專利名稱：具有超高靈敏度的使用納米等離子體激元共振器的實時單步生物測定的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用單獨的納米等離子體激元共振器(nanoplasmonic resonator)和 納米等離子體激元共振器陣列檢測酶活性的表面增強拉曼散射(SERS)的領域。本發(fā)明具 體涉及蛋白酶活性，例如用于前列腺癌診斷應用的前列腺特異性抗原(PSA)和蛋白水解活 性PSA的檢測。
背景技術：
最早在1928年開發(fā)的拉曼光譜已經廣泛地用于表征分子性質(KazuoNakamoto John R. Ferraro, Chris W. Brown, Introductory Raman Spectroscopy,第二版(Elsevier Science, 2003) 0表面增強拉曼光譜學(SERS)通過靠近表面的增強電磁場顯著提高拉 曼信號(C. R. Yonzon, C. L Haynes, X. Zhang 等，Anal Chem 76 (1)，78 (2004) ；A. E. Grow, L. L. Wood, J. L. Claycomb 等，J Microbiol Methods 53 (2)，221 (2003) ；K. Nithipatikom, Μ. J. McCoy, S. R. Hawi 等，Anal Biochem 322 (2)，198 (2003) ;J. B. Jackson 和 N. J. Halas, P Natl Acad Sci USAlOl (52)，17930 (2004))。在粗糙金屬表面或分散的金屬納米顆 粒聚集體上進行的SERS測量顯示對于下至單個分子水平的檢測的高達IO14的最高拉 曼增強因子(Katrin Kneipp, Harald Kneipp, Irving Itzkan 等，Current Science (Bangalore) 77 (7), 915 (1999) ；S. Nie 和 S.R.Emory，Science 275 (5303)，1102 (1997))， 但是這些測量經常遭受差的重現(xiàn)性(Μ. Moskovits，Reviews of Modern Physics 57(3)， 783(1985))。為了改善重現(xiàn)性，已經開發(fā)了其它方法以高達IO8的重現(xiàn)性增強因子在 大面積上制造由同質特征組成的SERS基底，所述方法包括金屬膠體納米顆粒的自組裝 (R. G. Freeman, K. C. Grabar, K. J. Allison 等，Science 267 (5204)，1629 (1995))、納米球平
4版印刷術(lithography) (NSL)和納米球上的金屬膜(MFON) (C. L. Haynes和R. P. VanDuyne, Journal of Physical Chemistry B 107 (30)，7426 (2003))、拋光的金基底的電化學糙化 (J.M.Sylvia，J. A. Janni, J.D.Klein 等，Analytical Chemistry 72 (23)，5834 (2000)) 和使用電子束平版印刷術的周期結構化的金屬基底(M.Kahl，Ε. Voges, S. Kostrewa等， Sensors and Actuators B-Chemical 51 (1-3), 285 (1998)) 雖然這些努力導致 SERS 分 析成功用于許多有前途的應用中，但是缺少在特定位置制造SERS熱點的能力限制了對于 非常小的樣品量的應用，所述有前途的應用包括基因和蛋白質鑒別(Y.C.Cao，R. C. Jin, J. M.Nam 等，J Am Chem Soc 125 (48)，14676 (2003) ；Y. W. C. Cao, R. C. Jin 和 C. A. Mirkin， Science 297 (5586)，1536 (2002) ；Τ. Vo-Dinh, F. Yan 禾口 Μ. B. Wabuyele， Journal of Raman Spectroscopy 36 (6-7)，640 (2005))、生物戰(zhàn)劑檢測(D. A. Stuart, K. B. Biggs 和 R. P. Van Duyne, Analyst 131 (4)，568 (2006))和實時葡萄糖監(jiān)測(0. Lyandres, N. C. Shah, C. R. Yonzon 等，Analytical Chemistry 77 (19)，6134 (2005))。為了克服這種限制，我們最近開發(fā)了可調的納米等離子體激元共振器(NPR)，其由 夾在引入本文作為參考的 Durant S. Su K, Steel M. J.，Xiong Y. Sun C, Zhang X，Journal of Physical Chemistry B 110 (9)，3964 (2006)中所述的金屬納米盤之間的薄SiO2層組 成?？赏ㄟ^改變介電層厚度和NRP的縱橫比精確地調控共振頻率。在對于單獨的SERS基 底或納米顆粒所得的最大值之中，個別WR可增加拉曼強度至6. IX IOltl倍。使用已經確立 的(well established)納米平版印刷術方法制造，基于M3R的方法使得能夠在所需位置以 小得多的尺度可重現(xiàn)地制造SERS熱點，容許多重的(多路的，multiplexed)高通過量檢測 和芯片上的實驗室應用。