專利名稱：區(qū)分測定的制作方法
區(qū)分測定本發(fā)明包括用于區(qū)分樣品中特異性和非特異性抗藥物抗體的存在的方法，以及用 于使用該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
使用單克隆抗體的標準固相免疫測定涉及在吸附在固相上的抗體(捕獲抗體)、 抗原、和針對所述抗原的另一個表位的與可檢測標記物例如酶綴合的抗體(示蹤抗體)之 間形成復(fù)合物。由此，形成夾心結(jié)構(gòu)固相-捕獲抗體-抗原-示蹤抗體。在由該夾心結(jié) 構(gòu)催化的反應(yīng)中，與抗體綴合的酶的活性與溫育培養(yǎng)基中的抗原濃度成比例。標準夾心 法也稱為雙抗原橋連免疫測定，因為捕獲和示蹤抗體結(jié)合同一抗原的不同表位。Hoesel， W.，等，J. Immunol. Methods (免疫方法雜志)294 (2004) 101-110，報告了抗-EPO 雙抗原 橋連測定，其中使用與氨基和與碳水化合物基團偶聯(lián)的固定化rhEPO的混合物。免疫 測定諸如雙抗原橋連ELISA是研究患者對抗體藥物的免疫原性應(yīng)答中的常用測定類型。 Mire-Sluis, A. R.，等，J. Immunol. Methods (免疫方法雜志)289 (2004) 1-16，總結(jié) 了對于 設(shè)計和最優(yōu)化免疫測定的建議，所述免疫測定是利用抗生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主抗體的檢測。 根據(jù)Mire-Sluis等，公知的抗藥物抗體測定形式表現(xiàn)出相當多的缺點?？顾幬锟贵w測 定記述在，例如，WO 2005/045058和WO 90/006515中。抗特應(yīng)抗體測定記述在，例如，US 5，219，730，WO 87/002778，EP 0139389，和 EP 0170302 中。Wadhwa，Μ.，等，J. Immunol. Methods (免疫方法雜志)278 (2003) 1-17,報告了用于檢測、測量和表征由治療性生物制 劑誘導(dǎo)的有害抗體的策略。不同免疫測定的原則由，例如，Hage, D.S.，Anal. Chem.(分析 化學(xué))Π (1999) 294R-304R 記述。Lu，B.，等，Analyst.(分析家)I2I (1996) 29R-32R,報 告了抗體的定向固定化以用于免疫測定。抗生物素蛋白_生物素_介導(dǎo)的免疫測定由， 例如，ffilchek, M.，和 Bayer, Ε. Α.，Methods Enzymo 1.(酶學(xué)方法)184(1990)467-469 報告。ELISA與表面等離子共振的比較由Lofgren，J. Α.，等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜 志)178 (2007) 7467-7472 報告。發(fā)明_既述本發(fā)明的第一方面是利用包括捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的免疫測定來確定 樣品中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)所述捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)所述示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣
P
PR，b-iii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣
P
PR，c)通過b-i)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性免疫測定來確定所述樣品中的針對所述藥物抗體的抗體。本發(fā)明的另一方面是利用包括捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的雙抗原橋連免疫 測定來確定樣品中存在的抗體是特異性抗藥物抗體或非特異性抗藥物抗體的方法，其中所 述方法包括以下步驟a)提供a-i)所述捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)所述示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性 免疫測定來確定所述樣品中存在的抗體是特異性抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫 測定來確定所述樣品中存在的抗體是非特異性抗藥物抗體。本發(fā)明的第三方面是使用免疫測定在樣品中將針對人源化抗炎藥物抗體的抗藥 物抗體與抗人IgG抗體相區(qū)分的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性 免疫測定來確定針對人源化抗炎藥物抗體的抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫 測定來確定所述樣品中存在的抗體是抗人IgG抗體。本發(fā)明還有的另一方面是使用免疫測定來確定樣品中的抗藥物抗體是單體形式 還是寡聚形式的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，
b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b_i)中的陽性免疫測定和以下各項來確定所述樣品中的抗藥物抗體是單 體形式α )b-ii)和b-iii)中的陰性免疫測定，或β ) b-ii)，b-iii)，b-iv)，和 b-v)中的陰性免疫測定，或通過b_i)中的陽性免疫測定和以下各項來確定所述樣品中的抗藥物抗體是寡聚 形式a)b_iii)中的陰性免疫測定，或β )b-iii)和b-v)中的陰性免疫測定，其中所有其他沒有列出的免疫測定為陽性。本發(fā)明的另一方面是使用免疫測定來確定樣品中存在寡聚抗藥物抗體的方法，其 中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-iii)和b-v)中的陽性免疫測定和b-ii)和b-iv)中的陰性免 疫測定來確定樣品中的抗藥物抗體是寡聚形式。本發(fā)明的另一方面是使用免疫測定來確定樣品中確定的抗藥物抗體的種類的方 法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性免疫測定來確定抗藥物抗體的種類是單體和藥物抗體特異性抗藥物抗體，或通過b_i)和b-ii)和b-iv)和b-ν)中的陽性免疫測定和b-iii)中的陰性免疫 測定來確定抗藥物抗體的種類是寡聚和藥物抗體特異性抗藥物抗體，或通過b_i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-ν)中的陰性免疫 測定來確定抗藥物抗體的種類是寡聚和非藥物抗體特異性抗體，或通過b_i)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)和b-iv)和b-v)中的陰性免 疫測定來確定抗藥物抗體的種類是單體和非藥物抗體特異性抗體。在一個實施方案中，抗藥物抗體的種類根據(jù)下表來確定 本發(fā)明的最后一方面是使用免疫測定來確定樣品中存在單體抗藥物抗體的方法， 其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫測定來確定所述樣品中的抗藥物抗體是單體形式。在本發(fā)明方面的一個實施方案中，所述免疫測定是雙抗原橋連免疫測定，其包括 捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體。本發(fā)明方面的另一個實施方案是所述藥物抗體是用于治療 炎性疾病的抗體。在一個實施方案中，所述用于治療炎性疾病的抗體是用于治療類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的抗體。在另一個實施方案中，所述用于治療炎性疾病的抗體是抗IL-6 受體，或抗IGF-I受體，或IL-13受體Ia的抗體。本發(fā)明方面的一個實施方案包括所述捕 獲藥物抗體是所述藥物抗體的混合物，其包括至少兩種在不同抗體位點處與所述固相綴合 的所述抗體，且示蹤藥物抗體是所述藥物抗體的混合物，其包括至少兩種在不同抗體位點 處與所述可檢測的標記物綴合的所述抗體。另一個實施方案是所述藥物抗體與其綴合配偶 體的綴合是通過經(jīng)由藥物抗體的氨基酸主鏈的N端和/或ε-氨基(賴氨酸)，不同賴氨酸 的ε -氨基，羧基-，巰基-，羥基-和/或酚官能團，和/或藥物抗體的糖結(jié)構(gòu)的糖醇基團 的化學(xué)鍵合來進行。在本發(fā)明方面的一個實施方案中，捕獲藥物抗體混合物或示蹤藥物抗 體混合物包括經(jīng)由氨基與它們的綴合配偶體綴合的藥物抗體和經(jīng)由糖結(jié)構(gòu)與它們的綴合 配偶體綴合的藥物抗體。在另一個實施方案中，捕獲藥物抗體與固相的綴合是通過被動吸 附，或經(jīng)由特異性結(jié)合對來進行。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述特異性結(jié)合對(第一成 分/第二成分)選自鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素，或抗體/抗原(參見，例 如，Hermanson，G. Τ.