專利名稱：用于早期妊娠診斷的組合物和方法
用于早期妊娠診斷的組合物和方法相關(guān)申請的交叉參考本申請要求享有美國臨時申請61/013，603(2007年12月13日提交)的優(yōu)先權(quán)， 該美國臨時申請的完整公開內(nèi)容通過參考引入本文。
背景技術(shù)：
I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的涉及獸醫(yī)、生殖生物學和診斷學領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及用于檢 測早期妊娠的方法和組合物。II.相關(guān)技術(shù)妊娠診斷允許乳品和牛肉工業(yè)進行有效的繁殖管理。通常，人工授精的成功率不 到50%，生產(chǎn)者必須依賴于恢復到發(fā)情期的明顯跡象(容易忽略)或推遲再繁殖直到通過 上述方法之一證實妊娠失敗。這樣的推遲具有極高的代價，并且構(gòu)成了工業(yè)的主要經(jīng)常損失。長期以來一直在尋找可以早期進行并且具有低假陽性的用于牛的準確的妊娠 試驗?？梢圆捎脦追N妊娠試驗，包括牛奶孕酮分析(Oltenacu等人，1990 ;Markusfeld 等人，1990)、雌酮硫酸酯分析(Holdsworth等人，1982 ；Warnick等人，1995)、直腸觸診 (Hatzidakis 等人，1993)、超聲(Beal 等人，1992 ；Cameron 和 Malmo，1993)和妊娠特異性抗 原的血液檢驗。這些方法中的每一種在實際的現(xiàn)場使用方面都達不到預期。例如，第18-22天 前后對牛奶或血清孕酮的檢測產(chǎn)生高得不可接受的假陽性率(Oltenacu等人，1990; Markusfeld等人，1990)。直腸觸診可以用來早在第35天檢測妊娠，但是該方法可導致 5-10%或更高的胚胎死亡率(Oltenacu等人，1990 ;Hatzidakis等人，1993)。第50天的 直腸觸診對胚胎有較小的傷害，但是由于太晚而只有極小的經(jīng)濟價值(Oltenacu等人， 1990)。超聲波檢查相對于直腸觸診在準確性方面具有優(yōu)點，特別是在第45天之前(Beal 等人，1992 ；Cameron和Malmo, 1993)，但是設(shè)備昂貴，其應(yīng)用需要大量的培訓，并且對動 物有有限的風險。一種相關(guān)的方法，多普勒超聲波檢查，比直腸觸診更準確(Cameron和 Malmo, 1993)，但是仍然需要訓練良好的人員。尿或血清中雌酮硫酸酯的存在提供了另外一 種檢驗，但是只在第100天后隨著濃度升高才有用(Holdsworth等人，1982 ；ffarnick等人， 1995)。妊娠特異性蛋白B(PSP-B)的發(fā)現(xiàn)(Butler等人，1982)提供了一種新的妊娠診斷 方法，因為它可以在妊娠第4周的懷孕母牛的血液中檢測到(Sasser等人，1986 ；Humblot 等人，1988)。其他人開發(fā)了基于相同或免疫學相似抗原的免疫測定(Zoli等人，1992a; Mialon等人，1993 ；Mialon等人，1994)。在一種情況中，抗原(Mr 67kDa)被稱為牛妊娠相 關(guān)糖蛋白(boPAG ；現(xiàn)在稱為boPAG-1) (Zoli等人，1992a)；在第二種情況中，它被稱為妊娠 血清蛋白 60(PSP60) (Mialon 等人，1993 ；Mialon 等人，1994)。對于 PSP_B/boPAGl/PSP60 的 免疫測定具有某些缺點。首先，妊娠第4周的陽性診斷仍然有一些不確定性，因為血液中的 抗原濃度低而且有些不穩(wěn)定。第二，boPAGl濃度到期顯著升高(Sasser等人，1986 ；Zoli等人，1992a ；Mialon等人，1993)，并且由于該分子的循環(huán)半衰期較長(Kiracofe等人，1993)， 在產(chǎn)后80-100天仍然可以檢測到該抗原(Zoli等人，1992a ；Mialon等人，1993 ；Mialon等 人，1994 ；Kiracofe等人，1993)，這影響了產(chǎn)后早期配種的母牛的妊娠診斷。因此，只有在 產(chǎn)后70天或之后進行人工授精(“AI”)時，才可以在第30天對奶牛進行該試驗。妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG)在結(jié)構(gòu)上與胃蛋白酶相關(guān)。它們被認為限于有蹄類哺乳動 物，并且其特征為在胎盤的外上皮細胞層(絨毛膜/滋養(yǎng)外胚層)特異性表達(Green等 人，2000 ；Hughes等人，2003 ；Xie等人，1997)。至少有些PAG沒有作為蛋白酶的催化活性， 盡管每一種似乎都具有能夠結(jié)合肽的裂隙(Guruprasad等人，1996)。據(jù)估計，牛、綿羊和大 多數(shù)、可能所有偶蹄目(Artiodactyla)反芻動物具有幾十個PAG基因。PAG在序列上有高 度多樣性，超變區(qū)主要限于表面暴露的環(huán)。在發(fā)展用于家畜的妊娠試驗的嘗試中發(fā)現(xiàn)了牛妊娠相關(guān)糖蛋白(boPAGs/PSPB/ PSP60) (Butler 等人，1982 ；Sasser 等人，1986 ；Zoli 等人，1991 ；Zoli 等人，1992a)。在每 次嘗試中，給兔注射胎盤絨毛葉提取物，通過用來自未孕動物的組織提取物吸附除去不針 對胎盤抗原的抗體。得到的抗血清為早至授精后一個月對牛和綿羊的準確妊娠試驗提供了 ■石出。甚至在最初的研究中(Butler等人，1982 ；Zoli等人，1991 ；Xie等人，1991 ；Xie 等人，1994 ；Xie等人，1996)，清楚知道boPAG在分子量和電荷方面是不均勻的，并且由于 已經(jīng)純化了許多同工型，證明它們的氨基末端序列不同(Atkinson等人，1993 ；Xie等人， 1997a)。進一步的文庫篩查顯示在反芻動物中有額外的轉(zhuǎn)錄物(Xie等人，1994 ；Xie等人， 1995 ；Xie等人，1997b)并且在非反芻動物如豬中存在PAG (Szafranska等人，1995)。PAG樣 蛋白(也稱為“胃蛋白酶原F”或“胃蛋白酶F”)在馬和貓中已有描述(Green等人，1999 ； Guruprasad 等人，1996)。已經(jīng)描述的牛 PAG 包括 boPAG2、boPAG4、boPAG5、boPAG6、boPAG7、 boPAG9、boPAG7v、boPAG9v、boPAG15、boPAG16、boPAG17、boPAG18、boPAG19、boPAG20 和 boPAG21 (美國專利6，869，770)。關(guān)于通過測定這些PAG診斷早孕的方法的信息可見，例如， 美國專利6，869，770和美國專利申請公布No. 20050100975。在配種后第30天之前，大多數(shù)可以采用的檢測牛懷孕的試驗具有較低的準確性。 此外，許多已有的試驗需要熟練的技術(shù)人員。因此，需要能夠在配種后第30天之前快速、容 易地進行的準確、靈敏的牛妊娠試驗。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明一方面提供靈敏和準確的早孕檢測。在一個實施方案中，本發(fā)明提供 早孕檢測，其中包括PAG高度特異性結(jié)構(gòu)域的特異性多肽可以在妊娠第四周末期之前以高 度的靈敏性和特異性檢測到。在這樣的早期階段診斷懷孕的能力在乳品工業(yè)特別有用，其 中動物通常至少在一天的一部分時間被限制，并且實施集中管理。此外，本發(fā)明的實施方案 將在其它動物的繁殖計劃中得到應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供檢測動物懷孕的方法，包括(a)從動物獲得樣品；(b)使該 樣品接觸抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包括2D9抗體或其片段或變體；和(c)檢 測該抗體或抗體片段與樣品中至少一種妊娠相關(guān)抗原(PAG)的接觸，其中檢測到PAG表明 該動物已懷孕。在一個實施方案中，使用的抗體包含與SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或與SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述動物 是反芻(Ruminantia)亞目的成員。在具體的實施方案中，反芻類動物是牛科(Bovidae)的 成員。在其它實施方案中，所述動物是山羊、綿羊、奇蹄目(Perissodactyla)的成員、馬、犀 牛、犬、貓、人或大熊貓。產(chǎn)生2D9的雜交瘤細胞系于2007年8月2日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心專 禾llf呆藏部 1、二 (Patent Depository of the American Type Culture Collection(ATCC), Manassas, Va.，20110-2209)，專利保藏號為 PTA-8566 (識別號為 M0N-PAG-2D9)。該保藏在 國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約的條款下進行。進行該保藏只是便于本 領(lǐng)域技術(shù)人員，而不是承認根據(jù)35U. S.C. §112需要保藏。在特定實施方案中，結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :1有98%或更高的序列同一性，包括與 SEQ ID NO :1的99%或更高的序列同一性。在進一步的實施方案中，結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO :1。在一些實施方案中，結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :2有92%或更高的序列同一性，包括與 SEQ ID NO :2的至少93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%或更高的序列同一性。在一 些特定實施方案中，結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID N0:2。在一些實施方案中，抗體或抗體片段進一步被定義為包含至少一個輕鏈和至少一 個重鏈的抗體。在具體實施方案中，輕鏈可以與SEQID N0 :1有大于97%的序列同一性。在 進一步的實施方案中，重鏈與SEQ ID NO :2有大于95%的序列同一性。在更特別的實施方 案中，重鏈與SEQ ID NO :2有大于98%的序列同一性。在其它實施方案中，重鏈包括SEQ ID NO :2。在一些另外的特定實施方案中，抗體包含含有SEQ ID NO 3的輕鏈和含有SEQ ID NO 4的重鏈。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。在一個實施方案中，抗體是單克隆抗體 2D9。檢測的PAG 可以是任何 PAG，如 boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG16、boPAG17、 boPAG19、boPAG20 和 boPAG21。在一個實施方案中，PAG 是 boPAG6。在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測牛動物懷孕的方法，包括(a)從 動物獲得樣品；(b)使該樣品接觸2D9單克隆抗體；和(c)檢測該抗體與樣品中boPAG4、 boPAG6、boPAG9、boPAG16、boPAG17、boPAG19、boPAG20 或 boPAG21 中的一種或多種的接觸， 其中檢測到一種或多種PAG表明該動物已懷孕。用于檢測懷孕的方法，例如，可以在人工授 精后的第 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 天或更多天后進行。樣品可以是已知或懷疑含有PAG的任何樣品。在具體的實施方案中，樣品是唾液、 血清、血漿、血液、乳液或尿液。任何有效量的樣品可以從動物獲得。例如，所述量可以是 大約 5ii lUOu l、15ii l、20ii l、25ii l、30ii l、40ii l、50ii l、60ii l、70ii l、80ii l、90ii 1、 100 u l、150ii l、200ii l、250ii l、300ii l、350ii l、400ii l>450u l、500ii l、550ii l、600ii 1、 700 u l、800ii l、900ii l、lml、l. 5ml、2. 0ml>2. 5ml、3. 0ml>3. 5ml、4. 0ml、4. 5ml,5. 0ml 或更
^^ o本發(fā)明的方法涉及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何檢測抗體或抗體片段與PAG 接觸的方法。例如，所述方法可以包括ELISA或Western印跡法。在具體實施方案中，待檢