前列腺癌生物標記物前列腺特異性抗原(PSA)，一種激肽釋放酶(hK)家族絲氨 酸蛋白酶(S. R. Denmeade 和 J. T. Isaacs，BJU Int 93Suppl 1，10 (2004) ； J. A. Clements, N.M. Willemsen，S. A.Myers 等，Crit Rev Clin Lab Sci 41 (3)，265 (2004))用作本申 請中的模型蛋白酶。通常使用的前列腺特異性抗原(PSA)血液測試已經被廣泛地用于 前列腺癌(最主要的男性癌癥)的早期診斷和處理(H. Gronberg, Lancet 361(9360)， 859(2003) ；S. R. Denmeade 禾口 J. Τ· Isaacs, Nat Rev Cancer 2 (5)，389 (2002))。然而,血清 PSA濃度更經常地反映良性前列腺增生(BPH)的存在，而不是癌癥(A. Caplan和A. Kratz， Am J Clin Pathol 117Suppl, S104(2002) ；Ε. I. Canto, S. F. Shariat 和 K. Μ. Slawin，Curr Urol Rep 5 (3)，203 (2004))。特異性的缺乏導致高的假陽性率并且經常導致昂貴的用于 診斷的前列腺針吸活組織檢查和活組織檢查后的并發(fā)癥(complication))以及相當大的 焦慮(M. B. Gretzer 和 A. W. Partin，Urol Clin North Am 30(4)，677(2003) ；A. Haese, Μ· Graefen，H. Huland 等，Curr Urol Rep 5 (3)，231 (2004))。最近的研究已經鑒定了一 類高度特異性的肽，其可在異種移植模型(S. R. Denmeade，C. M. Jakobsen, S. Janssen等，J Natl Cancer Inst 95 (13)，990 (2003))和人類樣品(P. Wu, U. H. Stenman, M. Pakkala 等， Prostate 58 (4)，345 (2004) ；P. Wu，L. Zhu，U. H. Stenman 等，Clin Chem 50 (1)，125 (2004)) 中被papSA同種型(isoform)切割，因此，來自體內樣品的paPSA蛋白酶活性的測量是可能 的，并且作為前列腺癌的更特異性的篩選劑(掩蔽劑，screening agent)和在復發(fā)性疾病 的檢測中是潛在有價值的。然而，基于免疫肽分析(IMPA)的報道結果顯示出低的熒光信噪 比，妨礙在臨床上重要的60 300pM范圍內較低的濃度下的可靠測量(P. Wu，U. H. Stenman,M. Pakkala 等，Prostate 58 (4)，345 (2004) ；P. ffu, L. Zhu, U. H. Stenman 等，Clin Chem 50(1) ,125(2004))。此外，通常從細針吸活組織檢查或循環(huán)細胞捕獲中分離有限數(shù)量的前 列腺癌細胞(< 1000)。不存在對于臨床分期可以在少量細胞上進行paPSA蛋白酶活性測 定的商業(yè)化方法。因此，本發(fā)明的一個目的是提供容許以非常少的樣品量進行用于前列腺 癌檢測的PaPSA的特異性和靈敏的測量的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供使用由納米等離子體激元共振器(NPR)組成的納米傳感器以至 少皮摩爾靈敏度在體外和原位檢測和測量酶活性。在一個實施方式中，生物結合的 (bioconjugatecONra增強在表面增強拉曼光譜學(SERS)中的拉曼光譜強度并且使得能夠 以非常小的量靈敏地單步檢測酶活性。在一些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供包括納米等離子體激元共振SERS平臺的 納米傳感器。所述平臺包括特征在于單獨的或陣列形式的表面增強拉曼散射(SERS)納米 等離子體激元共振器的基底，其中所述納米等離子體激元共振器(NPR)具有與其結合的生 物分子(biomolecule)。在一個實施方式中，所述M3R包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤， 具有結合或束縛(tether)到所述WR表面的被標記的生物分子。在優(yōu)選的實施方式中，所 述標記物是拉曼活性標記物。在一個實施方式中，所述生物分子是與拉曼活性標記物連接的肽，其中所述肽包 括可被特異性修飾或者通過酶切割的特異性序列。因此，這種肽結合的納米等離子體激元 共振器意圖用作特異性篩選工具以提供關于酶例如蛋白酶、激酶和肽酶的存在、濃度和活 性的信息。在一個實施方式中，篩選將測量在生物樣品中癌生物標記例如前列腺特異性抗 原(PSA)的活性。在一個實施方式中，所述肽應為被待檢測的相應酶特異性識別、修飾和/ 或發(fā)揮作用的底物。在另一實施方式中，實時反應監(jiān)測還提供關于酶活性的關鍵(臨界，critical)信 息，而不是僅測量蛋白質的存在?？墒褂貌煌睦鼧擞浳锓肿樱沟每赏ㄟ^多重肽結合的 WR進行兩種或更多種類型酶的檢測。而且，在基底上的肽結合的WR的陣列描述用于進一 步放大或擴展檢測。在另一實施方式中，彼此正交或者具有特異性的較小重疊的不同生物分子底物可 用于檢測相應的酶。在一個實施方式中，生物分子庫可與WR結合并且以無規(guī)陣列或有序 的微陣列形式空間分離。生物分子-納米等離子體激元共振器的多重陣列可用于同時檢測 多種酶。NI3R也可通過激光或磁場操作以在空間上以高精確度尋址(address)，使得其可 多重化為高密度陣列(具有亞微升容量)。以微陣列或納米陣列形式的用于多種蛋白酶的 另外的空間多重化是預期的。另外，磁場或激光操縱性容許在所需的位置處生物傳感，這對 于在細胞內得到原位測量是有用的。在另一實施方式中，本文中所述的納米傳感器可集成到微流體系統(tǒng)或其他芯片系 統(tǒng)中。在一個實施方式中，基于納米傳感器的測定可以液相進行，其中樣品與NPR納米傳感 器或NPR陣列接觸，和可進行SERS測量。


