專利名稱：在不使用對照細(xì)胞的情況下測量細(xì)胞活力的方法
在不使用對照細(xì)胞的情況下測量細(xì)胞活力的方法本申請要求2007年11月9日提交的美國專利申請60/986，751號的優(yōu)先權(quán)，其全 部內(nèi)容通過引用包含于此。本發(fā)明涉及如下領(lǐng)域細(xì)胞生物學(xué)以及細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程。更具體而言，本發(fā)明 涉及通過檢測蛋白質(zhì)或酶活性來測量所培養(yǎng)細(xì)胞的活力的方法。組織工程(見Langer 和 Vacanti ,Science，260 :920_926 (1993))領(lǐng)域關(guān)注于對基 質(zhì)或支架的使用以支持細(xì)胞的生長和維持。例如，基質(zhì)誘導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞移植(MAGI 移植)是用來修復(fù)軟骨的第二代自體軟骨細(xì)胞移植(ACi)方法。在MAGI 移植中，將培 養(yǎng)擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞接種到膠原基膜基質(zhì)上，此后便于外科移植。MAGI 移植可以用于通 過關(guān)節(jié)鏡檢查或者通過微創(chuàng)手術(shù)來治療軟骨缺損。組織工程化產(chǎn)品中對基質(zhì)的使用對試圖測量工程化產(chǎn)品組成細(xì)胞活力的研究者 提出重大挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的測量細(xì)胞活力的方法有賴于活細(xì)胞兩個(gè)特征中的至少一個(gè)特征呈 現(xiàn)出完整質(zhì)膜和/或其代謝活性。在體外，細(xì)胞的死亡伴隨著失去質(zhì)膜的完整性。使用活體 染料在顯微鏡下可以容易地觀測到這種現(xiàn)象。在最常用的活體染料化驗(yàn)中，將染料臺盼藍(lán) 添加到細(xì)胞的懸浮液中。染料無法進(jìn)入膜完整的活細(xì)胞，但使膜破損的死亡或正在死亡的 細(xì)胞著色?？商孢x地，可以通過測量細(xì)胞代謝活性的一個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記來評定細(xì)胞活力。一 個(gè)這樣的方法是對在活細(xì)胞中存在但在死亡細(xì)胞中枯竭或不存在的主要代謝物(例如， ATP、NADH)進(jìn)行量化。補(bǔ)充方法是對從膜受損細(xì)胞釋放出的特定酶活性進(jìn)行化驗(yàn)。例如， Cytox-Fluor細(xì)胞毒性化驗(yàn)(Promega，麥迪遜市，威斯康星州，Cat. No. G9260)使用內(nèi)部淬 滅熒光肽底物雙_ (丙氨酰_丙氨酰_苯丙氨酰)_羅丹明-110 (bis- (Ala-Ala-Phe) -Rhoda mine-110)來檢測從死亡細(xì)胞釋放出的蛋白酶，諸如三肽基肽酶。在應(yīng)用于組織工程化產(chǎn)品時(shí)，大多數(shù)現(xiàn)有細(xì)胞活力檢驗(yàn)需要在檢驗(yàn)之前分離(收 回)細(xì)胞。然而，分離過程常常是復(fù)雜的，有時(shí)是苛刻的，從來不是100%有效的。在該過程 中，隨著活細(xì)胞失去或被殺死，或者，隨著死亡細(xì)胞失去，會出現(xiàn)測量人為因素。例如，在通 過臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)行評估時(shí)，所收回細(xì)胞的活力總是接近100%，這未能反映出獲得收回細(xì) 胞的原始樣本的真實(shí)活力。由于基質(zhì)干擾、非特異性結(jié)合、檢測的上限低、范圍不夠，或者在 不同培養(yǎng)基類型中的精度低，在不首先收回細(xì)胞的情況下使用基于代謝活性的活力檢驗(yàn)的 嘗試同樣是不成功的。此外，現(xiàn)有的基于代謝活性的細(xì)胞活力檢驗(yàn)都有根本的缺點(diǎn)，即，為 了測量測試樣本的活力，需要細(xì)胞數(shù)量和活力已知的陽性和/或陰性對照。為了做出有效 的比對，對照和測試樣本中使用的細(xì)胞必須是來自同一供體或同一株的同樣類型的細(xì)胞， 還必須具有同樣的代謝輪廓(metabolic profile)。此方式不能應(yīng)用于如下這些組織工程 產(chǎn)品其中，接種在3維基質(zhì)中的細(xì)胞常常得到與生長在懸浮液中或2維表面上的同樣的細(xì) 胞非常不一樣的代謝概況。另外，在每天的活力和質(zhì)量控制中檢驗(yàn)大量批次的工業(yè)生產(chǎn)實(shí) 踐中準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)膶φ找约矮@得額外的細(xì)胞常常是不實(shí)際的。所移植細(xì)胞的活力在采用組織工程化產(chǎn)品的成功治療中仍然是關(guān)鍵的決定因素。 鑒于現(xiàn)有活力檢驗(yàn)的缺點(diǎn)，需要容易、迅速且準(zhǔn)確的方法以測量組織工程化產(chǎn)品中細(xì)胞的 活力。這種方法需要在大范圍細(xì)胞密度上、采用許多不同的細(xì)胞類型、培養(yǎng)基和基質(zhì)進(jìn)行操作。此外，這種細(xì)胞活力方法在無需對照細(xì)胞群的情況下有利地進(jìn)行操作。本發(fā)明提供了用以在各種情況下并且無需對照細(xì)胞而容易、快速、準(zhǔn)確地測量細(xì) 胞活力的方法。這些方法部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)組織工程化產(chǎn)品中細(xì)胞的活力可 以通過檢測培養(yǎng)物上清液中所呈現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)酶活性的比率來確定。為了本發(fā)明的目的，所理論化但不局限于的方面是，在伴隨細(xì)胞死亡而失去膜完 整性時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中由質(zhì)膜正常限制的細(xì)胞的內(nèi)含物變得可檢測。本發(fā)明的方法 有賴于對細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶(即，可以檢測其是呈現(xiàn)在活的還是死亡細(xì)胞中的蛋白 質(zhì)或酶)的檢測。然后可以通過檢測細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶在不含細(xì)胞的條件培養(yǎng)基 (例如，上清液、或者支持基質(zhì)或支架)中與在含有細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(例如，膜完整的細(xì)胞 以及相關(guān)聯(lián)的條件培養(yǎng)基)中的相對量來確定培養(yǎng)物的細(xì)胞活力。僅在含有細(xì)胞的條件培 養(yǎng)基的細(xì)胞中的細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶的量可以通過這樣的方式確定破壞膜完整細(xì)胞 的膜完整性(例如，部分或完全裂解)、測量含有細(xì)胞部分(即，破損細(xì)胞以及相關(guān)聯(lián)的條件 培養(yǎng)基)中總的酶活性，并且然后減去由相關(guān)聯(lián)的條件培養(yǎng)基貢獻(xiàn)的任何酶活性。通過對 無細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行檢驗(yàn)來測量所減去的值。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于通過這樣的方式測量培養(yǎng)基中維持的細(xì)胞群中活 細(xì)胞的比率的方法檢測條件培養(yǎng)基的不含細(xì)胞的部分(例如，條件培養(yǎng)基)中的細(xì)胞死亡 穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性，檢測培養(yǎng)基的含有細(xì)胞的部分(例如，細(xì)胞和條件培養(yǎng)基)中的細(xì)胞 死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性，并且將兩個(gè)部分中的細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的水平相比 較。通過該方法，群中活細(xì)胞的比率與含有細(xì)胞的部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的 水平與不含細(xì)胞部分的細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的水平之間的差成比例。在一些實(shí)施例中，所檢驗(yàn)的細(xì)胞可以生長在傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)底物(例如，玻 璃或組織培養(yǎng)塑料)上。在其它實(shí)施例中，在三維支架或基質(zhì)上或者三維支架或基質(zhì)中支 持細(xì)胞，即，細(xì)胞是組織工程化產(chǎn)品的一部分。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞生長在豬膠原蛋白衍 生基質(zhì)上。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法還包括步驟提供細(xì)胞群以及成比例量的不含細(xì) 胞的培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的樣本部分。然后，樣本部分被分成含細(xì)胞(即，細(xì)胞加條件培養(yǎng)基) 和不含細(xì)胞(僅條件培養(yǎng)基)組成部分并根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行處理。在某些實(shí)施例中，通過例如剪切、聲波降解法、低氣壓、高溫、低溫、化學(xué)或酶裂解、 或者膜解耦劑破壞樣本部分細(xì)胞的膜完整性。在一些實(shí)施例中，可以通過添加兩親分子破 壞膜完整性。在某些實(shí)施例中，兩親分子是皂素。本發(fā)明其它方面提供了用于測量組織工程化產(chǎn)品的基質(zhì)中所呈現(xiàn)活人類軟骨細(xì) 胞(在培養(yǎng)基中維持，具有1. 