專利名稱：：添加在飼料中植酸酶的微量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種添加在詞料中植酸酶的微量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：一、植酸酶在飼料中的應(yīng)用及其測(cè)定方法近年來，隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和磷資源的消耗，磷酸氫鈣價(jià)格連年攀升，已成為繼蛋白質(zhì)和能量之后又一大飼料原料；另一方面，飼料中添加大量無機(jī)磷也加劇了環(huán)境污染。因此，利用微生物植酸酶減少日糧中的磷酸氫鈣用量越來越受到人們的青睞。目前，植酸酶產(chǎn)品的種類與劑型繁多，確定科學(xué)的植酸酶以及添加到飼料后，質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)判方法，對(duì)選擇質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的植酸酶產(chǎn)品尤為重要。植酸酶檢測(cè)方法最初由德國(guó)巴斯夫公司推出，1個(gè)植酸酶活性單位定義為在37°C和pH為5.5的條件下每分鐘從濃度為0.005mol/1的植酸鈉溶液中釋放出lpmol無機(jī)磷所需要的植酸酶的數(shù)量。2002年，在這一定義的基礎(chǔ)上，起草了飼用植酸酶活性測(cè)定方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)適用于作伺料添加劑用的植酸酶產(chǎn)品，也適用于添加有植酸酶的配合飼料、濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料，樣品最低檢出量為90U/kg。植酸酶的基因片段一些來源于大腸桿菌，而另外一些商品植酸酶則來源于曲霉。大量的植酸酶分離純化后性質(zhì)鑒定表明，不同來源的植酸酶在分子量、等電點(diǎn)、最適溫度和pH值上都有著明顯的不同，并且在對(duì)底物的選擇性上也有區(qū)別。來源于曲霉的植酸酶檢測(cè)方法已于2002年正式發(fā)布(GB/T18634~2002)，但因?yàn)椴煌瑏碓吹闹菜崦缸饔梦稽c(diǎn)、最佳pH等均不同，用GB/T18634—2002測(cè)定來源于大腸桿菌的植酸酶，檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)較大，無法準(zhǔn)確測(cè)定，因此，需要有一種快速、簡(jiǎn)便，具有高度特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度的方法，測(cè)定植酸酶的活性以及添加在詞料中的植酸酶的活性，將會(huì)更有利于科學(xué)合理地制作配方，促進(jìn)植酸酶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。二、目前現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定配合(全價(jià))飼料中植酸酶樣品的問題(一)、加酶飼料中植酸酶活性測(cè)定的問題1、加酶飼料中酶活測(cè)定的問題之一酶的活性是測(cè)定其底物或產(chǎn)物的變化量，但是酶降解的底物或生成的產(chǎn)物，在飼料中本身就存在，而且存在的量很大，其數(shù)量是酶引起的變化量的好多倍。在酶活測(cè)定時(shí)飼料中本來存在的大量底物或產(chǎn)物也會(huì)引起顯色反應(yīng)，對(duì)酶制劑引起的顯色反應(yīng)構(gòu)成干擾，所以屬于酶活測(cè)定的雜質(zhì)。由于飼料中本來存在的底物或產(chǎn)物量更大，會(huì)引起更深的顯色反應(yīng)，其所引起的吸光度變化值會(huì)遠(yuǎn)大于酶促反應(yīng)底物顯色所引起的吸光度值的變化。所以，加酶詞料中酶活檢測(cè)的第一個(gè)問題存在的雜質(zhì)(本底)干擾。2、加酶詞料中酶活測(cè)定的問題之二酶制劑加入飼料后，100010，000倍的稀釋，使得飼料中酶制劑的活性，低于可測(cè)的活性底線。這是加酶飼料中酶活測(cè)定的第二個(gè)問題活性太低的問題。加酶飼料中酶的微量測(cè)定技術(shù)的關(guān)鍵之二是設(shè)法濃縮酶的濃度，或采用常用比色法以外靈敏度更高的測(cè)定方法。3、其它問題(1)酶與詞料中的某些成分的親和性，導(dǎo)致酶的溶解不全，引起測(cè)定的誤差。最典型的例子是某些來源的植酸酶。(2)詞料中的少量?jī)?nèi)源酶對(duì)外源酶的干擾，等等。