圖1 使用肽結合的NPR SERS納米傳感器檢測PSA蛋白酶活性的工作原理的示意 性圖解。(a) WR通過耦合的等離子體激元共振呈現(xiàn)出可調的等離子體激元共振和高度增強 的局部電磁場。短軸150nm和長軸200nm的NPR由厚度分別為25nm和5nm的銀和SiO2層的 多重疊層制成。(b)由拉曼染料R19、PSA特異性肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID NO 1)和半胱 氨酸組成的生物標記的分子結構。所述肽可通過PSA酶在HSSKLQ和LAAAC之間切割。(c) 用肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID NO 1)和拉曼染料R19(星)官能化的NPR的檢測圖。PSA 酶的存在將切割所述肽序列。切割之后，通過R19部分的SERS標志(signature)的消失監(jiān) 測R19(星)離開表面的擴散。填充分子辛烷硫醇(HS-(CH2)2-CH3)用于減小WR表面上的 報告肽的填充密度，由此容許PSA酶達到所述報告肽。(d)使用標準電子束平版印刷術和薄 膜沉積方法制造的NPR陣列的光學顯微圖像。制造的NPR陣列由間隔500nm的30X30NPR 組成。可在相同的基底上便利地制造多個NPR陣列和對準標記。(e)通過掃描電子顯微鏡 測量的WR陣列的放大圖像。使用精確平版印刷術方法，可以受控的方式制備NPR。(f)使 用原子力顯微鏡(AFM)在較高的放大率下測量的NPR圖像。(g)在425 650nm的波長范 圍內所測量的NPR陣列的消光光譜。已調節(jié)NPR的共振峰以緊密匹配激光激發(fā)和拉曼發(fā)射 頻率，并由此使拉曼信號的總體增強最大化。(h)在不同的WR陣列上測量的結合在WR表 面上的對巰基苯胺(PMA)分子的高度重現(xiàn)性拉曼光譜。積分時間為30秒。圖2 =PSA蛋白酶活性的實時動態(tài)測量。(a)對于在30分鐘內所取的6nMPSA培養(yǎng) 的SERS光譜，積分時間為30秒。(b)對于在30分鐘內所取的陰性對照6nM粒酶B的SERS 光譜。(c)添加PSA蛋白酶之前和之后在1316CHT1、1456CHT1、1526CHT1和1597CHT1處的拉曼 峰強度的相對變化的時間分辨的測量。負時間表示添加蛋白酶之前的時間。圖3 通過改變活性PSA濃度的PSA活性的時間分辨的測量。(a)對于1316CHT1峰 在6pM 6nM的活性PSA濃度下的歸一化的SERS強度變化?？汕宄販y量SERS強度的降 低，而在不含活性PSA蛋白酶的對照實驗中不能觀察到顯著的改變。(b)30分鐘時獲得的 歸一化SERS強度變化與濃度的關系。(c)從未處理的細胞外流體(ECF)中獲得的蛋白酶 活性測量結果在將LNCaP細胞(陽性對照)ECF暴露于NPR納米傳感器開始時(t = 0分 鐘)和30分鐘之后所得的拉曼光譜。(d)在1316CHT1峰處的歸一化的SERS強度變化，表 示從LNCaP和K562細胞系中提取的流體中PSA蛋白水解活性。圖4 使用拉曼檢測和光譜學的PSA檢測圖。圖5A =SERS顯微光譜學系統(tǒng)以及納米等離子體激元共振器目測和實時酶反應檢 測。圖5B:光譜測量設備的示意圖。圖6(A)具有各個金屬層的單獨納米盤的模擬散射光譜。所述納米盤是圓形的，直 徑為90nm，而金屬層和SiO2層的總厚度均保持為30nm。入射光的偏振在Y-軸方向偏振。 (B)共振頻率下單獨Au層納米盤(Si02/Au/Si02)的局部電場分布的Y-Z面橫截面。(C)共 振頻率下6Au層納米盤(SiO2Au)fVSiO2的局部電場分布的Y-Z面橫截面。
具體實施例方式本發(fā)明證明使用由納米等離子體激元共振器(NPR)組成的納米傳感器以至少皮 摩爾靈敏度在體外檢測和測量酶活性。在一個實施方式中，生物結合的WR增強表面增
7強拉曼光譜學(SERS)中的拉曼光譜強度并且使得能夠以非常小的量靈敏地單步檢測酶活 性。小量性質的主要優(yōu)點和應用之一是其在單細胞水平上檢測癌細胞的蛋白酶例如 前列腺特異性抗原(PSA)的活性中是有用的。小量的要求和靈敏度水平使得可能在捕獲的 循環(huán)前列腺癌細胞中檢測PSA活性用于指示各種疾病狀態(tài)例如轉移，這是使用常規(guī)技術不 可行的。在精液中，PSA濃度為10 150 μ Μ,大約三分之二的PSA是酶活性的。使用NPR PSA探針實現(xiàn)的靈敏度水平(納摩爾范圍)足以進行基于精液的測定，因此本文所述的納米 等離子體激元共振SERS平臺意圖具有臨床應用。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供包括納米等離子體激元共振SERS平臺的納米 傳感器。