5X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2和6X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2之間的細(xì)胞密度) 的比率的方法。該步驟包括提供含有細(xì)胞以及成比例量的培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的組織工程化 產(chǎn)品部分；提供培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含組織工程化產(chǎn)品細(xì)胞的部分；將皂素以及雙_(丙氨 酰_丙氨酰_苯丙氨酰)_若丹明-110 (bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110)添加到這些 部分中；并且檢測兩個(gè)部分中來自附著(cleave)的bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110的 熒光信號。在一些實(shí)施例中，可以在這些方法中用具有綴合離去基團(tuán)的另一底物或者丙氨 酰-丙氨酰-苯丙氨酰(Ala-Ala-Phe-AMC)代替 bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110。組 織工程化產(chǎn)品中活細(xì)胞的比率與含有細(xì)胞與不含細(xì)胞部分之間熒光信號強(qiáng)度的差除以兩個(gè)部分中熒光信號的總量的結(jié)果成比例。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了確定測試治療(例如，采用藥理或生物化合物的治 療；或者暴露于各種條件(例如，滲透壓、PH、溫度、或者氣壓)下；或者光、電或機(jī)械治療； 或者這些的組合)對于所培養(yǎng)細(xì)胞測試群的細(xì)胞毒性的方法。該方法需要將測試治療應(yīng) 用于測試群，通過本發(fā)明的方法測量試驗(yàn)群中活細(xì)胞的比率，并將測量到的試驗(yàn)群的活力 與所培養(yǎng)細(xì)胞的未治療群(“對照群”)的活力相比較。可以在各種條件下采用各種細(xì)胞來使用本發(fā)明的方法。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞可 以是哺乳動(dòng)物的(例如，人類的、靈長類的、綿羊的、牛的、豬的、馬的、貓的、犬科的或嚙齒 類的)。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞是人類的。衍生自任何來源組織的細(xì)胞均可以用于本發(fā)明的 方法中。在特定實(shí)施例中，細(xì)胞是軟骨細(xì)胞。本發(fā)明的方法可以用于密度范圍廣泛的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞以1.5X104 個(gè)細(xì)胞/cm2與6 X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2之間的密度呈現(xiàn)。在其它實(shí)施例中，細(xì)胞可以以2. 2 X IO4 個(gè)細(xì)胞/cm2與2. 8 X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2之間、3. 5 X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2與2. 8 X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2 之間、或者5X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2與IX IO6個(gè)細(xì)胞/cm2之間的密度呈現(xiàn)。在某些實(shí)施例中， 細(xì)胞可以以至少 2. 0X105、5. 0X105、1. 0X106、2. 0X106、2. 8X106、3X106、4X106、5X106、 6X 106、8X 106、10X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2、或者更高密度呈現(xiàn)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，通過這樣的方式來測量細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性將樣本 部分與細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的底物相接觸，其中，底物綴合到可檢測離去基團(tuán)；然后檢測該 離去基團(tuán)。通過該方法，所檢測離去基團(tuán)的量與樣本部分中所呈現(xiàn)細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的 水平成比例。在各種實(shí)施例中，離去基團(tuán)可以是顯色的、發(fā)光的或者熒光的。在特定實(shí)施例 中，離去基團(tuán)是熒光的。在某些實(shí)施例中，離去基團(tuán)是羅丹明110。在其它實(shí)施例中，離去基 團(tuán)是香豆素衍生物，例如，7氨基4甲基香豆素(AMC)。用于酶活性的底物可以是可以由酶處理的任何分子。在某些實(shí)施例中，底物是三 肽。在一些實(shí)施例中，底物是bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110。在其它實(shí)施例中，底物 是Ala-Ala-Phe-AMC。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可以還包括步驟添加對離去基團(tuán)的信號進(jìn)行調(diào) 制(例如，增強(qiáng)/增大或者衰減/降低)的制劑。在一些實(shí)施例中，制劑可以將信號調(diào)制 至少 5%、10%、15%、20%、40%、60%或 80% ；或者大于 1、2、3、5、10、50 或 100 倍(fold)。 在某些實(shí)施例中，對離去基團(tuán)的信號進(jìn)行調(diào)制的制劑通過使離去基團(tuán)的信號衰減來進(jìn)行工 作。在特定實(shí)施例中，使離去基團(tuán)的信號衰減的制劑是酚紅。在一些實(shí)施例中，酚紅可以以 達(dá)到10、20、40、60、70、100、150、200mg/L或者更高的濃度呈現(xiàn)。在本發(fā)明的各種實(shí)施例中，所檢測的細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性可以是例如合成代謝的 或分解代謝的、氧化還原酶、轉(zhuǎn)染酶、水解酶、裂解酶、激酶、磷酸酸、異構(gòu)酶或者連接酶。在 一些實(shí)施例中，細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性可以是蛋白水解的，例如，一個(gè)或更多個(gè)三肽基肽酶、 糜蛋白酶或者類糜蛋白酶(諸如，鈣蛋白酶)。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性是這樣的蛋白質(zhì)或酶活性在壞 死性或程序性細(xì)胞死亡(或者二者均有)后是穩(wěn)定的(以及優(yōu)選地，在二者之一形式的細(xì) 胞死亡后是穩(wěn)定的)。在其它實(shí)施例中，細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性是壞死性穩(wěn)定蛋白質(zhì) 或酶活性。在另外一些實(shí)施例中，細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性是程序性細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可以包括質(zhì)量控制檢驗(yàn)。在這種實(shí)施例中，本發(fā)明 的方法可以還包括步驟檢測含有細(xì)胞或不含細(xì)胞部分(或者二者均有)中污染物特定酶 活性。檢測污染物特定酶活性表明了培養(yǎng)污染物。結(jié)合在本說明書中并形成本說明書一部分的附圖示例了本發(fā)明的若干實(shí)施例，連 同描述一起進(jìn)一步用以解釋本發(fā)明的原理。


圖1是細(xì)胞活力檢驗(yàn)的示意性說明。圖2A是這樣的實(shí)驗(yàn)的圖形化表示證明了樣本的細(xì)胞和上清液中呈現(xiàn)的酶活性 與細(xì)胞群的密度線性相關(guān)。圖2B是這樣的實(shí)驗(yàn)的圖形化表示證明了樣本的上清液中呈現(xiàn)的酶活性與細(xì)胞 群的密度線性相關(guān)。圖3是這樣的實(shí)驗(yàn)的圖形化表示圖4是這樣的實(shí)驗(yàn)的圖形化表示圖5是這樣的實(shí)驗(yàn)的圖形化表示性。圖6是這樣的實(shí)驗(yàn)的圖形化表示圖7是這樣的實(shí)驗(yàn)的圖形化表示確性。圖8是這樣的實(shí)驗(yàn)的圖形化表示 的離去基團(tuán)的底物。定義單數(shù)形式的“一”、“一個(gè)”、“該”包括復(fù)數(shù)引用，除非上下文明確規(guī)定了例外的情況。除非規(guī)定了例外的情況，用語“約”表示士 10%。本文中所使用的“表面積”，例如，方形面積，cm2，是指底物的宏觀表面積，即，表面 到二維平面上的Z軸投影。本文中所使用的“密度”意思是每單位面積或體積中一些物質(zhì)(例如，細(xì)胞或其它 對象)的平均數(shù)量。在本申請中最常出現(xiàn)的是，密度將會出現(xiàn)在細(xì)胞密度(每單位表面積 中細(xì)胞的數(shù)量)的上下文中。通過將所植細(xì)胞的數(shù)量除以其生長表面的宏觀表面積來估量 此平均數(shù)目。此定義預(yù)見到二維表面、以及三維結(jié)構(gòu)或點(diǎn)陣。本文中所使用的用語“培養(yǎng)基”是指在培養(yǎng)物中支持細(xì)胞生長或維持的所有成分。 這可以包括傳統(tǒng)的流體細(xì)胞培養(yǎng)基以及所述培養(yǎng)基會含有的任何額外因子。這些因子可以 包括例如血清、抗生素、生長因子、藥理劑、緩沖劑、PH指示劑等。培養(yǎng)基不應(yīng)一般地指其上 或其中維持了或生長了細(xì)胞的任何基質(zhì)或支持物，除非明確規(guī)定了例外的情況。相應(yīng)地，在 組織工程化產(chǎn)品中，基質(zhì)通常是含有細(xì)胞部分的一部分。相應(yīng)地，“細(xì)胞培養(yǎng)基的不含細(xì)胞的部分”包括培養(yǎng)基的流體部分，并且不包括任 何含有細(xì)胞的基質(zhì)。