三、目前現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定配合(全價(jià))飼料中植酸酶樣品的缺點(diǎn)現(xiàn)有測(cè)定方法(GB/T18634-2002)中，"鉬黃法"測(cè)定植酸酶含量的原理為植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會(huì)生成黃色的[(NH4)3P04NH4V(V16Mo03]復(fù)合物，在波長(zhǎng)415nm下進(jìn)行比色測(cè)定。具體過程為取待反應(yīng)液(酶濃度約0.4U/ml)0.2ml，加入1.8ml0.25mol/l的pH5.0乙酸緩沖液，37。C水浴預(yù)熱5分鐘，加入已預(yù)熱至37°(3的7.5mmo1/1的植酸鈉溶液4ml，37'C精確水解30分鐘，加入4ml顏色終止液(1份100g/l鉬酸銨溶液+1份2.35g/L偏釩酸銨溶液+2份l:2水溶液的硝酸溶液)，反應(yīng)后室溫下靜置10分鐘，4000rpm7離心10分鐘。上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在分光光度計(jì)415nrn波長(zhǎng)處測(cè)定樣品空白和樣品溶液的吸光值，根據(jù)實(shí)測(cè)吸光值計(jì)算植酸酶的活性。該方法用于測(cè)定植酸酶樣品，相對(duì)較為準(zhǔn)確。但是，用于測(cè)定添加在飼料中的植酸酶，該方法檢測(cè)下限為2.0U/g飼料，而實(shí)際飼料中的植酸酶酶活約為0.5U/g飼料，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該方法的檢測(cè)下限。另外，飼料中無機(jī)磷含量遠(yuǎn)高于反應(yīng)生成的無機(jī)磷量，影響植酸酶與底物的反應(yīng)。樣品空白吸光值超出測(cè)定范圍。四、現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定配合(全價(jià))飼料中植酸酶樣品的結(jié)果目前，植酸酶制劑在畜禽飼料生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用，但飼料中植酸酶活性的測(cè)定方法還存在一些爭(zhēng)議。2002年，國(guó)家頒布了飼用植酸酶活性的測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18634-2002)，該標(biāo)準(zhǔn)注明其適用于詞料添加劑用的植酸酶產(chǎn)品，也適用于添加有植酸酶的配合飼料、濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料。但配合飼料、濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料成分顯然更為復(fù)雜，其適用性受到質(zhì)疑。使用該方法測(cè)定"添加在飼料中的植酸酶活性"，結(jié)果相對(duì)偏差較大，變異系數(shù)較大。下表所示是用標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18634-2002)方法測(cè)定加酶詞料中植酸酶活性的一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加酶飼料樣品中植酸酶活性測(cè)定(U/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由上述測(cè)定結(jié)果可知，該方法直接測(cè)定配合飼料或濃縮料中的植酸酶活性，變異系數(shù)較高(13%—20%)，有時(shí)甚至更高，因此，本方法用于測(cè)定配合飼料或濃縮料中的植酸酶活性時(shí)，相對(duì)偏差在20%，測(cè)定結(jié)果誤差較大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠準(zhǔn)確測(cè)定添加在飼料中植酸酶活性的微量測(cè)定方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明所述添加在飼料中植酸酶的微量測(cè)定方法，其步驟如下(1)試劑和溶液的配制(U)乙酸緩沖液(I)，c(CH3COONa)=0.25mol/l:稱取34.02g三水乙酸鈉于1000ml燒杯中，加入900mL水?dāng)嚢枞芙?