所述平臺包括特征在于單獨的或陣列形式的表面增強拉曼散射(SERS)納米等離 子體激元共振器的基底，其中所述納米等離子體激元共振器(NPR)具有與其結合的生物分 子。在一個實施方式中，所述NPR包括至少兩個具有交替薄屏蔽層的納米盤，和結合或束縛 到所述NPR的表面的被標記的生物分子。在優(yōu)選的實施方式中，所述標記物是拉曼活性標 記物?，F(xiàn)有技術中已知潛在用于拉曼光譜學的各種檢測裝置并且可使用任意已知的拉 曼檢測裝置。拉曼檢測裝置的非限制性實例公開在美國專利No. 6，002，471中。在該實例 中，通過532nm(納米)波長的Nd :YAG激光或者365nm波長的Ti 藍寶石激光產生激發(fā)束。 可使用脈沖激光束或連續(xù)激光束。激發(fā)束通過共焦光學器件和顯微鏡物鏡，并且可聚焦在 含有連接的生物分子目標物的基底上。可通過顯微鏡物鏡和共焦光學器件收集拉曼發(fā)射光 目標，其耦合至用于光譜分離的單色器。所述共焦光學器件可包括用于減少背景信號的反 射鏡、二向色性濾光器、屏障濾光片、共焦針孔、和透鏡的組合。標準全場光學器件也可用作 共焦光學器件?？赏ㄟ^拉曼檢測器檢測拉曼發(fā)射信號。所述檢測器可包括與用于計算和數(shù)字化信 號的計算機接口的雪崩光電二極管。在待分析目標陣列時，可設計光學檢測系統(tǒng)以檢測拉 曼信號和將拉曼信號定位到芯片或格子上的特定位置。例如，發(fā)射光可引導到CCD(電荷耦 合器件)照相機或在檢測區(qū)域內能夠同時測量來自20個多重像素或像素組的光發(fā)射的其 它檢測器。各種激發(fā)源包括，但不限于，337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm的 氦-鎘激光器(Liconox)(美國專利No. 6，174，677)。激發(fā)束可使用帶通濾光器30 (Corion) 光譜純化并且可使用6X物鏡(Newport，Model L6X)聚焦在基底140上。物鏡可用于激 發(fā)指示器和收集拉曼信號兩者，通過使用全息分束器(Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26NI8)產生用于激發(fā)束和發(fā)射的拉曼信號的直角幾何形狀。全息陷波濾波 器(Kaiser Optical Systems, Inc.)可用于減小瑞利散射輻射。供選擇的拉曼檢測器包 括，但不限于，配置有紅色增強強化電荷耦合器件(RE-ICXD)檢測系統(tǒng)的ISA HR-320攝譜 儀(Princeton Instruments) 0可使用其它類型的檢測器，例如電荷注射器件、光電二極管 陣列或光電晶體管陣列?，F(xiàn)在參考圖1A，NPR的納米級尺寸和高的局部電磁場增強使得能夠在其表面上高 靈敏度地光學檢測生物分子反應。在優(yōu)選的實施方式中，所述納米等離子體激元共振器是 包括通過屏蔽層分離的至少兩個垂直堆疊的納米盤的平版印刷限定的金屬電介質納米顆粒。在各種實施方式中，WR優(yōu)選通過電子束平版印刷術在基底上圖案化。其上NPR圖案化的基底可由石英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光譜 的任意其它材料組成。在一個實施方式中，為了防止電子束平版印刷術期間的帶電效應，所 述基底進一步涂布有層例如氧化銦錫。所述層可濺射、沉積、涂布或使用任意其它方法添加 到所述基底上以形成薄膜。在另一實施方式中，然后用聚合物旋涂所述基底以在曝光以產 生圖案之前產生正性光刻膠。在一個實施方式中，在曝光之后，使用溶劑混合物顯影圖案， 隨后進行多層電子束蒸發(fā)和標準的剝離過程。在一個實施方式中，如實施例1所述制備NPR。在另一實施方式中，如以下所述制 備 NPR K. H. Su,Q. H. Wei 禾口 X. Zhang, “ Tunable and augmented ρlasmon resonances of Au/Si02/Au nanodisks" ，Appl. Phys. Lett. 88，063118，2006 ；以及 Kai—Hung Su, Stephane Durant, Jennifer M. Steele, Yi Xiong, Cheng Sun 禾口 Xiang Zhang, Raman Enhancement Factor of a Single Tunable Nanoplasmonic Resonator, Journal of Physical Chemistry B, 110 (9)，3964 (2006)，這兩者的全部內容引入本文作為參考。在優(yōu)選的實施方式中，所述納米等離子體激元共振器由層疊或堆疊有交替屏蔽層 的納米盤組成。例如，可在兩個金納米盤之間夾入SiO2屏蔽層制備NPR。在另一實施方式 中，其間夾有SiO2屏蔽層的兩個金納米盤在一端用另一 SiO2屏蔽層覆蓋，從而產生SiO2/ Au/Si02/Au納米等離子體激元共振器。在一個實施方式中，在圖案化基底上蒸發(fā)納米級層以形成NPR的納米盤層。在優(yōu) 選的實施方式中，各納米盤在其最寬點處為50 500nm。所述納米盤可由金屬薄層、半導體 材料、金屬多層、金屬氧化物、合金、聚合物、或碳納米材料組成。