類似地，“細(xì)胞培養(yǎng)基的含有細(xì)胞的部分”包括與培養(yǎng)基相關(guān)聯(lián)的、所分證明了所公開的檢驗(yàn)準(zhǔn)確地預(yù)測了活力。 證明了添加酚紅不影響所公開檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 證明了使用替選基質(zhì)不影響所公開檢驗(yàn)的準(zhǔn)確證明了沒有基質(zhì)不影響所公開檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 證明了使用非人類細(xì)胞不影響所公開檢驗(yàn)的準(zhǔn)證明了所公開的檢驗(yàn)可以使用具有并非羅丹明離的細(xì)胞或者基質(zhì)相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞?！皸l件培養(yǎng)基”意思是這種培養(yǎng)基與細(xì)胞相接觸以允許修改培養(yǎng)基的成分，即，通 過攝取或釋放一個(gè)或更多個(gè)代謝物、營養(yǎng)素、或者基因(factor)(例如，一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞 死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性)。除非規(guī)定了例外的情況，條件培養(yǎng)基通常意思是這種培養(yǎng)基 與細(xì)胞群相接觸，用以從膜完整性受損的細(xì)胞采集細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性。如本申請中所使用的，“可檢測的離去基團(tuán)”是指可以用來監(jiān)測酶促反應(yīng)進(jìn)度的酶 促反應(yīng)產(chǎn)物?！暗鞍踪|(zhì)組”意思是一組細(xì)胞中所表達(dá)的所有蛋白的集合?！爸亟M細(xì)胞”在本文中是指非原生生物分子，例如，核酸、其轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物、或者 含有以上任何內(nèi)容的細(xì)胞。酶的“內(nèi)在活性”意思是其Vmax ；即，在僅酶的制備底物的能力有限時(shí)的產(chǎn)物產(chǎn)出 率；否則針對酶活性優(yōu)化反應(yīng)條件。本申請中所使用的“完整膜”意思是用以在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下阻止染料臺盼藍(lán)的 能力。“比例因子”意思是對于特定檢驗(yàn)條件所確定的數(shù)值常數(shù)?！跋鄬Υ笮　痹诒旧暾堉惺侵笇?shù)目表示成參考值的函數(shù)；例如，將一個(gè)值表示成 另一個(gè)值的分?jǐn)?shù)?！敖^對大小”在本申請中意思是一些數(shù)目的實(shí)際數(shù)值，S卩，不是相對大小。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了基于樣本兩部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的相對大小來計(jì) 算活力的方法。與活體染料檢驗(yàn)不同，不需要從基質(zhì)中回收細(xì)胞。相應(yīng)地，本發(fā)明的方法可 以排除與現(xiàn)有方法相關(guān)聯(lián)的測量人為因素，例如，在過程中失去細(xì)胞、低估或高估了活力。確定細(xì)胞活力本發(fā)明提供了測量培養(yǎng)基所維持的群中活細(xì)胞比率的方法。這是通過這種方式完 成的將不含細(xì)胞的條件培養(yǎng)基部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的量與含有細(xì)胞的條件培養(yǎng)基 部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶的量相比較。通常，本發(fā)明的方法包括三個(gè)步驟(1)將樣本分成兩部分，含有細(xì)胞的部分(“X”)和不含細(xì)胞的部分(“Y”)；(2)將含有細(xì)胞部分的細(xì)胞(或者取自含有細(xì)胞部分的樣本)裂解(Iyse)；以及(3)檢測或測量每個(gè)部分(“X”和“Y”)中細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶的量。技術(shù) 人員可以以各種方式將這些測量結(jié)果轉(zhuǎn)換為細(xì)胞群中活細(xì)胞的比率。在一個(gè)示例中，首先將條件培養(yǎng)基均等地分成兩個(gè)部分(即，兩半)，含有細(xì)胞的 部分(“X”)和不含細(xì)胞的部分(“Y”)。如圖1中所示以及如示例1中所描述的，當(dāng)含有細(xì) 胞的部分(“Y”)具有樣本的條件培養(yǎng)基的一半并且其余一半是在不含細(xì)胞的部分(“X”) 中時(shí)，則比率活力(fractional viability)只是差值除以活性的和，即 此表達(dá)式的分子是膜完整的細(xì)胞中呈現(xiàn)的酶活性(含有細(xì)胞部分中的量，即，細(xì)胞和條件培養(yǎng)基，小于只有條件培養(yǎng)基的情況下呈現(xiàn)的量)，而分母是樣本中所呈現(xiàn)酶活性 的總量。如果樣本的含有細(xì)胞和不含細(xì)胞部分中所呈現(xiàn)測量到的酶活性為500和50，則比 率活力為 當(dāng)然，在本發(fā)明方法的第一個(gè)步驟中，不需要在含有細(xì)胞的與不含細(xì)胞的部分之 間均分樣本中的條件培養(yǎng)基。在兩個(gè)部分之間未均分樣本中全部條件培養(yǎng)基比率的情況 下，則比率活力給出如下 其中， 在第一個(gè)表達(dá)式中，c是比例因子，用于相對于所檢驗(yàn)含有細(xì)胞部分中條件培養(yǎng)基 的體積來調(diào)整所檢驗(yàn)無細(xì)胞部分中條件培養(yǎng)基的體積。此比例因子是Y部分(不含細(xì)胞的 樣本部分)中所呈現(xiàn)全部樣本條件培養(yǎng)基的非零十進(jìn)制分?jǐn)?shù)f的函數(shù)。在示例性的示例中， 將組織工程化產(chǎn)品的樣本分成(I)X部分，含有細(xì)胞以及樣本條件培養(yǎng)基的25% ；以及(2) Y部分，不含細(xì)胞，含有樣本條件培養(yǎng)基的75 %。此處，c為 1-.75 .25 1 如果對于X和Y測量到的酶活性為400和30，貝Ij 以上討論包括使用本發(fā)明所提供的方法來計(jì)算活力的詳細(xì)手段。這可以是在所生 長的僅用于檢驗(yàn)或者用于估算一些較大群活力的培養(yǎng)物的上下文中。例如，在對于組織工 程化產(chǎn)品的“批次釋放”檢驗(yàn)中，通過取產(chǎn)品的樣本(即，活組織檢查)、以及加置的條件培 養(yǎng)基中的一些來確定產(chǎn)品組成細(xì)胞的活力。以其最簡單的形式，加置于(overlying)產(chǎn)品 的全部條件培養(yǎng)基的百分比以及產(chǎn)品被活組織檢查的總表面積或體積(以及因此的細(xì)胞) 的百分比是一樣的。例如，如果活組織檢查包括產(chǎn)品細(xì)胞的約2%，則樣本中還應(yīng)當(dāng)呈現(xiàn) 加置于產(chǎn)品的條件培養(yǎng)基體積的約2%。取樣可以通過這樣的方式完成使用技術(shù)人員所 能預(yù)見到的任意數(shù)量的步驟，取細(xì)胞連同條件培養(yǎng)基一起、或者按順序(按兩者之一的次 序)、或者兩項(xiàng)技術(shù)的一些組合(例如，取細(xì)胞和一些條件培養(yǎng)基，然后移除另外的條件培 養(yǎng)基)。以上公式隱含假定了樣本中百分比細(xì)胞對百分比體積的該1 1的比值。技術(shù)人員將會明白的是，1 1的細(xì)胞對體積取樣比值可以變化，以及，特定的細(xì) 胞類型、產(chǎn)品、或者培養(yǎng)條件是可以修改為(或者，甚至需要)樣本中細(xì)胞和條件培養(yǎng)基的變換的比值。如對于技術(shù)人員將會是明顯的，應(yīng)當(dāng)根據(jù)所使用取樣策略的不同采用對以上 所呈現(xiàn)計(jì)算的特定修改。例如，樣本中百分比條件培養(yǎng)基體積對百分比細(xì)胞的比值偏離1， 則樣本的活力可以給出如下 其中，α =樣本中全部細(xì)胞百分比對總的條件培養(yǎng)基體積百分比的比值。因此， 如果樣本包括全部細(xì)胞的2%以及條件培養(yǎng)基總體積的4% (即，全部細(xì)胞百分比與條件培 養(yǎng)基百分比的比值小于1)，并且“X”和“Y”樣本部分中的活性分別為1000和200，則 可替選地，樣本中百分比細(xì)胞對百分比條件培養(yǎng)基的比值可以大于1。因此，如果 樣本包括全部細(xì)胞的5%以及全部條件培養(yǎng)基的1%，并且“X”和“Y”樣本部分中的活性分 別為820和20，則 值得注意的是，在這些示例中，僅需要在以上已呈現(xiàn)公式的分母中進(jìn)行校正。該修 正后的公式假定在所檢驗(yàn)的“X”與“Y”部分之間均分樣本中所呈現(xiàn)條件培養(yǎng)基的總體積。 在未均分條件培養(yǎng)基時(shí)，對于在樣本的“X”與“Y”部分之間未均分條件培養(yǎng)基的情況，可以 將該同樣的分母校正應(yīng)用于已提供的公式。本發(fā)明所提供的用于確定細(xì)胞活力的方法消除了對于對照細(xì)胞的需要。對照細(xì) 胞用來標(biāo)定針對特定培養(yǎng)基、基質(zhì)或者細(xì)胞類型的基于酶的檢驗(yàn)。這部分地因?yàn)楝F(xiàn)有檢驗(yàn) 做出了蛋白質(zhì)或酶活性的絕對大小。蛋白質(zhì)或酶活性的絕對大小會受到如下因素的影響 例如，血清、添加劑、維生素、酚紅或基質(zhì)/底物存在或者不存在。另外，蛋白質(zhì)或酶活性的 絕對大小會受到如下因素的影響內(nèi)在的供體對供體、株對株、以及細(xì)胞傳代對傳代的變化 性。另外，現(xiàn)有方法即使在應(yīng)用(諸如，組織工程)中密度低的一端也常常飽和。本發(fā) 明所提供的方法對于在高細(xì)胞密度應(yīng)用(諸如，組織工程)中測量活力是有用的。細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶活性.檢驗(yàn)條件以及細(xì)胞破損細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶活性是這樣的活性在由于各種機(jī)制(例如，程序性細(xì) 胞死亡(需要能量的過程)或者壞死(不需要能量的過程))而出現(xiàn)的細(xì)胞死亡過程中保 持在可檢測的水平的活性。