專利名稱：篩選RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質(zhì)的方法
篩選RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于篩選RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質(zhì)的系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及利用其的篩選方法。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆最常見(jiàn)的形式?，F(xiàn)在僅在美國(guó)就有估計(jì) 四百五十萬(wàn)人患有阿爾茨海默病。它是世界范圍內(nèi)65歲以上人中10%以上被診斷患有的 神經(jīng)退行性疾病。阿爾茨海默病(AD)是呈現(xiàn)為散發(fā)性且家族性疾病的異類實(shí)體。遺傳性 誘因?qū)е录易逍园柎暮Ｄ?FAD)。散發(fā)性AD(SAD)的原因目前未知。遺傳性阿爾茨海 默病是阿爾茨海默病的不常見(jiàn)形式，僅占所有阿爾茨海默病患者的5-10%。其余的病例全 部是散發(fā)性形式。研究表明阿爾茨海默病的病理學(xué)特征與大腦中淀粉狀蛋白斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié) 有關(guān)。淀粉狀蛋白斑起因于淀粉狀蛋白β肽(Αβ)的沉積，并且神經(jīng)原纖維纏結(jié)是由于被 稱為tau的微管相關(guān)蛋白的過(guò)度磷酸化——使其以不溶性形式聚集——而形成的病態(tài)蛋白 聚集體。Αβ是淀粉狀-β前體蛋白(APP)依序分裂后形成的，并且在正常大腦中被保持在 恒定水平。然而，在AD患者中發(fā)現(xiàn)了過(guò)量的Αβ累積，形成了斑點(diǎn)。這些斑點(diǎn)誘導(dǎo)神經(jīng)元 損失，引起認(rèn)知和記憶的病損。存在一種維持大腦中淀粉狀蛋白β肽水平的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的控制系統(tǒng)。系統(tǒng)功能的 平衡功能受到RAGE (晚期糖基化終產(chǎn)物受體；Zlokovic TRENDS inNeuroscience. 28. 2005， D. Stern&Zlokovic et al. Nat. Med. vol 9，2003)、LRP-1 (低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1 ; Zlokovic et al. Neuron,vol 43. 333-344,2004, D. Stern&Zlokovic et al. Nat. Med. ,vol 9,2003)的調(diào)節(jié)(圖1)。RAGE涉及通過(guò)與淀粉狀蛋白β肽的直接相互作用淀粉狀蛋白β 肽從周?chē)}管向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的流入，而LRP-I涉及淀粉狀蛋白β肽從中樞神經(jīng)系統(tǒng)向周 圍脈管的流出。RAGE——其在淀粉狀蛋白β肽向大腦的傳輸中起重要作用——被報(bào)道在患有阿 爾茨海默病的患者中具有升高的水平(E. Stopa et al. (2006)ActaNeuropathol.)。通過(guò) RAGE活性的過(guò)量淀粉狀蛋白β肽的流入加速了淀粉狀蛋白β肽在大腦中的沉積，引起淀 粉狀蛋白斑的形成。此外，除了淀粉狀蛋白β肽向大腦的流入外，RAGE還涉及通過(guò)與淀 粉狀蛋白β肽的相互作用的各種發(fā)信號(hào)過(guò)程。特別地，RAGE與淀粉狀蛋白β肽的相互 作用被報(bào)道引起反應(yīng)性氧種類(ROS)的產(chǎn)生以及炎癥，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Zlokovic et al. (2004)Neuron, vol 43. 333-344)(圖2)。因此，RAGE和淀粉狀蛋白β肽之間相互作用 的抑制被期待阻礙淀粉狀蛋白β肽的累積及其向下游發(fā)信號(hào)，因此對(duì)阿爾茨海默病的進(jìn) 展發(fā)揮著非常大的預(yù)防性作用。最初研究RAGE是由于其在糖尿病中的重要作用。因?yàn)榈矸蹱畹鞍爪码摹狝D 的主要原因——是RAGE的配體這個(gè)公開(kāi)內(nèi)容，所以對(duì)RAGE的研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向與AD的相互關(guān)系。到目前為止，已經(jīng)從下列兩個(gè)方向努力抑制RAGE與淀粉狀蛋白β肽之間的相互作用 使用化合物，和使用可溶性RAGE (sRAGE)——RAGE的異構(gòu)體，其通過(guò)可選的剪接產(chǎn)生。