專利名稱：使用了包覆磁性微粒的生物傳感方法以及用于該方法的生物傳感裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物傳感方法，更詳細而言，涉及使用了包覆磁性微粒的生物傳感方 法。
背景技術(shù)：
以往，在生物傳感技術(shù)領(lǐng)域中，對于利用了在具有相互互補的序列的多核苷酸間 產(chǎn)生的互補結(jié)合的DNA芯片、利用了在抗原和抗體之間產(chǎn)生的特異性結(jié)合的抗體芯片等進 行了各種研究。在這方面而言，日本特表2005-533236號公報(專利文獻1)中公開了一種 使用了夾心法ELISA的抗原的檢測和測定方法。圖9為以時間序列示出專利文獻1中公開 的夾心法ELISA的步驟的圖。首先，如圖9的(a)所示那樣，使與檢測對象即抗原特異性結(jié) 合的第1抗體42吸附到基板44上而固相化。接著，如圖9的(b)所示那樣，將基板44浸 漬到含有作為檢測對象的抗原46的試樣溶液后，添加識別與第1抗體42不同表位的第2 抗體48。此時，第2抗體48預(yù)先通過酶或熒光物質(zhì)等分子標(biāo)記50而標(biāo)記。在經(jīng)過充分的 反應(yīng)時間后，洗滌基板44而除去未反應(yīng)的物質(zhì)，則如圖9的(c)所示那樣，在基板表面形成 基板44-第1抗體42-抗原46-第2抗體48這樣的復(fù)合體。這里，通過使用所對應(yīng)的測定 體系來測定與第2抗體48結(jié)合的分子標(biāo)記50，間接地檢測抗原46。以上，如例示出夾心法ELISA而說明的那樣，很多生物傳感通常都利用了抗體抗 原反應(yīng)等生物分子間的親和(親和性)反應(yīng)，這種親和反應(yīng)通常大多都需要數(shù)小時以上的 反應(yīng)時間，該反應(yīng)工序降低了傳感操作的處理量。此外，日本特開2003-130880號公報(專利文獻2)中公開了使用磁性微粒的夾心 法ELISA的其他方法。

圖10為以時間序列示出專利文獻2中公開的使用磁性微粒的夾心 法ELISA的步驟的圖。如圖10的(a)所示那樣，在專利文獻2中，使與檢測對象即抗原52 特異性結(jié)合的第1抗體54吸附到磁性顆粒56上，將所形成的抗體_磁性顆粒復(fù)合體58添 加到含有作為檢測對象的抗原52的試樣溶液后，靜置充分的時間使第1抗體54與抗原52 反應(yīng)。接著，如圖10的(b)所示那樣，利用磁鐵60的作用將抗體-磁性顆粒復(fù)合體58磁 性集中，并洗滌而除去未反應(yīng)的物質(zhì)。接著，如圖10的(c)所示那樣，對于僅含有抗體-磁 性顆粒復(fù)合體58與抗原52結(jié)合而成的復(fù)合體的試樣溶液，加入利用分子標(biāo)記62而標(biāo)記的 第2抗體64，使其充分反應(yīng)。其結(jié)果，如圖10的(d)所示那樣，形成磁性顆粒56-第1抗 體54-抗原52-第2抗體64這樣的復(fù)合體。這里，若再次利用磁鐵60的作用將磁性顆粒 56磁性集中，并洗滌而除去未反應(yīng)的第2抗體64，則如圖10的(e)所示那樣，僅殘留磁性 顆粒56-第1抗體54-抗原52-第2抗體64這樣的復(fù)合體，這里，通過使用所對應(yīng)的測定 體系來測定與第2抗體64結(jié)合的分子標(biāo)記62，間接地檢測抗原52。然而，專利文獻2只不過是通過使用磁性顆粒而省略了耗費時間的離心分離工 序，在圖10的(a)和(c)所示的工序中的抗體抗原反應(yīng)依然需要數(shù)小時的反應(yīng)時間，專利 文獻1完全沒有解決上述問題。如以上所說明的那樣，在以往的生物傳感技術(shù)中，抗體抗原反應(yīng)等親和反應(yīng)的工序成為瓶頸而降低了處理量，正在尋求一種縮短該反應(yīng)時間的方法。另一方面，近年來，作為用于生物傳感的標(biāo)記物質(zhì)，磁性顆粒受到矚目。相對于因 猝滅的影響而可能會經(jīng)時退色的熒光物質(zhì)，磁性顆粒除了其物性(磁性)不會經(jīng)時劣化以 外，還確立了能夠高速且以高精度測定磁力的優(yōu)異的測定體系，此外，對于磁性顆粒，可以 期待與利用其磁性的操作等相關(guān)聯(lián)的、作為標(biāo)記物質(zhì)的潛在的有效性，因而在生物傳感的 領(lǐng)域中面臨著磁性顆粒的更進一步的應(yīng)用開發(fā)。在這方面，本申請人在先申請的日本特開2006-88131號公報(專利文獻3)中公 開了一種新型的聚合物包覆磁性微粒。