因?yàn)楦鞣N細(xì)胞死亡過程以不同的程度影響不同的蛋白質(zhì)，所以 細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)可以是程序性細(xì)胞死亡穩(wěn)定的、壞死性穩(wěn)定的、或者二者均有。對于細(xì) 胞死亡的概述，參見例如 Guimaraes 和 Linden，Eur. J. Biochem.，271 1638-1650 (2004)以 及 Hengartner, Nature,407 770-6(2000)。在一些實(shí)施例中，相對于未經(jīng)歷細(xì)胞死亡過程的細(xì)胞，在具有經(jīng)歷了細(xì)胞死亡過程的細(xì)胞中，細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶活性的相對濃度不受影響，或改變不大于5%、10%、 15%、20%、40%、60%或80%，或者不大于1、2或3倍。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋 白質(zhì)和酶活性的半衰期可以為約30、60、90或120分鐘；約2、3、4、5、6、8、10或12小時(shí)；或 者達(dá)到約1、2、3、4天、或者更長時(shí)間。技術(shù)人員將會明白的是可以通過各種手段來識別適合于本發(fā)明的蛋白質(zhì)或 酶活性。例如，相對于未經(jīng)歷細(xì)胞死亡過程的細(xì)胞的基因表達(dá)簡檔(gene expression profile)，對經(jīng)歷了細(xì)胞死亡過程的細(xì)胞的基因表達(dá)簡檔的分析可以用來識別蛋白質(zhì)產(chǎn)物 為細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或者酶活性的基因。這種基因相對于未經(jīng)歷細(xì)胞死亡過程的細(xì)胞， 在經(jīng)歷了細(xì)胞死亡過程的細(xì)胞中可以有差異地表達(dá)為不大于5%、10%、15%、20%、40%、 60%或80%，或者不大于1、2或3倍。技術(shù)人員將會認(rèn)識到的是需要在不同細(xì)胞死亡過 程中針對酶活性或蛋白產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)一步對以此方式識別出的基因進(jìn)行評估。應(yīng)當(dāng)由細(xì)胞的外圍(例如，在質(zhì)膜上或質(zhì)膜內(nèi)、在細(xì)胞質(zhì)中、或者在膜結(jié)合細(xì)胞 器內(nèi))約束細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶活性。目標(biāo)分子不應(yīng)當(dāng)是分泌蛋白質(zhì)(secreted protein)，因?yàn)闊o法容易地確定這種蛋白質(zhì)或酶活性的起源(即，來自活細(xì)胞或非活細(xì) 胞)。如果被約束在質(zhì)膜內(nèi)，則細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性在失去膜完整性后應(yīng)該變得可 檢驗(yàn)。細(xì)胞群中細(xì)胞的膜完整性會由于技術(shù)人員已知的各種手段而破損。這種手段 應(yīng)當(dāng)保留所有或大多數(shù)細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性。例如，通過剪切、聲波降解法、真 空、高溫、低溫(例如，冷凍)、化學(xué)或酶裂解、或者膜解耦劑會破壞細(xì)胞膜完整性?？梢酝?過采用兩親分子(諸如，脂肪酸鹽(soap)、去污劑、或者某些苷(例如，皂素))進(jìn)行孵化 (incubation)來實(shí)現(xiàn)化學(xué)裂解?？梢哉{(diào)整化學(xué)裂解劑的量以實(shí)現(xiàn)期望的效果。例如，可以 以0. 01%與2% (W/V)之間(例如，0. 05%與0. 5%之間)的最終濃度來使用皂素。細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性可以是細(xì)胞群蛋白質(zhì)組天然出現(xiàn)的成分，或者，非 天然出現(xiàn)的成分，例如，所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)或酶活性。這種重組分子可以通過本領(lǐng)域中 已知的常規(guī)方法引入，并可以被穩(wěn)定地或瞬時(shí)地表達(dá)，即，整合到基因組中、或者基于質(zhì)粒。 參見例如 JosephSambrook 禾口 David Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory Press ；第 3 片反(2001)。將會理解的是可以有多于一個(gè)酶負(fù)責(zé)細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性。例如，底物可以由一 組相關(guān)酶共享。在一些實(shí)施例中，可以通過至少1、2、3、4、5、10、20或更多個(gè)不同的酶來催 化酶活性。檢測方法可以通過本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)技術(shù)(例如，蛋白免疫印跡(Westernblot)、ELISA、質(zhì) 譜學(xué)、色譜法或者免疫化學(xué))來檢測細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)?？商孢x地，可以通過特性化的細(xì) 胞死亡穩(wěn)定酶活性來檢測細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)。即，可以通過其功能(例如，它所催化的反 應(yīng))間接地檢測蛋白質(zhì)。通過將酶分散到細(xì)胞外、底物進(jìn)入到細(xì)胞中或者二者均有，破損的 膜完整性允許檢測之前對于細(xì)胞外環(huán)境中的分子無法接觸到的酶活性。技術(shù)人員將會認(rèn)識到的是可以對離去基團(tuán)和底物的組合進(jìn)行篩選以用于本發(fā)明 的方法，而無需知曉負(fù)責(zé)對離去基團(tuán)的釋放進(jìn)行催化的酶。例如，測試樣本可以根據(jù)本發(fā)明 的方法采用候選底物進(jìn)行孵化以及根據(jù)已知數(shù)目的活細(xì)胞和非活細(xì)胞(見例如示例1)做出。然后，檢測離去基團(tuán)并相對于活細(xì)胞與非活細(xì)胞的已知比繪制其密集度。有用的底物 將會是這些底物以活細(xì)胞與非活細(xì)胞的已知比例承載線性相關(guān)性。通過以此方式對底物 進(jìn)行測試，無需知曉細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的來源。酶底物/離去基團(tuán)綴合物是本領(lǐng)域中公知的。這種化合物的有用屬性是可檢測離 去基團(tuán)的內(nèi)部淬滅。即，離去基團(tuán)在綴合到酶底物時(shí)一點(diǎn)也不能(或者僅僅很少地能夠) 檢測，但是，在從底物分離后迅速變得可檢測，例如，按照酶底物的酶處理。可以用于本發(fā)明 方法中的離去基團(tuán)的類別包括但不限于顯色分子、熒光分子以及發(fā)光分子。用于檢測酶活性的顯色分子是本領(lǐng)域中公知的。四唑鹽和甲臜(formazan) 是用來檢測酶活性的首選底物中的一些(Altman, Prog. Histochem. Cytochem.，9 1-56(1976))。在例如美國專利7，026，111號的第11欄中可以找到另外的比色法化合物。發(fā)光分子(諸如，魯米諾和異魯米諾)可以綴合到酶底物并直接用于本發(fā)明的方 法中(見例如美國專利4，748，116號)?？商孢x地，在表達(dá)出蟲熒光素酶的系統(tǒng)中可以采用 綴合到蟲熒光素的底物(見例如美國專利7，148，030號)。本發(fā)明的方法可以采用熒光離去基團(tuán)，例如，噸染料、熒光素、羅丹明、基于香豆素 的分子、以及其衍生物?？捎玫臒晒夥肿邮潜绢I(lǐng)域中公知的。(對于熒光離去基團(tuán)的示例，參 見例如美國專利 4，557，862 號；4，640，893 號；4，694，070 號；4，801，534 號；5，352，803 號； 6，130，101 號；6，248，904 號；6，342，611 號；6，458，966 號；6，750，357 號；6，759，207 號； 其中的RE38，723，特別是表II，以及，2002年5月6日提交的美國專利申請10/138，375號 (以美國專利公開2003/0208037號公開)和2003年7月18日提交的10/621，311號(以 美國專利公開2005/0014160號公開))。可以通過任何適合的手段(例如，視覺觀測、分光光度計(jì)、光度計(jì)、或者熒光計(jì))來 檢測離去基團(tuán)所產(chǎn)生的信號。在樣本中呈現(xiàn)兩個(gè)或更多個(gè)可區(qū)分離去基團(tuán)的應(yīng)用中，可以 同時(shí)或按順序檢測它們。在本發(fā)明的方法中有用的底物離去基團(tuán)綴合物將會具有綴合到細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶 底物的離去基團(tuán)，例如，糖類、油脂、蛋白質(zhì)、縮氨酸、核酸、激素或者維生素基團(tuán)；或者，一個(gè) 或更多個(gè)這些底物的組合。這些基團(tuán)可以是天然出現(xiàn)的(例如，生化純化的)或者合成的 (例如，化學(xué)合成的或者重組產(chǎn)生的)。另外，這些底物可以不含、含有一些、或者含有所有 非原生成分(例如，非天然氨基酸、封閉或保護(hù)基團(tuán)等)。酶/底物對的擴(kuò)展種類是本領(lǐng)域 中已知的(對于這種酶/底物對的示例，參見例如美國專利4，167，449號(特別是表II)、 5，871，946號(特別是表I)、以及7，026，111號(特別是13-18欄))。另外，如美國專利 6，680，178號中所公開的，底物庫可以生成并被篩選以識別有用的肽底物以用于本發(fā)明的 方法中。在一些實(shí)施例中，可以使用噬菌體顯示技術(shù)來說明酶活性的底物偏好，例如，如 Felber 等人，Biol. Chem. 386 291-98 (2005)中所公開的。其它在本發(fā)明方法中有用的分子包括在對于蛋白酶活性的檢驗(yàn)中有用的熒 光染料羅丹明到肽基團(tuán)的綴合物(Leytus等人，Biochem. J.，209 :299_307 (1983))，例 如，Grant 等人，J. of Biomol. Screen, 7 :531_540 (2002)和 Hug 等人，Biochemistry, 38 13906-11(1999)?？梢詫⑦@些試劑整合到多重檢驗(yàn)中，例如，如2004年1月22日提交的美 國專利申請10/762，836號(2005年7月28日以美國專利公開2005/0164321號公開)中 所公開的。