關(guān)于 化合物，最先進(jìn)的分子是Transtech的TTP488，其已經(jīng)在患有阿爾茨海默病的患者中進(jìn)行 第2階段的實(shí)驗(yàn)研究并且目前處于糖尿病性腎病的第2階段研究。該化合物是口服可生物 利用的小分子，其被報(bào)道降低了淀粉狀蛋白β肽負(fù)載。對(duì)于與淀粉狀蛋白β肽的相互作 用來(lái)說(shuō)與跨膜RAGE (全長(zhǎng)RAGE)相競(jìng)爭(zhēng)，可溶性RAGE (sRAGE)被假定抵消了淀粉狀蛋白β 肽向CNS的流入或者全長(zhǎng)RAGE的發(fā)信號(hào)。已經(jīng)進(jìn)行了深入研究以檢驗(yàn)sRAGE作為淀粉狀 蛋白β肽鰲合劑的應(yīng)用。如上所解釋，對(duì)抑制RAGE與淀粉狀蛋白β肽之間相互作用的物質(zhì)的大部分研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向?qū)蜻x物的篩選。相反，可以檢驗(yàn)藥物候選物有效性并且被允許應(yīng)用于臨床階段 的體外篩選系統(tǒng)進(jìn)展很少。事實(shí)上，甚至RAGE拮抗劑的領(lǐng)先研究小組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)僅僅達(dá)到這 樣的程度新藥物候選物的發(fā)信號(hào)過(guò)程僅僅通過(guò)RT-PCR或蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行研究。目前還 沒(méi)有報(bào)道使得預(yù)測(cè)候選物如何在體內(nèi)起作用成為可能的任何系統(tǒng)。為了產(chǎn)生本發(fā)明，對(duì)用于預(yù)測(cè)候選物作用方式的系統(tǒng)深入且徹底的研究導(dǎo)致這樣 的發(fā)現(xiàn)基于RAGE表達(dá)細(xì)胞系的模擬BBB系統(tǒng)能夠模擬體內(nèi)BBB并且被用作篩選RAGE-淀 粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質(zhì)的有效體外系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題因此目的是提供用于體外篩選抑制RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的物質(zhì)的系統(tǒng)。本發(fā)明的另一目的是提供篩選抑制RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的物質(zhì)的方法。有利的效果根據(jù)本發(fā)明的篩選系統(tǒng)被用于定量分析候選物的對(duì)RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互 作用的抑制活性以及通過(guò)細(xì)胞旁路途徑的通過(guò)速度，因此發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病的藥物。此外， 該系統(tǒng)可被用于檢驗(yàn)與RAGE信號(hào)級(jí)聯(lián)放大相關(guān)的蛋白，因此提供對(duì)于理解阿爾茨海默病 病因?qū)W有用的信息。

圖1是圖解淀粉狀蛋白β肽通過(guò)RAGE (晚期糖基化終產(chǎn)物受體)和LRP (低密度 脂蛋白受體相關(guān)蛋白)在大腦和血液之間交換的示意圖(Neuron，43，605-608，2004，部分 進(jìn)行了修改)。圖2是圖解通過(guò)RAGE-淀粉狀蛋白β肽復(fù)合物發(fā)起的下游信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的示意 圖(Stroke,35(suppll)，2628-2631，2004)。圖3是篩選抑制RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的候選物的系統(tǒng)的示意圖，其顯 示了基于Transwell板的體外篩選系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)(a)，隨著細(xì)胞間緊密連接形成的TEER的變 化(b)，通過(guò)RT-PCR表達(dá)緊密連結(jié)蛋白(c)，以及由于用甘露醇打斷緊密連接形成而導(dǎo)致標(biāo) 準(zhǔn)物(FD40)通過(guò)速度的增加。