在一些實施方式中，納米月 牙狀物(nanocrescent)包括選自 Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、 V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo 的金屬、及其氧化物、和 /或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或燒結基質。屏蔽層材料可為具有恒定拉曼光譜的任意材料。所述屏蔽層起到NPR的等離子體 激元共振頻率的調節(jié)參數(shù)的作用。與單層金屬納米盤相比，多層納米盤呈現(xiàn)出若干獨特的 性質，包括顯著增強的等離子體激元共振和可調的共振波長，所述共振波長可通過簡單地 改變電介質層厚度而修整到所需值同時保持顆粒直徑恒定。數(shù)值計算表明將一個金屬層分 為金屬多層導致較高的散射強度和更多的“熱點”或者強場增強區(qū)域。圖6顯示具有各個 金屬層的納米盤的顏色模擬散射光譜。因此，在另一實施方式中，NPR中各納米盤層可具有相同或不同的厚度。通過選擇 不同的層厚度，可以調節(jié)等離子體激元共振波長和表面增強因子以匹配各種應用。例如，在 實施例1中，短軸150nm和長軸200nm的NPR由厚度分別為25nm和5nm的銀和SiO2層的多 重疊層制成。而且，通過選擇性地屏蔽金屬結構的外表面，可通過將分子集合體(assembly) 導向呈現(xiàn)出強電磁場的位置來進一步增強效率。因此，在另一實施方式中，所述外層為包括 具有恒定拉曼光譜的材料的屏蔽層。圖IA顯示優(yōu)選納米等離子體激元共振器(NPR)的示 意圖和透射電子顯微照片。在一個實施方式中，所述生物分子是包括可通過蛋白酶特異性切割的特異性序列 的肽，其與拉曼活性標記物連接?，F(xiàn)有技術中已知各種拉曼標記(例如，美國專利No. 5，306，403 ;6，002，471 ；6，174，677，其引入本文作為參考)并且可使用任意這種已知的拉曼標記。所述標記典型地 具有特有的(例如，獨特的)和高度可見/可檢測的光學標志。合適的拉曼標記包括，但 不限于，熒光團、生色團、量子點、熒光微球、生物素等。在一些實施方式中，所述拉曼標記 包括若丹明、熒光素、或外源化學分子。在一些實施方式中，所述拉曼標記包括作為拉曼標 記物的部分。標記物分子的非限制性實例包括TRIT (四甲基若丹明異硫醇)、NBC(7-硝基 苯-2-氧雜-1，3- 二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固 紫、甲酚藍紫、燦爛甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、生物素、異羥洋地黃毒苷、5-羧基-4'， 5' -二氯-2'，7' -二甲氧基熒光素、5-羧基-2'，4'，5'，7'四氯熒光素、5-羧基熒 光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-10羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-若丹明、偶氮 甲堿、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、氨吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(el)、溴(Br)、甲 基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、Te、和含有這些部分的化合物。在一些實施方式中，碳 納米管、量子點(參見，例如 Evident Technologies, Troy N. Y. ；Invitrogen/Molecular Probes，15等)或者微球(例如熒光微球(參見，例如來自InvitrogenIMolecular Probes 的Transfluosphres )可用作拉曼標記物。在各種實施方式中，一種或多種拉曼標記(拉曼標記物)可以與附著到NPR的生 物分子(例如，多肽)連接。這種拉曼標記物的存在可以增強通過切割肽產生的拉曼信號 的變化。因此，在一個實施方式中，這種拉曼標記的生物分子結合的納米等離子體激元 共振器意圖用作特異性篩選工具以提供關于生物樣品中酶和其它癌生物標記例如前列 腺-特異性抗原(PSA)的存在、濃度和酶活性的信息。在一些實施方式中，所述生物分子是 肽。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換地用于指氨基酸殘基的聚合物。所述 術語應用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應天然存在的氨基酸的人工化學模擬物的氨 基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在一些實施方 式中，多個肽與納米月牙的表面結合，各自相同或不同。在各種實施方式中，約5 500，更 優(yōu)選約10 約400，還更優(yōu)選約20、30或40 約200、250或300，和最優(yōu)選約50 約150 個底物分子(例如肽)與納米月牙狀物連接。在一個實施方式中，約100個肽以Au與肽上 的硫醇基團之間的直接反應15結合至納米月牙狀物。其活性受到監(jiān)測的酶可以包括，但不限于，酶、蛋白酶、激酶、肽酶或其它生物分 子。在各種實施方式中，所述生物分子是被待檢測的相應酶特異性識別和修飾或切割的肽。 