，等，Bioconjugate Techniques (生物綴合技術(shù))，Academic Press (學(xué) 術(shù)出版社)，1996)，或凝集素/多糖，或類固醇/類固醇結(jié)合蛋白，或激素/激素受體，或酶 /底物，或IgG/蛋白A和/或G。在一個實施方案中，捕獲藥物抗體與生物素綴合且與固相 的綴合經(jīng)由固定化的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白進行。在本發(fā)明方面的一個實施方 案中，所述方法在步驟b)后包括另外的步驟ba)使在步驟b)中與所述樣品接觸的所述捕 獲藥物抗體與所述示蹤藥物抗體接觸和檢測所述可檢測的標記物。在本發(fā)明方面的另一 個實施方案中，示蹤藥物抗體經(jīng)由特異性結(jié)合對與可檢測的標記物綴合。在一個實施方案 中，所述示蹤藥物抗體與洋地黃毒苷綴合且與可檢測的標記物的連接是經(jīng)由抗洋地黃毒苷 的抗體來進行。本發(fā)明方面的另一個實施方案是捕獲藥物抗體與示蹤藥物抗體的比率為 1 10 50 1(比率意指抗體分子比，而不考慮綴合物的分子量，綴合物的分子量可以不 同)。本發(fā)明的另一方面是用于確定樣品中的針對藥物抗體的抗藥物抗體的試劑盒，其 包括a)鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板，b)用于使藥物抗體與生物素綴合的試劑，c)用于使所述藥物抗體與洋地黃毒苷綴合的試劑，d)與抗洋地黃毒苷抗體綴合的辣根過氧化物酶，e)用于寡聚化所述藥物抗體的試劑，f)處于單體形式的人免疫球蛋白G，和g)處于寡聚形式的人免疫球蛋白G。本發(fā)明的另一方面是利用包括捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的雙抗原橋連免疫 測定來確定樣品中存在的針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體)的類型的方法，其中所述方 法包括以下步驟
a)提供a-i)所述捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)所述示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定和b-ii)和b-iii)中的陰性免 疫測定來確定所述樣品中存在的抗體是特異性、單體抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定和b-iii)中的陰性免疫 測定來確定所述樣品中存在的抗體是特異性、寡聚抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫 測定來確定所述樣品中存在的抗體是非特異性的、寡聚抗人IgG抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iii)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定來確定所述樣 品中存在的抗體是非特異性抗體，或通過b-i)中的陽性免疫測定和b-ii)和b-iii)和b-iv)和b-v)中的陰性免疫 測定來確定所述樣品中存在的抗體是非特異性的、單體抗人IgG抗體。發(fā)明詳述本發(fā)明報告利用包括捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的免疫測定來確定樣品中針 對藥物抗體的抗體的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)所述捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)所述示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品，c)通過b-i)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性免疫測定來確定所 述樣品中的針對所述藥物抗體的抗體。按照本發(fā)明的術(shù)語“藥物抗體，，表示能夠施用于個體以使得在給藥后懷疑所述個 體的樣品包含所述藥物抗體的抗體。在按照本發(fā)明進行的一種測定中，藥物抗體、捕獲藥物 抗體和示蹤藥物抗體包括“相同”抗體分子，例如用相同的表達載體重組產(chǎn)生并包含相同氨 基酸序列的抗體分子。藥物抗體(治療性單克隆抗體)廣泛用于治療多種疾病諸如腫瘤疾 病(例如血液惡性腫瘤和實體惡性腫瘤，包括非_霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、和結(jié)腸直腸癌) 或炎性疾病。這樣的抗體由，例如，Levene，A. P.，等，Journal of the RoyalSociety of Medicine (皇家醫(yī)學(xué)學(xué)會雜志)98 (2005) 145-152 ；Groner,B.，等，Curr. Mol. Meth.(當前分 子方法學(xué))4 (2004) 539-547 ；和 Harris，M.，LancetOncol. 5 (2004) 292-302 報告。示范性抗體是，例如，抗 CD20，CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250,⑶3，HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, Levis Y抗原，IL-6受體，IGF-I受體，或IL-13受體1 α的抗體。在一個實施 方案中，所述藥物抗體是有效用于治療炎性疾病的抗體，即抗炎抗體，諸如抗IL-6受體抗 體，或抗IGF-I受體抗體，或抗IL-13受體1 α抗體。一種實例(優(yōu)選單克隆)抗體是抗IL-6受體的抗體(mAb IL-6R)。這樣的抗體， 例如，由 Mihara，等，Clin. Immunol.(臨床免疫學(xué))98 (2001) 319-326 ；Nishimoto, N.，等， Blood (血液)106 (2005) 2627-2632，在臨床試驗 NCT00046774 中，或在 W 2004/096274 中報告。一種實例(優(yōu)選單克隆)抗體是抗IGF-I受體的抗體(mAb IGF-1R)。這樣的抗 體，例如，在WO 2004/087756中或在WO 2005/005635中報告。一種實例(優(yōu)選單克隆)抗體是抗IL-13受體α的抗體(以下也表示為mAb IL-13Ral 或 mAb IL-13R)。抗 IL_13Ral 的抗體從，例如，WO 96/29417, WO 97/15663， WO 03/080675, Graber, P.，等，Eur. J. Immunol.(歐洲免疫學(xué)雜志)28 (1998) 4286-4298 ； Poudrier, J.，等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)163(1999) 1153-1161 ；Poudrier, J.，等，Eur. J. Immunol.(歐洲免疫學(xué)雜志)30 (2000) 3157-3164 ；Aikawa, M.，等，Cytokine (細胞因 子)13 (2001) 75-84已知，且可商購自，例如，美國的R&D系統(tǒng)公司(R&D Systems Inc. USA)。 其他示范性抗IL-13Ral抗體在WO 2006/072564中報告。術(shù)語“抗藥物抗體”用于本申請中時表示這樣的抗體，其針對并結(jié)合藥物抗體的抗 原區(qū)。該抗原區(qū)可以是藥物抗體的可變區(qū)，CDR，恒定區(qū)，或糖結(jié)構(gòu)。在一個是實施方案中， 所述抗藥物抗體針對所述藥物抗體的CDR區(qū)或所述藥物抗體在非人細胞，諸如CHO細胞、 HEK細胞、Sp2/0細胞或BHK細胞中的重組產(chǎn)生的所述藥物抗體的二級修飾。一般地，抗藥 物抗體針對藥物抗體的抗原區(qū)，其由施用了該藥物抗體的動物的免疫系統(tǒng)所識別。上述抗 體稱為“特異性抗藥物抗體”。將藥物抗體設(shè)計為包括盡可能少的抗原區(qū)。例如，意欲在人 中使用的藥物抗體在應(yīng)用于人患者前進行人源化，從而最小化針對藥物抗體的免疫反應(yīng)的 產(chǎn)生。該免疫反應(yīng)應(yīng)該處于抗藥物抗體的形式，其針對該人源化藥物抗體的非人部分，諸如 例如可變區(qū)中的互補決定區(qū)(參見例如Pan, Y.，等，F(xiàn)ASEB J. 9 (1995) 43-49)。術(shù)語“抗人IgG抗體”表示針對抗體G類的人或人源化抗體的任何抗原區(qū)的人抗 體。這樣的抗人IgG抗體是“非特異性抗藥物抗體”的實例。術(shù)語“非特異性抗藥物抗體” 在本申請中表示結(jié)合藥物抗體但也結(jié)合許多其他抗體，諸如內(nèi)源性人抗體的抗體，這歸因 于不決定藥物抗體特異性的與共同抗原位點的結(jié)合。抗體，作為蛋白質(zhì)，包括許多反應(yīng)結(jié)構(gòu)部分，諸如，例如，氨基(賴氨酸，α-氨基)， 硫醇基(胱氨酸，半胱氨酸，和甲硫氨酸)，羧基(天冬氨酸，谷氨酸)和糖_醇基。這些 可以用于偶聯(lián)結(jié)合配偶體，如表面、蛋白、多聚體(諸如例如PEG、纖維素或聚苯乙烯)、酶 或許多結(jié)合對(參見例如 Aslam Μ.,禾口 Dent, A. , Bioconjuation MacMillan Ref. Ltd. (1999)50-100)。蛋白的最常見反應(yīng)基團之一是氨基酸賴氨酸的脂肪族胺。