專利名稱：：一種快速測定硒多糖中硒含量的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及硒含量的測定方法，特指一種測定硒多糖中硒含量的方法。
背景技術：
：硒(Se)是人體必需的微量營養(yǎng)元素，是部分重金屬元素的天然解毒劑，能有效提高生命免疫機能，對防癌、抗癌能發(fā)揮重要作用。硒的抗氧化能力比維生素E高500倍，所以，硒又是人體內抗衰老的重要物質。缺硒將導致許多重要器官機能下降，如引起克山病、誘發(fā)肝壞死和心血管疾病。硒在自然界中的存在形式分為無機硒與有機硒兩種。有機硒的來源主要是天然富硒植物和人工合成的有機硒如硒多糖。硒多糖作為一種有機硒化合物，保持了多糖的基本構型和生理功能，同時提高了硒的生物可利用度及其作為生物必需微量元素的生理功能，其毒性和副作用比無機硒大大降低。研究證明，硒多糖具有顯著的抗氧化、增強免疫力、降血糖、抗衰老、抗腫瘤和抗病毒等生物活性，其活性普遍高于多糖和無機硒，且更易于為機體吸收和利用?，F(xiàn)有對樣品中曬含量的測定方法有中子活化分析法(INAA)、原子發(fā)射光譜法(AES)、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體-質譜法(ICP-MS)、紫外分光光度法和熒光分光光度法、電化學分析法等。中國專利CN101173950A于2008年5月7日公開了"硒診斷/測定試劑盒及硒的濃度測定方法"，利用酶比色法及酶聯(lián)法技術測定硒的含量；中國專利CN101149357A于2008年3月26日公開了"一種硒含量的測定方法"，可對水質中微量或痕量硒進行電化學分析測定；中國專利CN1773254A于2006年5月17日公開了"硒測定液及其比色測定管"，可測定水質中硒的含量。上述測試方法及技術中，測試步驟往往較為繁瑣，分析周期長，限制了其應用范圍；有的測定方法存在測定結果不準確、重復性差的缺點。文獻"柱前螯合萃取-高效液相色譜法測定痕量硒"(分析化學，1988，16(4)328330)報道了對天然藥物中硒含量的HPLC(以下用HPLC簡稱"高效液相色譜")測定方法，但存在線性范圍較窄(28ng)、環(huán)己烷與流動相乙腈不相溶等缺點。目前對硒多糖中硒含量的測定也僅限于上述方法，人們期望有更為快速、準確、普及的測定硒多糖中硒含量的方法。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種快速、準確測定硒多糖中硒含量的方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明一種快速、準確測定硒多糖中硒含量的方法，包括如下步驟(1)繪制標準曲線并建立回歸方程取相應體積的硒標準溶液母液分別定容于同一容量的容量瓶中，所述硒標準溶液母液的濃度為50500ug/mi，所述同一容量的容量瓶為容量10ml或以上的容量瓶，依次稀釋制成濃度范圍0.005~liig/ml的梯度硒標準溶液，分別取10ml各梯度硒標準溶液加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和O.5mol/L的鹽酸羥胺各24ml，振蕩均勻后靜置510min，暗處分別加入0.1%的2,3-二氨基萘(2,3-二氨基萘在本發(fā)明下文中用其簡稱DAN替代)溶液24ml，沸水浴46min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己烷5ml，充分振蕩萃取，取環(huán)己垸層注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品重復三針，以峰面積平均值對梯度硒標準溶液濃度繪制標準曲線并建立回歸方程；(2)待測樣品的消解稱取待測干物質硒多糖，加入相應量的混酸，所述干物質硒多糖和所述混酸的比例為重量體積^.010.03g:2ml，所述混酸中各成分的體積比為HN03:H2S04:HC104-1:1:4,靜止過夜后在135。C中消解12小時，得消解液A;(3)消解液的處理和HPLC法檢測將消解液A用蒸餾水稀釋定容于容量為10ml或以上的容量瓶中，所定容的樣品溶液的硒濃度在步驟(1)中所制備的梯度硒標準溶液的濃度范圍0.005lug/ml以內；具體地說，如果該消解液A稀釋定容至10ml后其硒濃度在步驟(1)中所制備的梯度硒標準溶液的濃度范圍0.005lug/ml以內，則將該10ml樣品溶液用作下一步處理的樣品溶液；如果待測干物質樣品為含硒量較高的樣品，則可把消解液A的稀釋后體積擴大為合適的體積如定容至100ml或1000ml等，使其硒濃度在步驟(1)中所制備的梯度硒標準溶液的濃度范圍0.005lug/ml以內，再取10ml該樣品溶液用作下一步處理的樣品溶液；按照與步驟(1)中處理10ml梯度硒標準溶液完全相同的實驗條件處理該10ml樣品溶液，即加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mol/L的鹽酸羥胺各24ml，振蕩均勻后靜置510min，暗處加入0.1%的DAN溶液24ml，沸水浴46min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己烷5ml，充分振蕩萃取，取環(huán)己垸層注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品重復進三針，將峰面積平均值代入步驟(1)中所建立的回歸方程算出定容后樣品溶液的硒濃度(ug/ml)，再根據(jù)所定容的樣品溶液含硒的總量和所用干物質硒多糖的重量算出所測干物質硒多糖的硒含量(ug/g)。