6測的 PAG 是 boPAG2、boPAG4、boPAG5、boPAG6、boPAG7、boPAG9、boPAG7v、boPAG9v、boPAG15、 boPAG16、boPAG17、boPAG18、boPAG19、boPAG20 或 boPAG21。在具體的實施方案中，PAG 是 boPAG6。在本發(fā)明方法的某些實施方案中，檢測每個樣品中一種以上的PAG。當應(yīng)用于牛 以外的物種時，本發(fā)明將允許檢測在滋養(yǎng)層(胎盤前)開始附著到或植入母親子宮壁時產(chǎn) 生的其它PAG。這些物種中的“早期”PAG可以與在檢測牛早孕中有用的PAG免疫學交叉反 應(yīng)。在具體實施方案中，ELISA是夾心ELISA，包括PAG與固定到基底上的抗體或抗體 片段和酶標記的第二抗體制品的結(jié)合。例如，固定抗體或抗體片段的基底可以是管、孔、小 瓶、試紙(strip)、試條(dipstick)或生物傳感器。例如，酶可以是堿性磷酸酶或辣根過氧 化物酶或任何酶標記。本發(fā)明通常也涉及由一種結(jié)構(gòu)域編碼的分離的和純化的多肽，該結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或與SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性。在具體實施 方案中，該結(jié)構(gòu)域包含與SEQID NO :1的大于98%的序列同一性。在更特定的實施方案中， 該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :1?？赡苡幸粋€或多個額外的氨基酸殘基連接到該結(jié)構(gòu)域的N-末 端或C-末端。在一個具體實施方案中，多肽是SEQ IDN0:1。在一些實施方案中，該結(jié)構(gòu)域 包含與SEQ ID NO :2的大于95%的序列同一性。在更特定的實施方案中，該結(jié)構(gòu)域包含與 SEQ IDN0:2的大于98%的序列同一性。在進一步特定的實施方案中，該多肽是SEQ ID NO: 2。在其它實施方案中，該多肽包含SEQ ID N0:3。在進一步的實施方案中，該多肽包含SEQ ID NO :4。本發(fā)明也包括編碼一種多肽的分離的和純化的多核苷酸，該多肽具有與SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或者與SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的結(jié)構(gòu)域。 在一些實施方案中，該多核苷酸編碼與SEQ ID NO :1有大于98%的序列同一性的多肽。在 具體實施方案中，該多核苷酸編碼SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，該多核苷酸編碼一種 多肽，該多肽包含與SEQ ID NO :2有大于95%的序列同一性的結(jié)構(gòu)域。在更特定的實施方 案中，該多核苷酸編碼一種多肽，該多肽具有與SEQ ID NO :2有大于98%的序列同一性的 結(jié)構(gòu)域。在更特定的實施方案中，該多核苷酸編碼一種多肽，該多肽包含SEQ ID N0:2。在 一些實施方案中，該多核苷酸包含與SEQ ID NO :5有大于98%的同一性或與SEQ ID NO 6 有大于95%的同一性的核酸序列。在一些具體實施方案中，該多核苷酸是SEQ ID N0:5，在 進一步特定的實施方案中，該多核苷酸是SEQ ID N0:6。本發(fā)明通常也涉及通常也涉及分泌單克隆抗體2D9的雜交瘤細胞。本發(fā)明也涉及用于檢測動物中是否存在PAG的試劑盒，其中該試劑盒包括抗體或 抗體片段。在一些實施方案中，抗體或抗體片段包含含有SEQ ID NO :3的輕鏈。在進一步 的實施方案中，抗體或抗體片段包含含有SEQ ID NO :4的重鏈。在一個實施方案中，抗體或 抗體片段附著到支持體上。例如，所述支持體可以是聚苯乙烯板、試管、試紙、試條或生物傳 感器。在一些實施方案中，試劑盒進一步包括可檢測標記。例如，可檢測標記可以是連接 到抗體或抗體片段上的熒光標記。在其它實施方案中，可檢測標記是化學發(fā)光標記。在進 一步的實施方案中，可檢測標記是酶，如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。試劑盒還可以包括 酶底物。在進一步的實施方案中，試劑盒包括緩沖液或稀釋劑。試劑盒也可以任選地包括一次性移液管。其它試劑盒組分，包括試劑容器、說明書等，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且 預期也可用于此處所述的試劑盒中。本發(fā)明通常也涉及檢測動物懷孕的方法，包括(a)從動物獲得樣品；(b)使該樣 品接觸本發(fā)明提供的抗體或抗體片段；和(c)通過與該抗體或抗體片段接觸檢測樣品中的 PAG，其中檢測到 boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG16、boPAG17、boPAG19、boPAG20 或 boPAG21 中的一種或多種，包括它們所有可能的組合，表明該動物已懷孕。通過以下詳細說明，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點將是清楚的。但是應(yīng)當理解， 雖然詳細說明和具體實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是只是說明性的，因為基于 此詳細說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會明白本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種變化和修改。


以下附圖構(gòu)成了本發(fā)明說明書的一部分，并且用于進一步說明本發(fā)明的某些方 面。參考這些附圖中的一張或多張，結(jié)合此處所述的具體實施方案的詳細說明，可以更好地 理解本發(fā)明。圖1. 2D9輕鏈的核酸序列(SEQ ID NO 5)。加工形式的起始密碼子(N_末端氨基 酸)和終止密碼子以粗體示出。圖2. 2D9重鏈的核酸序列(SEQ ID NO 6)。加工形式的起始密碼子(N_末端氨基 酸)和終止密碼子以粗體示出。圖3A、3B.圖3A_boPAG6的肽序列(上圖)和通過LC_MS_MS分析確定的肽序列 (下圖)(SEQ ID NO 7-18)表明，在富含PAG的制品免疫沉淀后從2D9-包被的磁珠上洗脫 的PAG主要對應(yīng)于boPAG6。為了確定所有結(jié)合2D9的成分，對富含PAG的制品進行了免疫 親和色譜純化。對免疫親和柱純化的材料進行LC-MS-MS分析。該分析顯示，boPAG6是主要 的結(jié)合 2D9 的 PAG，boPAG-4、boPAG-9、boPAG-20 和 boPAG21 是次要的結(jié)合 2D9 的 PAG。圖 3B-從第55天牛胎盤制備的組織提取物經(jīng)2D9免疫親和色譜純化的PAG的變性凝膠電泳 (SDS-PAGE)和Western印跡分析。考馬斯染色的凝膠和使用PAG多克隆抗體的Western印 跡分析都顯示位于67kD、55kD和50kD處的三條蛋白質(zhì)條帶是結(jié)合2D9的PAG?！癕z” =質(zhì) 荷比肽的質(zhì)量與電離的肽的電荷之比，減去水；“電荷”=離子電荷狀態(tài)；“Mr (計算)，，= 計算的肽分子量；“起點”=與肽比對的蛋白質(zhì)的起始氨基酸；“終點”=與肽比對的蛋白質(zhì) 的終止氨基酸；“得分”=肽序列置信度的量度。圖4.考馬斯染色的SDS-PAGE，顯示肉阜(caruncle)(子宮內(nèi)膜)和絨毛葉 (cotyledon)(胎盤)組織提取物經(jīng)免疫親和色譜法純化的結(jié)合2D9的PAG。切下蛋白條帶 1-7，并進行胰蛋白酶消化，然后進行LC-MS-MS分析(SEQ ID NO :7_18)。圖5.使用2D9-抗體包被的ELISA板和使用免疫親和純化的PAG作為標準建立的 PAG ELISA標準曲線的Log-logit轉(zhuǎn)換。該分析顯示從0. 5ng/ml到50ng/ml的線性反應(yīng)。圖6.所示表格顯示在兩個研究地點威斯康辛州和加利福尼亞州，與第28天超聲 妊娠診斷相比，使用基于實驗室的ELISA的第28天妊娠診斷的準確性。在這一 0研究中 檢查了第28天妊娠試驗在奶牛繁殖管理中的經(jīng)濟性。使用多克隆抗體的基于實驗室的PAG ELISA用于妊娠診斷。成斯康辛州地點使用嚴格同步化繁殖，而加利福尼亞州地點使用同步 化繁殖(synchronized breeding)加上發(fā)情繁殖(breeding to heat)。每個地點的研究使用大約1000頭牛。在第28天采集血樣，并運送至實驗室進行妊娠試驗。結(jié)果在24小時內(nèi) 返回農(nóng)場，以便能夠作出繁殖決定。也在第28天采血時通過超聲確定妊娠狀態(tài)。圖7.威斯康辛州地點試驗的繁殖參數(shù)的分析結(jié)果。該地點使用嚴格同步化繁殖 計劃，使用第28天妊娠試驗(早期再同步組)或第45天觸診(對照組，晚期再同步)。結(jié) 果表明與晚期再同步組(對照組)相比，早期再同步組(第28天妊娠試驗)中授精之間的 天數(shù)和未孕期(days open)明顯減少。圖8.加利福尼亞州地點試驗的繁殖參數(shù)的分析結(jié)果。該地點使用同步化繁殖加 發(fā)情繁殖，使用(早期再同步組)及不使用(晚期再同步組)第28天妊娠試驗。結(jié)果表明 與晚期再同步組相比，授精之間的天數(shù)、授精次數(shù)和未孕期明顯減少。圖9.顯色試驗基礎(chǔ)。使用2D9單克隆抗體作為捕獲抗體和使用生物素標記的兔 多克隆抗體作為第二抗體發(fā)展的PAG免疫測定的結(jié)果。妊娠第28天和第55天采集的血漿 測試組(20個未孕和20個懷孕)樣品顯示未孕母牛(藍色)與懷孕母牛(粉紅色)完全 分開。未孕母牛獲得的接近零的PAG值提示測試血漿中免疫反應(yīng)性PAG的定量檢測可能不 需要PAG標準。圖10.在顯色試驗中使用全血樣品進行的牛妊娠診斷的結(jié)果。目視觀察結(jié)果。顯 示藍色反應(yīng)溶液的試管(管1、3、6、9、10、14和15)為妊娠狀態(tài)陽性結(jié)果，顯示澄清背景的 試管(管2、4、5、7、8、11、12、13和16)為妊娠狀態(tài)陰性(未懷孕)。為了用分光光度計讀 數(shù)，可以向每個試管中加入等體積的(0.4ml)終止溶液(IN HC1)。添加終止溶液將使顏色 變?yōu)辄S色。然后，可以在630nm用分光光度計測量每個樣品的光密度(0D)。圖11A，11B.使用2D9包被的塑料管進行的顯色試驗的結(jié)果。圖11A-第28天血漿 組。圖11B-第55天血漿組。第28天和第55天檢測組的所有未孕母牛樣品都產(chǎn)生0. 20D 或更低的顏色強度，而懷孕血漿樣品產(chǎn)生高達1. 00D單位的顏色強度。在該分析中，當設(shè)置 0. 20D顏色強度為截值時，第28天血漿樣品顯示100%的靈敏性和100%的特異性。在相 同的顏色強度截值時，第55天血漿樣品在塑料管分析中顯示95%的靈敏性和100%的特異 性。圖12.新鮮血漿樣品的妊娠試驗與使用多克隆抗體(多克隆多克隆，上圖)和 2D9單克隆抗體和多克隆抗體(單克隆多克隆，下圖)進行的PAG夾心ELISA的比較。注 意使用0. 20D顏色強度截值容易地區(qū)分的未孕母牛樣品清楚地分開。所有懷孕母牛樣品具 有> 0. 20D單位的顏色強度。單克隆多克隆分析具有100%的靈敏性和100%的特異性。圖13.使用血樣的顯色試驗的現(xiàn)場檢測。檢測了配種后第33-34天采集的54個 血樣，由3個對顏色進行目視觀察。3人之間對結(jié)果的目視評分未見不一致。圖14.與54個樣品的超聲結(jié)果相比，顯色試驗的現(xiàn)場檢測結(jié)果。該試驗識別了所 有的懷孕母牛(100%靈敏度)，與超聲結(jié)果相比有一個假陽性結(jié)果。有2個樣品在顯色試 驗中為不確定的結(jié)果，后來發(fā)現(xiàn)為“未孕”母牛。但是，與超聲相比，顯色試驗識別了 40頭 未孕母牛中的37頭(92. 5%特異性)。圖 15.利用 BioEdit (v. 7. 0. 5. 3 ；www. mbio. ncsu. edu/BioEdit/BioEdit. html ； Hall, 1999)內(nèi)的PR0TDIST(v. 3. 5c)的相鄰系統(tǒng)發(fā)生樹分析包產(chǎn)生的PAG同工型蛋白質(zhì)序列簇。圖16.PAG同工型1、4、6、9、16、17、19、20和21的直接比對。PAG同工型和變體