該聚合物包覆磁性微粒具有數(shù)十nm 數(shù)百nm的平 均粒徑，良好地實現(xiàn)了以往在聚合物包覆的磁性顆粒中難以實現(xiàn)的高分散性與磁響應(yīng)性的兼顧。專利文獻1 日本特表2005-533236號公報專利文獻2 日本特開2003-130880號公報專利文獻3 日本特開2006-88131號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題而進行的，本發(fā)明的目的在于提供一種新型 的生物傳感方法作為磁性顆粒在生物傳感中的新的應(yīng)用開發(fā)，該方法利用了其作為標(biāo)記的 優(yōu)越性，同時改善了傳感的處理量。用于解決問題的方案本發(fā)明人等對磁性顆粒在生物傳感中的新的應(yīng)用開發(fā)進行了深入研究，結(jié)果想 到在生物傳感中的親和反應(yīng)中，通過將配體或受體固定在磁性微粒上，并將該磁性微粒朝 向親和反應(yīng)的反應(yīng)場強制性磁引導(dǎo)，從而使傳感中的控速因子即親和反應(yīng)迅速化。此外，本 發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)作為上述磁性微粒，采用一種特征在于兼具高分散性和高磁響應(yīng)性這兩者 的包覆磁性微粒，從而上述親和反應(yīng)迅速且以高密度發(fā)生，其結(jié)果是，與以往相比能夠以 非常短的時間獲得大的信號；由此完成了本發(fā)明。即，根據(jù)本發(fā)明，提供一種利用親和反應(yīng)的生物傳感方法，其特征在于，將所述親 和反應(yīng)中的配體固定在磁性微粒上，并將該磁性微粒朝向所述親和反應(yīng)的反應(yīng)場強制性磁 引導(dǎo)。本發(fā)明的方法能夠進一步包括一邊振蕩所述反應(yīng)場、一邊洗滌的工序，能夠進一步包 括一邊將所述磁性微粒向遠離所述反應(yīng)場的方向磁引導(dǎo)、一邊洗滌的工序。另外，本發(fā)明 中，所述磁性微粒的平均粒徑優(yōu)選為3 400nm，優(yōu)選為聚合物包覆磁性微?；虮缓泄倌?團的分子包覆的磁性微粒。另外，本發(fā)明中，能夠使所述磁性微粒為具備熒光功能的微粒， 能夠使所述聚合物包覆磁性微粒為在聚合物層導(dǎo)入了熒光物質(zhì)的磁性微粒。本發(fā)明中，能 夠使用磁傳感器進行傳感，還能夠使用光學(xué)檢測器、尤其是熒光檢測器進行傳感。此外，還 能夠利用使用了表面等離子共振法的sra傳感器或使用了石英晶體微天平法的質(zhì)量檢測 傳感器進行傳感。另外，根據(jù)本發(fā)明的其他方案，提供一種生物傳感裝置，其特征在于，該生 物傳感裝置利用了親和反應(yīng)，且具備磁引導(dǎo)單元，所述磁引導(dǎo)單元用于將固定有所述親和 反應(yīng)的配體的磁性微粒朝向所述親和反應(yīng)的反應(yīng)場強制性磁引導(dǎo)。此外，根據(jù)本發(fā)明，可提供如下方 ，其特征在于，在檢測與2個抗體特異性結(jié)合的抗原的夾心ELISA法中，朝向固定有第1抗體的基板，對固定有第2抗體的磁性微粒強制 性磁引導(dǎo)。此外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種檢測癌細胞的方法，其特征在于，將患者的組織切片 放置于基板上，朝向該基板，對固定有與癌組織特異性表達的蛋白質(zhì)分子特異性結(jié)合的抗 體的磁性微粒強制性磁引導(dǎo)。發(fā)明的效果如上所述，根據(jù)本發(fā)明，提供一種新型的生物傳感方法作為磁性顆粒在生物傳感 中的新的應(yīng)用開發(fā)，該方法利用了其作為標(biāo)記的優(yōu)越性，同時改善了生物傳感的處理量。根 據(jù)本發(fā)明的生物傳感方法，可良好地促進親和反應(yīng)，因此能夠以短時間獲得較高的信號，而 且通過標(biāo)記磁性顆粒可實現(xiàn)高速且高精度的分析。
