μ L，在室溫下培養(yǎng)3小時(shí)。用PBS將各孔分別洗滌5次，在各孔中分別添加100 μ L用PBS將N-(3- 二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽 酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)分別以lmg/mL溶解后的溶液，在室溫下培養(yǎng)2小 時(shí)，將在孔中固定的BSA的羧基活化。用PBS將各孔洗滌3次，將各多肽用0. IM磷酸緩沖 液(pH 6. 0)稀釋成5 μ g/mL的濃度，在96孔微量滴定板的各孔中分別添加100 μ L，于4°C 培養(yǎng)過(guò)夜。據(jù)此，各多肽通過(guò)氨基與固定化的BSA結(jié)合。用PBS將各孔洗滌2次后，在各孔中分別添加350 μ L含1 % BSA、2%蔗糖的PBS，在 室溫下培養(yǎng)3小時(shí)，然后吸除。在各孔中分別添加100 μ L稀釋成1 μ g/mL濃度的各單克隆 抗體，在室溫下反應(yīng)60分鐘后，用含0.05%吐溫20的PBS(PBS-T)洗滌5次后，在各孔中分 別添加IOOyL辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體溶液，在室溫下反應(yīng)20分鐘。 用PBS-T洗滌5次后，在各孔中分別添加100 μ L底物溶液(含ang/mL鄰苯二胺、0. 9 μ L/ mL30%過(guò)氧化氫溶液的0. IM檸檬酸磷酸緩沖液、pH 5. 0)，在室溫下反應(yīng)20分鐘后，在各孔 中分別添加IOOyL 2N硫酸，使反應(yīng)停止，立即測(cè)定492nm處的吸光度。除了本發(fā)明的各單 克隆抗體外，同時(shí)還研究了專利文獻(xiàn)3中所示的、識(shí)別ftx)GRP的40-60位的氨基酸序列構(gòu) 成的多肽、且與8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的多肽不發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體GRP-3D6-2的抗 原表位。其結(jié)果如表1所示。表 權(quán)利要求
1.一種測(cè)定胃泌素釋放肽前體和/或其降解物的方法，所述方法使用2種以上的不同 抗體，所述的抗體識(shí)別序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的 抗原表位。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法為夾心免疫測(cè)定法。
3.一種識(shí)別序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表 位的單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其中，所述抗體由按照保藏編號(hào)FERMP-21308保 藏的雜交瘤GCY9產(chǎn)生。
5.如權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其中，所述抗體由按照保藏編號(hào)FERMP-21309保 藏的雜交瘤GCY17產(chǎn)生。
6.按照保藏編號(hào)FERMP-21308保藏的雜交瘤GCY9。
7.按照保藏編號(hào)FERMP-21309保藏的雜交瘤GCY17。
8.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述的2種以上的不同抗體的至少一種是權(quán)利 要求4或5中任一項(xiàng)所述的抗體。
9.一種含有權(quán)利要求3 5中任一項(xiàng)所述的抗體、并用于測(cè)定胃泌素釋放肽前體或其 降解物的試劑盒。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，所述試劑盒是用于癌診斷或用于治療效果監(jiān)測(cè)的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種不存在測(cè)定值分散和樣品處理等操作上的制約等問(wèn)題的、高靈敏度的新的ProGRP測(cè)定方法。特別是，本發(fā)明提供一種使用2種以上的不同抗體測(cè)定胃泌素釋放肽前體和/或其降解物的方法，所述的抗體識(shí)別序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位。本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的測(cè)定方法相比，能夠以冷藏保存的樣品為對(duì)象，在短時(shí)間內(nèi)從更少量的樣品試樣中以更高的檢測(cè)靈敏度檢測(cè)ProGRP或其降解物。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102084249SQ20088011172
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2008年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日
發(fā)明者井澤雪路, 青柳克己 申請(qǐng)人:株式會(huì)社先端生命科學(xué)研究所