9的蛋白質(zhì)序列以SEQ ID NO :51-62給出，來自于UniProt登錄號Q29432、046492、046494、 A5PJW4、046497、A4FV16、Q9TTV8、Q9TTV7、A7MBA4、Q9TTV5、Q9TTV4 和 Q9TTV3。圖17.用考馬斯藍染色的純化的PAG批(每批5 μ g)的SDS-PAGE凝膠顯示在50 與75kD之間有三個PAG條帶(上、中、下條帶)。1)蛋白質(zhì)標準(Bio-Rad Cat. #161-0374)； 2)d55肉阜；3)d55絨毛葉；4)混合的d55肉阜和絨毛葉；5)d215肉阜；6)d215絨毛葉；7) 混合的d215肉阜和絨毛葉；8)蛋白質(zhì)標準(Bio-Rad Cat. #161-0374)。說明性實施方案詳述盡管幾種分析可以用于檢測懷孕，但是仍然需要提供用于準確和早期檢測懷孕的 改進的分析，特別是對于產(chǎn)后2至3個月內(nèi)或更早時配種的牛。本發(fā)明的某些實施方案涉及 確定牛的妊娠狀態(tài)的方法，包括進行顯色試驗以檢測從動物獲得的樣品中的PAG與多肽如 單克隆抗體2D9(表明牛懷孕的一種結(jié)合PAG的抗體)的結(jié)合。顯色試驗可以早期進行，如 授精后26天。顯色試驗可以使用多種形式中的任一種，如使用試管或ELISA板。在具體實 施方案中，該試驗使用夾心免疫測定原理，其使用第二抗體。顏色，如藍色，表示陽性試驗， 而澄清的管表示陰性試驗。本方法的實施方案可以在人工授精后30天之前容易地進行，并 且是高度靈敏和特異性的。此外，可以容易地和快速地同時分析多個樣品，這進一步提高了 本方法的價值。也提供了某些新的結(jié)合PAG的多肽，它們可以用于檢測受試者懷孕的方法中，以 及提供了編碼此處所述的多肽的多核苷酸。其余的公開內(nèi)容描述了本發(fā)明的各種特征和它 們的實施。I.多肽此處所述的本發(fā)明的某些實施方案涉及分離的和純化的多肽，該多肽包括與SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或者與SEQ IDNO :2有大于92%的序列同一性的PAG 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，PAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域與SEQ ID N0:1有大于97. 1%、97. 3%、 97. 5%,97. 7%,97. 9%,98. 1%,98. 3%,98. 5%,98. 7%,98. 9%,99. 1%,99. 3%,99. 5%, 99. 7%、99.9%或100%的序列同一性。在一些實施方案中，該PAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :2 有大于 92. 2 %,92. 6 %,93. 0 %,93. 4 %,93. 8 %,94. 2 %,94. 6 %,95. 0 %,95. 4 95. 8%,96. 2%,96. 6%,97. 0%,97. 4%,97. 8%,98. 2%,98. 6%,99. 0%,99. 4%,99. 8% 或100%的序列同一性。此處使用的“多肽”是指任意長度的連續(xù)氨基酸區(qū)段。在本方法的某些實施方案 中，其中使用的多肽是連續(xù)氨基酸，在其序列中包括與SEQ ID NO :1有大于97%的序列同 一性或者與SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 基于此處所述的公開內(nèi)容，應(yīng)當理解如何使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的大量實驗方法中的任 一種產(chǎn)生這樣的多肽。術(shù)語“百分序列同一性”，如本領(lǐng)域已知的，是指通過比較序列確定的兩個或多 個多肽序列或兩個或多個多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”也指多肽 或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，根據(jù)具體情況，通過這些序列串之間的匹配來確 定。“同一性”和“相似性”可以用已知方法容易地計算，包括但不限于Computational Molecular Biology(1988) ；Biocomputing Informatics and Genome Projects(1993)； Computer Analysis of Sequence Data,Part 1( ) ；Sequence Analysis in MolecularBiology (1987)；和Sequence Analysis Primer (1991)中所述的那些方法。優(yōu)選的確定同 一性的方法被設(shè)計為提供測試序列之間的最佳匹配。確定同一性和相似性的方法編入公 共可獲得的計算機程序中。序列比對和百分同一性計算可以使用LASERGENE生物信息學 計算套件(DNASTAR Inc. , Madison, Wis.)的Megalign程序進行。序列的多重比對可以使 用采用缺省參數(shù)(空位罰分=10，空位長度罰分=10)的聚類比對方法進行(Higgins和 Sharp (1989).使用多重方法的逐對比對的缺省參數(shù)是KTUPLE 1，空位罰分=3，窗口 = 5， DIAGONALS SAVED = 5。技術(shù)人員應(yīng)當理解，“多肽”的定義中固有這樣一個概念在分子的限定部分內(nèi)可 以進行的、仍然產(chǎn)生具有可接受水平的序列同一性或功能(例如結(jié)合PAG的能力)的分子 的改變的數(shù)目是有限的。此處所述的多肽定義內(nèi)包括任意長度的氨基酸序列，只要該多肽保留所述的序列 同一性。此處所述的多肽的PAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以在C-末端或N-末端具有額外的氨基酸。 例如，多肽等價物可以包括連接至PAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域C-末端或N-末端的4、5、6、7、8、9、10、 15、20、50、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 個或更多的額
外的核酸。當然，具有不同取代的多種不同的多肽可以根據(jù)本發(fā)明容易地制備并使用。本發(fā)明可以使用從天然來源或從重組產(chǎn)生的材料純化的多肽。本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員知道如何從重組產(chǎn)生的材料產(chǎn)生這些多肽。這種材料可以使用20種在天然合成蛋白質(zhì) 中常見的氨基酸或一種或多種修飾的或不常見的氨基酸。通常，“純化的”是指已經(jīng)進行分 級分離除去了各種其它蛋白質(zhì)、多肽或肽的多肽組合物，該組合物基本上保留其活性。純化 可以是基本純化，其中多肽是主要的種類或者是均質(zhì)的，該純化水平允許準確的降解測序。氨基酸序列突變體包括在本發(fā)明中，并且包括在“多肽”的定義中。多肽的氨基酸 序列突變體可以是取代突變體或插入突變體。插入突變體一般包括在肽的非末端位點添加 材料。這可能包括插入少數(shù)殘基、免疫反應(yīng)性表位或只是一個殘基。添加的材料可以是修 飾的，例如通過甲基化、乙酰化等修飾的。此外，也可以向肽的N-末端或C-末端添加額外 的殘基。氨基酸取代通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對相似性，例如，它們的疏水性、親水 性、電荷、大小等。氨基酸側(cè)鏈取代基的大小、形狀和類型的分析顯示精氨酸、賴氨酸和組氨 酸均是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸均具有類似的大??；苯丙氨酸、色氨酸和 酪氨酸均具有通常相似的形狀。因此，基于這些考慮，丙氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘 氨酸和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，在此定義為生物功能等價物。在進行改變時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)(hydropathic index)。每個氨基酸 已經(jīng)基于其疏水性和電荷特征被分配親水指數(shù)異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸 (+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)； 甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸 (-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺 (-3. 5)；賴氨酸(-3. 9)；和精氨酸(-4. 5)。本領(lǐng)域通常理解氨基酸親水指數(shù)在給蛋白質(zhì)提供相互作用性生物功能中的重要 性(Kyte和Doolittle，1982，通過參考并入本文)。眾所周知，某些氨基酸可以取代其它具有類似親水指數(shù)或得分的氨基酸，而仍然保留類似的生物活性。在基于親水指數(shù)進行改變 時，親水指數(shù)在+2以內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選的，在+1以內(nèi)的是特別優(yōu)選的，在+0. 5以內(nèi)的 是更加特別優(yōu)選的。應(yīng)當理解，氨基酸可以取代其它具有類似親水性值的氨基酸，而仍然獲得生物學 等效的蛋白質(zhì)。如美國專利4，554，101所詳述的，氨基酸殘基被賦予以下親水性值精氨酸 (+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3. 0+1)；谷氨酸(+3. 0+1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺 (+0. 2)；谷氨酰胺(+0. 2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0. 4)；脯氨酸(-0. 5+1)；丙氨酸(-0. 5)； 組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮 氨酸("1. 8)；酪氨酸(-2. 3)；苯丙氨酸(-2. 5)；色氨酸(-3. 4)。在基于類似的親水性值進行改變時，其親水性值在+2以內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選 的，在+1以內(nèi)是特別優(yōu)選的，在+0.5以內(nèi)是更加特別優(yōu)選的。II.多核苷酸本發(fā)明的各方面涉及編碼一種多肽的多核苷酸，該多肽包括與SEQ ID NO 1有大 于97%的序列同一性或者與SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的結(jié)構(gòu)域。此處所述 的其它實施方案涉及編碼一種多肽的分離的和純化的多核苷酸，該多肽具有與SEQ ID NO 1有大于97%的序列同一性或者與SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的結(jié)構(gòu)域。也 公開了包含與SEQ ID NO :5有大于98%的序列同一性或與SEQ ID NO :6有大于95%的序 列同一性的核酸序列的多核苷酸。SEQID NO 5是指編碼2D9輕鏈的cDNA的核酸序列，SEQ ID NO 6是指編碼2D9重鏈的cDNA的核酸序列。在一些實施方案中，多核苷酸與SEQ ID NO :5 有 98. 1 %、98· 2%、98· 3%、98· 4%、
98.5%,98. 6%,98. 7%,98. 8%,98. 9%,99. 0%,99. 1%,99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,