具體實施例方式以下，通過附圖所示的實施方式對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明不限于附圖所示的 實施方式。首先，關(guān)于本發(fā)明的使用包覆磁性微粒的生物傳感方法的機制，以作為生物傳感 的方法之一而較多使用的夾心法ELISA的反應(yīng)體系為例進行說明。圖1為以時間序列示出 夾心法ELISA的反應(yīng)體系10的圖。如圖1的(a)所示那樣，試樣溶液12含有檢測對象即 抗原14和除此以外的蛋白質(zhì)16以及蛋白質(zhì)18，表面吸附并固相化有與抗原14特異性結(jié)合 的第1抗體20的基板22浸漬于試樣溶液12中。在以往的夾心法ELISA中，在這種反應(yīng)體 系中加入與抗原14特異性結(jié)合的第2抗體，該第2抗體通過酶或熒光物質(zhì)等分子標(biāo)記而被 標(biāo)記，但本發(fā)明中，特征在于使用在磁性微粒26上固定有該第2抗體24的抗體-磁性微粒 復(fù)合體28。本發(fā)明中，磁性微粒26優(yōu)選為磁響應(yīng)性優(yōu)異的微粒，同時，優(yōu)選使用具有接近單 分散的高分散性的微粒。具體而言，優(yōu)選使用平均粒徑為3 400nm的微粒，更優(yōu)選使用 10 200nm的微粒。關(guān)于兼具高磁響應(yīng)性和高分散性的極小尺寸的磁性微粒，以往，其制作 較為困難，但本申請人在先申請的日本特開2006-88131號公報、日本特愿2006-313493號、 和日本特愿2007-194233號中公開的發(fā)明已經(jīng)實現(xiàn)了其制作。另外，本發(fā)明中的磁性微粒 26的詳細內(nèi)容如后所述。這里，磁性微粒26是與以往的微粒相比相當(dāng)小的微粒，例如，可以是粒徑200nm左 右的微粒，其擴散系數(shù)為10_8左右，與以往的分子標(biāo)記的擴散系數(shù)即約10_6左右相比，該擴 散系數(shù)小2個數(shù)量級，由此也導(dǎo)致其反應(yīng)速度與使用以往的分子標(biāo)記的反應(yīng)體系的反應(yīng)速 度相比更小。在這方面，本發(fā)明人等采用了通過對磁性微粒26磁引導(dǎo)從而使抗體_磁性微粒復(fù) 合體28接近反應(yīng)場的方案。關(guān)于其機制，參照圖1的(b)進行說明。對于圖1的(b)所示的反應(yīng)體系10，本發(fā)明的方法中，通過使用磁產(chǎn)生部30對抗 體_磁性微粒復(fù)合體28磁引導(dǎo)，從而彌補由于磁性微粒26的擴散系數(shù)小而導(dǎo)致的反應(yīng)性 的降低。圖1的(b)所示的反應(yīng)體系10中，由于第1抗體20固定在基板22的表面，因而基 板22的表面附近成為抗體抗原反應(yīng)的反應(yīng)場R。因此，本發(fā)明中，通過將磁產(chǎn)生部30例如 配置于基板22的背側(cè)，從而使磁力作用于反應(yīng)體系10，由此，將抗體-磁性微粒復(fù)合體28 強制性磁引導(dǎo)至基板22的表面附近、即反應(yīng)場R。通過采用這種方案，抗體20-抗原14-抗 體24的夾心法反應(yīng)迅速化，其結(jié)果，如圖1的(c)所示那樣，抗體-磁性微粒復(fù)合體28以高密度吸附在基板22上。另外，作為本發(fā)明中的磁力產(chǎn)生部30，可以適當(dāng)使用永久磁鐵、電 磁鐵等。另外，本發(fā)明中，由于磁性微粒26的平均粒徑為3 400nm左右，非常小，因而良 好地避免了因反應(yīng)體系10的流動所致的沖量(impulse)的影響，其結(jié)果是，抗體-磁性微 粒復(fù)合體28的吸附后的穩(wěn)定性被保持。這意味著，由于洗滌工序等而喪失親和反應(yīng)的特異 性結(jié)合的可能性低，由此，確保了較高的傳感精度。此外，本發(fā)明的生物傳感方法以上述吸附后的穩(wěn)定性為基礎(chǔ)，從進一步提高傳感 精度的觀點出發(fā)，公開了以下所示的方法。圖2為在本發(fā)明的生物傳感方法中使用圖1所 示的夾心法ELISA的反應(yīng)體系10對選擇性除去不基于親和反應(yīng)的非特異性結(jié)合的洗滌工 序進行說明的圖。如圖2的(a)中箭頭所示那樣，抗體-磁性微粒復(fù)合體28F有時通過不 基于抗原抗體反應(yīng)的非特異性結(jié)合而吸附在基板22上。這種抗體-磁性微粒復(fù)合體28F 的存在會降低傳感的精度，因而需要選擇性除去。因此，本發(fā)明中，如圖2的(b)所示那樣， 可以使用未圖示的板振蕩器等一邊振蕩反應(yīng)體系10、一邊進行洗滌。另外，此時，優(yōu)選不從 配置于基板22背側(cè)的磁產(chǎn)生部30作用磁力。