，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.00±0.01,再轉(zhuǎn)移至lOOOmL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度；室溫下存放2個(gè)月內(nèi)有效；(1.2)乙酸緩沖液(II)，c(CH3COONa)=0.25mol/l:稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml燒杯中，加入900mL水?dāng)嚢枞芙猓帽宜嵴{(diào)節(jié)pH值至5.00士0.01,再轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度；室溫下存放2個(gè)月內(nèi)有效；(1.3)植酸鈉溶液(C6H6024P6Na,2)為7.5mmol/l:稱取0.6929g植酸鈉(C6H6024P6Na12，相對(duì)分子質(zhì)量為923.8，純度為95%)，精確至O.lmg，置于100ml燒杯中，用約80ml乙酸緩沖液(I)溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.00土0.01，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，并用乙酸緩沖液(I)定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配(實(shí)際反應(yīng)液中的最終濃度為5.0mmol/l);(1.4)硝酸溶液l份濃硝酸+2份水；(1.5)鉬酸銨溶液，100g/l:稱取10g鉬酸銨[(NH4)6Mo70244H20]于50ml燒杯中加水溶解，再轉(zhuǎn)移至lOOmL容量瓶中，加入1.0ml氨水(25%)用水定容至刻度；(1.6)偏釩酸銨溶液，2.35g/l:稱取0.235g偏釩酸銨,4￥03)于50ml燒杯中，加入2ml硝酸溶液及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再轉(zhuǎn)移至lOOmL棕色容量瓶中，用水定容至刻度；避光條件下保存；(1.7)顏色終止液取2份硝酸溶液，1份鉬酸銨溶液，1份釩酸銨溶液混合使用，現(xiàn)用現(xiàn)配；(1.8)標(biāo)準(zhǔn)植酸酶(標(biāo)明準(zhǔn)確活性單位和類型)；(2)測(cè)定(2.1)標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)植酸酶，精確至0.0001g，于50ml容量瓶中，用乙酸緩沖液(II)溶解并定容至刻度，做兩次稀釋，使植酸酶活性為0.30U/ml左右，當(dāng)日配制；將上述植酸酶按表1用緩沖液(II)進(jìn)行稀釋，需要準(zhǔn)確計(jì)算植酸酶的濃度，與樣品一起反應(yīng)測(cè)定，以植酸酶濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo),列出直線回歸方程(廣ax+b):表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2.2)試樣溶液的制備(2.2.1)樣品處理將取有代表性樣品預(yù)冷至4'C，全部粉碎(采取間斷式粉碎，防止粉碎時(shí)飼料發(fā)熱)通過0.45mm的標(biāo)準(zhǔn)篩，充分混勻后準(zhǔn)確稱取樣品50.00g，加入500ml乙酸緩沖液n，在4"C環(huán)境下磁力攪拌45分鐘，過濾(棄去初濾液50ml)，取過濾液100ml完全準(zhǔn)確移入透析袋中，置于4t:預(yù)冷的透析外液(乙酸緩沖液I)中，透析外液體積約為透析酶液的10倍，透析時(shí)間為20小時(shí)(透析10小時(shí)需換一次透析外液)；透析后準(zhǔn)確量取體積并記錄；(2.2.2)已知酶液配制取標(biāo)準(zhǔn)植酸酶配制成酶活為0.05U/ml的酶液，取100ml，如步驟(2.2.1)的方法進(jìn)行透析、測(cè)定；(2.2.3)樣品+已知酶準(zhǔn)確稱取待測(cè)定飼料樣品預(yù)冷至4°C，全部粉碎并通過0.45mm的標(biāo)準(zhǔn)篩，充分混勻后取樣50.00g，量入步驟(2.2.2)所得已知酶液500ml，在4"C環(huán)境下磁力攪拌45分鐘，過濾(棄去初濾液50ml)，取過濾液100ml完全準(zhǔn)確移入透析袋中，置于4r預(yù)冷的透析外液(乙酸緩沖液I)中，透析外液體積約為透析酶液的10倍，透析時(shí)間為20小時(shí)(透析10小時(shí)需換一次透析外液)；透析后準(zhǔn)確量取體積并記錄；得加有己知酶的樣品透析液.(2.3)反應(yīng)取透析液l.Oml，加入l.Oml乙酸緩沖液(I)，37。C水浴預(yù)熱5分鐘，加入已預(yù)熱至37'C的7.5mmo1/1的植酸鈉溶液4ml，37'C精確水解30分鐘，加入4ml顏色終止液，反應(yīng)后室溫下靜置10分鐘，4000rpm離心10分鐘；上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在分光光度計(jì)415nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品空白和樣品溶液的吸光值；根據(jù)實(shí)測(cè)吸光值計(jì)算植酸酶的活性取25mL試管按表2所示順序進(jìn)行操作，在反應(yīng)過程中，從加入植酸鈉溶液開始，向每支試管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對(duì)一致，37"C水解30min:表2反應(yīng)步驟、溶液用量反應(yīng)順序樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品空白(標(biāo)準(zhǔn)空白)l.