99.6%、99. 7%、99. 8%、99. 9%或100%的序列同一性。在一些實施方案中，多核苷酸 與 SEQID NO 6 有大于 95. 2%,95. 4%,95. 6%,95. 8%,96. 0%,96. 2%,96. 4%,96. 6%, 96. 8%,97. 0%,97. 2%,97. 4%,97. 6%,97. 8%,98. 0%,98. 2%,98. 4%,98. 6%,98. 8%, 99. 0%,99. 2%,99. 4%,99. 6%,99. 8%或 100%的序列同一性。多核苷酸可以從天然來源獲得或者使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法化 學合成。本發(fā)明也包括化學合成的這些序列的突變體。在特定實施方案中，可能希望使用包括其它元件的構(gòu)建體，例如，包括C-5丙炔 嘧啶的構(gòu)建體。含有尿苷和胞苷的C-5丙炔類似物的寡核苷酸已經(jīng)證明高親和力地結(jié)合 RNA(ffagner等人，1993)。在一些實施方案中，多核苷酸編碼一種或多種額外的能夠結(jié)合 PAG的氨基酸區(qū)段。III.抗體和抗體片段本發(fā)明的具體實施方案涉及抗體或抗體片段。術(shù)語“抗體”用來指任何具有抗原結(jié) 合區(qū)的抗體樣分子，包括抗體片段，如Fab'、Fab、F(ab' )2、單域抗體(DAB)、Fv、scFv (單 鏈Fv)等。制備和使用各種基于抗體的構(gòu)建體和片段的方法是本領(lǐng)域公知的。制備和表 征抗體的方法也是本領(lǐng)域公知的(參見,例如，Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ；通過參考并入本文)。“小抗體”或“微抗體”也可用于本發(fā)明。小抗體是在C-末端具有寡聚結(jié)構(gòu)域的SFv 多肽鏈，該結(jié)構(gòu)域與sFv之間被鉸鏈區(qū)隔開。Pack等人(1992)。寡聚結(jié)構(gòu)域包含自結(jié)合的α-螺旋，例如亮氨酸拉鏈，它們可以進一步用額外的二硫鍵穩(wěn)定化。寡聚化結(jié)構(gòu)域被設(shè)計 為與跨膜的矢量折疊相容，該過程被認為促進了多肽在體內(nèi)折疊為功能結(jié)合蛋白質(zhì)。通常， 小抗體是使用本領(lǐng)域公知的重組方法產(chǎn)生的。參見，例如，Pack等人(1992) ；Cumber等人 (1992)。本發(fā)明也涉及抗體樣結(jié)合擬肽。Liu等人，2003描述了“抗體樣結(jié)合擬肽”(ABiP)， 它們是作為縮小的(pared-down)抗體起作用的肽，并且具有較長血清半衰期以及較不繁 雜的合成方法的特定優(yōu)點。單克隆抗體(MAb)公認具有某些優(yōu)點，例如再現(xiàn)性和大規(guī)模生產(chǎn)，并且其應(yīng)用通 常是優(yōu)選的。本發(fā)明因此提供人、鼠、猴、大鼠、倉鼠、兔和甚至雞來源的單克隆抗體。由于 容易制備和易于獲得試劑，鼠單克隆抗體通常是優(yōu)選的。但是，也包括“人源化”抗體，以及來自小鼠、大鼠或其它物種、攜帶人恒定區(qū)和/ 或可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗體、雙特異性抗體、重組和工程化抗體及其片段。此處使用的術(shù)語 “人源化”免疫球蛋白是指包含人構(gòu)架區(qū)和一個或多個來自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫 球蛋白的互補決定區(qū)(CDR)的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被稱為“供體”，提 供構(gòu)架的人免疫球蛋白被稱為“接受體”?！叭嗽椿贵w”是包含人源化輕鏈和人源化重鏈 免疫球蛋白的抗體。術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體、可以以可溶性或結(jié)合 形式標記的抗體的抗獨特型(抗-id)抗體，以及通過任何已知技術(shù)提供的其片段、區(qū)域或 衍生物，所述方法例如但不限于酶切、肽合成或重組技術(shù)。此處所述的抗體能夠結(jié)合PAG。此處定義的“多克隆抗體”是指來源于用抗原免疫的動物血清的不均一的抗體分 子群體。這些不同的抗體可以識別同一抗原上的幾個表位?！皢慰寺】贵w”含有基本均質(zhì)的 抗原特異性抗體群體，該群體含有基本相似的表位結(jié)合位點。MAb可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的方法獲得。參見，例如，Kohler和Milstein，1975 ；美國專利No. 4，376，110 ；Ausubel 等人，1992) ；Harlow和Lane 1988 ;Colligan等人，1993，其內(nèi)容均通過參考并入本文。這 樣的抗體可以是任何免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何亞類。產(chǎn)生 本發(fā)明的mAb的雜交瘤可以在體外、原位或體內(nèi)培養(yǎng)。在體內(nèi)或原位產(chǎn)生高效價mAb使其 成為目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法?！扒逗峡贵w”是其不同部分來源于不同動物種的分子，如具有來源于鼠mAb的 可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子，它們主要用于降低應(yīng)用時的免疫原性以及提高產(chǎn) 率。嵌合抗體及其生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域已知的。示例性的生產(chǎn)方法在Cabilly等人，1984; Boulianne等人，1984 ；和Neuberger等人，1985中描述，均通過參考并入本文。“抗獨特型抗體”(抗-Id)是識別通常與抗體的抗原結(jié)合位點相關(guān)的獨特決定簇 的抗體。Id抗體可以通過用制備其抗-Id的mAb免疫作為mAb來源的相同種和屬類型的動 物(例如小鼠株)來制備。被免疫的動物將通過產(chǎn)生針對這些獨特型決定簇的抗體(抗-id 抗體)識別并且響應(yīng)于免疫抗體的獨特型決定簇。一種示例性的產(chǎn)生這種抗體的方法在美 國專利No. 4，699，880中描述，該專利通過參考并入本文。本發(fā)明的抗體可以包括至少一個重鏈、至少一個輕鏈、重鏈恒定區(qū)、重鏈可變區(qū)、 輕鏈可變區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)，其中多克隆抗體、單克隆抗體、其片段和/或區(qū)域包括至少 一個結(jié)合PAG —部分的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)。
本發(fā)明的某些實施方案涉及用于檢測動物懷孕的方法，包括從該動物獲得樣品， 使該樣品接觸抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含可以結(jié)合boPAG4、boPAG6、 boPAG9、boPAG20和/或boPAG21中的一種或多種的結(jié)構(gòu)域，以及檢測該抗體或抗體片段與 樣品中的一種或多種PAG的接觸，其中檢測到PAG表明該動物已懷孕。本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員已知的任何方法都可以用來鑒定結(jié)合PAG的抗體。涉及定義IgG可變區(qū)的參考文獻的例 子包括Mo等人(1993)和Leibiger等人(1999)，通過參考引入本文。IV.檢測方法和測定形式本發(fā)明的某些實施方案涉及檢測動物懷孕的方法，包括使從動物獲得的樣品接觸 此處提供的抗體，并且檢測樣品中的至少一種妊娠相關(guān)抗原，其中檢測到PAG表明該動物 已懷孕。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法都可以用來檢測結(jié)合樣品中的PAG的抗體或 抗體片段。本發(fā)明因此提供抗體在PAG的免疫檢測中的應(yīng)用。各種有用的免疫檢測方法已經(jīng) 在科學文獻中描述，例如，Nakamura等人(1987)。免疫測定，在其最簡單和直接的意義上來 說，是結(jié)合測定。某些免疫測定是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。使用 組織切片的免疫組化檢測也特別有用。但是，容易理解，檢測不限于這些技術(shù)，Western印 跡法、斑點印跡法、FACS分析等也可以用于本發(fā)明。通常，免疫結(jié)合方法包括獲得懷疑含有蛋白質(zhì)、肽或抗體的樣品，并且根據(jù)情況， 在允許形成免疫復合物的有效條件下使該樣品接觸根據(jù)本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)或肽。根據(jù) 本發(fā)明，優(yōu)選的樣品是流體，如乳汁、尿、血液、血清或唾液。在具體實施方案中，抗體連接到固體支持體上，如試管或孔的內(nèi)壁，懷疑含有PAG 的樣品將加至固定的抗體。抗體包被的試管系統(tǒng)在美國專利3，646，346和WO 98/16832中有述，該專利均通 過參考并入本文。然后可以在特定條件下檢測PAG-抗體復合物的存在。任選地，這種免疫
復合物可以定量化。使選擇的生物樣品在足以允許形成免疫復合物(第一免疫復合物)的有效條件和 時間下接觸抗體，通常是向樣品中簡單添加抗體組合物，并且溫育混合物足以使抗體與樣 品中存在的任何PAG形成免疫復合物(即結(jié)合)的一段時間。這一時間之后，通常洗滌樣 品-抗體組合物，以除去任何非特異性結(jié)合的抗體種類，只允許在第一免疫復合物內(nèi)特異 性結(jié)合的抗體被檢測到。通常，免疫復合物形成的檢測是本領(lǐng)域公知的，并且可以通過應(yīng)用多種方法來實 現(xiàn)。這些方法通?；跈z測標記或標記物，如放射性、熒光、生物和酶標記中的任一種。涉及 使用這些標記的美國專利包括 3，817，837 ；3, 850，752 ；3, 939，350 ；3, 996，345 ；4, 277，437 ； 4，275，149和4，366，241，均通過參考并入本文。免疫測定蛋白質(zhì)的方法和進行該方法的試 劑盒可以在美國專利5，721，105中找到，該專利通過參考并入本文。在具體實施方案中，該方法包括使用第二結(jié)合配體如第二抗體和/或本領(lǐng)域已知 的生物素/親和素配體結(jié)合排列。檢測中使用的第二抗體本身可以連接到可檢測標記上， 其中然后簡單地檢測該標記，由此允許測定組合物中第一免疫復合物的量。使用免疫捕獲、 生物素/親和素擴增和辣根過氧化物酶顏色產(chǎn)生來檢測測試樣品中生物分子的方法可以 在美國專利申請公布2003/508381中找到。
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通常，利用具有針對PAG或PAG特異性第一抗體的結(jié)合親和力的第二結(jié)合配體可 以檢測第一免疫復合物。在這些情況中，第二結(jié)合配體可以連接到可檢測標記上。第二結(jié) 合配體本身通常是抗體，因此可命名為“第二”抗體。在足以允許形成第二免疫復合物的有 效的條件和時間下，第一免疫復合物接觸標記的第二結(jié)合配體或抗體。然后通常洗滌第二 免疫復合物，以除去任何非特異性結(jié)合的標記的第二抗體或配體，然后檢測第二免疫復合 物中剩余的標記。其它的方法包括通過兩步法檢測第一免疫復合物。如上所述，具有針對PAG或抗 PAG抗體的結(jié)合親和力的第二結(jié)合配體，如抗體，用于形成第二免疫復合物。第二結(jié)合配體 含有能夠?qū)⒌孜锛庸榭蓹z測產(chǎn)物，因此隨時間擴增信號的酶。洗滌后，第二免疫復合物與 底物接觸，允許檢測。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以采用酶聯(lián)免疫測定(ELISA)。參見，例如， Engvall, 1980 ；Engvall, 1976 ；Engvall, 1977 ；Gripenberg 等人，1978 ；Makler 等人，1981 ； Sarangadharan等人，1984。ELISA允許將物質(zhì)被動吸附到固體支持體如塑料上，以便能夠 在實驗室條件下容易地處理。關(guān)于ELISA的全面論述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參見"ELISA ； Theory and Practise“ (Crowther，1995)。ELISA方法的靈敏性取決于使用的酶的更新和檢測酶反應(yīng)產(chǎn)物的容易程度。這 些分析系統(tǒng)的靈敏性的提高可以通過使用酶的熒光和放射性底物來實現(xiàn)。本發(fā)明涉及 的免疫測定包括但不限于美國專利4，367，110(雙單克隆抗體夾心測定)和美國專利 4，452，901 (Western印跡法)所述的方法。其它分析包括體外和體內(nèi)的標記配體的免疫沉 淀和免疫細胞化學。在一個實施方案中，本發(fā)明包括“夾心”ELISA，其中本發(fā)明的抗PAG抗體被固定到 選擇的表面上，如聚苯乙烯微孔板的孔中、試管或試條。然后，懷疑含有PAG的測試組合物 如臨床樣品與所述表面接觸。結(jié)合并洗滌除去非特異性結(jié)合的免疫復合物后，可以用PAG 的第二抗體檢測結(jié)合的抗原。在另一種示例性的ELISA中，將來自樣品的多肽固定到表面上，然后接觸抗PAG抗 體。結(jié)合并洗滌除去非特異性結(jié)合的免疫復合物后，檢測結(jié)合的抗體。在初始抗體連接到 可檢測標記上的情況下，第一免疫復合物可以直接檢測。或者，可以使用具有對第一抗體的 結(jié)合親和力的第二抗體檢測免疫復合物，該第二抗體連接到可檢測標記上。其中固定PAG的另一種ELISA包括在檢測中使用抗體競爭。在這種ELISA中，將 標記的抗體添加到孔中，使其結(jié)合PAG，并利用它們的標記進行檢測。通過在與包被孔溫育 之前或期間將樣品與標記的抗體混合來檢測樣品中的PAG的量。樣品中PAG的存在用來減 少可與孔結(jié)合的抗體的量，因此降低了最終的信號。無論使用的形式如何，ELISA都具有某些共同的特點，例如包被、溫育或結(jié)合、洗滌 除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)，以及檢測結(jié)合的免疫復合物。在用抗原或抗體包被板時，通常將 板的孔與抗原或抗體的溶液溫育過夜或特定的時間。然后洗滌板的孔以除去不完全吸附的 物質(zhì)。然后用相對于測試抗血清為抗原中性的非特異性蛋白質(zhì)封閉孔的任何剩余的可利用 表面。它們可包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、奶粉溶液或其它抗原中性蛋白質(zhì)。包被允 許封閉固定表面上的非特異性吸附位點，因此減少了抗血清非特異性結(jié)合到該表面上產(chǎn)生 的背景。