通常，幾乎所有抗 體包含豐富的賴氨酸。賴氨酸胺是相當好的高于PH 8.0的親核試劑(pKa = 9.18)，且因 此與多種試劑容易并完全地反應(yīng)以形成穩(wěn)定的鍵?？贵w中的另一種常見反應(yīng)基是來自含硫 氨基酸胱氨酸及其還原產(chǎn)物半胱氨酸(cysteine)(或半胱氨酸)的硫醇殘基。半胱氨酸包含自由的硫醇基，其比胺更親核且通常是蛋白質(zhì)中最具反應(yīng)性的官能團。硫醇通常在中性 PH下具有反應(yīng)性，且因此可以在存在胺的條件下選擇性偶聯(lián)其他分子。由于自由的巰基是 相對反應(yīng)性的，具有這些基團的蛋白通常以其氧化形式如二硫基或二硫鍵存在。除胱氨酸 和半胱氨酸外，一些蛋白還具有氨基酸甲硫氨酸，其在硫醚鍵中包含硫。文獻報告了若干硫 醇鹽交聯(lián)試劑諸如Traut試劑(2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-iminothiolane))，琥珀酰亞胺基 (乙?；虼?乙酸酯(SATA)，或磺基琥珀酰亞胺基6- [3- (2-吡啶基二硫代)丙酰胺基] 己酸酯(磺基-LC-SPDP)用于提供通過反應(yīng)性氨基引入多個巰基的有效途徑的應(yīng)用。反應(yīng) 性酯，特別是N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯，是修飾胺基團的最常用試劑之一。在水性環(huán)境 中反應(yīng)的最佳PH是pH 8. 0-9. 0。異硫氰酸鹽(或酯)是胺-修飾試劑并與蛋白形成硫脲 鍵。它們在水溶液(最佳處于PH9. 0-9. 5)中與蛋白胺反應(yīng)。醛在適度水性條件下與脂肪 族和芳香族胺、胼和酰胼反應(yīng)形成亞胺中間體(Schiff堿)。Schiff堿可以使用中度或強 還原劑(諸如硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉)來選擇性還原，以得到穩(wěn)定的烷基胺鍵。已經(jīng)用 于修飾胺的其他試劑是酸酐。例如，二亞乙基三胺五乙酸酐(DTPA)是雙功能螯合劑，其包 含兩個胺-反應(yīng)性酐基。其可以與蛋白的N端和ε-胺基反應(yīng)形成酰胺鍵。酐環(huán)打開，以 形成能夠與配位復(fù)合物中的金屬緊密結(jié)合的多價金屬螯合臂?？贵w中的另一個常見反應(yīng)基是羧基(天冬氨酸，谷氨酸)。蛋白在天冬氨酸和谷氨 酸的C端位置處和側(cè)鏈中含有羧基。為了綴合，羧基通常通過使用水溶性碳二亞胺被轉(zhuǎn)化 為反應(yīng)性酯，并與親核試劑諸如胺、酰胼或胼反應(yīng)。包含胺的試劑應(yīng)該是弱堿性的，從而在 該蛋白上存在其他胺的條件下與活化的羧酸選擇性反應(yīng)。蛋白交聯(lián)可以在PH上升到高于 8.0時發(fā)生。高碘酸鈉可以用于將糖結(jié)構(gòu)部分中糖醇部分氧化為醛。每個醛基可以與胺、酰胼 或胼反應(yīng)，如關(guān)于羧酸所述的。由于糖結(jié)構(gòu)部分主要存在于抗體的可結(jié)晶片段(Fe)區(qū)，所 以綴合可以通過遠離抗原結(jié)合位點的糖的定點修飾來完成。硫醇反應(yīng)性試劑是應(yīng)該偶聯(lián)蛋白上的硫醇基，從而形成硫醚偶聯(lián)產(chǎn)物的那些。這 些試劑在略酸性到中性PH下迅速反應(yīng)并因此可以在存在胺基的條件下選擇性反應(yīng)。鹵代 乙?；苌铮绲庖阴０?，形成硫醚鍵并是用于硫醇修飾的試劑。在抗體中，反應(yīng)發(fā)生 在半胱氨酸基團處，所述半胱氨酸是本身存在的或由抗體不同位置處的胱氨酸二硫化物還 原獲得的。其他有用試劑是馬來酰亞胺。馬來酰亞胺與硫醇反應(yīng)性試劑的反應(yīng)與碘乙酰胺 基本相同。馬來酰亞胺在略酸性到中性PH下迅速反應(yīng)。胺、酰胼和胼是醛和羧酸反應(yīng)性試劑(形成酰胺、腙、烷基胺鍵)。胺、酰胼和胼可 以在羧基由水溶性碳二亞胺活化后，偶聯(lián)至蛋白的羧酸。包含胺的試劑必須是弱堿性的，以 使得其在賴氨酸的更高堿性的ε _胺的存在下與碳二亞胺活化的蛋白選擇性反應(yīng)，以形成 穩(wěn)定的酰胺鍵。在與醛基的反應(yīng)中，形成Schiff堿中間體，所述醛基可以通過高碘酸鹽氧 化抗體上的碳水化合物殘基而在抗體上產(chǎn)生，所述Schiff堿中間體可以經(jīng)由使用氰基硼 氫化鈉(中度且選擇性)或硼氫化鈉(強)水溶性還原劑還原該中間體而被還原為烷基胺。術(shù)語“樣品”用于本申請中時表示，但不僅限于，來自有生命物體或以前有生命的 物體的任意量物質(zhì)。所述有生命物體包括，但不僅限于，人、小鼠、猴、大鼠、兔、和其他動物。 所述物質(zhì)包括，但不僅限于，來自個體的全血、血清或血漿，其是臨床常規(guī)程序中樣品的最 廣泛使用來源。
術(shù)語“固相”用于本申請中時表示非流體物質(zhì)，且包括由材料諸如聚合物、金屬 (順磁性的或鐵磁性粒子)、玻璃和陶瓷制成的粒子(包括微粒子或珠)；凝膠物質(zhì)諸如 硅、礬土、和聚合物凝膠；毛細管，其可以由聚合物、金屬、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其 他多孔物質(zhì)；電極；微量滴定板；固體條帶；和試管、管或其他分光計樣品容器。測定的固 相成分與該測定可以接觸的惰性固體表面不同，因為“固相”在其表面上包含至少一個意 欲與捕獲藥物抗體相互作用的結(jié)構(gòu)部分。固相可以是固定的成分，諸如管、條帶、試管或 微量滴定板，或可以是非固定成分，諸如珠和微粒子。微粒子也可以用作均相測定形式的 固相。可以使用多種容許蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)非共價或共價連接的微粒子。所述粒子包括 聚合物粒子，諸如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金粒子，諸如金納米粒子和金膠體； 和陶瓷粒子，諸如硅，玻璃和金屬氧化物粒子。參見例如Martin，C. R.，等，Analytical Chemistry-News&Features (分析化學(xué)-新聞&特輯)(1998) 322A-327A，通過參考將其 引入本文。用于按照本發(fā)明的免疫測定的固體支持物廣泛記述在現(xiàn)有技術(shù)(參見，例如， Butler, J. Ε.，Methods (方法)22 (2000) 4-23)中。發(fā)色團(熒光或發(fā)光基團和染料)、酶、NMR-活性基團或金屬粒子、半抗原，例如 洋地黃毒苷，是可檢測標記物的實例?？蓹z測標記物還可以是光可激活的交聯(lián)基團，例如 疊氮基或azirine基?？梢酝ㄟ^電化學(xué)發(fā)光檢測的金屬螯合物也是可檢測的信號發(fā)射基 團，特別優(yōu)選釕螯合物，例如釕(二吡啶基)32+螯合物。合適的釕標記基團記述在，例如，EP 0580979, WO 90/005301, WO 90/11511，和 WO 92/14138 中。待確定其中的抗體的樣品通常不止包含所討論中的抗體。因此，不能避免通過免 疫測定的測定法導(dǎo)致陽性免疫測定，盡管該樣品不包含所述待確定的抗體。為了使用所述 測定，這樣的陽性免疫測定必須排除或至少減少至可以接受的量，例如低于全部陽性免疫 測定的5%。現(xiàn)在已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)待通過用于確定針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗，ADA)的 方法來分析的樣品的陽性免疫測定可以通過使待分析樣品摻加藥物抗體和非特異性抗體 并通過確定關(guān)于這些摻加樣品的方法的結(jié)果來確定。術(shù)語“摻加”用于本申請中時表示向待分析的樣品中添加增補物質(zhì)，該增補物質(zhì)可 以是或可以不是所述樣品中已經(jīng)存在的。所述物質(zhì)的增補具有這樣的效果，即所述物質(zhì)以 超過所述樣品中被討論的抗藥物抗體的濃度的濃度存在于所述樣品中。在一個實施方案 中，所述增補物質(zhì)是抗體，在另一個實施方案中，其是所述藥物抗體或Fc部分特異性抗體， 諸如抗人IgG抗體。術(shù)語“抗體”用于本文中時涵蓋抗體結(jié)構(gòu)的多種形式，包括完整抗體和抗體片段。 在一個實施方案中，按照本發(fā)明的方法中的藥物抗體是人抗體，人源化抗體，嵌合抗體，或T 細胞抗原缺失(depleted)抗體(參見例如 WO 98/33523，WO 98/52976，或 WO 00/34317)。 抗體的遺傳工程例如由Morrison，S. L.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué) 報)81 (1984) 6851-6855 ；US 5，202，238 和 US 5，204，244 ；Riechmann, L.，等，Nature (自 然)332 (1988) 323-327 ；Neuberger, M. S.，等，Nature (自然)314 (1985) 268-270 ；Lonberg, N.，Nat. Biotechnol.(自然生物技術(shù))23 (2005) 1117-1125 報道?！翱贵w片段”表示完整抗體的片段，所述片段保持結(jié)合與完整抗體結(jié)合的抗原相同 的抗原的能力?！巴暾贵w”是由兩條多肽輕鏈和兩條多肽重鏈組成的抗體，其中每條多肽鏈包括可變區(qū)和恒定區(qū)?！