加入乙酸緩沖液(I)l.Oml1.0ml(2.0ml)2.加入待反應(yīng)液l.Omll.Oml3.混合V々11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2.4)樣品測(cè)定反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機(jī)上以4000r/min離心10min，上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零,在分光光度計(jì)415nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品空白和樣品溶液的吸光值，用直線回歸方程計(jì)算植酸酶的活性；(2.5)結(jié)果計(jì)算和表示(2.5.1)植酸酶活性計(jì)算C植酸酶活性(U/g"-xFm式中C-…根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由直線回歸方程計(jì)算出的酶活性；F—試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)；m畫—-試樣重量；(2.5.2)結(jié)果表示兩個(gè)平行樣品的測(cè)定結(jié)果用算式平均值表示，保留整數(shù)。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所述添加在飼料中植酸酶的微量測(cè)定方法與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)加酶飼料的測(cè)定方法(用標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18634-2002)方法)相比存在以下不同首先，通過預(yù)處理方法降低飼料中無機(jī)磷含量用乙酸緩沖液I作為透析外液對(duì)樣品進(jìn)行透析處理，來消除飼料中的無機(jī)磷對(duì)植酸酶水解反應(yīng)的影響。植酸酶水解底物植酸鈉生成正磷酸和肌醇衍生物，如果無機(jī)磷含量過高，則會(huì)抑制植酸酶水解底物，從而影響測(cè)定的準(zhǔn)確性，本發(fā)明方法通過將樣品提取液低溫透析后，可以將樣品提取液中的無機(jī)磷透析出來，排除了樣品中無機(jī)磷含量過高對(duì)植酸酶水解底物的抑制作用。其次，反應(yīng)時(shí)取待反應(yīng)液體積lml代替現(xiàn)有方法中的0.2ml，加lml乙酸緩沖液I代替現(xiàn)有方法的1.8ml乙酸緩沖液I，使樣品空白的吸光值落在一個(gè)合理的測(cè)定范圍內(nèi)，避免因樣品空白中無機(jī)磷含量過高而引起測(cè)定的誤差。飼料中酶活約為0.5U/g飼料，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有方法中測(cè)定酶活的下限(2.0U/g飼料)，提取后的待反應(yīng)液酶活約為0.05U/ml，本發(fā)明將現(xiàn)有方法中待反應(yīng)液體積由0.2ml提高到lml，待反應(yīng)液中酶活提高了5倍，使得樣品吸光值落入一個(gè)有效的測(cè)定范圍。第三，在詞料中添加已知酶，通過測(cè)定已知酶，檢驗(yàn)已知酶在樣品提取、透析、測(cè)定過程中是否有損失。具體計(jì)算步驟為已知酶回收率(%)=(Al-A2)/A3xl00%Al:已知酶液與飼料(體積/質(zhì)量)為10:l進(jìn)行提取、透析后的測(cè)定值(U/ml)A2:乙酸緩沖液II與飼料(體積/質(zhì)量)為10:l進(jìn)行提取、透析后的測(cè)定值(U/ml)A3:已知酶液進(jìn)行透析后的測(cè)定值(U/ml)飼料樣品酶活(U/g飼料)=八2><稀釋倍數(shù)><(透析后體積/透析前體積)計(jì)算已知酶添加到飼料中是否與理論添加量相符己知酶回收率允許誤差不大于10%;同一個(gè)樣品兩個(gè)平行測(cè)定值的相對(duì)偏差不大于10%。綜上分析，本發(fā)明所述添加在詞料中植酸酶的微量測(cè)定方法通過飼料樣品的預(yù)處理，消除了無機(jī)磷對(duì)植酸酶水解反應(yīng)的影響，降低了植酸酶檢測(cè)下限，因此能夠準(zhǔn)確測(cè)定添加在飼料中植酸酶含量。具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)驗(yàn)測(cè)定過程來說明本發(fā)明。l.試劑和溶液本標(biāo)準(zhǔn)中所用試劑，在沒有注明其它要求時(shí)，均指分析純和符合GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。