“在允許免疫復合物(抗原/抗體)形成的有效條件下”是指該條件優(yōu)選地包括用 如BSA、牛γ球蛋白(BGG)、蒸發(fā)乳或奶粉和磷酸鹽緩沖液(PBS)/TWEEN等溶液稀釋抗原和 抗體。這些添加的試劑也傾向于幫助減少非特異性背景?！昂线m的”條件也指在某一溫度下溫育一段時間，該溫度和時間足以允許有效結(jié) 合。溫育步驟一般是大約1小時到2小時到4小時，溫度優(yōu)選地為25°C至27°C，或者可以 在大約4°C過夜，等等。為了提供檢測手段，第二或第三抗體具有結(jié)合的標記，以允許檢測。通常，這是在 與合適的發(fā)色底物溫育時將產(chǎn)生顯色的酶。因此，例如，希望在利于形成進一步的免疫復合 物的條件下，第一或第二免疫復合物與脲酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶或過氧化氫酶偶聯(lián) 的抗體接觸并溫育一段時間(例如，在室溫下在含有PBS的溶液如PBS-TWEEN中溫育2小 時)。與標記的抗體溫育后，并且洗滌以除去未結(jié)合的物質(zhì)后，對標記的量進行定量，例 如通過與顯色底物如尿素和溴甲酚紫或2,2'-疊氮-二 _(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸 [ABTS]和H2O2—起溫育，在過氧化物酶的情況下作為酶標記。然后通過測定產(chǎn)生顏色的程 度，例如，使用可見光譜分光光度計完成定量。ELISA的一個變化形式是酶聯(lián)凝固分析或ELCA(美國專利4，668，621)，該方法使 用凝固級聯(lián)與標記酶RVV-XA的組合作為通用檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)用于本發(fā)明的優(yōu)點是凝固 反應(yīng)可以在生理pH下在多種緩沖液的存在下進行。因此能夠保持復合分析物的完整性。根據(jù)本發(fā)明也可以在PAG鑒定中使用免疫組織化學(IHC)。包括檢測新鮮冷凍的 和福爾馬林固定的、石蠟包埋的由IHC研究制備的組織塊。例如，每個組織塊由50mg殘余 的“粉碎的”胎盤組織組成。由這些微粒標本制備組織塊的方法已經(jīng)在以前的各種預后因 素(例如胸)的IHC研究中成功使用，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(Brown等人，1990; Abbondanzo 等人，1990 ；Allred 等人，1990)。簡言之，冷凍切片可以如下制備在室溫下在小塑料膠囊中在磷酸鹽緩沖液 (PBS)中再水合50mg冷凍的“粉碎的”胎盤組織；通過離心沉淀顆粒；將其重懸浮于粘性包 埋介質(zhì)(OCT)中；顛倒膠囊并再次離心沉淀；在_70°C異戊烷中急凍；切割塑料膠囊并取出 冷凍的組織柱；將組織柱固定在低溫恒溫器切片機夾具上；切割25-50個含有平均大約500 個明顯完整的胎盤細胞的連續(xù)切片。永久切片可以通過類似的方法制備，包括在塑料微量離心管中再水合50mg樣品； 沉淀；在10%福爾馬林中重懸浮4小時進行固定；洗滌/沉淀；重懸浮于溫2. 5%瓊脂中； 沉淀；在冰水中冷卻以使瓊脂變硬；從管中取出組織/瓊脂塊；將該塊浸入并包埋到石蠟 中；切成最多50個連續(xù)永久切片。V.蛋白質(zhì)的純化某些實施方案涉及分離的或純化的多肽或使用分離的或純化的多肽的方法。蛋白 質(zhì)純化技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些技術(shù)包括在一個水平上將細胞環(huán)境粗分級分離 為多肽和非多肽級分。在將該多肽與其它蛋白質(zhì)分離后，感興趣的多肽可以使用色譜和電 泳技術(shù)進一步純化，以實現(xiàn)部分或完全純化(或純化至均質(zhì))。特別適合于制備純肽的分析 方法是離子交換色譜法、排阻色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦。特別有效的純化肽 的方法是快速蛋白質(zhì)液相色譜法乃至HPLC。
本發(fā)明的某些方面涉及編碼的蛋白質(zhì)或多肽的純化，在具體實施方案中，涉及其 基本純化。本文使用的術(shù)語“純化的多肽、蛋白質(zhì)或肽”意指可與其它成分分離的組合物， 其中該蛋白質(zhì)或肽相對于其可天然獲得的狀態(tài)純化至任何程度。純化的蛋白質(zhì)或肽因此也 指脫離可能天然存在的環(huán)境的蛋白質(zhì)或肽。通常，“純化的”是指已經(jīng)分級分離除去各種其它成分并且該組合物基本保留其表 達的生物活性的蛋白質(zhì)或肽組合物。當使用術(shù)語“基本純化的”時，該術(shù)語是指組合物中蛋 白質(zhì)或肽構(gòu)成該組合物的主要成分，如構(gòu)成該組合物中蛋白質(zhì)的大約50%、大約60%、大 約70%、大約80%、大約90%、大約95%或更多。適用于蛋白質(zhì)純化的各種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。其中包括，例如，硫酸 銨、PEG、抗體等沉淀或通過污染蛋白質(zhì)的熱或酸性pH變性，然后離心；色譜步驟，如離子交 換、凝膠過濾、反相、羥基磷灰石和親和色譜法；等電聚焦；凝膠電泳；和這些和其它技術(shù)的 組合。本領(lǐng)域公知，據(jù)認為進行各個純化步驟的順序可以變化或者某些步驟可以省略，而仍 然導致用于制備基本純化的蛋白質(zhì)或肽的合適的方法。通常不需要多肽總是以最純化的狀態(tài)提供。實際上，想到較低程度基本純化的產(chǎn) 物在某些實施方案中有用。部分純化可以通過使用較少的組合純化步驟或者通過使用相同 普通純化方案的不同形式來實現(xiàn)。例如，應(yīng)當理解，使用HPLC裝置進行的陽離子交換柱色 譜法通常比使用低壓色譜系統(tǒng)的相同技術(shù)導致更高的純化倍數(shù)。顯示較低相對純化程度的 方法可能在蛋白質(zhì)產(chǎn)物的總回收率或者保持表達蛋白質(zhì)的活性方面具有優(yōu)點。VI.試劑盒在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了用于通過上述免疫檢測方法檢測PAG的試劑 盒，如診斷牛懷孕的免疫檢測試劑盒。在具體的實施方案中，試劑盒中包括包含與SEQ ID NO :1有大于97%的序列同一性或與SEQ ID NO :2有大于92%的序列同一性的結(jié)構(gòu)域的抗 體。該試劑盒可以包括一個或多個容器裝置。容器，例如，可以是小瓶、試管、瓶、小瓶或注 射器。在具體實施方案中，抗體是單克隆抗體2D9。在具體實施方案中，試劑盒包括一個 或多個預結(jié)合有抗體的試管或微量滴定板的孔?？商娲?，試劑盒可以包括預結(jié)合到柱基 質(zhì)上的抗體。試劑盒可以允許測定一個樣品或一個以上的樣品。在一些實施方案中，試劑 盒包括多個用允許同時或連續(xù)免疫檢測大量樣品的抗體包被的微量滴定板或試管。試劑盒的免疫檢測試劑可以采用多種形式中任意一種，包括與給定抗體相關(guān)的和 /或連接的可檢測標記。也涉及與第二結(jié)合配體相關(guān)的和/或連接的可檢測標記。示例性 的第二配體是具有對于第一抗體的結(jié)合親和力的第二抗體。在一些實施方案中，試劑盒包括具有對于第一抗體的結(jié)合親和力的第二抗體。第 二抗體可以與可檢測標記連接或不連接。在一些進一步的實施方案中，試劑盒包括具有對 于第二抗體的結(jié)合親和力的第三抗體，該第三抗體與可檢測標記連接。如上所述，大量示例 性的標記是本領(lǐng)域已知的，和/或本發(fā)明可以使用所有這些標記。試劑盒可以任選地包括適當?shù)确值腜AG的組合物，以提供陽性對照。試劑盒的成 分可以在水性介質(zhì)中和/或以凍干形式包裝。Vl I.實施例包括以下實施例是為了證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解， 下面這些實施例中公開的技術(shù)代表了發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實施本發(fā)明中工作良好的技術(shù)，因此 可以被認為構(gòu)成了實施本發(fā)明的優(yōu)選方式。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本公開內(nèi)容應(yīng)當理 解，可以對公開的具體實施方案進行許多變化，而仍然獲得相同或相似的結(jié)果，而不背離本 發(fā)明的精神和范圍。實施例1結(jié)合2D9的PAG的鑒定進行了研究來鑒定結(jié)合2D9的蛋白質(zhì)、對2D9抗體進行表征和測序、以及對PAG的 2D9結(jié)合位點作圖。為了實現(xiàn)這一點，采用了兩種方法(如下所述)。材料與方法使用2D9包被的磁珠免疫沉淀PAG。根據(jù)廠商說明(Dynal)，將純化的2D9偶聯(lián)至 甲苯磺?；?Tosyl)活化的Dynal磁珠上。抗體包被的磁珠與100微克富含PAG的制品(從 第55天的胎盤獲得)在Ix PBS中溫育30分鐘，并用相同的緩沖液充分洗滌。使用pH 3. 0 乙酸洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，并進行凝膠和Western印跡分析。Western印跡用兔抗-PAG多克 隆抗體顯示。從SDS-PAGE上切下免疫反應(yīng)性蛋白條帶，并在胰蛋白酶消化后進行LC-MS-MS 分析(圖3)。力特· 55碰_(賴_)禾口M和十(月臺I) _吿細_馳_ 免疫親和餼譜。簡要地說，根據(jù)廠商說明(Sigma，St. Louis)，將純化的2D9 (IOmg)偶聯(lián)至1 克CNBr活化的sepharose上。2D9-親和樹脂(大約5. Oml)與25ml組織提取物在pH 7. 0 下溫育過夜，進行結(jié)合。次日，將樹脂裝柱，并用Ix PBS洗滌，以除去未結(jié)合的材料，并用pH 3.0乙酸洗脫。洗脫的材料的pH在洗脫后立即用IM Tris中和至pH 7.0。對洗脫的材料 進行凝膠和Western印跡分析。Western印跡用兔抗-PAG多克隆抗體顯示。從SDS-PAGE 上切下蛋白條帶1-7，并在胰蛋白酶消化后進行LC-MS-MS分析(圖4)。利用BLAST分析確 定肽序列的身份。通過用2D9-結(jié)合抗原作為PAG標準(通過免疫親和色譜法純化的)獲得的ELISA 數(shù)據(jù)的log-log轉(zhuǎn)換確定PAG對2D9的結(jié)合親和力(圖5)。使用從0. 05ng/ml到50ng/ ml (0. 083nM到8. 3nM)的一系列PAG標準進行該分析。ELISA分析重復8次。數(shù)據(jù)用SoftMax (Molecular Devices, Inc. , Sunnyvale, CA)進行分析。結(jié)果2D9偶聯(lián)的磁珠對PAG的免疫沉淀。對磁珠洗脫的材料進行的SDS-PAGE和Western 印跡分析顯示在67kD處有一條蛋白條帶。肽指紋分析和LC-MS-MS分析確定該蛋白條帶為 boPAG6 (圖3)。但是，該分析沒有顯示所有結(jié)合2D9的PAG，因為該分析使用100微克富含PAG 的制品進行免疫沉淀實驗。通過在PH 5.0下對胎盤組織提取物進行胃酶抑素-親和色譜以 及隨后在PH 9. 5洗脫，分離該材料。該制品也被稱為“酸性PAG”，一種富集的早期PAG抗原 制品。為了鑒定所有結(jié)合2D9的PAG，使用組織提取物進行免疫親和色譜法(見下文)。使用2D9-免疫親和餼譜法從組織提取物純化的PAG的分析。免疫親和柱洗脫的材 料的考馬斯藍染色顯示分子量為67kD、55kD和50kD的3個蛋白條帶。在使用兔抗PAG抗 體的Western印跡分析中也發(fā)現(xiàn)所有這三個蛋白條帶都是免疫反應(yīng)性的?；谶@些結(jié)果，