翱贵w綴合物”表示抗體與其他多肽的綴合物?？乖慕Y(jié)合不通過 與其他多肽的綴合而減少?！翱乖巍卑ㄈL抗體的一部分，優(yōu)選其可變結(jié)構(gòu)域或至少 其抗原結(jié)合部分?？贵w片段的實例是單鏈抗體分子(scFv)，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab)2片段等，條件是它 們保持抗體的結(jié)合特征。ScFv抗體，例如，在Huston，J. S.，Methodsin Enzymo 1.(酶學(xué)方 法)203 (1991) 46-88中報告。Huston還報告了用于連接本發(fā)明的多肽的連接體和方法?？贵w的“Fe部分”不直接參與結(jié)合抗原，但表現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能。根據(jù)重鏈恒 定區(qū)的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)分為以下類型IgA，IgD, IgE, IgGjP IgM。這些 類型中的一些進一步分為亞型(同種型)，即IgG分為IgGl，IgG2，IgG3，和IgG4，或IgA 分為IgAl和IgA2。根據(jù)抗體所屬的免疫球蛋白類型，免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為 α (IgA)，δ (IgD)，ε (IgE), y (IgG)，和μ (IgM)。按照本發(fā)明的方法中的藥物抗體屬于一 個關(guān)于IgG類型的實施方案?！翱贵w的Fc部分”是技術(shù)人員公知的術(shù)語且基于抗體的木瓜 蛋白酶裂解而定義。術(shù)語“抗體”用于本文中時指由一種或多種基本由抗體基因編碼的多肽組成的蛋 白。組成抗體的不同多肽根據(jù)其重量稱為多肽輕鏈和多肽重鏈。識別的抗體基因包括不 同的恒定區(qū)基因以及無數(shù)抗體可變區(qū)基因?？贵w可以以多種形式存在，包括，例如，單條重 鏈和輕鏈，F(xiàn)v, Fab，和 F(ab)2 以及單鏈(scFv)(例如 Huston, J. S.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883 ；Bird, R. Ε.，等，Science (科學(xué))242 (1988) 423-426 ；—般地， Hood, L.，等，Immunology (免疫學(xué))，Benjamin N. Y.，第 2 版(1984) ；Hunkapiller, T.，和 Hood, L.，Nature (自然)323 (1986) 15-16)?？贵w通常包括2條多肽輕鏈和2條多肽重鏈。每條多肽重鏈和多肽輕鏈包含可變 區(qū)(多肽鏈的氨基端部分)，所述可變區(qū)包含能夠與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。每個多 肽重鏈和多肽輕鏈包含恒定區(qū)(多肽鏈的羧基端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)抗體i)與攜 帶Fc γ受體(FcyR)的細胞，諸如吞噬細胞，或ii)與攜帶新生Fc受體(FcRn)(也稱為 Brambell受體)的細胞的結(jié)合?？贵w輕鏈或重鏈的可變結(jié)構(gòu)域又包括不同區(qū)段，即4個構(gòu) 架區(qū)(FR)和3個高變區(qū)(CDR)。非人(例如嚙齒動物)抗體的“人源化”形式是包括源自非人抗體和源自人抗體的 部分序列的抗體。對于大多數(shù)部分，人源化抗體源自人抗體(受體抗體)，其中來自高變區(qū) 的殘基被來自非人物種(供體抗體)，諸如小鼠、大鼠、兔、或非人靈長類動物的具有所需特 異性和親和力的殘基替代。(參見例如Morrison, S. L.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國 國家科學(xué)院學(xué)報)81 (1984) 6851-6855 ;US 5, 202, 238 ；US 5，204，244)。在一些實例中，人 抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可以包括其他修飾，例 如受體抗體中或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基。這樣的修飾導(dǎo)致所述受體或供體抗體的 變體，其與相應(yīng)的母體序列同源但不相同。進一步進行這些修飾以改善抗體的表現(xiàn)。一般 地，人源化抗體應(yīng)該包括基本全部的至少一個，或典型地兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或基本 全部的高變環(huán)與非人供體抗體的那些相對應(yīng)，且全部或基本全部FR是人受體抗體的那些。 人源化抗體任選還應(yīng)該包括抗體恒定區(qū)的至少一部分，典型地人抗體的至少一部分。用于 人源化非人抗體的方法已經(jīng)記述在現(xiàn)有技術(shù)中。優(yōu)選地，人源化抗體具有由非人來源引入 其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為“輸入”殘基，其典型地來自 “輸入”可變結(jié)構(gòu)域。人源化可以基本按照Winter及其同事的方法通過用高變區(qū)序列替代非人抗體的相應(yīng)序列進行。因此，所述“人源化”抗體是這樣的抗體，其中基本小于完整人 可變結(jié)構(gòu)域被來自非人物種的相應(yīng)序列替代。實踐上，人源化抗體典型地是人抗體，其中一 些高變區(qū)殘基和可能一些構(gòu)架區(qū)殘基被來自嚙齒動物或非人靈長類動物抗體的類似位點替代。術(shù)語“單克隆抗體”用于本文中時，指獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的抗體，即組成 所述群體的各個抗體除可能天然存在微小量的突變以外是相同的。單克隆抗體是高度特異 性的，其針對單個抗原位點。此外，與包含針對不同抗原位點(決定簇或表位)的不同抗體 的多克隆抗體制備物相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一抗原表位。除它們的特異性 外，單克隆抗體由于它們可以由其他抗體無污染地合成而非常有利。修飾語“單克隆”表示 抗體獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的特征，但不應(yīng)該被解釋為需要通過任何特殊方法生成該 抗體。術(shù)語“處于單體形式的抗體”用于本申請中時，表示所述抗體不與相同特異性的 其他抗體分子共價或非共價結(jié)合。例如，抗IGF-IR抗體處于單體形式，如果它不與第二抗 IGF-IR抗體結(jié)合。這不排除所述抗體可以與其他抗體諸如例如抗IL-6R抗體共價或非共價
纟口口。術(shù)語“處于寡聚形式的抗體”用于本申請中時，表示所述抗體與相同特異性的其他 抗體分子共價或非共價結(jié)合。在一個實施方案中，“處于寡聚形式的抗體”與相同特異性的 一個或多個其他抗體分子共價結(jié)合。例如，抗IGF-IR抗體處于寡聚形式，如果其與至少第 二抗IGF-IR抗體結(jié)合。術(shù)語“相同特異性”用于本申請中時，表示兩個抗體結(jié)合相同靶分子，即相同抗原。 這不排除兩個抗體結(jié)合所述抗原的不同表位。在一個實施方案中，包含在處于寡聚形式的 抗體中的抗體結(jié)合相同抗原且結(jié)合相同表位。在另一個實施方案中，所述處于寡聚形式的 抗體中的抗體是相同的單克隆抗體。本發(fā)明的第一方面是利用包括捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的免疫測定來確定 樣品中針對藥物抗體的抗體的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)所述捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)所述示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，c)通過b-i)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性免疫測定來確定所 述樣品中的針對所述藥物抗體的抗體。如果樣品包含除被討論抗藥物抗體以外的抗體，所述抗體可以干擾用于檢測所述 抗藥物抗體的免疫測定且因此導(dǎo)致陽性免疫測定，則該方法是特別有效的。在一個實施方 案中，本發(fā)明的方法有效用于確定用于抗炎治療的藥物抗體的抗藥物抗體。術(shù)語“用于抗炎治療的藥物抗體”用于本申請中時，表示所述藥物抗體針對介導(dǎo)炎癥的細胞表面受體。這樣 的受體是例如IL-6受體，或IGF-I受體，或IL-13a受體1。如果分析來自用該抗炎藥物抗 體處理的受試者的樣品，則必須確定，該方法的陽性結(jié)果是基于樣品的抗藥物抗體還是除 抗藥物抗體以外的抗體。所述情形的一個實例是來自具有自身免疫疾病諸如風(fēng)濕病的受試 者的樣品，且由此來自所述受試者的樣品包含所謂的“風(fēng)濕因子”。術(shù)語“風(fēng)濕因子”用于本 申請中時，表示結(jié)合人IgG、更準確地結(jié)合人IgG的Fc部分的抗體。在大多數(shù)情形中，這些 “風(fēng)濕因子”是低聚結(jié)合分子。