在另一實施方式中，所述生物分子是被待檢測的激酶特異性識別和磷酸化的肽。各種類型 的蛋白酶和通過這些蛋白酶特異性識別的肽也描述于名為“Detection of Protease and Protease Activity Using a Single Nanoscrescent SERS Probe，，的共審未決國際申請 No. PCT/US2007/010722中。使用納米月牙探針用于蛋白酶或其它生物分子的SERS檢測的 相關方法也描述于PCT/US2007/010722中，其全部內容引入本文作為參考。在優(yōu)選的實施方式中，所述生物分子是肽，其中所述肽是長度約10 12個氨基酸 殘基的寡肽。然而，所述肽可短至4個氨基酸殘基，和長至100個氨基酸。在一個實施方式 中，所述肽應為被相應酶特異性識別和修飾的序列。所述肽可合成和商業(yè)上得到，或者所述 肽可以根據(jù)實施例1中所述方法制備。拉曼活性分子例如生物素或若丹明6G(R19)(圖1B) 優(yōu)選通過短的聚乙二醇或氨基戊酸連接物接枝在所述肽的氨基末端。
10
所述生物分子可直接地或者經由一個或多個連接劑“結合”(即連接)到所述納米 等離子體激元共振器。本文中使用的“連接劑”是指在WR和生物分子之間形成鍵且包括例 如官能團、親和劑、或穩(wěn)定化基團的任意化合物。合適的鍵包括離子相互作用，共價化學鍵， 物理力例如范德華或疏水相互作用，包封作用，包埋，結合親和力，吸引或認可，和各種類型 的一級、二級、三級連接，所述連接包括，但不限于，肽、醚、酯、丙烯?；?acryl)、醛、酮、丙 烯?；?acryloyl)、硫醇、羧基、羥基、巰基和胺連接等。在一個實施方式中，數(shù)百種肽通過NPR的金屬納米盤與所述肽上的硫醇基之間的 直接反應與所述WR結合。在另一實施方式中，WR金屬表面還可使用胺或羧基改性，從而 所述肽可以通過肽鍵經由與異雙官能交聯(lián)劑的反應束縛到WR表面上，其中所述異雙官能 交聯(lián)劑可與胺基和硫醇基兩者反應，或者與羧基和硫醇基兩者反應。在具體實施方式
中， Au/Si02/Au/Si02Nra可以使用胺或羧基官能團官能化，和所述肽可經由交聯(lián)劑與胺和羧基 官能團交聯(lián)。各種交聯(lián)劑可用于硫醇活化的肽和WR上表面官能團例如胺、羧基和羥基的
纟口口。在一個優(yōu)選的實施方式中，依靠Au-硫醇反應以形成共價鍵，使用在肽羧基末端 的半胱氨酸基團以將所述肽連接到Au表面將底物肽束縛到Au/Si02/Au WR的表面上。在 優(yōu)選的實施方式中，類似地將多個肽結合到NPR的表面，各自相同或不同。本文中所述的WR指示物可利用包括用于需要檢測的任意蛋白酶的一個或多個 識別位點的多肽序列。蛋白酶(蛋白水解活性)不僅對于維持正常的細胞功能是需要的， 而且對于各種人類疾病的發(fā)病也是重要的。寄生蟲感染(例如血吸蟲病和瘧疾)、真菌感染 (例如白念珠菌(C. albicans))和病毒感染(例如HIV、皰疹和肝炎)以及癌癥、炎癥疾病、 呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病和包括阿爾茨海默病的神經變性疾病需要蛋白水解活性用于進 展。因此蛋白酶存在、量或活性的檢測作為用于疾病的存在或可能性的診斷/預示標志是 有用的。另外，蛋白酶活性(或者其抑制)的檢測在篩選用于治療許多病狀的蛋白酶抑制 劑療法中是有用的。可根據(jù)本發(fā)明檢測和/或定量的“蛋白酶”是典型地使位于多肽鏈中一對氨基 20酸之間的肽鍵水解的酶，也稱作內切蛋白酶。典型地參考酶催化中心的親核物質來限 定蛋白酶。最通常的親核物質來自絲氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸的側鏈，產生蛋白酶家 族例如絲氨酸蛋白酶(Paetzel等(1997)Trends Biochem. Sci. 22 :28_31)、天冬氨酰蛋 白酶(Spinelli 等(1991)Biochemie 73:1391-25 1396)、和半胱氨酸蛋白酶(Altschuh 等(1994)Prot.Eng.7 :769-75，1994)。金屬蛋白酶通常在催化位點含有鋅催化金屬離子 (Klimpel 等(1994)Mol. Microbiol. 13 :1093_1100)?！暗鞍酌缸R別位點”是通過肽鍵連接的鄰接氨基酸序列，其含有一對通過由特定 蛋白酶水解的肽鍵連接的氨基酸。任選地，蛋白酶識別位點可包括在待水解肽鍵任一側 的一個或多個氨基酸，其也結合有所述蛋白酶的催化位點(Schecter and Berger，(1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 157-62)，或者蛋白質底物上的識別位點和切割位點可 為通過一個或多個(例如2 4個)氨基酸分離的兩個不同位點。蛋白酶識別位點中的氨基酸的特異性序列典型地取決于蛋白酶的催化機理，其通 過蛋白酶活性位點處的官能團性質所限定。例如，胰蛋白酶水解其羰基官能由賴氨酸或精 氨酸殘基貢獻的肽鍵，而不管多肽鏈的長度或氨基酸序列。然而，因子Xa識別特異性序列