蛋白酶在維持跨門類細(xì)胞和機(jī)體動(dòng)態(tài)平衡中的核心作用是標(biāo)記肽底物作為蛋白 酶活性標(biāo)記流行的一個(gè)原因(見例如美國專利6，037，137號和6，984，718號，其提供用于 檢測原位和整個(gè)細(xì)胞中蛋白酶活性的試劑和方法)。內(nèi)在酶活性在不同的酶之間以及對于特定酶的不同底物廣泛變化。影響酶活性的 內(nèi)在因素包括培養(yǎng)基的條件(例如，PH、溫度、滲透壓等)、酶的表達(dá)水平或翻譯后調(diào)整、以 及底物濃度。專業(yè)人員需要適當(dāng)?shù)卣{(diào)整底物濃度。對于給定的酶以及培養(yǎng)基條件，合適的 底物濃度會處于例如0. 01ng/ml至100mg/ml、或者10 μ g/ml至10mg/ml的范圍內(nèi)。在一些 情形中，0. OOlmM與IOmM之間的底物濃度會是適當(dāng)?shù)?。可替選地，底物濃度可以在0. OlmM 與0. 5mM之間。類似地，允許發(fā)展出可檢測信號的孵化時(shí)間將會依據(jù)這些同樣參數(shù)而廣泛 變化。相應(yīng)地，孵化時(shí)間的范圍可以從30秒或更短直到1、2、3、5、10、20、30、45、60、75或90 分鐘；或者甚至2、4、6、10或12小時(shí)、或者更長時(shí)間。本發(fā)明方法中用于檢測蛋白水解活性的一個(gè)有用底物是biS-(Ala-Ala-Phe) -Rhodamine-110 (Promega, Cat. No. G9260)。本發(fā)明方法中另外的有用底物是 Ala-Ala-Phe-AMC (Bachem Cat No. 1-1415. 0050)。所理論化但不局限于的方面是 Ala-Ala-Phe三肽是用于溶酶體外三肽基肽酶II酶(TPP II ；Balow等人，J. Biol. Chem.， 261 2409-2417(1986))以及溶酶體三肽基肽酶 I 酶(TPP I ；Vines 和 Warburton，Biochim. Biophys. Acta.，1384 233~242 (1998)以及 Steinfeld 等人，J. Histochem. Cytochem.，54 991-996(2006))的底物。值得注意的是，Ala-Ala-Phe是用于功能上與三肽基肽酶類似的 細(xì)菌枯草桿菌(Stambolieva 等人，Arch. Biochem. Biophys.，294 :703_6 (1992))的普通具 體底物。在例如Tian等人，J. Biol. Chem, 281 =6559-72 (2006)(對底物的大庫進(jìn)行篩選) 以及美國專利6，824，998號(公開了對于組織學(xué)應(yīng)用有用的底物(具有沉淀的離去基團(tuán))) 中可以找到TPP I另外的底物。已知Ala-Ala-Phe還是用于糜蛋白酶的底物。用于糜蛋白酶和相關(guān)酶(如，鈣蛋 白酶)的其它底物是本領(lǐng)域中已知的——對于這些酶的結(jié)構(gòu)/功能相關(guān)性也是如此。在 例如 Sharma 等人，Biol. Chem. (2008 ；8 月 8 日的電子刊物；PubMed Id(PMID) 18690777 號)，Croall 禾口 ErsfeldGenome Biol. 8 218(2007) ；Czapinska 禾口 Otlewski Euro. J. Biochem260 :571_95 (1999) ；Perona和 Craik J. Biol. Chem. 272 :29987_90 (1997)中對這 些內(nèi)容進(jìn)行了進(jìn)一步的討論。細(xì)胞培養(yǎng)基以及基質(zhì)本發(fā)明提供了可以用來測量從眾多宿主生物體(例如，哺乳動(dòng)物，包括人)以及從 眾多來源組織衍生出的培養(yǎng)的細(xì)胞活力的方法。所檢驗(yàn)的細(xì)胞可以衍生自處于各種發(fā)育階 段的組織。細(xì)胞可以衍生自成體、胚兒或者胚胎來源。細(xì)胞可以是從起源于三個(gè)原始生殖 層(即，外胚層、中胚層或內(nèi)胚層)的器官衍生出的全能干細(xì)胞或多能干細(xì)胞。例如，細(xì)胞可 以得自皮膚、心臟、骨骼肌、平滑肌、腎臟、肝臟、肺、骨、胰腺、中樞神經(jīng)組織、周圍神經(jīng)組織、 循環(huán)組織、淋巴組織、腸、脾臟、甲狀腺、結(jié)締組織(例如，軟骨細(xì)胞)或者性腺。細(xì)胞可以是 非擴(kuò)增原代細(xì)胞、培養(yǎng)擴(kuò)增原代細(xì)胞或者建立的細(xì)胞系。另外，細(xì)胞可以在例如，有或沒有 血清的(例如，化學(xué)定義的培養(yǎng)基)以及有或沒有酚紅的各種培養(yǎng)基中生長。本發(fā)明提供了用以在大范圍細(xì)胞密度上測量細(xì)胞活力的方法。例如，細(xì)胞可以以 2. 2 X IO4 個(gè)細(xì)胞 /cm2 與 2. 8 X IO6 個(gè)細(xì)胞 /cm2 之間、3. 5 X IO4 與 2. 8 X IO6 之間、或者 5 X IO4與1 X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2之間的密度呈現(xiàn)。細(xì)胞還可以以至少2. 0 X 105、5. 0 X 105、1. 0 X 106、 2. OX 106、2. 8X 106、3X 106、4X 106、5X 106、6X 106、8X 106、10X IO6 個(gè)細(xì)胞 /cm2、或者更高 密度呈現(xiàn)。已經(jīng)采用達(dá)到約3X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度實(shí)踐了本發(fā)明所提供的方法。 可以預(yù)見到的是，這些方法可以采用達(dá)到IO6個(gè)細(xì)胞/cm2、或者更高的細(xì)胞密度進(jìn)行工作。 應(yīng)當(dāng)理解的是，本公開通篇所引用的所有細(xì)胞密度用術(shù)語“平均”限定。技術(shù)人員將會毫無 疑義地明白的是細(xì)胞密度的局部波動(dòng)將會出現(xiàn)并且是本發(fā)明所提供的方法中可以預(yù)見到 的。在培養(yǎng)基中孵化細(xì)胞以允許培養(yǎng)基中細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的聚集，即， 以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的方法在細(xì)胞與培養(yǎng)基相接觸的時(shí)間量上測量活力，即， 在緊鄰檢驗(yàn)之前通常不能用新鮮培養(yǎng)基代替條件培養(yǎng)基。取決于特定應(yīng)用(例如，細(xì)胞類 型、細(xì)胞密度、培養(yǎng)基類型、或細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的半衰期)，可以將細(xì)胞孵化可 變的時(shí)間量?？梢栽跈z驗(yàn)之前將細(xì)胞孵化約1、5、10、30、60、90、120、150、180、210或240分 鐘；或者約3、4、5、6、8、10、12、18或24小時(shí)；或者達(dá)到約1、2、3、4、5天、或者更長時(shí)間。本發(fā)明的方法對于測量各種底物或基質(zhì)上所生長活細(xì)胞的比率是有用的。細(xì)胞 可以生長在傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)底物(例如，采用塑料處理過的表面或者玻璃)上?？商?選地，可以用支架或基質(zhì)(例如，其中，細(xì)胞是組織工程化產(chǎn)品的一部分)支持細(xì)胞。合適 的支架可以包括由金屬、塑料、玻璃、硅、陶瓷和/或磷酸鈣構(gòu)建的結(jié)構(gòu)。其它的合適支架材 料包括可吸收聚酯(例如，乳酸或乙交酯的聚合物、以及其衍生物或共聚物)；糖類(例如， 玻酸、幾丁質(zhì)、淀粉、或者海藻酸鈉)；以及蛋白質(zhì)(例如，膠原蛋白(例如，豬膠原蛋白衍生 基質(zhì))或者明膠)、或者這些基質(zhì)中任何基質(zhì)的組合。在例如Langer和Vacanti (1993)； Ikada, J. R. Soc. Interfac, 3 :589_601 (2006)；以及美國專利 6，689，608 號和 6，800，296 號 中可以找到對組織工程中所使用基質(zhì)的進(jìn)一步討論。檢驗(yàn)變化申請人:發(fā)現(xiàn)了酚紅可以進(jìn)一步擴(kuò)展本發(fā)明方法可檢驗(yàn)細(xì)胞密度的范圍。這是通過 衰減離去基團(tuán)的信號實(shí)現(xiàn)的。即，酚紅減小例如羅丹明IlO(RllO)的信號，檢驗(yàn)在較高細(xì)胞 密度處飽和。理論化但不取決于的是除去蛋白質(zhì)的酚紅能夠有此作用，因?yàn)槠湮展庾V與 羅丹明110的激發(fā)和發(fā)射光譜這二者顯著重疊。除了用于RllO的酚紅之外，還可以預(yù)見到適用于其它離去基團(tuán)的衰減劑的使用。 用于特定離去基團(tuán)激發(fā)和或發(fā)射譜的適當(dāng)衰減劑將會在其吸收譜中具有期望的重疊程度。 吸收、激發(fā)以及發(fā)射譜是本領(lǐng)域中已知的或者可以按經(jīng)驗(yàn)的方式(例如，通過熒光)容易地 確定。此外，本發(fā)明所提供的方法是模塊化的以及可修改為復(fù)用的。即，另外的過程、步 驟、和/或制劑可以進(jìn)一步擴(kuò)展檢驗(yàn)的效用。例如，本發(fā)明所提供的方法可以進(jìn)一步包括對 多于一個(gè)細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的檢測。這是通過使用例如正交底物和/或離去基 團(tuán)在樣本部分中對于兩個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性應(yīng)用多個(gè)酶特定的底物實(shí)現(xiàn)的。