于是，通過上述振蕩使得通過非特異性結(jié)合 而吸附在基板22上的抗體-磁性微粒復(fù)合體28F從基板22脫離，另一方面，通過基于抗原 抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合而吸附在基板22上的其他抗體-磁性微粒復(fù)合體28不太會受到反 應(yīng)體系10的流動所致的沖量的影響，因而不脫離，通過將其洗滌并回收，能夠選擇性除去 非特異性結(jié)合。此外，本發(fā)明中，如圖2的(c)所示那樣，可以在基板22的另外一側(cè)配置磁產(chǎn)生部 30，一邊將抗體-磁性微粒復(fù)合體28F向遠離反應(yīng)場R的方向磁引導(dǎo)、一邊洗滌。于是，通 過非特異性結(jié)合而吸附在基板22上的抗體-磁性微粒復(fù)合體28F由于磁力的作用而從基 板22脫離，磁性集中到磁產(chǎn)生部30側(cè)，另一方面，由于基于抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合力 比磁力的作用力更大，因而不脫離，通過將其洗滌并回收，能夠選擇性除去非特異性結(jié)合。 本發(fā)明中，為了實現(xiàn)更高的傳感精度，在洗滌工序中，優(yōu)選一并進行上述振蕩和磁弓I導(dǎo)。以上，以夾心法ELISA的反應(yīng)體系為例對本發(fā)明的生物傳感方法進行說明，但本 發(fā)明不限于利用抗原抗體反應(yīng)的生物傳感，能夠適用于所有利用親和反應(yīng)的生物傳感方 法。另外，本發(fā)明中的親和反應(yīng)的概念包含核酸DNA的互補性結(jié)合、核酸與蛋白質(zhì)的特異 性結(jié)合、與信號傳遞體系相關(guān)的蛋白質(zhì)與其受體蛋白質(zhì)的結(jié)合或者Protein A或Protein G 與抗體的Fc部位的結(jié)合這類蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合、酶與其底物的特異性結(jié)合、激素分 子與其受體的特異性結(jié)合、糖鏈與凝集素的特異性結(jié)合等生物分子間(還包括與經(jīng)人工改 變的生物分子的反應(yīng))的特異性反應(yīng)；以及，使用了適體等的人工抗體樣分子與生物分子 的特異性結(jié)合、藥劑或藥劑候選物質(zhì)與生物分子的特異性結(jié)合、抗生物素蛋白與生物素的 特異性結(jié)合等低分子化合物與生物分子(還包括與經(jīng)人工改變的生物分子的反應(yīng))之間的 特異性反應(yīng)。另外，本發(fā)明中，配體意味著構(gòu)成上述親和反應(yīng)(特異性結(jié)合)的要素中的任 一者，并且意味著能夠通過親和力而吸附到構(gòu)成該反應(yīng)的其他要素上的相互匹配的物質(zhì)。作為本發(fā)明的應(yīng)用例，例如，可列舉出如下方案在將具有與作為分離對象的核酸 互補的堿基序列的核酸固定在芯片上而成的所謂的DNA芯片中，將作為分離對象的核酸固 定在上述磁性微粒上而形成核酸_磁性微粒復(fù)合體，將該核酸_磁性微粒復(fù)合體添加到上 述芯片上時，從該芯片的背側(cè)作用磁力而對核酸-磁性微粒復(fù)合體磁引導(dǎo)，從而使核酸間的互補性結(jié)合迅速化。另外，本發(fā)明的生物傳感法如以上所示的夾心法ELISA或DNA芯片的例子那樣，不 限于使用預(yù)先固定有抗體或核酸等分子的基板的情況，還能夠?qū)悠分苯討?yīng)用。以下，對于 這樣的應(yīng)用例，參照圖3和圖4進行說明。通常，在醫(yī)療診斷中判斷癌的轉(zhuǎn)移時，如圖3所示那樣，從患者42摘取疑為癌的 轉(zhuǎn)移處的前哨淋巴結(jié)，研究在該組織中是否存在癌組織特異性表達的蛋白質(zhì)分子。本實施 方式中，將從患者42摘取的組織切片44放置于載玻片46上，利用抗原抗體反應(yīng)實施生物 傳感。如果癌轉(zhuǎn)移了的話，則從癌細胞48的切斷面應(yīng)該表露出癌組織特異性表達的蛋白質(zhì) 分子50。圖4所示為對于從患者42摘取的組織切片44使用本發(fā)明的生物傳感法研究有無 癌細胞的步驟。如圖4的(a)所示那樣，首先，將放置有組織切片44的載玻片46設(shè)置在反 應(yīng)容器56中，該反應(yīng)容器56充滿了含有固定了針對蛋白質(zhì)分子50的抗體52的磁性微粒 54的反應(yīng)液。接著，在載玻片46的背側(cè)配置磁產(chǎn)生部58，通過對磁性微粒54磁引導(dǎo)，從而 如圖4的(b)所示那樣，介由蛋白質(zhì)分子50與抗體52的抗原抗體反應(yīng)，磁性微粒54迅速 吸附到癌細胞48的表面。