圖4是顯示通過(guò)該篩選系統(tǒng)鑒別的抑制RAGE與淀粉狀蛋白β肽之間相互作用物 質(zhì)的圖，其中候選物24比其它候選物6、25和32通過(guò)速度慢60%。圖5是導(dǎo)入CHO的pNFkB-熒光素酶載體的示意性基因圖譜，其通過(guò)在pLuc-MCS 載體的MCS (多克隆位點(diǎn))中靠近NFkB的位置插入增強(qiáng)子DNA而制備(Stratagene，Cat. no.219087)。圖6是這樣的圖，顯示了通過(guò)使用下游信號(hào)級(jí)聯(lián)放大篩選的抑制RAGE與淀粉狀蛋 白β肽之間相互作用的候選物。在對(duì)照物，與NFkB結(jié)合的熒光素酶的表達(dá)水平在用淀粉 狀蛋白β肽處理后由于響應(yīng)于RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用NFkB的激活而增加。相 反，候選物24顯示熒光素酶的表達(dá)水平降低，證實(shí)其對(duì)RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的 抑制活性。圖7是潮霉素選擇性載體(pcDNA3. Ι/Hygro⑴載體)的示意性基因圖譜 (Invitrogen, Cat no.V870-20)。最佳實(shí)施方式根據(jù)其一方面，本發(fā)明提供用于體外篩選抑制RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的 物質(zhì)的系統(tǒng)。更詳細(xì)地，該系統(tǒng)是包含表達(dá)人RAGE的細(xì)胞系的模擬血腦屏障(BBB)系統(tǒng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，bEND. 3細(xì)胞系——其被報(bào)道適合于形成血腦屏障
(BBB) (M. Gumbleton et al. Brain research, vol 990. 95-112，2003)-被用于該系統(tǒng)的
構(gòu)建。得自小鼠腦內(nèi)皮瘤的bEND. 3細(xì)胞系是多瘤病毒中型T抗原轉(zhuǎn)化的腦內(nèi)皮細(xì)胞。首先， bEND. 3細(xì)胞在Transwell板的上插入物中以合適的密度進(jìn)行培養(yǎng)(Corning，Cat. No. 3495) 以形成細(xì)胞間的緊密連接，如圖3A所示。倘若類似于BBB的條件，該細(xì)胞間緊密連接可充 當(dāng)用于篩選抑制RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的物質(zhì)的系統(tǒng)的主要成分。bEND. 3細(xì)胞 之間緊密連接的形成可通過(guò)各種試驗(yàn)進(jìn)行鑒別。例如，TEER(跨內(nèi)皮電阻)可被最有效地 用于檢驗(yàn)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的形成。TEER隨著細(xì)胞間緊密連接的形成而增加。因此，與 初始TEER值的比較確定緊密連接的形成。另一方面，Z0-1、緊蛋白和密蛋白——被稱為緊 密連接蛋白——隨著緊密連接形成，表達(dá)水平增加。基于其mRNA水平——其可通過(guò)反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT PCR)進(jìn)行分析，可以測(cè)定緊密連接的形成。在更簡(jiǎn)單的方法中，甘露醇——其已知 干擾緊密連接的形成——被施加到細(xì)胞培養(yǎng)層，然后將標(biāo)準(zhǔn)物穿過(guò)細(xì)胞間空間的通過(guò)速度 與沒(méi)有施加甘露醇的陰性對(duì)照進(jìn)行比較。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例中，bEND. 3細(xì)胞間緊密連接的形成通過(guò)所有的上述三種方法 進(jìn)行檢測(cè)。因此，對(duì)于四天的培養(yǎng)TEER被觀察到增加(圖3B)，并且緊密連接蛋白ZOl和緊 蛋白被發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平增加，如RT-PCR所測(cè)定(圖3C)。此外，bEND. 3細(xì)胞間緊密連接的形 成通過(guò)緊密連接被甘露醇中斷后標(biāo)準(zhǔn)物穿過(guò)細(xì)胞間空間的通過(guò)增加進(jìn)行確定(圖3C)?；?于這些結(jié)果，其間形成緊密連接的bEND. 3細(xì)胞被用在本發(fā)明的模擬血腦屏障系統(tǒng)中。根據(jù)bEND. 3細(xì)胞的條件和RAGE基因的導(dǎo)入效率，篩選系統(tǒng)的靈敏度可以改變。為 了排除差異，在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方式中，可過(guò)量表達(dá)人RAGE的bEND. 