11Ile-Glu-Gly-Arg并且水解在Arg的C末端側上的肽鍵。各種優(yōu)選的蛋白酶識別位點包括， 但不限于，對于來自絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶識別位點，或者對于金屬蛋白酶 的蛋白酶識別位點，或者對于來自半胱氨酸蛋白酶家族、和/或天冬氨酸蛋白酶家族、和/ 或谷氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶識別位點。在一些實施方式中，優(yōu)選的絲氨酸蛋白 酶識別位點包括，但不限于，對于類似糜蛋白酶的蛋白酶、和/或類似枯草桿菌蛋白酶的蛋 白酶、和/或α/β水解酶、和/或信號肽酶的識別位點。在一些實施方式中，優(yōu)選的金屬 蛋白酶識別位點包括，但不限于，對于金屬羧基肽酶或金屬內肽酶的識別位點。說明性的蛋 白酶和蛋白酶識別位點如下表1所示。表1.說明性的蛋白酶和蛋白酶識別位點C表示水解的肽鍵)
蛋白酶家族蛋白酶蛋白酶識別位點絲氨酸因子XaIle-Gly-Gly-Arg*絲氨酸胰蛋白酶Lys*, Arg*絲氨酸糜蛋白酶高 PH 下的 Tyr*，Phe*，Leu lie*，Val% Trp"和 His*絲氨酸凝血酶Arg*絲氨酸PSA絲氨酸和半胱 氨酸變型花生斑駁病毒(polyvirus) Nla蛋白酶Glul-Xaa-Xaa-Tyr-Gln*(Ser/Gly)半胱氨酸木瓜蛋白酶(papaine)Arg*，Lys*, Phe*半胱氨酸菠蘿蛋白酶(bromelaine)Lys ，Ala ， Iyr ，Crly半胱氨酸組織蛋白酶BArg*Arg Phe*Arg半胱氨酸組織蛋白酶LPhe*Arg天冬氨酰HIV蛋白酶Phe*Pro天冬氨酰釀酒酵母(S :cerevisiae) yapsin 2Lys*, Arg*天冬氨酰組織蛋白酶DPhe*Phe Phe*Lys Leu*Phe Leu*Tyr金屬-嗜熱菌蛋白酶*Tyr，*Phe，*Leu，*Ile，*Val， Trp，和'His金屬-肽基-Lys 金屬內肽酶Xaa^Lys金屬-肽基-Asp 金屬內肽酶Xaa*Asp Xaa^Glu Xaa^Cys金屬-coccolysin*Leu，*Phe，*Tyr，*Ala金屬-自溶素Leu-Trp-Met^Arg-Phe-Ala金屬-明膠酶A(MMP-2)Pro-Gln-Gly'lle-Ala-Gly-Gln金屬-人類中性粒細胞膠原酶 (MMP-8)Gly-Leu-Ser-Ser-Asn-Pro^Ile-Gln -Pro在檢測PSA的具體實施方式
中，肽設計將按照具有絲氨酸殘基的PSA-特異性 肽的活性位點和可通過PSA識別的側翼序列的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方式中，所 述肽含有已經對蛋白水解活性PSA具有非常高的特異性的HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO 1)序列(參見 Denmeade, S. R.等 Specific and efficient peptide substrates for assaying the proteolytic activity of prostate-specific antigen. Cancer Res 57, 4924-4930(1997))。已經顯示，在小鼠模型中，HSSKLQ-L被PSA而不是被任意其它蛋白酶 在體內切割。因此，在另一實施方式中，可產生多個肽，各自具有隨機或已知序列部分，只要 各自結合有高度特異性序列HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO :1)。PSA消化位點在肽HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO 1)中谷氨酰胺(Q)和亮氨酸(L)殘 基之間，并且所述肽被消化成兩個片段HSSKLQ和LkkkC0在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述 肽優(yōu)選如圖IB所示束縛到NPR表面，使得沒有使PSA肽和PSA酶空間阻礙且從而PSA肽是 最佳可達到的，并且拉曼標記物R19在組氨酸處與所述肽連接。預計在Cys (C)殘基之后在 肽序列HSSKLQ-LAAAC (SEQ ID NO 1)和NPR之間合成的額外的間隔物，將改善表面上PSA 底物肽HSSKLQ的呈現(xiàn)并從而提高檢測靈敏度。雖然這樣做，拉曼標記物分子與NPR表面的 距離可更遠和導致較低的拉曼強度水平，因為線圈狀短肽結構意味著遠端拉曼標記物分子與NPR金屬表面接觸的機會大。在優(yōu)選的實施方式中，所述間隔物是填充分子例如辛烷硫 醇(HS-(CH2)2-CH3)并且用于減少WR表面上報告肽的填充密度，因此容許所述酶達到所述 報告肽。本方法可用于檢測其它水解生物分子的存在。因此，例如肽蛋白酶底物可用單鏈 或雙鏈核酸(RNA或DNA)取代，并且指示劑可檢測和/或定量活性核酸酶的存在。在這種 情況下，核酸底物典型地包括對于核酸酶(例如限制性內切核酸酶)的1個或30更多個識 別位點。核酸酶識別位點的長度典型地為約3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或IObp至約 15bp、20bp、25bp或30bp。在各種實施方式中，核酸的長度范圍可為約3bp至約200bp，優(yōu)選 約 4bp 至約 IOObp，更優(yōu)選約 6、8、10、16 或 20bp 至約 80、60、40 或 30bp。在另一實施方式中，基本上可通過激酶磷酸化的任意分子可用作本文所述方法和 組合物中的激酶底物。雖然蛋白質/肽包括最大的激酶底物類型，但是也已知許多其它的 激酶底物。這種底物包括，但不限于，各種糖(例如己糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等)、核苷酸 /核酸、醋酸鹽、丁酸鹽、脂肪酸、二氫鞘氨醇、甘油二酯、神經酰胺等。說明性的蛋白質激酶 底物和序列如序列表和表3所述。表3.說明性的蛋白質激酶底物