因此，驚訝地發(fā)現(xiàn)所述抗人IgG抗體的干擾可以通過對待分析樣品摻加處于單體 或寡聚形式的確定的抗體，和進行使用所述摻加的樣品確定抗藥物抗體的方法來確定，且 基于使用不同樣品進行的方法的結(jié)果來確定該免疫測定是否為陽性。本發(fā)明的另一方面是利用包括捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的雙抗原橋連免疫 測定來確定樣品中存在的抗體是抗藥物抗體還是抗人IgG抗體，即樣品中存在的抗體是特 異性抗藥物抗體還是非特異性抗藥物抗體的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)所述捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)所述示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iv)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人IgG，b-v)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人IgG，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性 免疫測定來確定所述樣品中存在的抗體是抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫 測定來確定所述樣品中存在的抗體是抗人IgG抗體。在本申請中可交換使用的術(shù)語“陽性免疫測定”和“陽性免疫測定結(jié)果”，表示在使 用所述未增補樣品進行的免疫測定的情形中，使用所述未增補樣品進行的免疫測定產(chǎn)生充 分高于所述免疫測定背景水平的信號。在一個實施方案中，所述背景水平是通過測定來自 在所述免疫測定中未施用所述藥物抗體的不同個體的許多樣品獲得的平均信號加該平均 值標準偏差的三倍，即95%置信區(qū)間。同樣地，在本申請中可交換使用的術(shù)語“陰性免疫測 定”和“陰性免疫測定結(jié)果”，表示在所述免疫測定背景水平內(nèi)的信號，即在所述免疫測定中 不使用任何抗體的樣品獲得的信號的標準偏差的三倍以內(nèi)。在本申請中可交換使用的術(shù)語“陽性免疫測定”和“陽性免疫測定結(jié)果”，表示在使 用所述增補的樣品進行的免疫測定用于本申請的情形中，使用所述增補的樣品進行的免疫 測定在一個實施方案中產(chǎn)生所述在使用未增補樣品進行的免疫測定情形中的信號的50% 以上的相對信號，在另一個實施方案中產(chǎn)生65%以上的相對信號，在再一個實施方案中產(chǎn)生80%以上的相對信號。術(shù)語“陰性免疫測定”，表示在使用所述增補的樣品進行免疫測定 用于本申請的情形中，使用所述增補的樣品進行的免疫測定在一個實施方案中產(chǎn)生小于在 使用所述未增補樣品進行的免疫測定情形中的所述信號的50%，在另一個實施方案中小于 所述信號的65 %，在再一個實施方案中小于所述信號的80 %的相對信號。按照本發(fā)明的免疫測定包括處于以下順序的下列步驟a)使與固相綴合的捕獲藥物抗體與所述未摻加或摻加的樣品相接觸，b)使所述已經(jīng)與樣品相接觸的、與固相綴合的捕獲藥物抗體與示蹤藥物抗體相接 觸，c)通過檢測與所述示蹤藥物抗體綴合的可檢測標記物，檢測示蹤藥物抗體。任選地，步驟a)和b)，即b)和C)之間可以包括洗滌步驟?！瓣栃悦庖邷y定”和“陽性免疫測定結(jié)果”在a)樣品中含有的抗藥物抗體通過捕獲藥物抗體與固相結(jié)合，b)示蹤藥物抗體結(jié)合a)的復(fù)合物，和c)直接或在其他結(jié)合配偶體的幫助下檢測示蹤藥物抗體的可檢測標記物時獲得。在“陰性免疫測定”和“陰性免疫測定結(jié)果”的情形中，沒有達到一個或多個以上 列出的標準。本發(fā)明的第三方面是用于將在樣品中針對人源化抗炎藥物抗體的抗藥物抗體與 抗人IgG抗體區(qū)分開，即將特異性抗藥物抗體與非特異性抗藥物抗體相區(qū)分的方法，其中 所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣
品，b-iii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣
品，b-iv)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白 G，b-v)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白 G，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性免疫測定來確定針對人源化抗炎藥物抗體的抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫測定來確定所述樣品中存在的抗體是抗人IgG抗體。本發(fā)明的還有的另一方面是用于確定樣品中的抗藥物抗體是單體形式還是寡聚 形式，其中所述方法包括以下步驟
a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b_i)所述樣品，b-ii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iv)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白 G，b-v)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白 G，c)通過b_i)以及b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定以及b-iii)和b-v)中的陰 性免疫測定來確定所述樣品中的抗藥物抗體是單體形式或通過b_i)和b-iii)和b-v)中的陽性免疫和測定以及b-ii)和b-iv)中的陰性 免疫測定來確定所述樣品中的抗藥物抗體是寡聚形式。本發(fā)明的另一方面是用于確定樣品中存在寡聚抗藥物抗體的方法，其中所述方法 包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iv)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白 G，b-v)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白 G，c)通過b-i)和b-iii)和b-v)中的陽性免疫測定和b-ii)和b-iv)中的陰性免 疫測定來確定樣品中的抗藥物抗體是寡聚形式。本發(fā)明的另一方面是用于確定樣品中存在單體抗藥物抗體的方法，其中所述方法 包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，
b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iv)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白 G，b-v)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白 G，c)通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免 疫測定來確定所述樣品中的抗藥物抗體是單體形式。現(xiàn)在已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)了在使用處于單體和處于寡聚形式的所述藥物抗體以及使 用處于單體和處于寡聚形式的人IgG增補所述樣品的條件下，可以由其獲得測定結(jié)果模 式，可以進行結(jié)果類型的確定，其記述在以下方案中 因此，使用按照本發(fā)明的方法，可以對特異性和非特異性以及單體和寡聚免疫測 定反應(yīng)或結(jié)果進行分類。因此，本發(fā)明作為另一方面包括利用包括捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的免疫測 定來確定陽性結(jié)果的方法，所述陽性結(jié)果是針對藥物抗體的抗體的測定的陽性結(jié)果，其中 所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b-iii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣
品，b-iv)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白 G，b-v)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白 G，c)通過b-i)和b-iii)和b-v)中的陽性免疫測定和b-ii)和b-iv)中的陰性免 疫測定來確定樣品中針對藥物的抗體的確定的陽性結(jié)果。本發(fā)明該方面的一個實施方案是所述免疫測定是使用捕獲藥物抗體和示蹤藥物 抗體的雙抗原橋連免疫測定。本發(fā)明該方面的另一個實施方案是所述藥物抗體是用于治療 炎性疾病的抗體。在一個實施方案中，所述用于治療炎性疾病的抗體是用于治療類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的抗體。在另一個實施方案中，所述用于治療炎性疾病的抗體是抗IL-6 受體，或抗IGF-1受體，或IL-13受體la的抗體。本發(fā)明該方面的一個實施方案包括所 述捕獲藥物抗體是所述藥物抗體的混合物，其包括至少兩種在不同抗體位點處與所述固相 綴合的所述抗體，且示蹤藥物抗體是所述藥物抗體的混合物，其包括至少兩種在不同抗體 位點處與所述可檢測的標記物綴合的所述抗體。另一個實施方案是所述藥物抗體與其綴 合配偶體的綴合是通過經(jīng)由藥物抗體的氨基酸主鏈的N端和/或￡-氨基(賴氨酸)，不 同賴氨酸的￡ “氨基，羧基_，巰基_，羥基_和/或酚官能團，和/或藥物抗體的糖結(jié)構(gòu)的 糖醇基團的化學(xué)鍵合來進行。在本發(fā)明方面的實施方案中，捕獲藥物抗體混合物或示蹤藥 物抗體混合物包括經(jīng)由氨基或經(jīng)由糖結(jié)構(gòu)與其綴合配偶體綴合的藥物抗體。在另一個實 施方案中，捕獲藥物抗體與固相的綴合通過被動吸附，或經(jīng)由特異性結(jié)合對進行。在本發(fā) 明的一個實施方案中，所述特異性結(jié)合對(第一成分/第二成分)是鏈霉抗生物素蛋白或 抗生物素蛋白/生物素，或抗體/抗原(參見，例如，Hermanson, G. T.，等，Bioconjugate Techniques (生物綴合技術(shù))，Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)，1996)，或凝集素/多糖，或 類固醇/類固醇結(jié)合蛋白，或激素/激素受體，或酶/底物，或IgG/蛋白A和/或G。在一 個實施方案中，捕獲藥物抗體與生物素綴合且與固相的綴合經(jīng)由固定化的抗生物素蛋白或 鏈霉抗生物素蛋白進行。在本發(fā)明方面的另一個實施方案中，示蹤藥物抗體經(jīng)由特異性結(jié) 合對與可檢測的標記物綴合。在一個實施方案中，所述示蹤藥物抗體與洋地黃毒苷綴合且 與可檢測的標記物的連接經(jīng)由抗洋地黃毒苷的抗體進行。在本發(fā)明該方面的另一個實施方 案中，捕獲藥物抗體與示蹤藥物抗體的比率為1 10 50 1(比率意指抗體分子比，而 不考慮綴合物的分子量，綴合物的分子量可以不同)。本發(fā)明的另一方面是用于確定針對施用的藥物抗體，特別是治療性抗體的免疫系 統(tǒng)響應(yīng)類型的方法。使用該方法，可以區(qū)分檢測的抗藥物抗體是否是以下各項之一i)特異性、單體抗藥物抗體，或ii)特異性、寡聚抗藥物抗體，或iii)非特異性、寡聚抗人IgG抗體，或iv)非特異性、單體抗人IgG抗體，或v)非特異性抗體。
因此，本發(fā)明包括使用包括捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的雙抗原橋連免疫測定 來確定樣品中存在針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體)的類型的方法，其中所述方法包括 以下步驟a)提供a-i)所述捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)所述示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b-i)所述樣品，b-ii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iii)在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣
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PR，b-iv)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白 G，b-v)所述樣品，在免疫測定前已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白 G，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性 免疫測定來確定所述樣品中存在的抗體是特異性的、單體抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定和b-iii)中的陰性免疫 測定來確定所述樣品中存在的抗體是特異性的、寡聚抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫 測定來確定所述樣品中存在的抗體是非特異性的、寡聚抗人IgG抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iii)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定來確定所述樣 品中存在的抗體是非特異性抗體，或通過b-i)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)和b-iv)和b-v)中的陰性免 疫測定來確定所述樣品中存在的抗體是非特異性抗人IgG抗體。提供以下實施例、參考文獻和附圖來協(xié)助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍由后附 權(quán)利要求限定。應(yīng)當理解在不偏離本發(fā)明實質(zhì)的條件下可以在所述程序中進行變化。


圖1.用于檢測抗藥物抗體的橋連測定生物素化的藥物抗體(捕獲-BI)與鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板 (SA-MTP)結(jié)合；抗藥物抗體使捕獲藥物抗體(捕獲-BI ；BI =生物素化的)與洋地黃毒 苷-標記的示蹤藥物抗體(示蹤劑-DIG ；DIG =洋地黃毒苷化(digoxigenylated))橋連； 固定化的復(fù)合物通過多克隆抗洋地黃毒苷辣根過氧化物酶綴合物(DIG-pAb-POD)檢測；多 克隆兔抗藥物抗體(rpAb)用作標準樣。
實施例實施例1
用D-生物素酰(biotinoyl)-氨基己酸_N_羥基琥珀酰亞胺酯生物素化抗體mAb IL-6R針對緩沖液(100mM磷酸鉀緩沖液(以下表示為K_P04)，pH 8. 5)透析了抗IL-6受 體抗體(mAb IL-6R)。隨后，將該溶液調(diào)節(jié)到蛋白質(zhì)濃度為10mg/ml。將D-生物素酰-氨 基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯溶解在DMS0中并以1 5的摩爾比加入到該抗體溶液中。 60分鐘后，通過加入L-賴氨酸終止反應(yīng)。過剩的標記試劑通過針對增補了 150mM NaCl的 25mM K-P04, pH 7. 5 透析去除。實施例2在用檸康酸酐處理后用D-生物素酰_氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯生物素化 mAb IL-6R針對lOOmM K_P04，pH 8. 4透析了 mAb IL-6R。隨后將該溶液調(diào)節(jié)到蛋白質(zhì)濃度 為20mg/ml。將檸康酸酐溶解在DMS0中并以1 5的摩爾比加入到該抗體溶液中。120分 鐘后，通過在用lOOmM k-po4, pH 8.4平衡的Sephadex G25柱上層析來終止反應(yīng)。將抗 體溶液調(diào)節(jié)到蛋白濃度為約4mg/ml。將D-生物素酰-氨基己酸_N_羥基琥珀酰亞胺酯溶 解在DMS0中并以1 5的摩爾比加入到抗體溶液中。該反應(yīng)在60分鐘后，通過加入L-賴 氨酸來終止。過剩的標記試劑通過針對200mM乙酸鈉緩沖液，pH 5.0透析去除。通過在 Sephadex G25柱上層析，將抗體溶液轉(zhuǎn)移到增補了 150mM NaCl的25mM K_P04，pH 7.2 中。實施例3用生物素酰胼生物素化mAb IL-6R針對lOOmM乙酸鈉緩沖液，pH 5. 5透析了 mAb IL-6R。隨后將該溶液調(diào)節(jié)到蛋白 質(zhì)濃度為20mg/ml。將高碘酸鈉溶解在100mM乙酸鈉緩沖液，pH 5. 5中并加入到抗體溶液 中以達到最終濃度10mM。該反應(yīng)在30分鐘后，通過在用lOOmM乙酸鈉緩沖液，pH 5. 5平衡 的Sephadex G25柱上層析來終止。將抗體溶液調(diào)節(jié)到蛋白濃度為約5mg/ml。將生物素 酰胼溶解在DMS0中并以1 5的摩爾比加入到抗體溶液中。該反應(yīng)在120分鐘后，通過加 入硼氫化鈉達到最終濃度為15mM來終止。30分鐘后，通過針對增補了 150mM NaCl的25mM K-P04, pH 7. 2來透析抗體溶液。實施例4用洋地黃毒苷3-0-甲基羰基_ ￡ _氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯將mAbIL_6R 洋地黃毒苷化針對洋地黃毒苷化緩沖液(lOOmM K_P04，pH 8. 5)透析了 mAb IL-6R。隨后，將該 溶液調(diào)節(jié)到蛋白質(zhì)濃度為10mg/ml。將洋地黃毒苷3-0-甲基羰基-￡ -氨基己酸_N_羥基 琥珀酰亞胺酯溶解在DMS0中并以1 5的摩爾比加入到抗體溶液中。60分鐘后，通過加入 L-賴氨酸終止反應(yīng)。過剩的標記試劑通過針對增補了 150mM NaCl的25mM K_P04，pH 7.5 透析去除。實施例5在用檸康酸酐處理后，用洋地黃毒苷3-0-甲基羰基_ ￡ -氨基己酸-N-羥基琥珀 酰亞胺酯將mAb IL-6R洋地黃毒苷化針對lOOmM K_P04，pH 8. 4透析了 mAb IL-6R。隨后將該溶液調(diào)節(jié)到蛋白質(zhì)濃度為20mg/ml。將檸康酸酐溶解在DMS0中并以1 5的摩爾比加入到抗體溶液中。