3突變體菌株通過(guò) 在潮霉素選擇性載體的幫助下導(dǎo)入人RAGE基因而加以制備。目標(biāo)細(xì)胞可通過(guò)在包含潮霉 素的板上培養(yǎng)進(jìn)行選擇。根據(jù)其另一方面，本發(fā)明提供利用包含人RAGE過(guò)量表達(dá)細(xì)胞系的模擬BBB系統(tǒng)篩 選抑制RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的物質(zhì)的方法。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，利用熒光(FITC)標(biāo)記的淀粉狀蛋白β肽分析候選物對(duì)RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的抑制活性。首先，過(guò)量表達(dá)RAGE的Bend. 3細(xì)胞系以 在Transwell板中適于其間形成緊密連接的濃度進(jìn)行制備和培養(yǎng)。將候選物與熒光標(biāo)記的 淀粉狀蛋白β肽一起加入到Transwell板的上室，其中細(xì)胞以連接的方式生長(zhǎng)。通過(guò)RAGE 使一些淀粉狀蛋白β肽遷移到細(xì)胞中，而其余的由于重力下沉到Transwell板的下室。下 室中收集的淀粉狀蛋白β肽利用熒光分光計(jì)進(jìn)行定量分析。與陰性對(duì)照物——其中在沒(méi) 有任何候選物的情況下使用熒光(FITC)標(biāo)記的淀粉狀蛋白β肽——的熒光測(cè)量比較得到 了候選物的％ RAGE抑制(圖4)。根據(jù)其另外的方面，本發(fā)明提供利用下游信號(hào)發(fā)射結(jié)構(gòu)篩選抑制RAGE-淀粉狀蛋 白β肽相互作用的物質(zhì)的系統(tǒng)。如上所解釋，RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用誘導(dǎo)許多信號(hào)過(guò)程，其最早的是 NFk B易位。因此，候選物的拮抗作用可通過(guò)比較用淀粉狀蛋白β肽和候選物處理的系統(tǒng) 中的NFk B易位與僅僅用淀粉狀蛋白β肽處理的系統(tǒng)的NFK B易位進(jìn)行測(cè)定。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，分別攜帶人RAGE基因和NF κ B基因的表達(dá)載體被共轉(zhuǎn) 染到CHO (中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞，以便經(jīng)由NF κ B檢測(cè)RAGE的表達(dá)。更詳細(xì)地，當(dāng)用人RAGE 和NFk B共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系用淀粉狀蛋白β肽進(jìn)行處理時(shí)，RAGE和淀粉狀蛋白β肽之間的 相互作用引起下游信號(hào)發(fā)射來(lái)誘導(dǎo)NF-kB易位，因此導(dǎo)致導(dǎo)入的pNFkB-熒光素酶載體的熒 光素酶基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。表達(dá)水平可用熒光分光計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
實(shí)施例通過(guò)下面的實(shí)施例可以獲得對(duì)本發(fā)明更好的理解，下面的實(shí)施例被提出以舉例說(shuō) 明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 利用小鼠bEND. 3細(xì)胞建立模擬血腦屏障系統(tǒng)1-1.細(xì)胞系的選擇和培養(yǎng)條件bEND. 3細(xì)胞系(ATCC CRL2299)被用于構(gòu)建模擬血腦屏障。使用的是5 10傳 代后早期繼代培養(yǎng)的細(xì)胞。為了找到適于形成如血腦屏障中同樣的緊密連接的培養(yǎng)條件， bEND. 3細(xì)胞在24-孔Transwell板(Corning)中于不同細(xì)胞密度下被培養(yǎng)不同的培養(yǎng)時(shí) 間。在這點(diǎn)上，細(xì)胞在24-孔Transwell板中以每孔1 X 105、5X IO4和2. 5X104個(gè)細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)以檢測(cè)細(xì)胞狀況。當(dāng)以每孔IXIO5個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞太密而不能令人 滿意地粘附到孔的底部，并且因此經(jīng)歷分化。在光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞被觀察到狀況差。