然后，以在圖1和圖2中說明的同樣的步驟實施洗滌，從而如圖 4的(c)所示那樣，多余的磁性微粒54被排除。最后，通過檢測殘留的磁性微粒54，能夠確 定癌細胞的存在。另外，在本發(fā)明的使用包覆磁性微粒的生物傳感方法中，可以使用高靈敏度磁傳 感器作為其測定體系，通過高速且高精度地測定包覆磁性微粒的磁力，可以實現(xiàn)可靠性高 的傳感。作為在本發(fā)明中使用的磁傳感器，可列舉出霍爾元件、SQUID元件、MR元件、GMR元 件、TMR元件、和MI元件等。此外，本發(fā)明中，還可以采用使用了表面等離子共振法的SI^R傳 感器、使用了石英晶體微天平法的質(zhì)量檢測傳感器作為其測定體系。接著，對于在本發(fā)明的生物傳感方法中使用的磁性微粒26進行以下說明。以往， 對于包覆磁性微粒在生物傳感領(lǐng)域中的應(yīng)用進行了各種研究，但是在包覆磁性微粒中，其 分散性和對磁場的響應(yīng)性處于二律相悖的關(guān)系，難以制作兼具這兩者的材料。在這方面， 本申請人在先申請的日本特開2006-88131號公報所公開的發(fā)明的發(fā)明人等，創(chuàng)造出一種 粒徑非常小、聚合物覆膜良好、且兼具高分散性和高磁響應(yīng)性的聚合物包覆磁性微粒。本發(fā) 明中，作為磁性微粒26，可以使用日本特開2006-88131號公報中公開的平均粒徑為25 400nm左右的聚合物包覆磁性微粒。這里，對于上述聚合物包覆磁性微粒的制造方法進行以 下概述。首先，使平均粒徑為20 300nm的鐵氧體顆粒等親水性的強磁性微粒吸附脂肪酸 等疏水化物質(zhì)而疏水化，對其使用非離子性的具有親水基的表面活性劑來抑制離子強度， 并進行親水化，獲得分散液。另一方面，使用非離子性表面活性劑和離子性表面活性劑將聚 合物包覆的單體液乳化。作為單體，可以使用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和苯乙烯。接 著，通過混合上述分散液和上述單體的乳化液而進行乳液聚合，良好地分散的強磁性微粒 進行了均勻且穩(wěn)定的聚合物包覆，其結(jié)果，獲得顆粒尺寸統(tǒng)一、且對磁場的響應(yīng)性良好的聚 合物包覆的強磁性微粒。另外，為了在上述聚合物包覆的強磁性微粒上固定配體，可以對上述聚合物覆膜 導(dǎo)入能夠與配體反應(yīng)的官能團。例如，可以對聚合物覆膜導(dǎo)入環(huán)氧基，此外也可以將上述 環(huán)氧基用氨處理而導(dǎo)入羥基和氨基。此外，還可以使上述氨基與單乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)或聚乙二醇二縮水甘油醚分子結(jié)合而形成隔離物(spacers)。通過介由這種隔離物 而將生物分子固定，從而能夠避免聚合物包覆的強磁性微粒的立體障礙。另外，本發(fā)明中，作為磁性微粒26，可以使用本申請人在先申請的日本特愿 2007-194233號公開的、用檸檬酸等含有親水性官能團的分子包覆而成的平均粒徑3 40nm左右的包覆磁性微粒。這里，對上述包覆磁性微粒的制造方法進行以下概述。首先，在 分散有用脂肪酸包覆的磁性微粒的非極性溶劑中，添加硫代蘋果酸等作為暫時包覆物質(zhì)， 將顆粒的脂肪酸包覆先用該暫時包覆物質(zhì)包覆置換。接著，將用該暫時包覆物質(zhì)包覆的磁 性微粒分散到極性溶劑中，向該分散液中添加檸檬酸等含有親水性官能團的分子，將磁性 微粒上覆蓋的暫時包覆物質(zhì)覆膜用含有該官能團的分子置換。通過上述步驟，可獲得用含 有親水性官能團的分子包覆的、在水系等極性溶劑中也能良好地分散的包覆磁性微粒。通 過含有這些官能團的分子包覆而成的磁性顆粒具有均勻的粒徑，磁特性也均勻，因而在磁 傳感中可獲得更好的定量性。另外，作為上述親水性的低分子物質(zhì)，可以使用蘋果酸、檸檬酸、酒石酸等具有羥 基的多元羧酸，天冬氨酸、谷氨酸等具有氨基的多元羧酸，兒茶酚、水楊酸等具有酚性羥基 的化合物及其衍生物，分子量比較小的寡肽，蛋白質(zhì)等大分子，半胱氨酸等具有巰基的化合 物，磺基丙氨酸等具有磺酸基的化合物，具有磷酸基的化合物，具有硅烷三醇的化合物等。 此外，還可以使用核酸及其衍生物、葡聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚 賴氨酸、海藻酸、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、明膠及其衍生物。