1.1乙酸緩沖液(I)，c(CH3COONa)=0.25mol/l:稱取34.02g三水乙酸鈉于lOOOml燒杯中，加入900ml水?dāng)嚢枞芙?，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.00±0.01，再轉(zhuǎn)移至lOOOml容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度。室溫下存放2個(gè)月內(nèi)有效。1.2乙酸緩沖液(II)，c(CH3COONa)=0.25mol/l:稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于lOOOml燒杯中，加入900mL水?dāng)嚢枞芙猓帽宜嵴{(diào)節(jié)pH值至5.00士0.01，再轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度。室溫下存放2個(gè)月內(nèi)有效。1.3植酸鈉溶液(C6H6024P6Na,2)為7.5mmol/l:稱取0.6929g植酸鈉(C6H6024P6Na12，相對(duì)分子質(zhì)量為923.8，純度為95%)，精確至O.lmg，置于100ml燒杯中，用約80ml乙酸緩沖液(I)溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.00±0.01，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，并用乙酸緩沖液(I)定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配(實(shí)際反應(yīng)液中的最終濃度為5.0mmol/l)。1.4硝酸溶液l份濃硝酸+2份水。1.5鉬酸銨溶液，100g/l:稱取10g鉬酸銨[(NH4)6Mo70244H20〗于50ml燒杯中加水溶解，再轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25%)用水定容至刻度。1.6偏釩酸銨溶液，2.35g/l:稱取0.235g偏釩酸銨,4￥03)于50ml燒杯中，加入2ml硝酸溶液(1.4)及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度。避光條件下保存。1.7顏色終止液取2份硝酸溶液(1.4)，1份鉬酸銨溶液(L5)，l份釩酸銨溶液(1.6)混合使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.8標(biāo)準(zhǔn)植酸酶(標(biāo)明準(zhǔn)確活性單位和類型)。2.儀器和設(shè)備實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備2.1分析天平感量0.1mg2.2恒溫水浴(37士0.1)。C2.3分光光度計(jì)有10mm比色皿，可在415nm下測(cè)定吸光度。2.4磁力攪拌器。2.5渦流式混合物。2.6酸度計(jì)精確至小數(shù)點(diǎn)后2位。2.7離心機(jī)轉(zhuǎn)速4000r/min以上。3.試樣制備取有代表性樣品，用四分法將試樣縮分至500g，配合伺料和添加劑預(yù)混合飼料需粉碎通過0.45mm標(biāo)準(zhǔn)篩，裝入密封器，防止試樣成分變化。4.測(cè)定步驟4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)植酸酶(1.8)，精確至0.0001g，于50ml容量瓶中，用乙酸緩沖液(II)溶解并定容至刻度，做兩次稀釋，使植酸酶活性大約為0.30U/ml左右，當(dāng)日配制。將上述植酸酶按表1用緩沖液(II)進(jìn)行稀釋，需要準(zhǔn)確計(jì)算植酸酶的濃度，與樣品一起反應(yīng)測(cè)定，以植酸酶濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，列出直線回歸方程(廠ax+b)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.2試樣溶液的制備、4.2.1樣品處理將取有代表性樣品預(yù)冷至4°C，全部粉碎(采取間斷式粉碎，防止粉碎時(shí)飼料發(fā)熱)通過0.45mm的標(biāo)準(zhǔn)篩，充分混勻后準(zhǔn)確稱取樣品50.00g，加入500ml乙酸緩沖液n，在4"環(huán)境下磁力攪拌45分鐘，過濾(棄去初濾液50ml)，取過濾液100ml完全準(zhǔn)確移入透析袋中，置于4。C預(yù)冷的透析外液(乙酸緩沖液I)中，透析外液體積約為透析酶液的10倍，透析時(shí)間為20小時(shí)(透析10小時(shí)需換一次透析外液)。透析后準(zhǔn)確量取體積并記錄。