這 種“檢測混合物”含有耦聯(lián)到一個(gè)或更多個(gè)可檢測離去基團(tuán)的、用于細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的 一個(gè)或更多個(gè)種類的底物。這些復(fù)用方法可以分成兩大類單個(gè)種類的離去基團(tuán)、以及多個(gè) 種類的離去基團(tuán)。單個(gè)種類的離去基團(tuán)與多個(gè)種類的酶底物耦聯(lián)的檢測混合物將會產(chǎn)生整合信號。即，所得信號是所檢測酶活性的和。例如，可以通過獨(dú)特的酶活性來處理每個(gè)底物。通過對 多個(gè)酶活性進(jìn)行檢驗(yàn)和求和，整合信號更準(zhǔn)確反映了樣本的整體代謝狀態(tài)。在期望較短孵 化時(shí)間的情況下整合信號也可以是有用的。本發(fā)明方法中對多個(gè)種類離去基團(tuán)的使用提供了對活力的獨(dú)立測量。含有用于耦 聯(lián)到多個(gè)種類離去基團(tuán)的酶活性的單個(gè)種類底物的檢測混合物提供了對活力的并行測量。 不同的信號為使用例如在不同波長和或強(qiáng)度可以具有機(jī)器或檢測儀相關(guān)靈敏度的檢測設(shè) 備的研究者提供了附加的靈活性。對多個(gè)底物種類(每個(gè)種類耦聯(lián)到不同種類的離去基團(tuán))的使用提供了對活力的 完全獨(dú)立測量。底物可以例如屬于低、中或高相對活性的酶。相對活性可以按照至少10%、 20%、40%或80%、或者按照至少1、2、5、10、50、100、500或1000倍、或者更多從低到高變 化。通過進(jìn)行對活力的多個(gè)獨(dú)立測量，研究者更有可能用至少一個(gè)底物種類保持在線性檢 測范圍中。使用多個(gè)離去基團(tuán)的進(jìn)一步的應(yīng)用是質(zhì)量控制檢驗(yàn)。特別地，本發(fā)明的方法還可 以包括添加一個(gè)或更多個(gè)污染物特定底物，每個(gè)底物耦聯(lián)到同樣種類的離去基團(tuán)，并檢測 一個(gè)或更多個(gè)污染物特定的酶的活性。污染物特定的底物種類是用于特定于普通細(xì)胞培 養(yǎng)污染物(諸如，真菌、細(xì)菌、古生菌以及原生生物-并且在所培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組中不存 在)的酶的底物。相應(yīng)地，對污染物特定的離去基團(tuán)的檢測表明所培養(yǎng)細(xì)胞群的污染。自 然地，用于污染物特定的酶活性的離去基團(tuán)將會是與用來測量所培養(yǎng)細(xì)胞活力的離去基團(tuán) 中可區(qū)分的。本發(fā)明的方法還可以適用于測量治療的細(xì)胞毒性。治療可以是環(huán)境或生理治療， 例如，熱、氣壓、機(jī)械或者光刺激。治療還可以是化學(xué)治療，例如，滲透壓、pH、藥理或生物制 劑、或者以上的任意組合。本發(fā)明的方法還可以包括如下這些步驟將治療應(yīng)用于測試細(xì)胞 群、通過本發(fā)明的方法測量測試細(xì)胞群的活力并將該活力與未接受治療的同樣細(xì)胞的對照 培養(yǎng)組相比較。在某些實(shí)施例中，可以將細(xì)胞毒性計(jì)算為1減去群的比率活力。在這些實(shí) 施例中，不需要對照群。TiM示例1 測量組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞活力圖1中示出了細(xì)胞活力檢驗(yàn)的簡要示意。此處，“讀取#1”是含有細(xì)胞和條件培養(yǎng) 基的群部分中所呈現(xiàn)細(xì)胞死亡穩(wěn)定或酶活性的量，而“讀取#2”是條件培養(yǎng)基的不含培養(yǎng)物 細(xì)胞的部分中所呈現(xiàn)酶活性的細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)的量。
tons] 人類關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞擴(kuò)增到單層培養(yǎng)物的第二或第三傳代。為了重復(fù)MAGI 移植中使用的培養(yǎng)條件，將軟骨細(xì)胞以每穿孔大約25，000至600，000個(gè)細(xì)胞的密度種 植三份到ACI-MACI 膜基質(zhì)穿孔(直徑6mm)粗糙側(cè)的白色不透明96孔板(96well plate)上。Matricel ACI-MACI 膜基質(zhì)是具有光滑側(cè)和粗糙側(cè)的豬膠原基膜基質(zhì)。 此種植密度等同于8. 75 X IO4至2. IXlO6個(gè)細(xì)胞/cm2 (相當(dāng)于每ACI-MACI 膜基質(zhì) (20cm2) 1. 75 X IO6至42 X IO6個(gè)細(xì)胞)。在將檢驗(yàn)應(yīng)用于全尺寸MAGI 種植樣本時(shí)，從每 個(gè)樣本取兩個(gè)小穿孔(通常直徑為6mm)以及成比例量的條件培養(yǎng)基。對于兩個(gè)直徑6mm 的穿孔(共同代表20cm2膜的大約2. 8% )，條件培養(yǎng)基的比例量為加置于20cm2膜的條件培養(yǎng)基總體積的大約2.8%。在原尺度以及小尺度的情形中，將空白的膜基質(zhì)穿孔以及培養(yǎng) 基處理為對照組。在細(xì)胞種植之后三小時(shí)，將條件培養(yǎng)基的一半(將會含有死亡(不能存活的)細(xì) 胞所釋放任何蛋白酶總量的一半)轉(zhuǎn)移到空的孔。接下來，將含有具有皂素(10% w/v的水溶液，Sigma，圣路易斯，密蘇里州，Cat. No. S4521)以及酚紅(可選的；通過在磷酸鹽緩沖液(PBS)中稀釋0.5%的酚紅(Sigma Cat. No. P0290)所配制的 0. 1 % 的溶液)的 bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110 底物 (雙_丙氨酰_丙氨酰_苯丙氨酰_羅丹明110 ；Promega Cat. No. G9260)的預(yù)混液添加到 樣本中。皂素用來滲透含有細(xì)胞和條件培養(yǎng)基部分中的活細(xì)胞以使得細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶可接 觸到底物。預(yù)混液中各種成分的最終濃度通常為· bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110 底物，0. 83mM 皂素 1.67% 酚紅 0. 167mg/mL(可選的)在孵化之后(45-90分鐘)，按激勵(lì) 485nm_ 發(fā)射 520nm 用 SoftMaxPro Software、 使用 Molecular Devices SpectraMax M5Microplate Reader 對該板進(jìn)行讀取。然后在 Microsoft EXCEL中對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。圖2中示出了代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。示出了作為細(xì)胞種植密度函數(shù)的熒光指示信 號強(qiáng)度的散點(diǎn)圖(讀取#1，具有上清液的活的細(xì)胞，圖2A ；以及讀取#2，僅上清液，圖2B)。 數(shù)據(jù)點(diǎn)是三個(gè)重復(fù)的平均值。采用bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110底物的孵化時(shí)間為 45,60或者90分鐘。信號與細(xì)胞密度之間的關(guān)系是線性的并且對于進(jìn)行測試的所有孵化時(shí) 間有少許變化。在隨后的測量中使用60分鐘的孵化步驟。示例2 檢驗(yàn)準(zhǔn)確性和精度通過將測量到的培養(yǎng)物活力與活細(xì)胞的已知百分比相比較來評估檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 培養(yǎng)物包括已知數(shù)目的活的細(xì)胞和死亡細(xì)胞的混合物、以指定密度被預(yù)混和種植、隨后如 示例1中被處理。以試驗(yàn)混合物中活細(xì)胞百分比函數(shù)的形式繪制測量到的活力(圖3)。所 繪制的數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩個(gè)重復(fù)的平均值。通常，測量到的活力與實(shí)際活力之間的差值小于15%。 對于低于0. 175 X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞種植密度，較長的孵化時(shí)間(至少90分鐘)幫助 確保檢驗(yàn)準(zhǔn)確性。為了測量檢驗(yàn)的株間準(zhǔn)確性，以7. OX IO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度種植來自3個(gè)不同株 的11比例的活的細(xì)胞和死亡細(xì)胞。雖然在來自不同細(xì)胞株的絕對信號等級中會存在顯 著的內(nèi)在變化性(表1，第一數(shù)據(jù)列；％ CV = 41. 49)，但測量到的活力中的變化性基本上 較小(表1，第二數(shù)據(jù)列；％ CV = 7. 62)。表1 3為了評估不同的化驗(yàn)員以及不同的基質(zhì)或試劑批次對于測量到的活力精度的作 用，來自單個(gè)親體培養(yǎng)物的細(xì)胞在膜穿孔上以7. 0 X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度被種植并如示例 1中被處理。對三個(gè)變量進(jìn)行分析基質(zhì)批次、檢驗(yàn)批次，以及化驗(yàn)員。每個(gè)變量在兩個(gè)組 (每個(gè)治療組具有三個(gè)統(tǒng)計(jì)重復(fù))中被測試。表2中示出了結(jié)果。這些結(jié)果顯示了檢驗(yàn)對于這些技術(shù)變量的改變較不靈敏。表2 示例4 酚紅的作用在此檢驗(yàn)進(jìn)展過程中，發(fā)現(xiàn)將酚紅添加到檢驗(yàn)混合物中會以取決于劑量的方式 使信號強(qiáng)度衰減，并將檢驗(yàn)的線性范圍擴(kuò)展到較高細(xì)胞密度。細(xì)胞按變化的密度被種植并 如示例1中被處理(采用或不采用酚紅)，圖4中示出了三個(gè)重復(fù)的平均活力。酚紅的添加 不影響檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，它只用于通過以取決于劑量的方式抑制信號輸出而防止信號等級接 近飽和。可以按照需要調(diào)整酚紅的量。對于低于0.5X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2膜基質(zhì)的種植密度 通常不需要酚紅。示例5 添加酚紅的時(shí)機(jī)發(fā)現(xiàn)將酚紅添加到檢驗(yàn)混合物中的時(shí)機(jī)是靈活的。為了證明這一點(diǎn)，來自單個(gè)株 的細(xì)胞被聲波降解法裂解以釋放所有細(xì)胞內(nèi)蛋白酶，并且，在100 μ 1/孔的體積中，在96孔