該反應(yīng)在 120分鐘后，通過在用lOOmM k-po4，ph 8. 4平衡的Sephadex G25柱上層析來終止。將抗 體溶液調(diào)節(jié)到蛋白濃度為約4mg/ml。將洋地黃毒苷3-0-甲基羰基-￡ -氨基己酸_N_羥 基琥珀酰亞胺酯溶解在DMS0中并以1 5的摩爾比加入到抗體溶液中。該反應(yīng)在60分鐘 后，通過加入L-賴氨酸來終止。過剩的標記試劑通過針對200mM乙酸鈉緩沖液，pH 5. 0透 析去除。通過在Sephadex G25柱上層析，將抗體溶液轉(zhuǎn)移到增補了 150mM NaCl的25mM K-P04, pH 7. 2 中。實施例6用洋地黃毒苷-X-酰胼將mAb IL-6R洋地黃毒苷化針對lOOmM乙酸鈉緩沖液，pH 5. 5透析了 mAb IL-6R。隨后將該溶液調(diào)節(jié)到蛋白 質(zhì)濃度為20mg/ml。將高碘酸鈉溶解在lOOmM乙酸鈉緩沖液，pH 5. 5中并加入到抗體溶液 中以達到最終濃度10mM。該反應(yīng)在30分鐘后，通過在用lOOmM乙酸鈉緩沖液，pH 5. 5平衡 的Sephadex G25柱上層析來終止。將抗體溶液調(diào)節(jié)到蛋白濃度為約5mg/ml。將洋地黃 毒苷-X-酰胼溶解在DMS0中并以1 50的摩爾比加入到抗體溶液中。該反應(yīng)在120分鐘 后，通過加入硼氫化鈉達到最終濃度15mM來終止。30分鐘后，通過針對增補了 150mM NaCl 的25mM K-P04, pH 7. 2來透析該抗體溶液。實施例7a)產(chǎn)生處于寡聚形式的藥物抗體重組藥物抗體(IgG)，例如抗IL-6R抗體，抗IGF-1R抗體，或抗IL-13R抗體，針對 增補了 lOOmM NaCl的150mM磷酸鉀緩沖液，pH 8. 4透析，并隨后將抗體溶液濃縮到抗體濃 度為 55mg/ml。將辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)溶解在DMS0中并以1 7 (IgG DSS)的摩爾 比加入到所述抗體溶液中。使該混合物在25°C和pH 8. 4下攪拌溫育，并用分析凝膠過濾 層析法(例如使用TSK 4000柱)分析該反應(yīng)。聚合通常在60分鐘后，通過加入賴氨酸達 到終濃度10mM來終止。在25°C溫育45分鐘后，聚合的藥物抗體通過凝膠過濾(例如使用 Sephacryl S400柱)分離，以除去低分子量級分。b)產(chǎn)生處于寡聚形式的人IgG將通過離子交換層析法從人血清中純化的人IgG針對含有l(wèi)OOmMNaCl的150mM磷 酸鉀緩沖液，pH 8.4透析，并將蛋白溶液濃縮到蛋白濃度為751^/1111。將辛二酸二琥珀酰亞 胺酯(DSS)溶解在DMS0中并以1 5(IgG DSS)的摩爾比加入到所述抗體溶液中。使該 混合物在25°C和pH8. 4下攪拌溫育，并用分析凝膠過濾柱(例如使用TSK 4000柱)分析 該反應(yīng)。聚合通常在60分鐘后，通過加入賴氨酸達到終濃度10mM來終止。在25°C溫育45 分鐘后，寡聚人IgG通過凝膠過濾(例如使用S印haCrylS400柱)分離，以除去低分子量級 分。實施例8測定原理ELISA利用鏈霉抗生物素蛋白微量滴定板(SA-MTP)上的固定化的藥物抗體(捕 獲-BI)來捕獲包含抗藥物抗體(ADA)的樣品。捕獲的ADA通過洋地黃毒苷化的藥物抗體 (示蹤劑-DIG)檢測。ADA和示蹤劑-DIG的結(jié)合復(fù)合物通過過氧化物酶綴合的多克隆抗DIG抗體與其底物ABTS(2，2'-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))反應(yīng)和隨后的光 度計讀數(shù)來檢測。光密度(0D)在405nm處測量(以490nm作為參考波長)。為了確定標準 曲線，用確定濃度的抗藥物抗體溶液代替樣品。最高標準濃度已經(jīng)達到0D值1. 8-2. 2AU。在第一步中，通過以1 20的稀釋度檢測所有樣品來篩選所有樣品，以確定對于 抗藥物抗體(ADA)的陽性或陰性(篩選測定；是/否答案)。陽性/陰性分界點是利用測 定反應(yīng)的95%置信區(qū)間，即來自空白血清樣品的多重分析的光密度(0D)來確定。在第二步中，所有陽性樣品通過使用最多四個另外的區(qū)分步驟再次檢測，從而表 征反應(yīng)(例如藥物特異性)i)未摻加的樣品ii)對樣品摻加1 ii g/ml處于單體形式的藥物抗體iii)對樣品摻加1 P g/ml處于寡聚形式的藥物抗體iv)對樣品摻加1 P g/ml處于單體形式的人IgGv)對樣品摻加1 P g/ml處于寡聚形式的人IgG在上述區(qū)分步驟中，如上(篩選測定)所述再次進行ELISA，但是樣品在應(yīng)用于微 量滴定板前分別用如上所述的溶液ii)_v)溫育，以實現(xiàn)所述四個區(qū)分步驟。摻加的物質(zhì)與 捕獲-BI競爭結(jié)合樣品的物質(zhì)(例如ADA)。未摻加的樣品的測定信號必須在測定的動力學(xué) 范圍內(nèi)，否則必須進一步稀釋該樣品。該最終樣品稀釋也必須用在所有區(qū)分步驟中。如果 由于存在摻加的試劑(ii)-v))導(dǎo)致的吸光度的減小小于20%，則該檢測結(jié)果被認為是“陽 性”(陽性免疫測定)。如果吸光度的減小是20%以上，則該檢測結(jié)果被認為是“陰性”(陰 性免疫測定)。換言之，如果信號恢復(fù)大于80%，則該檢測結(jié)果被認為是“陽性”(陽性免疫 測定)，且如果信號恢復(fù)小于80%，則該檢測結(jié)果被認為是“陰性”(陰性免疫測定)。實施例9用于檢測抗IL-6R-抗體的抗體的ELISA該測定按照實施例8進行。例外是該樣品(摻加的或未摻加的)用所述藥物-DIG 預(yù)溫育1小時。結(jié)果顯示在下表1中。表1 檢測抗IL-6R-抗體的抗體的ELISA的結(jié)果 BLQ =低于量化范圍實施例10用于檢測抗IGF-1R抗體的抗體的ELISA該測定按照實施例8進行。結(jié)果顯示在下表2中。表2 用于檢測抗IGF-1R抗體的抗體的ELISA的結(jié)果 實施例11用于檢測抗IL-13R-抗體的抗體的ELISA該測定按照實施例8進行。例外是這是利用電-化學(xué)發(fā)光作為檢測方法的測定。 這意味著代替洋地黃毒苷化藥物抗體和過氧化物酶綴合的抗DIG抗體，使用釕標記的藥物 抗體作為示蹤劑-DIG。結(jié)果顯示在下表3中。表3 用于檢測抗IL-13R-抗體的抗體的ELISA的結(jié)果 BLQ=低于量化范圍。
權(quán)利要求
利用免疫測定來確定樣品中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸b i)所述樣品，b ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，b iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品，c)通過b i)中的陽性免疫測定以及b ii)和b iii)中的陰性免疫測定來確定所述樣品中的針對所述藥物抗體的抗體。
2.利用免疫測定來確定樣品中存在的抗體是特異性抗藥物抗體或非特異性抗藥物抗 體的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸 b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品， b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性免疫 測定來確定所述樣品中存在的抗體是特異性抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫測定 來確定所述樣品中存在的抗體是非特異性抗藥物抗體。
3.利用免疫測定在樣品中將針對人源化抗炎藥物抗體的抗藥物抗體與抗人IgG抗體 相區(qū)分的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸 b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品， b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性免疫 測定來確定針對人源化抗炎藥物抗體的抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定以及b-iii)和b-v)中的陰性免疫測 定來確定所述樣品中存在的抗體是抗人IgG抗體。
4.利用免疫測定來確定樣品中的抗藥物抗體是單體形式還是寡聚形式的方法，其中所 述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸 b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品， b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)中的陽性免疫測定和以下測定來確定所述樣品中的抗藥物抗體是單體形式a)b-ii)和b-iii)中的陰性免疫測定，或β ) b-ii)，b-iii)，b-iv)，和b-v)中的陰性免疫測定，或通過b-i)中的陽性免疫測定和以下測定來確定所述樣品中的抗藥物抗體是寡聚形式a)b_iii)中的陰性免疫測定，或 i3)b_iii)和b-v)中的陰性免疫測定， 其中所有其他沒有列出的免疫測定為陽性。