此外，本發(fā)明中，作為磁性微粒26，可以使用本申請人在先申請的日本特愿 2006-313493號公開的聚合物包覆磁性微粒，該聚合物包覆磁性微粒在該包覆聚合物層的 內(nèi)部保持有熒光物質(zhì)。這里，對上述保持有熒光物質(zhì)的聚合物包覆磁性微粒的制造方法進 行以下概述。首先，將聚合物包覆磁性微粒浸漬到溶解有熒光物質(zhì)的非水系溶劑中，使熒光 物質(zhì)與溶劑一起吸收到聚合物層的內(nèi)部后，從該聚合物層除去非水系溶劑，從而獲得在聚 合物層導(dǎo)入了熒光物質(zhì)的聚合物包覆磁性微粒。上述熒光聚合物包覆磁性微粒除了可利 用上述磁傳感器檢測和測定外，還能夠應(yīng)用于以顆粒的熒光功能作為標(biāo)記并使用熒光檢測 器等光學(xué)檢測器的測定。如以上所說明的那樣，本發(fā)明中的磁性微粒26具有優(yōu)異的磁響應(yīng)性，因此能夠利 用磁引導(dǎo)而良好地促進親和反應(yīng)。另外，磁性微粒26具有接近單分散的高分散性，在反應(yīng) 場中可避免凝聚，其結(jié)果是，不易產(chǎn)生由于親和反應(yīng)以外的非特異性結(jié)合導(dǎo)致的傳感誤差。本發(fā)明的使用包覆磁性微粒的生物傳感方法的優(yōu)點在于，通過將固定有配體的磁 性微粒磁引導(dǎo)至反應(yīng)場附近，可使生物傳感中的控速因子即親和反應(yīng)迅速化。根據(jù)本發(fā)明， 在親和反應(yīng)中，尤其是其反應(yīng)起始變得更快，因而能夠以短時間獲得測定體系的進入測定 范圍內(nèi)的高信號，其結(jié)果是，能夠以數(shù)分鐘的等待時間預(yù)測樣品內(nèi)的所期望的生物分子的 量。這暗示了本發(fā)明的廣泛的應(yīng)用開發(fā)。本發(fā)明尤其被預(yù)測在要求緊急性的醫(yī)療現(xiàn)場的應(yīng) 用開發(fā)。例如，以往，關(guān)于癌的手術(shù)中的病灶的最終切除范圍，基于醫(yī)生的經(jīng)驗通過目視進 行判斷，但根據(jù)本發(fā)明，能夠在手術(shù)中實時獲取有關(guān)疑似癌的轉(zhuǎn)移的部位的分子水平的信 息(癌組織特異性表達的蛋白質(zhì)分子是否存在)，能夠當(dāng)場確認有無轉(zhuǎn)移，因而能夠?qū)η谐?范圍進行更準(zhǔn)確的判斷。實施例
以下，關(guān)于本發(fā)明的使用包覆磁性微粒的生物傳感方法，利用實施例進行更具體 的說明，但本發(fā)明不限于后述的實施例。(實施例1)反應(yīng)模型體系的調(diào)制本實施例中，將用于檢測腦鈉肽(BNP，Brain Natriuretic P印tide)的夾心法 ELISA作為反應(yīng)模型體系。反應(yīng)模型體系如下形成首先，將作為腦鈉肽(以下，稱為BNP) 的抗體的BC203(鹽野義制藥株式會社)吸附到金基板(5mmX5mm)上并固相化，并且在粒 徑約200nm的聚合物包覆磁性微粒(以下，稱為TO珠)、粒徑約27nm的檸檬酸包覆的磁性 微粒、市售的磁性顆粒DYNA珠(粒徑2. 8 μ m，DYNAL,羧基)這3種磁性微粒的表面固定BNP 的另一抗體即KY2 (鹽野義制藥株式會社)。另外，關(guān)于上述各種抗體_磁性微粒復(fù)合體，按 照每單位磁性微粒重量所固定化的抗體量相等的方式進行調(diào)制。抗體在金基板上的固定化如下進行介由交聯(lián)劑(cross linker)使自組裝單分 子膜與末端具有巰基的Z-tag蛋白質(zhì)反應(yīng)，從而具有抗體結(jié)合能力。將金基板在200ul的 ImM PEG3-0H烷基硫醇(Sensopath Technologies)乙醇溶液中在37°C下浸漬24小時。然 后將金基板在150ul的50mM PMPI (Pierce)的DMSO溶液中在室溫下反應(yīng)2小時。接著將 末端具有巰基的Z-tag蛋白質(zhì)在200ul的固定化溶液IdOmM Hepes (ρΗ7. 0), 50mM KCl, 1. OmM EDTA)中在4°C下反應(yīng)24小時。然后將IOug的BC203在200ul的固定化溶液2 (IOmM Hepes (pH7. 0) ,50mMKCl, 1. OmM EDTA，0. 1% Tween20)中在 4°C下反應(yīng)4 小時，從而在金基板 上固相化。反應(yīng)均在微量離心管(Eppendorf)內(nèi)浸漬金基板來進行。