在每 孔2. 5X IO4個(gè)細(xì)胞的密度下，細(xì)胞需要花一周或更長(zhǎng)的時(shí)間形成緊密連接。另外，分化所花 的時(shí)間被延長(zhǎng)。相反，在每孔5X IO4個(gè)細(xì)胞的密度下在短時(shí)間內(nèi)形成了緊密連接。細(xì)胞在 補(bǔ)充有 10% (ν/ν)胎兒牛血清(FBS，Hyclone，Salt Lake City, Utah, USA)和 lmg/ml 青霉 素 / 鏈霉素(P/S ;Sigma，Saint Louis, MO, USA)的 Dulbecco，s ModifiedEagle' s 培養(yǎng)基 (Hyclone, Salt Lake City, Utah, USA)中被穩(wěn)定且分化4天。這些細(xì)胞在5. 0% CO2培養(yǎng) 箱中37°C下進(jìn)行培養(yǎng)。接種后3小時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始粘附到Transwell板，并且每天對(duì)細(xì)胞監(jiān)測(cè) TEER。緊密連接的形成通過(guò)TEER(跨內(nèi)皮電阻)、RT-PCR和標(biāo)準(zhǔn)物穿過(guò)細(xì)胞的滲透進(jìn)行測(cè)定。1-2. TEER(跨內(nèi)皮電阻)Millicell-ERS (Millipore)被用于測(cè)量細(xì)胞電阻。細(xì)胞在24-孔Transwell板中 進(jìn)行培養(yǎng)。從接種后3小時(shí)——此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始粘附到板——到培養(yǎng)開(kāi)始的第4天，在五個(gè) 預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量細(xì)胞的電阻。首先，電極被穩(wěn)定并且被用于測(cè)量未包含細(xì)胞的空白孔的 電壓?？瞻卓椎臏y(cè)量被稱為R-空白。然后，測(cè)量所有其中包含細(xì)胞的孔的電壓并且測(cè)量的 平均值被稱為R-樣品。細(xì)胞的電阻通過(guò)從R-樣品減去R-空白得到。如圖3B所示，觀察 到細(xì)胞在培養(yǎng)的3小時(shí)至4天內(nèi)TEER增加，這表明隨著培養(yǎng)時(shí)期的增加形成了更強(qiáng)的細(xì)胞 間緊密連接。1-3.反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)在mRNA水平測(cè)定緊密連接肽ZO-I和緊蛋白的表達(dá)。在這一點(diǎn)上，細(xì)胞在接種后4 天利用胰島素-EDTA從Transwell板的上插入物中分離，并且用PBS進(jìn)行洗滌。細(xì)胞在離 心后得到為小球并且被用于利用TriZol試劑(Invitrogen)從中分離全部的RNA。cDNA在 反轉(zhuǎn)錄酶(π反轉(zhuǎn)錄酶)的存在下利用寡聚(dT)引物從全部的RNA中合成并被用作利用靶 向ZO-I和緊蛋白的引物對(duì)的PCR的模板。結(jié)果顯示在圖3C中。對(duì)PCR條件和引物的描述如下。*PCR 條件反轉(zhuǎn)錄-42°C90min,94°C IOmin聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)1) 94"C 5min (1 個(gè)循環(huán))循環(huán)2) DNA 變性 _94°C，30secDNA 退火-60"C，30secDNA 聚合-72 °C，Imin (30 個(gè)循環(huán))循環(huán)3)72°C，5min(l 個(gè)循環(huán))引物1) ZO-I (PCR產(chǎn)物大小為594個(gè)堿基對(duì))正向5，-TTTTGTCCCACTTGAATCCC-3，(SEQID NO. 1)反向5，-AGCTCTTGGGTCATGCACTT-3，(SEQID NO. 2)2)緊蛋白(PCR產(chǎn)物大小為406個(gè)堿基對(duì))正向5，-CAGGTTCGCTTATCTTGGGA-3，(SEQID NO. 3)反向5，-TCCGTAGCCAAAGCCACTAT-3，(SEQID NO. 4)1-4.比較穿過(guò)細(xì)胞間空間的通過(guò)細(xì)胞被接種在24-孔Transwell板的插入物上并且被培養(yǎng)5天，如上面的實(shí)施例 所述。F-NadOyM, Sigma, Cat No. 28803)、FD4 (ImM，Sigma，Cat No. FD4)禾口 FD40 (25 μ M， Sigma,Cat No. FD40S)——全部用熒光(FITC)標(biāo)記——被用作用于細(xì)胞間通過(guò)比較的標(biāo)準(zhǔn) 物。甘露醇(0.8M)——已知干擾細(xì)胞間緊密連接的形成——被加入到一些孔中，而其它孔 沒(méi)有用甘露醇處理。此后，向孔中加入標(biāo)準(zhǔn)物，接著在120min內(nèi)在20min的定期間隔下檢 測(cè)Transwell板的下室中的熒光密度。發(fā)現(xiàn)熒光密度隨著時(shí)間增加，但是在用甘露醇處理 的孔中檢測(cè)到比未用甘露醇處理的孔高的強(qiáng)度。圖3D顯示FD40的結(jié)果。