18板中以1.0X104個(gè)細(xì)胞/孔的密度被種植。以根據(jù)表3的量和時(shí)間添加底物和酚紅。表4 中以每個(gè)治療三個(gè)重復(fù)平均信號強(qiáng)度的形式示出了結(jié)果。這些結(jié)果證明了 在檢驗(yàn)過程中 在變化時(shí)間點(diǎn)添加的濃度變化的酚紅在衰減信號的過程中同樣地有效。對酚紅的使用在使用如下內(nèi)容中的二者之一時(shí)顯著擴(kuò)大了用以測量活力的新檢 驗(yàn)的動(dòng)態(tài)范圍高細(xì)胞種植密度(通常高于1.4X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2)、或者各種培養(yǎng)基(包括 含有血清或無血清的、以及含有酚紅或無酚紅的)。表3 表 4 示例6 在替詵基質(zhì)上牛長的細(xì)胞為了證明不同基質(zhì)材料對該方法的作用，以范圍從7. 1 X IO4至2. 3X IO6個(gè)細(xì)胞/ cm2的密度在Gelfoam(Upjohn Pharmacia，卡拉馬祖，密歇根)(非常多孔的明膠海綿)上種 植細(xì)胞。如示例1中對細(xì)胞進(jìn)行處理。圖5中以三個(gè)重復(fù)平均活力的形式示出了結(jié)果。如 通過緊鄰種植以前通過臺盼藍(lán)拒染法所確定的，細(xì)胞的活力為91%。這些數(shù)據(jù)表明檢驗(yàn)可修改為對種植在各種不同基質(zhì)上的細(xì)胞進(jìn)行分析。 [on ]7:2D mmm (mmmmmn)卜.牛長的細(xì)胞,。為了證明檢驗(yàn)在較傳統(tǒng)組織培養(yǎng)環(huán)境中的有效性(即，無機(jī)、平坦底物上的生 長)，以范圍從2. 2 X IO4至2. 8 X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2的密度在塑料六孔組織培養(yǎng)板(不采用基 質(zhì))中直接種植細(xì)胞。如示例1中對細(xì)胞進(jìn)行處理。圖6中以兩個(gè)重復(fù)平均活力的形式示 出了結(jié)果。如通過緊鄰種植以前通過臺盼藍(lán)拒染法所確定的，細(xì)胞的活力為96%。這些結(jié) 果證明了 除了各種基質(zhì)上生長的細(xì)胞之外，采用傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)底物上生長的細(xì)胞也較好 地執(zhí)行了檢驗(yàn)。示例8 非人類細(xì)胞為了證明檢驗(yàn)對非人類細(xì)胞的有效性，以范圍從0. 175至1.4X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2的 密度在ACI-MAIX 膜基質(zhì)穿孔(直徑6mm)上種植來自兩個(gè)供體的兔軟骨細(xì)胞。如示 例1中對細(xì)胞進(jìn)行處理。圖7中以兩個(gè)重復(fù)平均活力的形式示出了結(jié)果。如通過緊鄰種植 以前通過臺盼藍(lán)拒染法所確定的，株1和2的活力分別為88. 0%和84. 9%。這些結(jié)果證明 了 采用非人類來源的細(xì)胞較好地執(zhí)行了檢驗(yàn)。示例9 替詵底物為了證明使用除bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110以外底物的方法的有效性， 使用以范圍8. 75X IO4至1. 4X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2的密度種植的三株人類軟骨細(xì)胞對替選底 物(Ala-Ala-Phe)-AMC(Bachem Cat No. 1-1415. 0050，托倫斯，加利福尼亞)進(jìn)行測試。除 了用(Ala-Ala-Phe)-AMC 代替 bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110 并且按激勵(lì) 360nm_ 發(fā) 射440nm對樣本板進(jìn)行讀取之外，如示例1中對細(xì)胞進(jìn)行處理。在種植以前通過臺盼藍(lán)拒 染法所確定的株A、B和C的活力分別為98. 6%,98. 6%和99. 2%。圖8中以兩個(gè)重復(fù)平均 活力的形式示出了結(jié)果。這些結(jié)果證明了 替選(Ala-Ala-Phe)-AMC底物是有效的(圖8)。對于本文中所引述的所有專利、申請、或者其它參考，應(yīng)當(dāng)理解的是，為了所有的 目的以及為了所引述的提案，將其整體經(jīng)引用并入。在經(jīng)引用并入的文件與本申請之間存 在任何沖突的情況下，將以本申請為主。根據(jù)對說明書的研究以及對本文中所公開發(fā)明的實(shí)踐，本發(fā)明的其它實(shí)施例對于 本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將會是明顯的。意在僅以示范性的形式對說明書和示例進(jìn)行考慮，本 發(fā)明的真實(shí)范圍和實(shí)質(zhì)由所附權(quán)利要求而定。
權(quán)利要求
一種測量細(xì)胞培養(yǎng)基中維持的細(xì)胞群中活細(xì)胞的比率的方法，包括(a)檢測細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含所述細(xì)胞群細(xì)胞的部分中的細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性；(b)檢測所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含有所述細(xì)胞群細(xì)胞的部分所述細(xì)胞和條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性；以及(c)將所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含有細(xì)胞的所述細(xì)胞和條件培養(yǎng)基部分中的細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的水平與所述細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含細(xì)胞的部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的水平相比較，其中，細(xì)胞群中活細(xì)胞的比率與如下因素成正比所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含有細(xì)胞的部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的水平與所述細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含細(xì)胞的部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性的水平之間的差。
2.一種測量細(xì)胞培養(yǎng)基中維持的組織工程化產(chǎn)品中活細(xì)胞的比率的方法，包括(a)檢測細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的部分中的細(xì)胞死亡 穩(wěn)定酶活性；(b)檢測所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含有所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的部分的所述細(xì)胞和條件 培養(yǎng)基中的細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性；以及(c)將所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含有所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞和條件培養(yǎng)基的部分中細(xì)胞 死亡穩(wěn)定酶活性的水平與所述細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的 部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的水平相比較，其中，所述組織工程化產(chǎn)品中活細(xì)胞的比率與如下因素成正比所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含 有所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞和條件培養(yǎng)基的部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的水平與所述 細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的 水平之間的差。
3.一種測量細(xì)胞培養(yǎng)基中維持的組織工程化產(chǎn)品中活細(xì)胞的比率的方法，包括(a)提供所述組織工程化產(chǎn)品的含有細(xì)胞和成比例量的細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的樣本部分；(b)從步驟(a)中提供的樣本部分檢測細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含所述組織工程化產(chǎn) 品的細(xì)胞的部分中的細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性；(c)破壞步驟(a)中提供的所述組織工程化產(chǎn)品的樣本部分中細(xì)胞的膜完整性；(d)檢測步驟(a)中提供的所述組織工程化產(chǎn)品的樣本部分的細(xì)胞和條件培養(yǎng)基中的 細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性；以及(e)將步驟(b)和(d)中所檢測的細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的水平相比較，其中，所述組織工程化產(chǎn)品中活細(xì)胞的比率與(d)和(b)中所檢測的細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶 活性的水平之間的差成正比。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，通過剪切、聲波降解法、低氣壓、高溫、低溫、化學(xué)或 酶裂解或者膜解耦劑來破壞所述組織工程化產(chǎn)品的膜完整性。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，通過添加兩親分子來破壞所述組織工程化產(chǎn)品的 膜完整性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述兩親分子是皂素。