如上所述的實現(xiàn)本發(fā)明的步驟在歩驟(1)中，所述的硒標準溶液母液為100ug/ml的硒標準溶液，所述同一容量的容量瓶為10ml的容量瓶，所述濃度范圍0.005lug/ml的梯度硒標準溶液分別為0.005ug/ml、0.025ug/ml、0.05ug/ml、0.25ug/ml、0.5ug/ml和lug/ml的梯度硒標準溶液；在步驟(2)中，所稱取的待測干物質硒多糖重量為0.02g，所加入的混酸體積為2ml。高效液相色譜參數(shù)色譜柱C180DS柱；洗脫劑甲醇:乙醇的體積比=60%:40%;洗脫速率0.8ml/min;柱溫30'C;熒光檢測器檢測激發(fā)波長374nm，發(fā)射波長555nm;進樣量20ul;保留時間2.53.5min;標準曲線的線性范圍0.005lug/ml;檢出限5ng/g。表1為實施例13的標準曲線數(shù)據(jù)，圖13分別為實施例13中以峰面積(X)對梯度硒標準溶液濃度(Y)繪制的標準曲線，在實施例13中所建立的對應的回歸方程，其相關系數(shù)R的W值均接近于1，說明其對應的回歸方程都具有極顯著的線性相關關系。表1實施例13中各梯度硒標準溶液所對應的HPLC檢測峰面積及各實施例中所建立回歸方程的RS值<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2給出了針對同樣的樣品本發(fā)明實施例測定的硒含量與ICP(電感耦合等離子體發(fā)射光譜法)測定的硒含量數(shù)據(jù)的比較；此處的ICP測定是在其他測試機構測定的，ICP測定是目前比較準確、可靠的測定方法，但因測試費用較高而難以普及；本發(fā)明實施例的測定結果與ICP測定結果基本一致，說明本發(fā)明的測定結果是準確、可靠的。表2本發(fā)明實施例的HPLC測定與ICP測定的對應干物質樣品硒含量(ug/g)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明的有益效果是在本發(fā)明一種快速測定硒多糖中硒含量的方法中，環(huán)己垸與流動相甲醇和乙醇的混合液的相溶性很好、標準曲線線性范圍較寬，克服了以往HPLC測定硒含量過程中樣品與流動相不相溶、線性范圍較窄等缺點；本發(fā)明方法檢測結果準確可靠，重復性好，大大簡化了檢測步驟，不包括樣品消解預處理的時間，樣品一次測定的時間僅為20分鐘左右，節(jié)省了測定時間，測定費用低，易于推廣實施。下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明圖1為根據(jù)實施例1中數(shù)據(jù)制作的標準曲線；圖2為根據(jù)實施例2中數(shù)據(jù)制作的標準曲線；圖3為根據(jù)實施例3中數(shù)據(jù)制作的標準曲線；圖4為實施例1的測試樣品溶液的液相色譜圖，其中橫坐標為保留時間(分鐘)，縱坐標為熒光信號強度即響應值(MV)。具體實施例方式下面的實施例可更詳細地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種快速、準確測定硒多糖樣品中硒含量的方法。在實際測定中，每測同一批樣品要求標準曲線重新制作。實施例1本發(fā)明的目的是提供一種快速、準確測定硒多糖樣品中硒含量的方法(1)繪制標準曲線并建立回歸方程以濃度為100ug/ml的硒標準溶液為母液，分別從中取出相應體積的該母液定容于10ml的容量瓶中，依次按照0.005ug/ml、0.025ug/ml、0.05ug/ml、0.25ug/ml、0.5ug/ml和lug/ml的濃度稀釋制成新的系列梯度硒標準溶液，分別將10ml各硒標準溶液加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mol/L的鹽酸羥胺各2ml，振蕩均勻后靜置5min,暗處分別加入0.1%的DAN溶液4ml，沸水浴5min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己烷5ml，充分振蕩萃取，取環(huán)己烷層注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品重復三針，以峰面積平均值對梯度硒標準溶液濃度繪制標準曲線(圖l)并建立回歸方程Y=0.0183X-0.00401，R2=0.99979;(2)待測樣品的消解稱取待測干物質硒多糖樣品a0.02g，加入混酸2ml，所述混酸中各成分的體積比為HN03:H2S04:HC104=1:1:4，靜止過夜后在135'C中消解1小時，得消解液A;(3)消解液的處理和HPLC法檢測將消解液A用蒸餾水稀釋定容，該消解液A稀釋定容至10ml(其硒濃度在上述梯度硒標準溶液的濃度范圍0.005lug/ml以內)，將該10ml樣品溶液加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mol/L的鹽酸羥胺各2ml，振蕩均勻后靜置5min，暗處加入0.1。