F-Na, FD4和FD40大小分別為376Da、4, OOODa和40，OOODa0當(dāng)形成緊密連接時(shí)， 可在細(xì)胞間穿過(guò)的物質(zhì)受到其大小的限制。因此，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可被用作陽(yáng)性或陰性對(duì)照。例 如，當(dāng)緊密連接充分形成時(shí)，由于蛋白大小的不同，F(xiàn)D40在通過(guò)細(xì)胞間空間的通過(guò)上不同于 F-Na和FD4。當(dāng)緊密連接的形成被甘露醇打斷時(shí)，大的FD40被發(fā)現(xiàn)具有與小的F-Na和FD4 相似的細(xì)胞間通過(guò)程度，因此證實(shí)了緊密連接的形成。從實(shí)施例1-2至1-4的實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果確定了 bEND. 3細(xì)胞之間形成的緊密連接， 并且細(xì)胞因此被鑒定適合用于模擬血腦屏障的構(gòu)建。實(shí)施例2 過(guò)量表汰人RAGE的小鼠bEND. 3細(xì)胞系的津立人RAGE基因(SEQ ID NO. 5)經(jīng)由潮霉素選擇性載體導(dǎo)入bEND. 3細(xì)胞。首先，潮霉素選擇性載體是pcDNA3. 1/Hygro (+)載體(Invitrogen，Cat no. V870-20)，如圖7所示。人RAGE基因和pcDNA3. 1/Hygro (+)載體分別用兩種限制 性內(nèi)切酶Xhol和Kpnl進(jìn)行消化，接著在連接酶的存在下相互連接。由此獲得的重 組人 RAGE-pcDNA3. 1/Hygro (+)載體在 Lipofectamin LTX 試劑(Invitrogen, Cat. No. 15338-100)結(jié)合 Plus 試劑(Invitrogen，Cat. No. 11514-015)的幫助下轉(zhuǎn)染到 bEND. 3 細(xì)胞中。bEND. 3細(xì)胞在包含潮霉素(200 μ g/ml，AMRESC0，Cat. No. K547)的板上進(jìn)行培養(yǎng)。 溫育2 3周后形成的集落被挑選出來(lái)并且在肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)以建立表達(dá)人RAGE基因的 細(xì)胞系。多次傳代后，細(xì)胞系被發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定地表達(dá)人RAGE基因，如蛋白印跡法分析所化驗(yàn)。實(shí)施例3 測(cè)定對(duì)利用模擬BBB運(yùn)輸?shù)矸蹱畹鞍爪码牡霓卓剐释ㄟ^(guò)用熒光分光計(jì)測(cè)量穿過(guò)細(xì)胞旁路通道的熒光(FITC)標(biāo)記的淀粉狀蛋白β肽 (β -α -淀粉狀 β -蛋白，aa 1-42, FITC 結(jié)合的 / 示蹤的，Cat. No. M-2585. 1000，Bachem) 的熒光性，分析候選物對(duì)RAGE的抑制活性。人RAGE過(guò)量表達(dá)細(xì)胞系在Transwell板的上插入物中以形成緊密連接的濃度進(jìn) 行培養(yǎng)，其后細(xì)胞被分成兩組。一個(gè)是陰性對(duì)照，向其中僅僅加入FITC-結(jié)合的淀粉狀蛋 白β肽。向其它組中如入FITC-結(jié)合的淀粉狀蛋白β肽與候選物。下室的熒光性利用熒 光分光計(jì)在120min內(nèi)在20min的定期間隔下進(jìn)行測(cè)量。就測(cè)量的平均值對(duì)兩組進(jìn)行比較 (圖4)。如圖4所示，候選物6、24、25和32被發(fā)現(xiàn)具有對(duì)RAGE的抑制活性，因?yàn)闊晒鈽?biāo)記 的淀粉狀蛋白β肽被檢測(cè)到在下室中比對(duì)照低的水平(其中候選物24是它們當(dāng)中最高 的相比對(duì)照物的100%，60%通過(guò))。更詳細(xì)地，首先，Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液(K buffer ；Sigma, Cat. No. K4002)被制備并且被用作候選物的溶液。