4.2.2已知酶液配制取一已知酶配制成酶活為0.05U/ml的酶液。取100ml進(jìn)行透析、測(cè)定。(方法同樣品組)4.2.3樣品+已知酶準(zhǔn)確稱取樣品50.00g，量入已知酶液(4.2.2)500ml，在4"C環(huán)境下磁力攪拌45分鐘，過濾(棄去初濾液50ml)，取過濾液100ml完全準(zhǔn)確移入透析袋中，置于4t:預(yù)冷的透析外液(乙酸緩沖液I)中，透析外液體積約為透析酶液的10倍，透析時(shí)間為20小時(shí)(透析10小時(shí)需換一次透析外液)。透析后準(zhǔn)確量取體積并記錄。4.3反應(yīng)具體測(cè)定過程取透析液l.Oml，加入l.Oml乙酸緩沖液(I)，37。C水浴預(yù)熱5分鐘，加入已預(yù)熱至37-C的7.5mmol/L的植酸鈉溶液(1.3)4ml，37。C精確水解30分鐘，加入4ml顏色終止液(1.7)，反應(yīng)后室溫下靜置10分鐘，4000rpm離心10分鐘。上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在分光光度計(jì)415nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品空白和樣品溶液的吸光值。根據(jù)實(shí)測(cè)吸光值計(jì)算植酸酶的活性。取25mL試管按下面順序進(jìn)行操作，在反應(yīng)過程中，從加入底物(1.3)開始，向每支試管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對(duì)一致，37t水解30min。反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見表2表2反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量反應(yīng)順序樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品空白(標(biāo)準(zhǔn)空白)l.加入乙酸緩沖液(I)l.Oml1.0ml(2.0ml)2.加入待反應(yīng)液l.Omll.Oml3.混合々4.37。C預(yù)熱5min5.依次加入底物(1.3)4ml4ml(第二步)6.混合V167.37i:水解30minVV8.依次加入終止液4ml4ml(第一步)9.混合總體積10ml10ml4.4樣品測(cè)定反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機(jī)(2.7)上以4000r/min離心10min，上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零,在分光光度計(jì)(2.3)415nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品空白(A0)和樣品溶液(A)的吸光值，A—AO為實(shí)測(cè)吸光值。用直線回歸方程計(jì)算植酸酶的活性。4.5結(jié)果計(jì)算和表示4.5.1植酸酶活性計(jì)算C植酸酶活性(U/g"-xFm式中C---根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由直線回歸方程計(jì)算出的酶活性，U/g;F一一試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)；m-誦—試樣重量，g;4.5.2結(jié)果表示兩個(gè)平行樣品的測(cè)定結(jié)果用算式平均值表示，保留整數(shù)。4.5.3重復(fù)性同一樣品兩個(gè)平行測(cè)定的相對(duì)偏差，添加植酸酶的各種飼料樣品不大于10%。以下是兩種測(cè)定方法對(duì)于同一個(gè)詞料樣品，添加0.5U/g飼料的植酸酶，經(jīng)過測(cè)定得到的結(jié)果。表3添加在(仔豬料、中大豬料、肉仔雞料、中大肉雞料)中0.5U/g伺料植酸酶的測(cè)定結(jié)果17樣品名稱仔豬料中大豬料肉仔雞料中大肉雞料理論值(U/g飼料)0.50.50.50.5本發(fā)明方法測(cè)定結(jié)果(U/g伺料)10.4930.5360.5270.53720.4S70.4290.4960.48830.5400.4410.5600.44340.4680.4340.5160.46150.5070.5220.4520.58460.4890.4470.5370.44270.5130.5340.5190.53780.4340.4970.4890.52890.5150.5050.4510.496100.4440.4500.4840.449110.4660.4580.4990.473120.5280.4300.6170.444平均值0.4880.4740.5120.490標(biāo)準(zhǔn)偏差0.030.040.050.05變異系數(shù)6.988.888.999.56最大值0.