抗體在磁性微粒上的固定化通過偶聯(lián)各表面的羧基與KY2抗體的氨基來進行。分 別采集Img的re珠、粒徑約27nm的檸檬酸包覆的磁性微粒、DYNA珠(粒徑2. 8 μ m，DYNAL)， 分散到調(diào)整為0. 5M EDC (nakalai tesque)和0. 5M NHS (《U卜”研究所)的Iml DMF中， 在室溫下反應(yīng)2小時。然后將IOug的KY2抗體在Iml的固定化溶液(IOmM Hepes (pH7. 0)， 50mMKCl,1.0mM EDTA)中在4°C下反應(yīng)2小時，形成KY2-TO珠復(fù)合體、KY2-檸檬酸包覆的 微粒復(fù)合體、和KY2-DYNA珠復(fù)合體。(2)反應(yīng)時間的驗證在48孔板的孔內(nèi)靜置吸附BC203并固相化的金基板，用200 μ L的反應(yīng)溶液(IOmM Hepes (ρΗ7. 9), 50mM KCl, 1. 0mMEDTA,0. 1% Tween20,0. 03%脫脂乳)填滿。接著，在該孔中 添加Ing BNP ( “ 千K研究所)，在ELISA用板振蕩器(NISSIN)上振蕩5分鐘后，將KY2-FG 珠復(fù)合體添加到浸漬在上述反應(yīng)溶液中的金基板上。然后，在使磁鐵從48孔板的下方接近 的狀態(tài)下靜置規(guī)定時間(1分鐘、10分鐘、100分鐘)。經(jīng)過規(guī)定時間后，用洗滌溶液(IOmM Hepes (pH7. 9), 50mM KC1，1. OmMEDTA，0· 1% Tween20)將金基板洗滌 3 次。最后，用 Milli Q 洗滌各金基板后，用掃描型電子顯微鏡觀察。并且，作為背景，對于不添加BNP的反應(yīng)體系 也以與上述同樣的步驟進行實驗，此外，作為比較例，對于不使用磁鐵的反應(yīng)體系也以與上 述同樣的步驟進行實驗。另外，對于背景和比較例，也用掃描型電子顯微鏡觀察反應(yīng)后的金 基板。從掃描型電子顯微鏡的觀察結(jié)果算出表面包覆密度(％)。另外，本實施例中表面包 覆密度(％)由下述式(1)所定義，取用掃描型電子顯微鏡觀察的5個視野的平均而算出。[數(shù)學(xué)式1]〔 TT X (顆粒半徑廣2〕X顆粒個數(shù)，、
表面包覆密度(％)=-1個視野面積— χ10°⑴下述表ι示出了金基板上的re珠的表面包覆密度(％ )與反應(yīng)時間(1分鐘、10 分鐘、100分鐘)的關(guān)系。[表 1]
\有磁鐵無磁鐵1分鐘10分鐘100分鐘1分鐘10分鐘100分鐘有 BNP (%)15.0720. 6450. 650. 432. 043. 95無 BNP(%)1.192. 406. 640. 030. 040.18表1中，在紙面左側(cè)示出本實施例的結(jié)果(有磁鐵)，在紙面右側(cè)示出比較例的結(jié) 果(無磁鐵)，在最末行示出背景值(無BNP)。并且，圖5中以柱狀圖示出表1的結(jié)果。如 表1和圖5所示那樣，進行了磁引導(dǎo)的反應(yīng)體系(有磁鐵)的表面包覆密度(％)與經(jīng)過 相同反應(yīng)時間后的未進行磁引導(dǎo)的反應(yīng)體系(無磁鐵)的表面包覆密度相比，顯示出非常 高的值。例如，若著眼于經(jīng)過反應(yīng)時間1分鐘后的結(jié)果，則進行了磁引導(dǎo)的反應(yīng)體系(有磁 鐵)的表面包覆密度(％)為未進行磁引導(dǎo)的反應(yīng)體系(無磁鐵)的表面包覆密度的30倍 以上。另外，在進行了磁引導(dǎo)的反應(yīng)體系(有磁鐵)中，僅僅以1分鐘的反應(yīng)時間就可檢測 到與背景值之間的顯著性差異，顯示根據(jù)本發(fā)明能夠以數(shù)分鐘獲得足以可靠的數(shù)據(jù)。(3)測定精度的驗證對于添加了不同量(1 105pg)的BNP的反應(yīng)體系，在與上述同樣的條件下進行 實驗，算出各反應(yīng)體系的表面包覆密度(％)。圖6示出了在反應(yīng)體系中添加的BNP量(pg) 與表面包覆密度(％)的關(guān)系。如圖6所示那樣，隨著BNP量(pg)的增加，表面包覆密度 (% )增加，顯示出一定的濃度依賴性。(4)吸附穩(wěn)定性的驗證對于粒徑不同的3種磁性微粒，比較驗證對基板的吸附穩(wěn)定性。對與上述同樣條 件的孔分別加入KY2-檸檬酸包覆的微粒復(fù)合體(粒徑約27nm)、KY2-FG珠復(fù)合體(粒徑 約200nm)、和KY2-DYNA珠復(fù)合體(粒徑2. 8 μ m)，在使磁力沿著與金基板表面垂直的方向 作用的狀態(tài)下反應(yīng)10分鐘后，對各反應(yīng)體系算出表面包覆密度(％)。并且，對于另外調(diào)制 的同樣的3個反應(yīng)體系，一邊在ELISA用板振蕩器(NISSIN)上振蕩、一邊反應(yīng)10分鐘，然 后算出各反應(yīng)體系的表面包覆密度(％)。下述表2示出了上述3種復(fù)合體的表面包覆密 度(％)。并且，圖7以柱狀圖示出了表2的結(jié)果。[表 2]