分別地，人RAGE-表達(dá)細(xì) 胞在Transwell板的上室中以每孔5X IO4個(gè)細(xì)胞的密度進(jìn)行培養(yǎng)4天以允許形成緊密連 接。然后，上室和下室用K緩沖液洗滌兩次。200μ1 K緩沖液中的候選物溶液被小心地倒 入上室中，而向下室中加入Iml K緩沖液。在20min的定期間隔下，在2小時(shí)內(nèi)從下室中收 集200 μ 1等分的K緩沖液。K緩沖液樣品被置于白板(96孔，SPL，Cat. No. 31196)中并且 用熒光分光計(jì)測(cè)量熒光性。候選物的通過(guò)速度被表示為五次測(cè)量的平均值相對(duì)于對(duì)照物的 平均值的百分比。如圖4所示，候選物24對(duì)RAGE的抑制性被發(fā)現(xiàn)比候選物6、25和32大， 如下室中檢測(cè)的較低的平均熒光強(qiáng)度所確定(相對(duì)于對(duì)照物的100%，候選物24的60%通 過(guò)速度)。其它的候選物顯示大約80%通過(guò)速度。此后，分析細(xì)胞的TEER，并且熒光分析之前和之后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)變化，這表明增加的通 過(guò)速度沒(méi)有歸因于緊密連接被候選物毒性的中斷。
實(shí)施例4利用下游信號(hào)發(fā)射結(jié)構(gòu)構(gòu)件篩選RAGE-典墳狀蛋白β肽相互作用的系統(tǒng)比較分別僅用淀粉狀蛋白β肽處理的以及其與拮抗劑候選物聯(lián)合處理的系統(tǒng)之間的NFk B易位。4-1.建立用人RAGE和NF κ B共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系pNFkB-熒光素酶載體(圖5)和人RAGE基因被共轉(zhuǎn)染到CHO (中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì) 胞以構(gòu)造穩(wěn)定的突變體細(xì)胞系。首先，合成增強(qiáng)子DNA (增強(qiáng)子堿基序列(TGGGGACTTTCCGC) 5)，其對(duì)于NF κ B的表 達(dá)是有效的)。該增強(qiáng)子被插入pLuc-MCS載體(Stratagene，Cat. no. 219087)的MCS (多克 隆位點(diǎn))。當(dāng)在各種應(yīng)激條件下激活時(shí)，位于胞質(zhì)溶膠中的NF κ B被易位到細(xì)胞核中。在該 MCS中，NFkB基因被克隆在靠近用熒光基因標(biāo)記的位置，所以細(xì)胞被應(yīng)激至何種程度可以 通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度進(jìn)行估測(cè)。如此構(gòu)建的PNFkB-熒光素酶載體被導(dǎo)入用RAGE轉(zhuǎn)化的CHO 細(xì)胞系以建立用人RAGE禾Π NF κ B共轉(zhuǎn)染的突變體CHO細(xì)胞系。共轉(zhuǎn)染在Lipofectamin LTX(Invitrogen,Cat. No. 15338-100)結(jié)合 Plus (Invitrogen，Cat. No. 11514-015)的幫助 下進(jìn)行。其中導(dǎo)入人RAGE的CHO細(xì)胞系以與用人RAGE轉(zhuǎn)化的小鼠bEND. 3細(xì)胞相同的方 式建立。如實(shí)施例2所述，人RAGE基因被插入潮霉素選擇性載體，其又被導(dǎo)入CH0，接著在 包含潮霉素的板上進(jìn)行選擇。由此形成的集落在肉湯中進(jìn)行擴(kuò)增。4-2.熒光素酶報(bào)道分子試驗(yàn)在實(shí)施例4-1中制備的其中共轉(zhuǎn)染有人RAGE和NF κ B的細(xì)胞系中，RAGE的激活通 過(guò)測(cè)量與RAGE結(jié)合的熒光素酶基因的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞用PBS進(jìn)行洗滌，細(xì)胞裂解緩沖 液(40mM 麥黃酮(pH 7.8)，、50mM NaCl、2mM EDTAUmM MgS04、5mM DTT. 1% Triton X-100 被混合并且在蒸餾水中稀釋5倍)以50 μ L的量加入到24-孔Transwell板的每個(gè)孔中， 接著在室溫下溫育15min以分開(kāi)細(xì)胞。5 20 μ L由此形成的細(xì)胞懸浮液在5_ml圓底聚苯 乙烯管(BD Falcon)中與100 μ L熒光素酶分析試劑(40mM麥黃酮(pH 7. 8)、0. 5mM ATP、 IOmM MgS04、0. 5mM EDTAUOmM DTT. 0. 5mM輔酶A、0. 