18在SDS-PAGE后切下所有蛋白條帶(圖4)，并進行肽指紋分析和LC-MS-MS。得到的肽序列 的身份通過BLAST分析確定。表1顯示肽序列結(jié)果的概況以及通過BLAST分析確定它們?yōu)?對應(yīng)于 boPAG-4、boPAG-6、boPAG_9、boPAG-20 和 boPAG21 序列的 PAG。關(guān)于表 1 中各參數(shù) 的含義，參見圖3的說明。表1.肽序列結(jié)果的概況
蛋白條帶編號存在于條帶3、S、6和7中牛(gi286G3710)妊娠相關(guān)糖蛋白4Mz電荷Mr(計算)起點終點評分肽序列494.789 72969.564732333197.72%VPGOAYILK (SEO ID NO: 19)523.779 921027.512736236999.00%LYFSVFDR (SEO ID N0:20)544.765 721069.519312713698.95%TFSITYGSGR (SEQ ID NO:21)608.826 221197.621623224194.10%GELNWIPLMK (SEO ID NO:22)671.69531994.051319521299.00%LKNEGAISEPVFAFYLSK (SEQ ID NO:23)820.457 432440.267817219487.95%FDGVLGLSYTNISPSGAIPIFYK (SEQ ID NO:24)
蛋白條帶編號存在于條帶1、2、4和S中牛(gi28603714)妊娠相關(guān)糖蛋白6Mz電荷Mr(計算)起點終點評分肽序列886.423521752.872219621188.08%NEGAISEPVF AFYLSK (SEQ ID NO:25)881.939421743.886514716295.46%IGDLVSTDQPFGLCLK (SEQ ID NO:26)809.713132408.173623125091.77%GELNWVPLIQVGDWFVHMDR (SEQ ID NO:27)671.671831994.051319421197.94%LKNEGAISEPVFAFYLSK (SEQ ID NO:28)615.302621210.602218319398.74%TFSGAFPIFDK (SEQ ID NO:29)592.932131757.815421222799.00%DKQEGSVVMFGGVDHR (SEQ ID N0:30)511.906631514.693621422790.49%QEGS VVMFGG VDHR (SEQ ID NO:31)467.22422914.428636236891.26%YFSVFDR (SEQ ID NO:32)
19 該分析顯示，3個蛋白條帶中的每一個都具有一種以上的PAG (表1)。67kD的條帶 含有對應(yīng)于boPAG6和boPAG20的肽。55kD的蛋白條帶含有屬于boPAG6和boPAG9的肽。 50kD的蛋白條帶對應(yīng)于boPAG4和boPAG21，以及作為次要成分的boPAG9。這些結(jié)果表明， 2D9單克隆抗體結(jié)合boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG20和boPAG21。該單克隆抗體結(jié)合所 有5種PAG共有的表位。序列比較顯示這些PAG之間具有高度的序列同一性。使用結(jié)合2D9的PAG作為標準獲得的PAG ELISA結(jié)果(圖5)用于使用SoftMax 計算Kd值。2D9的Kd值確定為0.9nM(圖5)。因此，2D9是PAG的高親和力單克隆抗體。 這些結(jié)果表明，PAG單克隆抗體2D9結(jié)合來自第55天胎盤組織提取物的boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG20和boPAG21。通過LC-MS-MS獲得的肽序列的身份符合以前表征的這5種 PAG 的序列(boPAG4、boPAG6、boPAG9、boPAG20 和 boPAG21)。實施例2蛋白質(zhì)和mRNA測序純化的2D9的蛋白質(zhì)測序。對2D9進行測序以確定2D9的PAG-抗原結(jié)合序列。 2D9的測序利用蛋白質(zhì)和DNA測序方法實現(xiàn)。首先，通過變性凝膠電泳分離2D9抗體的重 鏈和輕鏈。切下凝膠條帶，并且分開進行胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化。分離得到的肽，并 且通過LC-MS-MS (液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜)法測序。選擇在質(zhì)量和序列分析中置信得分> 90%的肽。利用得到的肽序列裝配大約80%的輕鏈序列和大約50%的重鏈序列。2D9重鏈和輕鏈mRNA的測序。在第二種方法中，使用從2D9PAG雜交瘤細胞制備的 總RNA，通過使用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，將對應(yīng)于2D9重鏈和輕鏈的mRNA 進行測序。簡要地說，產(chǎn)生PAG單克隆抗體的雜交瘤細胞在無血清組織培養(yǎng)基中生長，以產(chǎn) 生IxlO6個細胞。離心細胞，將得到的細胞沉淀物在液氮中急凍。細胞沉淀物貯存在-80°C 直到使用。使用購自Ambion，Inc.，Austin, TX的細胞-cDNA試劑盒II產(chǎn)生第一鏈互補 DNA(cDNA)。將雜交瘤細胞中的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生cDNA，而不需單獨的RNA提取步 驟。使用一組為擴增小鼠重鏈和輕鏈所有亞類而設(shè)計的引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，用 得到的cDNA模板擴增輕鏈和重鏈(Chardes等人，1999)。分離得到的PCR產(chǎn)物。使用DNA STAR 軟件包組裝序列數(shù)據(jù)。重復整個研究以確保序列的準確性。PCR擴增和測序的第二 次重復包括額外的弓I物來提高覆蓋率。序列分析顯示2D9重鏈來源于小鼠IgGl γ亞類，輕鏈來源于κ型。重鏈由448 個氨基酸殘基組成，輕鏈由219個氨基酸殘基組成。2D9輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。2D9重鏈的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。2D9輕鏈的核酸序列如SEQ ID NO: 5所示(圖1)。2D9重鏈的核酸序列如SEQ ID NO 6所示(圖2)。實施例3基于免疫測定的妊娠試驗在牛中的可行性研究進行了大規(guī)模研究，以評估第28天早孕試驗在奶牛繁殖管理中的經(jīng)濟性。研究動 物位于兩個不同的地點，一個在加利福尼亞州，另一個在成斯康辛州。每個地點有1，050只 動物。在最初的配種后進行如下所述的基于免疫測定的妊娠試驗或標準觸診。將樣品連夜 運送至實驗室。該研究使用對兔抗PAG多克隆抗體優(yōu)化的標準ELISA。基于試驗性研究， PAG ELISA使用的截值為1.7ng/ml。在第28天采集血樣，并運送至實驗室進行妊娠試驗。 通過PAG ELISA完成妊娠診斷，產(chǎn)生結(jié)果報告，并且農(nóng)場人員在24小時內(nèi)可以獲得。早期 再同步(resynch)組基于PAG試驗的妊娠診斷結(jié)果進行繁殖決定。晚期再同步組(對照) 的繁殖決定基于第35-45天的觸診進行。兩個地點的結(jié)果在圖6-8中示出。圖6顯示與基于超聲的妊娠診斷相比，使用PAG ELISA的基于實驗室的妊娠診斷 的準確性。圖6顯示在兩個研究地點，威斯康辛州和加利福尼亞州，與基于第28天超聲的 妊娠診斷相比，使用基于實驗室的ELISA的第28天妊娠診斷的準確性。在這一 β研究中 檢查了第28天妊娠試驗在奶牛繁殖管理中的經(jīng)濟性。使用多克隆抗體的基于實驗室的PAG ELISA用于妊娠診斷。成斯康辛州地點使用嚴格同步化繁殖，而加利福尼亞州地點使用同步化繁殖加上發(fā)情繁殖。每個地點的研究使用大約1000頭牛。在第28天采集血樣，運送至 實驗室進行妊娠檢測。結(jié)果在24小時內(nèi)返回農(nóng)場以便能夠作出繁殖決定。在第28天采血 時也通過超聲確定妊娠狀態(tài)。圖7和圖8顯示在兩個不同的繁殖方案中，用于確定早孕檢測在奶牛繁殖管理中 的經(jīng)濟性的繁殖參數(shù)的結(jié)果。結(jié)果清楚地顯示，與對照相比，在早期同步組中未孕期顯著減 少10-15天。另外，在兩個地點都觀察到授精之間的天數(shù)的減少。這些結(jié)果表明，授精27-30天后使用PAG ELISA的早孕試驗比觸診允許更早的繁 殖。早孕試驗顯著減少了母牛再繁殖中的“未孕期”。另外，早孕試驗顯著減少了授精之間 的天數(shù)。使用早孕試驗的發(fā)情繁殖策略顯示減少了每次妊娠的授精次數(shù)。實施例4現(xiàn)場(On-Farm)試驗概念牛妊娠試驗(試紙)進行進一步的研究以評估在開發(fā)使用試紙的“現(xiàn)場”妊娠試驗中使用2D9的可行 性。試紙使用側(cè)流技術(shù)，該技術(shù)與家庭妊娠試驗中使用的技術(shù)相同。側(cè)流試紙在樣品施加 末端具有膠體金偶聯(lián)的抗體，并且在試紙中部具有作為測試線放置的捕獲抗體。如果樣品 中存在測試抗原(PAG)，則金偶聯(lián)的抗體將結(jié)合抗原，產(chǎn)生的復合物向測試線遷移。在測試 線處，捕獲抗體(也針對PAG)將結(jié)合該復合物并且在該線處濃縮。當測試線處有足夠的復 合物作為抗體夾心體時，由于膠體金標記的抗體與測試抗原結(jié)合，將出現(xiàn)可見的紫色線。生 產(chǎn)并測試了具有40種以上的抗體組合(包括2D9作為捕獲抗體)的側(cè)流試紙。測試的側(cè) 流試紙組合沒有一種產(chǎn)生可接受的靈敏性和特異性。結(jié)果，評估了用于開發(fā)“現(xiàn)場”試驗的 其它快速診斷試驗形式。在評估的形式中，具有內(nèi)部肋片的塑料管顯示有希望的結(jié)果。因 此，選擇這種試管形式作為顯色試驗進一步優(yōu)化。實施例5現(xiàn)場試驗概念牛妊娠試驗(多孔板)在進一步的研究中，使用第28天從證實懷孕的母牛采集的血漿樣品確定顯色試 驗的靈敏性和特異性。顏色強度如下確定將樣品溶液轉(zhuǎn)移到2D9包被的多孔板。在讀板 器(SpectraMax, Molecular Devices, Inc.，CA)中讀板。血漿組由20個懷孕的20個未孕 的樣品組成。每個樣品測定兩次?；趶?0個樣品獲得的顏色強度的光密度，通過使用 0. 20D單位截值作為背景顏色，該試驗顯示100%的靈敏性和100%的特異性(圖9)。實施例6現(xiàn)場試驗概念牛妊娠顯色試驗(塑料管)材料與方法。下列方案描述了使用2D9包被的塑料管的妊娠試驗的優(yōu)化程序?？?以對使用K3EDTA采血管采集的全血樣品或?qū)ρ獫{樣品進行該試驗。材料。具有內(nèi)部肋片的試管(#214-2131-010)購自Evergreen Scientific Company, Los Angeles，California。PAG單克隆抗體2D9和兔多克隆抗體通過蛋白G親 和色譜法純化。兔多克隆抗體的生物素標記使用Roche生物素標記試劑盒(#1-418-165， Roche Applied Science, Indianapolis, Indiana)按照廠商說明進行。鏈霉親禾口 素-PolyHRP20 (#RDI-PHRP20-SA)購自 Research Diagnostics, Inc, Concord, MA。Sure Blue Reserve (#53-00-03)購自 KPL，Inc, Gaithersburg, MD。含有 TWEEN20 的 SuperBlock(#37516)從 Pierce Biotech, Rockford, IL 獲得。在磷酸鹽緩沖液(PH7. 4)中具有已知濃度的純化的2D9單克隆抗體；包被緩沖液0. IM Na2CO3, PH 9. 3 ；洗滌緩沖液含有0. 05% Tween20的IxPBS ；稀釋緩沖液在洗滌緩沖液中的10% SuperBlock 。多克隆抗體的生物素標記。純化的兔多克隆抗體(Img)用于按照試劑盒生產(chǎn)商 (Roche)推薦的程序進行生物素標記。簡言之，將7. 6μ1于DMSO中的活化的生物素試劑 加至1.5ml試管中含有Img抗體的1.0ml PBS溶液中。將試管置于45rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上， 室溫2小時。該步驟后，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到透析slide-A-lyzer (Pierce Biotech,#63380)， 并于4°C對IxPBS透析16小時，更換2次緩沖液。