/。的DAN溶液4ml，沸水浴5min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己烷5ml，充分振蕩萃取，取環(huán)己烷層注入高效液相色譜檢測(液相色譜圖如圖4)，每次進樣量為20ul，每個樣品重復進三針，將所測樣品a峰面積平均值40.765代入步驟(1)中所建立的回歸方程(Y^.0183X-0.00401)算出定容后樣品溶液硒濃度為0.742ug/ml，再根據(jù)10ml所定容樣品溶液中含硒的總量7.42ug和所用干物質硒多糖的重量0.02g計算出所測干物質硒多糖的硒含量為371.0ug/g。實施例2本發(fā)明的目的是提供一種快速、準確測定硒多糖樣品中硒含量的方法(1)繪制標準曲線并建立回歸方程以濃度為100ug/ml的硒標準溶液為母液，分別從中取出相應體積的該母液定容于10ml的容量瓶中，依次按照0.005ug/ml、0.025ug/ml、0.05ug/ml、0.25ug/ml、0.5ug/ml和lug/ml的濃度稀釋制成新的系列梯度硒標準溶液，分別將10ml各硒標準溶液加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mol/L的鹽酸羥胺各4ml，振蕩均勻后靜置10min,暗處分別加入0.in/。DAN溶液2ml，沸水浴4min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己烷5ml，充分振蕩萃取，取環(huán)己垸層注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品重復三針，以峰面積平均值對梯度硒標準溶液濃度繪制標準曲線(圖2)并建立回歸方程YK).0188X+0.00487，R2=0.99955;(2)待測樣品的消解稱取待測干物質硒多糖樣品b0.02g，加入混酸2ml，所述混酸中各成分的體積比為HN03:H2S04:HC104=1:1:4，靜止過夜后在135。C中消解1.5小時，得消解液A;G)消解液的處理和HPLC法檢測將消解液A用蒸餾水稀釋定容，該消解液A稀釋定容至10ml(其硒濃度在上述梯度硒標準溶液的濃度范圍0.005lug/ml以內)，將該10ml樣品溶液加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mol/L的鹽酸羥胺各4ml，振蕩均勻后靜置10min，暗處加入0.1Q/。的DAN溶液2ml，沸水浴4min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己垸5ml，充分振蕩萃取，環(huán)己垸中濃度依次為2ug/ml、lug/ml、0.5ug/ml、0.1ug/ml、0.05ug/ml和0.01ug/ml，取環(huán)己烷層注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品重復進三針，將所測樣品b峰面積平均值17.586代入步驟(1)中所建立的回歸方程(Y=0.0188X+0.00487)算出定容后樣品溶液的硒濃度為0.335ug/ml，再根據(jù)10ml所定容樣品溶液中含硒的總量3.35ug和所用干物質硒多糖的重量0.02g計算出所測干物質硒多糖的硒含量為167.5ug/g。實施例3本發(fā)明的目的是提供一種快速、準確測定硒多糖樣品中硒含量的方法(1)繪制標準曲線并建立回歸方程以濃度為100ug/ml的硒標準溶液為母液，分別從中取出相應體積的該母液定容于10ml的容量瓶中，依次按照0.005ug/ml、0.025ug/ml、0.05ug/ml、0.25ug/ml、0.5ug/ml和lug/ml的濃度稀釋制成新的系列梯度硒標準溶液，分別將10ml各硒標準溶液加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mo/L的鹽酸羥胺各3ml，振蕩均勻后靜置8min，暗處分別加入0.1%DAN溶液3ml，沸水浴6min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己烷5ml，充分振蕩萃取，取環(huán)己垸層注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品重復三針，以峰面積平均值對梯度硒標準溶液濃度繪制標準曲線(圖3)并建立回歸方程Y=0.0196X+0.00161，R2=0.99937;(2)待測樣品的消解稱取待測干物質硒多糖樣品c0.02g，加入混酸2ml，所述混酸中各成分的體積比為HN03:H2S04:HC10fl:l:4，靜止過夜后在135°C中消解2小時，得消解液A;(3)消解液的處理和HPLC法檢測將消解液A用蒸餾水稀釋定容，該消解液A稀釋定容至100ml(其硒濃度在上述梯度硒標準溶液的濃度范圍0.005lug/ml以內)，取10ml該樣品溶液加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mol/L的鹽酸羥胺各3ml，振蕩均勻后靜置8min，暗處加入0.P/。