5mM熒光素)充分混合，其后發(fā)光計(jì)被 用于在2小時(shí)內(nèi)對(duì)整個(gè)24-孔Transwell板進(jìn)行讀數(shù)，其中積分時(shí)間為每孔10 30sec。 其中僅僅使用淀粉狀蛋白β肽的對(duì)照顯示高的熒光素酶表達(dá)水平，這是由于RAGE和淀粉 狀蛋白β肽之間的相互作用。相反，當(dāng)?shù)矸蹱畹鞍爪码呐c候選物24組合加入時(shí)，測(cè)量到 較低的熒光素酶表達(dá)水平，這表明候選物24起到抑制RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的 作用。通過(guò)對(duì)淀粉狀蛋白β肽傳輸?shù)霓卓剐试囼?yàn)以及利用下游信號(hào)發(fā)射結(jié)構(gòu)的試驗(yàn) 所獲得的結(jié)果一起證實(shí)了，根據(jù)本發(fā)明的基于模擬BBB的系統(tǒng)對(duì)于篩選RAGE-淀粉狀蛋白 β肽相互作用抑制物質(zhì)可能非常有用。
權(quán)利要求
篩選RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質(zhì)的方法，其包括a)制備RAGE-表達(dá)細(xì)胞系；b)在Transwell板的上室中以形成細(xì)胞間緊密連接的方式培養(yǎng)所述細(xì)胞系；c)向所述Transwell板的上室中加入淀粉狀蛋白β肽和用于抑制RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的候選物；和d)比較所述Transwell板的下室中淀粉狀蛋白β肽的濃度與當(dāng)沒(méi)有使用候選物時(shí)在所述下室中獲得的淀粉狀蛋白β肽濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞系是小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEND.3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述RAGE是人RAGE。
4 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述淀粉狀蛋白β肽用熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述熒光物質(zhì)是熒光素酶。
6.篩選RAGE-淀粉狀蛋白β肽抑制物質(zhì)的系統(tǒng)，其包括RAGE-表達(dá)細(xì)胞系，其在 Traswell板中以形成細(xì)胞間緊密連接的方式進(jìn)行培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞系是bEND.3。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的系統(tǒng)，其中所述RAGE是人RAGE。
9.篩選針對(duì)RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的拮抗劑的方法，其包括使淀粉狀蛋白 β肽和抑制RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用的候選物與用分別攜帶RAGE和NF κ B的重組 表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系接觸，和測(cè)量NF κ B的表達(dá)模式。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述攜帶NFκ B的重組表達(dá)載體包括在靠近NF κ B基 因的位置處的熒光素酶基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞系是CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞系。
全文摘要
提供的是利用Transwell板和RAGE-表達(dá)細(xì)胞系篩選RAGE-淀粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質(zhì)的系統(tǒng)和方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101828115SQ200880111808
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2008年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日
發(fā)明者墨仁姬, 孫成敏 申請(qǐng)人:首爾國(guó)立大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財(cái)團(tuán)