從Slide-A-Iyzer回收生物素標記的 IgG，并作為用含BSA的PBSl 100稀釋的貯存液貯存。該溶液在使用前用稀釋緩沖液 1 2000稀釋，用于妊娠試驗。試管的抗體包被。純化的單克降抗體2D9在0. IM碳酸鈉緩沖液(pH 9. 3)中稀釋 至濃度為ι. 25μ g/ml，用于包被試管。試管用0. 4ml碳酸鈉緩沖液中的0. 5 μ g抗體4°C 包被16-18小時。對于溫育，試管置于具有緊密閉合的氣密蓋子加用于濕潤的濕紙巾的塑 料容器內(nèi)部，并保持于4°C。溫育后，除去抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌試管兩次。然后用 0. 4ml superblock-TWEEN20于37°C封閉試管1小時。溫育后，除去superblock，并將試管 置于干燥室中室溫干燥2小時。該步驟后，密封試管，并在不合濕氣的塑料容器中4°C貯存 直到使用。包被的試管在6個月內(nèi)可用，具有最小的試驗性能損失。樣品采集。使用OvSynch同步方案使母牛達到同步發(fā)情。每個同步配種使用大約 200頭母牛?？偣?15頭母牛通過人工授精(Al)配種，AI日為第0天。將第26天和第28 天的800頭母牛的血樣采集到含有抗凝劑K3EDTA(BD#366643)的試管中，并通過連夜運輸 在冰上運送到實驗室。血樣在收到后直接用于顯色試驗。在大約第29天通過超聲檢查母 牛的妊娠狀態(tài)，并在大約第60天通過直腸觸診再次證實。在該研究結(jié)束時可以獲得797頭 母牛的妊娠診斷數(shù)據(jù)，并用于分析試驗的準確性。顯色試驗程序通過顛倒最多10次混合血樣，以便于樣品轉(zhuǎn)移。將400微升(0. 4ml)血液轉(zhuǎn)移 到每個管中，將試管在37°C水浴中溫育15分鐘。溫育后，吸出血樣，向試管中填充洗滌緩 沖液(含有0. 05% Tween20的IxPBS)。吸出洗滌緩沖液，并用洗滌緩沖液再洗滌試管兩 次。第三次洗滌后，向每管中加入0. 4ml用稀釋緩沖液(含有10% SuperblockT20 的洗 滌緩沖液)1 2000稀釋的生物素標記的抗PAG多克隆抗體，并在37°C水浴中溫育15分 鐘。溫育后，吸出試管的內(nèi)容物，并用洗滌緩沖液洗滌兩次。然后，向每管中加入含有0. 4ml 鏈霉親和素_PolyHRP20(l 30，000)的稀釋緩沖液，并在37°C水浴中溫育15分鐘。第三 次溫育后，吸出每管的內(nèi)容物，并用洗滌緩沖液洗滌試管兩次。然后，加入0.4ml HRP底物， SureBlueReserve ，并在室溫下溫育15分鐘。溫育后，在接收來自懷孕母牛的樣品的試管 中觀察到深藍色(圖10)。接收來自未孕動物的樣品的試管保持無色(圖10)?？梢阅恳?觀察顏色以推斷妊娠狀態(tài)。但是，為了在實驗室中對顏色進行定量，向每管中加入等體積的 (0. 4ml)終止溶液(IN HCl)，使藍色變?yōu)辄S色。然后將每一樣品的一等份(0.2ml)轉(zhuǎn)移到 ELISA板上，在430nm記錄光密度。大于或等于0. 2的OD值被認為是“懷孕的”，而低于0. 2 的值被認為是“未孕的”。顏色強度截值0. 20D是以前使用用于妊娠診斷的血漿測試組樣品 確定的。
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以下是試管試驗程序步驟的概述1.加入 400μ 1 樣品，37°C 15 分鐘2.血液洗滌3次，血漿洗滌2次3.加入400 μ 1生物素標記，370C 15分鐘4.洗滌2次5.加入 400 μ 1 Poly-HRP20,37°C 15 分鐘6.洗滌2次7.力口入 400 μ 1 SureBlue Reserve 8.讀數(shù)一 5min_15min (藍色=懷孕；無色=未孕)測試分析參數(shù)的定義靈敏性血液試驗確定懷孕母牛已懷孕的能力特異性血液試驗確定未孕母牛未懷孕的能力顯色試驗的優(yōu)點試驗用品包括用于采血的紫色帽采血管(3. 0!111，含K2EDTA)、預 包被的試管、試劑、洗瓶和移液管。需要37°C孵箱/加熱水池(waterback)/加熱部件。與 平板ELISA不同，該試驗不需要離心機來分離血漿，因為全血可以直接用于該試驗。該試 驗也不需要如平板振蕩器的裝置、洗滌裝置(洗板器)或讀數(shù)裝置(讀板器)。洗滌可以 用洗瓶實現(xiàn)，移液管用于除去洗滌之間的洗滌緩沖液。顏色可以目視觀察。但是，在實驗室 中，在顯色試驗結(jié)束時(第8步后)，向所有管中加入0.4ml終止溶液IN HC1，并將一等份 (0. 2ml)轉(zhuǎn)移到ELISA板中，用讀板器記錄顏色強度。與常規(guī)平板ELISA (4小時)相比，總 分析時間大約為2小時。該顏色分析可以任選地是多路分析，如使用96孔、48孔或24孔 板。結(jié)星。使用第28天血漿測試組(20個未孕和20個懷孕樣品)的顯色試驗的結(jié)果 在圖IlA中示出，使用第55天血漿測試組(20個未孕和20個懷孕樣品)的試驗結(jié)果在圖 IlB中示出。所有未孕樣品的顏色強度值均< 0. 20D，而懷孕樣品顯示顏色強度> 0. 20D。通過使用該截值，兩個測試組(圖IlA和11B)顯示> 95%的靈敏性和特異性。也 用該系統(tǒng)測試了一組新鮮血漿樣品，顯示能夠清楚地區(qū)分未孕母牛和懷孕母牛(圖12)。實施例7現(xiàn)場試驗概念牛妊娠顯色試驗(塑料管)該試驗如上所述在現(xiàn)場進行，使用37°C水浴，不使用額外的設(shè)備。在該現(xiàn)場試驗 中，檢測了 58個血樣。使用0. 4ml血樣進行了顯色試驗(圖13)，并通過超聲進行妊娠的 確認(圖14)。由3人觀察顏色，試驗結(jié)果的目視評分沒有不一致。顯色試驗?zāi)軌蜩b別所 有14頭懷孕母牛。所有3人將2個樣品評為“不確定”，因為其有藍色背景，發(fā)現(xiàn)該樣品為 “未孕的”。與超聲相比，該現(xiàn)場試驗顯示100%的靈敏性和92. 5%的特異性(37/40)。實施例8基于夾心免疫測定的妊娠顯色試驗(塑料管)材料與方法.使用PAG單克隆抗體2D9作為捕獲抗體和使用生物素標記的兔多克 隆抗體作為第二抗體發(fā)展了基于夾心免疫測定的試驗。PAG單克隆抗體包被在透明塑料管 或孔的內(nèi)部，并作為陷阱。使用的試管是內(nèi)部具有肋片的試管，以提高抗體包被的表面積 (Evergreen Scientific，Los Angeles，CA)。使用鏈霉親和素-HRP (辣根過氧化物酶)/HRP
24底物系統(tǒng)檢測復合物。鏈霉親和素Poly_HRP20獲自Research Diagnostics Inc. ,Concord, MA,辣根過氧化物酶獲自KPL，Inc.，Gaithersburg, MD。試管或孔中的顏色(藍色或黃色) 顯示檢測到復合物，表明樣品中存在PAG。關(guān)于建立用于檢測懷孕母牛和小母牛血清中PAG 的ELISA的信息可見Green等人，2005。分析標準是0. 5ng至6. Ongo該試驗需要大約4小 時完成。該試驗可以使用農(nóng)場或類似地點的簡單的實驗室用品進行。在該實施例中，37°C 孵箱和移液器是除試劑以外僅需的物品。顯色試驗概念可以與Ovsynch、再同步和定時人工 授精(Ovsynch，Resynch and Timed Artificial Insemination，TAI)結(jié)合作為牛繁殖管理 工具的一部分。該試驗概念也可以擴展到其它分析物，如孕酮和其它妊娠抗原，以提高診斷 的準確度或促進第26天前妊娠的檢測。多路分析可以使用例如96孔或48孔盤或或使用 多個試管來進行。表2.分析試劑、用品和供應(yīng)商信息 M^.通過與第29天超聲和第60天直腸觸診的結(jié)果相比較，對從第26天和第28 天動物采集的797個血液樣品的妊娠試驗的靈敏性和特異性進行了評估。獲得血漿樣品。 妊娠診斷的截值為0. 20D單位。表3顯示與第29天的基于超聲的妊娠診斷和第60天的直 腸觸診相比，血液檢驗的準確度。表3.與第29天超聲(US)和第60天直腸觸診相比，血液檢驗準確度的分析
這些結(jié)果表明，用PAG單克隆抗體2D9發(fā)展的牛妊娠試驗具有商業(yè)上可接受的準 確度，以及低假陰性結(jié)果。該抗體可以用于開發(fā)用來早在配種后第26天高靈敏性和特異性 地檢測牛妊娠狀態(tài)的快速試驗形式。進一步的分析顯示，通過將截值調(diào)整為0. 350D單位， 測試精度可以提高到99%的靈敏性和94%的特異性。實施例9適于發(fā)展牛妊娠試驗的早期PAG蛋白亞群的分離組織采集。授精后50-60天從早孕的牛中采集胎絨毛葉組織。妊娠50-60天是懷 孕的優(yōu)選時期，因為在這一妊娠階段或前后，早期PAG蛋白亞群占總PAG蛋白的高百分比。 但是盡管在授精后50-60天或前后，希望的早期PAG蛋白的百分比較高，但是總蛋白質(zhì)和可 獲得的組織的量較少。在授精后61-250天或前后，總PAG蛋白和胎絨毛葉和肉阜組織的量 高的多。可以用于鑒定結(jié)合2D9的蛋白質(zhì)以及對PAG的2D9結(jié)合位點作圖的方法。有四種 方法可用于鑒定結(jié)合2D9的蛋白質(zhì)、對2D9抗體進行表征和測序，以及對PAG的2D9結(jié)合位 點作圖。進行以下研究1.用2D9包被的磁珠免疫沉淀PAG(從第55天胎盤獲得的)。根據(jù)廠商說明 (Dynal)，將純化的2D9偶聯(lián)至甲苯磺?；罨腄ynal磁珠上?？贵w包被的磁珠與100微 克富含PAG的制品在Ix PBS中溫育30分鐘，并用相同的緩沖液充分洗滌。結(jié)合的蛋白質(zhì) 使用PH 3. 0乙酸洗脫，并進行凝膠和Western印跡分析。Western印跡用兔抗-PAG多克隆 抗體顯示。從SDS-PAGE上切下免疫反應(yīng)性蛋白條帶，并在胰蛋白酶消化后進行LC-MS-MS 分析。以下方法是可以進行的替代免疫沉淀法2.用2D9包被的磁珠免疫沉淀PAG(從第61-250天胎盤獲得的)。根據(jù)廠商說明 (Dynal)，將純化的2D9偶聯(lián)至甲苯磺酰基活化的Dynal磁珠上?？贵w包被的磁珠與100微 克PAG制品在Ix PBS中溫育30分鐘，并用相同的緩沖液充分洗滌。結(jié)合的蛋白質(zhì)使用PH 3. 0乙酸洗脫，并進行凝膠和Western印跡分析。Western印跡可以用兔抗-PAG多克隆抗 體顯示。然后從SDS-PAGE上切下免疫反應(yīng)性蛋白條帶，并在胰蛋白酶消化后進行LC-MS-MS 分析。早期PAG蛋白亞群(特別是PAG 4、6、9、20和21)的高度純化的制品可以利用該程 序純化。進行以下研究3.由牛妊娠第55天的肉阜(子宮內(nèi)膜)和絨毛葉(胎盤)組織制備的組織提取物的免疫親和色譜。簡要地說，根據(jù)廠商說明(Sigma，St. Louis)，將純化的2D9 (IOmg)偶 聯(lián)至1克CNBr活化的s印harose上。2D9-親和樹脂(大約5. Oml)與pH 7.0的25ml組 織提取物溫育過夜，進行結(jié)合。次日，將樹脂裝柱，并用Ix PBS洗滌，以除去未結(jié)合的材料， 并用PH 3.0乙酸洗脫。洗脫的材料的pH在洗脫后立即用IM Tris中和至pH 7.0。對洗 脫的材料進行凝膠和Western印跡分析。Western印跡用兔抗-PAG多克隆抗體顯示。從 SDS-PAGE上切下蛋白條帶1-7，并在胰蛋白酶消化后進行LC-MS-MS分析。利用BLAST分析 確定肽序列的身份。以下是可以進行的替代色譜方法4.由牛妊娠第61-250天的肉阜(子宮內(nèi)膜)和絨毛葉(胎盤)組織制備的組織 提取物的免疫親和色譜。簡要地說，根據(jù)廠商說明(Sigma，St. Louis)，將純化的2D9 (IOmg) 偶聯(lián)至1克CNBr活化的s印harose上。2D9-親和樹脂(大約5. Oml)與pH 7.0的25ml組 織提取物溫育過夜，進行結(jié)合。次日，將樹脂裝柱，并用Ix PBS洗滌，以除去未結(jié)合的材料， 并用PH 3.0乙酸洗脫。洗脫的材料的pH在洗脫后立即用IM Tris中和至pH 7.0。洗脫的 材料可以進行凝膠和Western印跡分析。Western印跡可以用兔抗-PAG多克隆抗體顯示。 從SDS-PAGE上切下蛋白條帶1-7，并在胰蛋白酶消化后進行LC-MS-MS分析。然后可以利 用BLAST分析確定肽序列的身份。早期PAG蛋白亞群(特別是PAG 4、6、9、20和21)的高 度純化的制品可以利用該程序純化。實施例10另外的結(jié)合2D9的PAG的鑒定如實施例1所總結(jié)的，發(fā)現(xiàn)MAb 2D9可識別五種PAG同工型(4、6、9、20和21)。通 過對從配種后55天收集的胎盤組織獲得的純化PAG樣品進行LC/MS/MS肽測序，鑒定這些 同工型。MAb 2D9進一步用于PAG的純化和鑒定，包括將抗體偶聯(lián)至CNBr活化的樹脂，以 產(chǎn)生免疫親和柱。純化樣品中存在的PAG可以被2D9結(jié)合(識別)。以類似的方式，在PAG ELISA中，牛全血或血漿樣品中存在的PAG可以被2D9結(jié)合并且引發(fā)指示懷孕的陽性ELISA 反應(yīng)。免疫純化過程中純化PAG的洗脫進行如下改變將pH從3. 0調(diào)整為2. 5，并在洗脫 液收集過程中立即中和至PH 7.0。使用純化的樣品，通過SDS-PAGE顯示純化的PAG，基本 如上所述進行(例如實施例1)。發(fā)現(xiàn)類似的條帶圖案，具有三個介于50和75kDa之間的主 要條帶。除了配種后55天從牛收集的胎盤組織以外，也從配種后215天的牛胎盤組織純化 了 PAG。PAG蛋白質(zhì)家族的某些成員(同工型)比其它成員在妊娠過程中早期表達。這組 在妊娠過程中較早表達的PAG通常被稱為早期PAG，而那組在妊娠過程中較晚表達的PAG通 常被稱為晚期PAG。來自配種后55天的胎盤組織代表表達早期PAG的妊娠期，而來自配種 后215天的胎盤組織代表包括晚期PAG表達的妊娠期。通過SDS-PAGE顯示來自第55天和 第215天胎盤組織的純化PAG，顯示了相同的位于50和75kDa之間的三條帶，但是第215胎 盤組織的較高分子量條帶的比例(強度)較大。使用2D9免疫親和柱純化來自第55天和第215天胎盤組織的PAG樣品的肽，并通 過LC/MS/MS肽測序進行分析，以鑒定樣品中存在的PAG同工型。將肽序列與從UniProt數(shù) 據(jù)庫(WWW. uniprot. org)獲得的PAG同工型序列(如表4中列出的)進行比較。表5顯示 肽序列結(jié)果的概況和它們通過BLAST分析被鑒定為對應(yīng)于boPAG-16、boPAG-17和boPAG_19