5400.5360.6170.584最小值0.4340.4290.4510.442已知酶透析前、(U/ml)0.05050.04910.05130.0508透析后(U/ml)0.05030.04960.05080.0501加到空白飼料中透析后(U/ml)0.05130.05010.04990.0503回收率(％)102.0101.098.2100.4現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定方《S測(cè)定結(jié)果(U/g伺料)10.5420.5830.6580.66320.4340.4520.6070.41130.6290.5160.4620.58440.4400.5720.3800.60818<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4織t^(肉/J呷輒W^Ns^f4)中05u/gWli^TOi^m<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表5添加在(羅非魚料、草魚料、鯽魚料)中0.511/8飼料植酸酶的測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>40.4730.5130.59450.6790.5840.44160.6750.6410.5卯70.6560.4660.39280.4190.7320.37690.7180.6360.646100.4040.4100.697110.3卯0.4070.443120.4410.3950.342平均值0.5510.5490.507標(biāo)準(zhǔn)偏差0.130.120.15變異系數(shù)24.3121.9228.60最大值0.7180.7320.768最小值0.3卯0.3950.342由上述測(cè)定結(jié)果可知，現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定方法測(cè)定結(jié)果(即添加在飼料中的植酸酶)相對(duì)偏差較大，變異系數(shù)CVX較大，可高達(dá)20%(有時(shí)甚至更高)，尤其是測(cè)定飼料中含有高含量的磷酸氫鈣或磷酸二氫鈣時(shí)，例如羅非魚料、草魚料、鯽魚料，變異系數(shù)較大，有時(shí)甚至無法測(cè)定。本發(fā)明方法測(cè)定結(jié)果，消除了無機(jī)磷對(duì)測(cè)定的干擾、降低了酶活檢測(cè)下限、用添加已知酶來檢驗(yàn)該測(cè)定方法的可行性與準(zhǔn)確性，變異系數(shù)較小(CV%《0%)，而且有比較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。2權(quán)利要求1、一種添加在飼料中植酸酶的微量測(cè)定方法，特征在于，其步驟如下(1)試劑和溶液的配制(1.1)乙酸緩沖液(I)，c(CH3COONa)＝0.25mol/l稱取34.02g三水乙酸鈉于1000ml燒杯中，加入900ml水?dāng)嚢枞芙猓帽宜嵴{(diào)節(jié)pH值至5.00±0.01，再轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度；室溫下存放2個(gè)月內(nèi)有效；(1.2)乙酸緩沖液(II)，c(CH3COONa)＝0.25mol/l稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml燒杯中，加入900ml水?dāng)嚢枞芙?，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.00±0.01，再轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度；室溫下存放2個(gè)月內(nèi)有效；(1.3)植酸鈉溶液(C6H6O24P6Na12)為7.5mmol/L稱取0.6929g植酸鈉(C6H6O24P6Na12，相對(duì)分子質(zhì)量為923.8，純度為95％)，精確至0.1mg，置于100ml燒杯中，用約80ml乙酸緩沖液(I)溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.00±0.01，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，并用乙酸緩沖液(I)定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配(實(shí)際反應(yīng)液中的最終濃度為5.0mmol/l)；(1.4)硝酸溶液1份濃硝酸+2份水；(1.5)鉬酸銨溶液，100g/l稱取10g鉬酸銨[NH4)6Mo7O24·4H2O]于50ml燒杯中加水溶解，再轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25％)用水定容至刻度；(1.6