權利要求
納米等離子體激元共振器(NPR)，包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤，具有結合或束縛到所述納米等離子體激元共振器的表面的被標記的生物分子。
2.權利要求1的共振器，其中所述標記物是用于表面增強拉曼散射(SERS)檢測的拉曼 活性標記物。
3.權利要求1的共振器，其中所述標記物是熒光或其它能檢測的標記物。
4.權利要求1的共振器，其中所述納米盤包括金屬薄層、半導體材料、金屬多層、金屬 氧化物、合金、聚合物、或碳納米材料。
5.權利要求4的共振器，其中所述納米盤由金屬組成。
6.權利要求1的共振器，其中所述屏蔽層包括具有恒定拉曼光譜的材料。
7.權利要求6的共振器，其中所述屏蔽層選自二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、和右旋 糖酐。
8.權利要求1的共振器，其中所述生物分子是與拉曼活性標記物連接的肽，其中所述 肽包括可被酶特異性修飾或者切割的特異性序列。
9.權利要求1的共振器，其中所述生物分子是肽R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQID NO :1)。
10.納米等離子體激元共振SERS檢測平臺，包括特征在于單獨的或陣列形式的表面增 強拉曼散射(SERS)納米等離子體激元共振器(NPR)的圖案化基底，其中所述納米等離子體 激元共振器具有與其結合的生物分子。
11.權利要求10的平臺，其中其上圖案化所述納米等離子體激元共振器的基底可由石 英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光譜的任意其它材料組成。
12.權利要求10的平臺，其中所述納米等離子體激元共振器包括具有交替屏蔽層的金 屬納米盤，具有結合或束縛到所述納米等離子體激元共振器的表面的被標記的生物分子， 其中所述標記物是用于SERS檢測的拉曼活性標記物。
13.權利要求12的平臺，其中所述納米盤包括金或銀的薄層。
14.權利要求12的平臺，其中所述屏蔽層包括二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、或右旋 糖酐。
15.權利要求10的平臺，其中所述生物分子是與拉曼活性標記物連接的肽，其中所述 肽包括可被酶特異性修飾或者切割的特異性序列。
16.權利要求10的平臺，其中所述陣列形式的納米等離子體激元共振器是相同或不同的。
17.權利要求15的方法，其中生物分子庫與所述納米等離子體激元共振器結合并且以 無規(guī)陣列或有序的微陣列形式空間分離。
18.
19.
20.用于使用納米傳感器以至少皮摩爾靈敏度體外檢測和測量酶活性的方法，所述納 米傳感器包括納米等離子體激元共振器(NPR)，其中所述NPR增強在表面增強拉曼光譜學 (SERS)中的拉曼光譜強度并且使得能夠以非常小的量靈敏地單步檢測酶活性。
21.用于酶活性的實時反應監(jiān)測的方法，包括(a)提供在基底上圖案化的肽結合的納米等離子體激元共振器陣列，其中各納米等離 子體激元共振器(NPR)包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤并且具有結合或束縛到所述納 米等離子體激元共振器的表面的被標記的生物分子，其中所述標記物是拉曼標記物分子，各自相同或不同，和其中各個肽包括通過特異性酶使用特異性反應識別和修飾的序列； (b)提供懷疑含有酶的生物樣品；(C)使所述樣品與所述納米等離子體激元共振器陣列接觸；(d)使所述反應進行；(e)通過SERS檢測測量所述酶的檢測。
22.權利要求21的方法，其中生物分子庫可與所述納米等離子體激元共振器結合并且 以無規(guī)陣列或有序的微陣列形式空間分離。
23.權利要求22的方法，其中所述生物分子_納米等離子體激元共振器的陣列可用于 同時檢測多種酶的活性。
全文摘要
酶活性測量在藥物篩選、診斷和疾病分期、及分子表達譜中具有廣泛的應用。然而，常規(guī)的免疫肽分析(IMPA)顯示出低的熒光信噪比，妨礙在臨床上重要的pM～nM范圍內較低濃度下的可靠測量。這里，我們證明了使用納米等離子體激元共振器(NPR)的蛋白酶活性的高靈敏度測量。NPR以高度重現(xiàn)性的方式將拉曼信號增強至6.1×1010倍，使得能夠在6pM(0.2ng/ml)的靈敏度下以3個數(shù)量級的動態(tài)范圍實時地進行蛋白酶和酶活性如前列腺特異性抗原(paPSA)的快速檢測。對來自paPSA-陽性細胞的細胞外液(ECF)的實驗證明了在復雜的生物流體背景中的特異性檢測。這種方法提供了以非常小的樣品量檢測蛋白酶活性的快速、靈敏、精確且單步的手段。
文檔編號G01J3/44GK101952697SQ200880123805
公開日2011年1月19日 申請日期2008年11月3日 優(yōu)先權日2007年11月2日
發(fā)明者喬納森·A·埃爾曼, 張祥, 陳帆青 申請人:加利福尼亞大學董事會