29序列的PAG。表5中提到的“泳道”和“條帶”(下、中)在圖17中顯示。在純化PAG樣品 中表征的PAG同工型的概況在表6中示出。表4.具有 UniProt 登錄號的 PAG 同工型(SEQ ID NO :51_62) · 表5.肽序列結(jié)果概況(包括SEQ ID NO :63_74)。“MH+”=肽的質(zhì)荷比，加水；“電 荷”=離子電荷狀態(tài)；“P(p印)，，=肽序列的概率；“起點”=與肽比對的蛋白質(zhì)的起始氨基 酸；“終點”=與肽比對的蛋白質(zhì)的終止氨基酸 蛋白條帶編號存在于條帶泳道3(中)> 泳道4(中)、泳道5(中 >、泳道6(中)牛(gi75051662)妊娠;te關(guān)糖J!■白 19MH+電荷起點終點P(PeP)肽序列1760.8385032122291.00E-06KDKQEGSVVMFGGVDHRY (SEQ ID N0:70)1088.5371121261374.36E-06KTFSITYGSGRI (SEQ ID NO:71)2243.0661632132311.32E-03DKQEGSVVMFGGVDHRYYR (SEQ ID NO:72)1046.5305223613709.55E-04RLYFSVFDRG (SEQ ID NO:73)1770.9061321962136.03E-09KNQGAISEPVFAFYLSKD (SEQ ID NO:74)表6.在第55天和第215天胎盤組織中表征的PAG同工型 表4所示的多肽序列使用例如來自PHYLIP軟件包(Felsenstein，1989)的 PROTDIST v. 3. 5c進行比對。對比對的序列應(yīng)用PR0TDIST的相鄰系統(tǒng)發(fā)生樹分析包，以產(chǎn) 生如圖15所示的樹。PAG的比對顯示在圖16中。對PAG同工型1、4、6、9、16、17、19、20和 21進行這種分析，以基于它們的相似性和差異區(qū)顯示同工型的相關(guān)性。根據(jù)該分析，除PAG 1 以外，PAG 4、6、9、16、17、19、20 和 21 聚類在一起。
氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺根據(jù)本申請的公開內(nèi)容，此處公開和請求保護的所有組合物和方法不需要過多的 實驗都可以制備和實施。盡管已經(jīng)通過優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明白，可以對此處所述的組合物和方法的步驟或步驟順序進行改變， 而不偏離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體而言，應(yīng)當明白，某些化學和生理學均相關(guān)的 試劑可以替換此處所述的試劑，而獲得相同或相似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白的所有這 些類似的替代物和改變都被認為處于由所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念 之內(nèi)。參考文獻以下參考文獻通過參考具體并入本文，提供用于補充本文所述內(nèi)容的示例性的程 序上的或其它方面的細節(jié)美國專利3646，346
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3權(quán)利要求
免疫學結(jié)合至少兩種選自PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG17、PAG19、PAG20和PAG21的PAG的抗體或其片段。
2.權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段免疫學結(jié)合PAG4、PAG6、PAG9、 PAG16、PAG17、PAG19、PAG20 和 PAG21。
3.以ATCC保藏號PTA-8566保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段。
4.以ATCC保藏號PTA-8566保藏的分離的細胞，或其產(chǎn)生抗體2D9的后代細胞。
5.編碼抗體重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域的分離的多核苷酸，其中所述重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域選自a)與SEQID NO 1有至少97%的序列同一性的多肽序列；b)與SEQID NO 2有至少92%的序列同一性的多肽序列；c)包含SEQID NO 1的多肽序列；和d)包含SEQID NO 2的多肽序列。
6.權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述結(jié)構(gòu)域包含與SEQID NO :1有大于97%的序列同 一性的多肽序列。
7.權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述結(jié)構(gòu)域包含SEQID N0:1。
8.權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述結(jié)構(gòu)域包含與SEQID NO :2有大于92%的序列同 一性的多肽序列。
9.權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所述結(jié)構(gòu)域包含SEQID N0:2。
10.權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸被進一步定義為編碼SEQID N0:3的 多肽序列。
11.權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸被進一步定義為編碼SEQID N0:4的 多肽序列。
12.權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID N0:5。
13.權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID N0:6。
14.一種包含抗體重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域的分離的多肽，其中所述重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域選自a)與SEQID NO 1有至少97%的序列同一性的多肽序列；b)與SEQID NO 2有至少92%的序列同一性的多肽序列；c)包含SEQID NO 1的多肽序列；和d)包含SEQID NO 2的多肽序列。
15.權(quán)利要求14的多肽，其進一步限定為包含與SEQID NO :1有至少97%的序列同一 性的序列和與SEQ ID NO 2有至少92%的序列同一性的多肽序列。
16.權(quán)利要求15的多肽，其中所述多肽免疫學結(jié)合選自PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、 PAG17、PAG19、PAG20 和 PAG21 的至少第一 PAG。
17.包含權(quán)利要求14的多肽的抗體或其片段。
18.—種檢測牛動物懷孕的方法，包括a)從牛動物獲得樣品；b)使該樣品接觸權(quán)利要求1的抗體或其片段；和c)確定該樣品是否含有能夠被所述抗體或其片段免疫學結(jié)合的至少第一妊娠相關(guān)抗 原(PAG)，其中樣品中存在該PAG指示懷孕。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體或其片段是單克隆抗體2D9。
20.權(quán)利要求18 的方法，其中所述 PAG 選自 PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG17、PAG19、 PAG20 禾口 PAG21。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述PAG是PAG6。
22.權(quán)利要求18的方法，其中確定樣品是否含有至少第一妊娠相關(guān)抗原包括ELISA或 Western印跡法。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述ELISA是夾心ELISA，包括PAG與固定到基底上的抗 體或其片段和酶標記的第二抗體制品的結(jié)合。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述酶是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
25.—種試劑盒，包括(a)權(quán)利要求1的抗體或其片段；和(b)所述抗體或其片段的容器。
26.權(quán)利要求25的試劑盒，進一步含有用于檢測所述抗體或其片段與至少第一妊娠相 關(guān)抗原(PAG)之間的免疫結(jié)合的裝置。
27.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述抗體或其片段附著到支持體上。
28.權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述支持體是聚苯乙烯板、試管或試條。
29.權(quán)利要求25的試劑盒，進一步包括可檢測標記。
30.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述可檢測標記是熒光或化學發(fā)光標記。
31.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述可檢測標記是酶。
32.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述酶是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
33.一種純化至少第一妊娠相關(guān)抗原(PAG)的方法，包括a)獲得包含至少第一妊娠相關(guān)抗原(PAG)的樣品；和b)基于PAG對權(quán)利要求1的抗體或其片段的親和力，相對于所述樣品純化PAG。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述樣品從第50天到第250天的牛胎盤獲得。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述樣品從第61天到第250天的牛胎盤獲得。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述純化包括免疫沉淀、Western印跡法或免疫親和色譜法。
全文摘要
本文公開了用于檢測動物懷孕的抗體和方法。在某些方面，使用的抗體免疫學結(jié)合至少兩種選自PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG17、PAG19、PAG20和PAG21的PAG。也提供了編碼抗體的核酸，以及試劑盒、使用方法和另外的抗體相關(guān)組合物。
文檔編號G01N33/53GK101918445SQ200880124722
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日
發(fā)明者J·格林, M·F·麥克格拉斯, N·馬賽亞拉甘, R·M·羅伯斯 申請人:孟山都技術(shù)公司;密蘇里大學管理者