7.一種測量細(xì)胞培養(yǎng)基中維持的組織工程化產(chǎn)品中活細(xì)胞的比率的方法，包括(a)提供所述組織工程化產(chǎn)品的含有細(xì)胞和成比例量的細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的部分；(b)提供步驟a)中提供的所述細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì) 胞的部分；(c)將皂素以及雙_(丙氨酰_丙氨酰_苯丙氨酰)_羅丹明-110 (biS- (Ala-Ala-Phe) -Rhodamine-110)添加到步驟a)和b)中提供的樣本中；以及(d)檢測與步驟a)和b)中提供的樣本中所附著的bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-IlO 相對應(yīng)的熒光，其中，所述細(xì)胞是以1. 5X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2與6X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2之間的密度維持于基 質(zhì)中的人類軟骨細(xì)胞，所述組織工程化產(chǎn)品中活細(xì)胞的比率與d)中所檢測熒光的所述差 除以所述和成比例。
8.一種測量治療對于細(xì)胞培養(yǎng)基中維持的組織工程化產(chǎn)品中細(xì)胞的細(xì)胞毒性的方法， 包括(a)將所述治療應(yīng)用于所述組織工程化產(chǎn)品；(b)檢測細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的部分中的細(xì)胞死亡 穩(wěn)定酶活性；(c)檢測所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含有所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的部分的所述細(xì)胞和條件 培養(yǎng)基中的細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性；以及(d)將所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含有所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活 性的水平與所述細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的部分中細(xì)胞死 亡穩(wěn)定酶活性的水平相比較，其中，所述治療的細(xì)胞毒性與經(jīng)治療的組織工程化產(chǎn)品與未經(jīng)治療的組織工程化產(chǎn)品 中活細(xì)胞比率的差成比例，并且其中，所述組織工程化產(chǎn)品中活細(xì)胞的比率與所述細(xì)胞培 養(yǎng)基的含有所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的水平和所述細(xì)胞 培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的不含所述組織工程化產(chǎn)品的細(xì)胞的部分中細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的水平 之間的差成正比。
9.如權(quán)利要求1、2、3或8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物的。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述細(xì)胞是人類的。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述細(xì)胞是軟骨細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述細(xì)胞生長在基質(zhì)上。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述細(xì)胞以1.5 X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2和6 X IO6個(gè)細(xì) 胞/cm2之間的密度呈現(xiàn)。
14.如權(quán)利要求1、2、3、7或8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞以高密度呈現(xiàn)。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述細(xì)胞以2X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2和6 X IO6個(gè)細(xì)胞 /cm2之間的密度呈現(xiàn)。
16.如權(quán)利要求1、2、3、7或8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過包括下述的步驟來測量 細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性(a)將樣本與所述細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的底物相接觸，其中，所述底物綴合到可檢測離 去基團(tuán)；以及(b)對所述離去基團(tuán)進(jìn)行檢測，其中，所檢測離去基團(tuán)的量與細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性的水平成比例。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述離去基團(tuán)是顯色的、發(fā)光的或者熒光的。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述離去基團(tuán)是熒光的。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述離去基團(tuán)是羅丹明110。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述底物是bis-(Ala-Ala-Phe) -Rhodamine-110ο
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述離去基團(tuán)是香豆素衍生物。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述離去基團(tuán)是AMC。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述底物是丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨 酸-AMC(Ala-Ala-Phe-AMC)。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，還包括步驟添加對可檢測離去基團(tuán)的信號進(jìn)行調(diào)制 的制劑。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，對所述離去基團(tuán)的信號進(jìn)行調(diào)制的制劑使所述 離去基團(tuán)的信號衰減。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述使所述離去基團(tuán)的信號衰減的制劑是酚紅。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述酚紅以達(dá)到500mg/L的濃度呈現(xiàn)。
28.如權(quán)利要求1、2、3、7或8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性是 蛋白水解的。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性包括一個(gè)或更多個(gè)三肽基肽酶。
30.如權(quán)利要求1、2、3、7或8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性是 壞死性和程序性細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性是程序性細(xì)胞死亡穩(wěn) 定酶活性。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述細(xì)胞死亡穩(wěn)定酶活性是壞死性穩(wěn)定酶活性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過檢測一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞死亡穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶活性來測量所培養(yǎng)細(xì)胞活力的方法。本發(fā)明所提供的方法使活力與細(xì)胞培養(yǎng)物含細(xì)胞與不含細(xì)胞比率中酶活性的相對水平相關(guān)。
文檔編號G01N33/50GK101889206SQ200880115903
公開日2010年11月17日 申請日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日
發(fā)明者王永忠 申請人:健贊公司