5.利用免疫測定來確定樣品中存在寡聚抗藥物抗體的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸 b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品， b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-iii)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iv)中的陰性免疫 測定來確定樣品中的抗藥物抗體是寡聚形式。
6.利用免疫測定來確定樣品中確定的抗藥物抗體的種類的方法，其中所述方法包括以 下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸 b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品， b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)中的陰性免疫 測定來確定抗藥物抗體的種類是單體的和藥物抗體特異性抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定和b-iii)中的陰性免疫測定 來確定抗藥物抗體的種類是寡聚的和藥物抗體特異性抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫測定 來確定抗藥物抗體的種類是寡聚的和非藥物抗體特異性抗體，或通過b-i)中的陽性免疫測定以及b-ii)和b-iii)和b-iv)和b-v)中的陰性免疫測 定來確定抗藥物抗體的種類是單體的和非藥物抗體特異性抗體。
7.利用免疫測定來確定樣品中存在單體抗藥物抗體的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸 b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品， b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，c)通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫測 定來確定所述樣品中的抗藥物抗體是單體形式。
8.利用免疫測定來確定樣品中存在的針對藥物抗體的抗體的種類的方法，其中所述方 法包括以下步驟a)提供a-i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的所述藥物抗體，a-ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的所述藥物抗體，b)使所述捕獲藥物抗體分別與下列接觸 b-i)所述樣品，b-ii)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iii)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品， b-iv)已經(jīng)向其中加入了處于單體形式的人免疫球蛋白G的所述樣品，b-v)已經(jīng)向其中加入了處于寡聚形式的人免疫球蛋白G的所述樣品， c)通過b-i)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定和b-ii)和b-iii)中的陰性免疫測 定來確定所述樣品中存在的抗體是特異性、單體抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定和b-iii)中的陰性免疫測定 來確定所述樣品中存在的抗體是特異性、寡聚抗藥物抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iv)中的陽性免疫測定和b-iii)和b-v)中的陰性免疫測定 來確定所述樣品中存在的抗體是非特異性、寡聚抗人IgG抗體，或通過b-i)和b-ii)和b-iii)和b-iv)和b-v)中的陽性免疫測定來確定所述樣品中 存在的抗體是非特異性抗體，或通過b-i)中的陽性免疫測定和b-ii)和b-iii)和b-iv)和b-v)中的陰性免疫測定 來確定所述樣品中存在的抗體是非特異性、單體抗人IgG抗體。
9.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述免疫測定是包括捕獲藥物抗體 和示蹤藥物抗體的雙抗原橋連免疫測定。
10.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述藥物抗體是用于治療炎性疾 病的抗體。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述用于治療炎性疾病的抗體是用于治療類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的抗體。
12.按照權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述用于治療炎性疾病的抗體是抗IL-6受 體、或抗IGF-I受體、或IL-13受體1 α的抗體。
13.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述捕獲藥物抗體是所述藥物抗 體的混合物，其包括至少兩種在不同抗體位點處與所述固相綴合的所述抗體，且所述示蹤 藥物抗體是所述藥物抗體的混合物，其包括至少兩種在不同抗體位點處與所述可檢測的標 記物綴合的所述抗體。
14.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述藥物抗體與其綴合配偶體的 綴合是通過經(jīng)由所述藥物抗體的氨基酸主鏈的N端和/或ε-氨基(賴氨酸)，不同賴氨酸 的ε “氨基，羧基_，巰基_，羥基_和/或酚官能團，和/或所述藥物抗體的糖結(jié)構(gòu)的糖醇 基團的化學(xué)鍵合來進行。
15.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述捕獲藥物抗體混合物或所述 示蹤藥物抗體混合物包括經(jīng)由氨基與其綴合配偶體綴合的藥物抗體和經(jīng)由糖結(jié)構(gòu)與其綴 合配偶體綴合的藥物抗體。
16.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述捕獲藥物抗體與所述固相的 綴合是通過被動吸附或經(jīng)由特異性結(jié)合對來進行。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其特征在于所述特異性結(jié)合對選自鏈霉抗生物素蛋白或 抗生物素蛋白/生物素，或抗體/抗原，或凝集素/多糖，或類固醇/類固醇結(jié)合蛋白，或激 素/激素受體，或酶/底物，或IgG/蛋白A和/或G。
18.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述捕獲藥物抗體與生物素綴合 且與所述固相的綴合是經(jīng)由固定化的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白進行。
19.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述方法在步驟b)后包括另外的 步驟ba)ba)使在步驟b)中與所述樣品接觸的所述捕獲藥物抗體與所述示蹤藥物抗體接觸和 檢測所述可檢測的標記物。
20.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述示蹤藥物抗體是經(jīng)由特異性 結(jié)合對與可檢測的標記物綴合。
21.按照權(quán)利要求20的方法，其特征在于所述示蹤藥物抗體與洋地黃毒苷綴合，且與 所述可檢測的標記物的連接是經(jīng)由抗洋地黃毒苷的抗體來進行。
22.按照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述捕獲藥物抗體與示蹤藥物抗 體的比率為1 10 50 1。
23.用于確定樣品中的針對藥物抗體的抗藥物抗體的試劑盒，其包括a)鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板，b)用于使藥物抗體與生物素綴合的試劑，c)用于使所述藥物抗體與洋地黃毒苷綴合的試劑，d)與抗洋地黃毒苷抗體綴合的辣根過氧化物酶，e)用于寡聚化所述藥物抗體的試劑，f)處于單體形式的人免疫球蛋白G，和g)處于寡聚形式的人免疫球蛋白G。
全文摘要
本發(fā)明包括使用包括捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的免疫測定來確定樣品中針對藥物抗體的抗體的方法，其中所述方法包括提供i)捕獲藥物抗體，其為與固相綴合的藥物抗體，ii)示蹤藥物抗體，其為與可檢測的標記物綴合的藥物抗體，使所述捕獲藥物抗體分別與i)所述樣品，ii)向其中加入了處于單體形式的所述藥物抗體的所述樣品，iii)向其中加入了處于寡聚形式的所述藥物抗體的所述樣品相接觸，和通過在i)中的陽性免疫測定和在ii)和iii)中的陰性免疫測定來確定所述樣品中的針對所述藥物抗體的抗體。
文檔編號G01N33/68GK101896820SQ200880119997
公開日2010年11月24日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月15日
發(fā)明者凱-貢納爾·施圖本勞赫, 馬庫斯·扎達克 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司