的DAN溶液3ml，沸水浴6min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己烷5ml，充分振蕩萃取，取環(huán)己烷層注入高效液相色譜檢測，每次進樣量為20ul，每個樣品重復進三針，將所測樣品c峰面積平均值14.955代入步驟(1)中所建立的回歸方程(Y-0.0196X+0.00161)算出定容后樣品溶液中的硒的濃度為0.295ug/ml，再根100ml所定容樣品溶液含硒的總量29.5ug和所用干物質硒多糖的重量0.02g計算出干物質硒多糖的硒含量為1475.0ug/g。權利要求1.一種快速測定硒多糖中硒含量的方法，其特征在于包括以下步驟(1)繪制標準曲線并建立回歸方程取相應體積的硒標準溶液母液分別定容于同一容量的容量瓶中，所述硒標準溶液母液的濃度為50～500ug/ml，所述同一容量的容量瓶為容量10ml或以上的容量瓶，依次稀釋制成濃度范圍為0.005～1ug/ml的梯度硒標準溶液，分別取10ml各梯度硒標準溶液加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mol/L的鹽酸羥胺各2～4ml，振蕩均勻后靜置5～10min，暗處分別加入0.1％的2，3-二氨基萘溶液2～4ml，沸水浴4～6min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己烷5ml，充分振蕩萃取，取環(huán)己烷層注入高效液相色譜檢測，以峰面積平均值對梯度硒標準溶液濃度繪制標準曲線并建立回歸方程；(2)待測樣品的消解稱取待測干物質硒多糖，加入混酸，所述干物質硒多糖和所述混酸的比例為重量∶體積＝0.01～0.03g∶2ml，所述混酸中各成分的體積比為HNO3∶H2SO4∶HClO4＝1∶1∶4，靜止過夜后在135℃中消解1～2小時，得消解液A；(3)消解液的處理和高效液相色譜檢測將消解液A用蒸餾水稀釋定容于容量10ml或以上的容量瓶中，所定容的樣品溶液的硒濃度在步驟(1)中所制備的梯度硒標準溶液的濃度范圍0.005～1ug/ml以內，取10ml該樣品溶液按照與步驟(1)中處理10ml梯度硒標準溶液完全相同的實驗條件處理，即加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5mol/L的鹽酸羥胺各2～4ml，振蕩均勻后靜置5～10min，暗處加入0.1％的2，3-二氨基萘溶液2～4ml，沸水浴4～6min，取出冷卻至室溫后，加入環(huán)己烷5ml，充分振蕩萃取，取環(huán)己烷層注入高效液相色譜檢測，將峰面積平均值代入步驟(1)中所建立的回歸方程算出定容后樣品溶液的硒濃度，再根據(jù)所定容的樣品溶液含硒的總量和所用待測干物質硒多糖的重量算出所測干物質硒多糖的硒含量。2.根據(jù)權利要求1所述的一種快速測定硒多糖中硒含量的方法，實施該方法的步驟與權利要求1所述的步驟相同，其特征在于在步驟(l)中，所述的硒標準溶液母液為100ug/ml的硒標準溶液，所述同一容量的容量瓶為10ml的容量瓶，所述濃度范圍0.005~lug/ml的梯度硒標準溶液分別為0.005ug/ml、0.025ug/ml、0.05ug/ml、0.25ug/ml、0.5ug/ml和lug/ml的梯度硒標準溶液，所述高效液相色譜檢測所用的洗脫劑為甲醇和乙醇的混合液，甲醇:乙醇的體積比=60%:40%;在步驟(2)中，所稱取的待測干物質硒多糖重量為0.02g，所加入的混酸體積為2ml。全文摘要本發(fā)明公開了一種快速測定硒多糖中硒含量的方法。本發(fā)明通過分別取相同體積配制好的梯度硒標準溶液處理后做高效液相色譜檢測，繪制標準曲線并建立回歸方程；然后，將待測干物質硒多糖用混酸消解后稀釋定容，配制待測樣品溶液，取與被處理的梯度硒標準溶液相同體積的該樣品溶液，以同樣的條件處理后做高效液相色譜檢測，根據(jù)所建立的回歸方程算出待測樣品溶液的硒濃度并進一步確定干物質硒多糖的含硒量。本發(fā)明克服了以往高效液相色譜法測定硒含量過程中樣品與流動相不溶、線性范圍較窄等缺點；本發(fā)明方法檢測結果準確可靠，重復性好，簡化了檢測步驟，節(jié)省了測定時間，測定費用低。文檔編號G01N30/00GK101493442SQ20091000919公開日2009年7月29日申請日期2009年2月23日優(yōu)先權日2009年2月23日發(fā)明者吳依茜,健姚,繼張,梁俊玉,王云普,王俊龍,王小芳,趙保堂,趙美榮,馬君義申請人:西北師范大學