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權(quán)利要求
一種利用親和反應(yīng)的生物傳感方法，其特征在于，該方法將所述親和反應(yīng)中的配體固定在磁性微粒上，并將該磁性微粒朝向所述親和反應(yīng)的反應(yīng)場強制性磁引導(dǎo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括一邊振蕩所述反應(yīng)場、一邊洗滌的工序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其進一步包括一邊將所述磁性微粒向遠離所述反 應(yīng)場的方向磁引導(dǎo)、一邊洗滌的工序。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的方法，所述磁性微粒的平均粒徑為3 400nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的方法，所述磁性微粒為聚合物包覆磁性微粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的方法，所述磁性微粒為被含有官能團的分子包 覆的磁性微粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，所述磁性微粒為具備熒光功能的微粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述聚合物包覆磁性微粒為在聚合物層導(dǎo)入了熒光物 質(zhì)的磁性微粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項所述的方法，其特征在于，使用磁傳感器進行傳感。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，使用光學(xué)檢測器進行傳感。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，所述光學(xué)檢測器為熒光檢測器。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的方法，其特征在于，利用使用了表面等離子共 振法的SPR傳感器或使用了石英晶體微天平法的質(zhì)量檢測傳感器進行傳感。
13.—種生物傳感裝置，其特征在于，該生物傳感裝置利用了親和反應(yīng)，且具備磁引導(dǎo) 單元，所述磁引導(dǎo)單元用于將固定有所述親和反應(yīng)的配體的磁性微粒朝向所述親和反應(yīng)的 反應(yīng)場強制性磁引導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的生物傳感方法作為磁性顆粒在生物傳感中的新的應(yīng)用開發(fā)，該方法利用了其作為標(biāo)記的優(yōu)越性，同時改善了傳感的處理量。在生物傳感中的親和反應(yīng)中，通過將配體固定在磁性微粒上，并將該磁性微粒朝向親和反應(yīng)的反應(yīng)場強制性磁引導(dǎo)，從而使傳感中的控速因子即親和反應(yīng)迅速化。本發(fā)明中，作為上述磁性微粒，采用一種特征在于兼具高分散性和高磁響應(yīng)性這兩者的包覆磁性微粒。根據(jù)本發(fā)明，親和反應(yīng)迅速且以高密度發(fā)生，其結(jié)果是，與以往相比能夠以非常短的時間獲得大的信號。
文檔編號G01N21/27GK101952725SQ20088012527
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日
發(fā)明者半田宏, 坂本聰, 望月勇輔, 畠山士, 西尾廣介, 阿部正紀 申請人:國立大學(xué)法人東京工業(yè)大學(xué)