)偏釩酸銨溶液，2.35g/l稱取0.235g偏釩酸銨(NH4VO3)于50ml燒杯中，加入2ml硝酸溶液及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再轉(zhuǎn)移至100ml棕色容量瓶中，用水定容至刻度；避光條件下保存；(1.7)顏色終止液取2份硝酸溶液，1份鉬酸銨溶液，1份釩酸銨溶液混合使用，現(xiàn)用現(xiàn)配；(1.8)標(biāo)準(zhǔn)植酸酶(標(biāo)明準(zhǔn)確活性單位和類型)；(2)測(cè)定(2.1)標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)植酸酶，精確至0.0001g，于50ml容量瓶中，用乙酸緩沖液(II)溶解并定容至刻度，做兩次稀釋，使植酸酶活性為0.30U/ml左右，當(dāng)日配制；將上述植酸酶按表1用緩沖液(II)進(jìn)行稀釋，需要準(zhǔn)確計(jì)算植酸酶的濃度，與樣品一起反應(yīng)測(cè)定，以植酸酶濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，列出直線回歸方程(y＝ax+b)表1<tablesid="tabl0001"num="0001"><table><tgroupcols="2"><colspeccolname="c001"colwidth="50%"/><colspeccolname="c002"colwidth="50%"/><thead></column></row><row><column><entrymorerows="1">標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)</entry><entrymorerows="1">酶活(U/ml)</entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrymorerows="1">1</entry><entrymorerows="1">0.010</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">2</entry><entrymorerows="1">0.020</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">3</entry><entrymorerows="1">0.041</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">4</entry><entrymorerows="1">0.081</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">5</entry><entrymorerows="1">0.122</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">6</entry><entrymorerows="1">0.162</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">7</entry><entrymorerows="1">0.244</entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></tables>(2.2)試樣溶液的制備(2.2.1)樣品處理將取有代表性樣品預(yù)冷至4℃，全部粉碎(采取間斷式粉碎，防止粉碎時(shí)飼料發(fā)熱)通過0.45mm的標(biāo)準(zhǔn)篩，充分混勻后準(zhǔn)確稱取樣品50.00g，加入500ml乙酸緩沖液II，在4℃環(huán)境下磁力攪拌45分鐘，過濾(棄去初濾液50ml)，取過濾液100ml完全準(zhǔn)確移入透析袋中，置于4℃預(yù)冷的透析外液(乙酸緩沖液I)中，透析外液體積約為透析酶液的10倍，透析時(shí)間為20小時(shí)(透析10小時(shí)需換一次透析外液)；透析后準(zhǔn)確量取體積并記錄；(2.2.2)已知酶液配制取標(biāo)準(zhǔn)植酸酶配制成酶活為0.05U/ml的酶液，取100ml，如步驟(2.2.1)的方法進(jìn)行透析、測(cè)定；(2.2.3)樣品+已知酶準(zhǔn)確稱取待測(cè)定飼料樣品預(yù)冷至4℃，全部粉碎并通過0.45mm的標(biāo)準(zhǔn)篩，充分混勻后取樣50.00g，量入步驟(2.2.2)所得已知酶液500ml，在4℃環(huán)境下磁力攪拌45分鐘，過濾(棄去初濾液50ml)，取過濾液100ml完全準(zhǔn)確移入透析袋中，置于4℃預(yù)冷的透析外液(乙酸緩沖液I)中，透析外液體積約為透析酶液的10倍，透析時(shí)間為20小時(shí)(透析10小時(shí)需換一次透析外液)；透析后準(zhǔn)確量取體積并記錄，得加有已知酶的樣品透析液；(2.3)反應(yīng)取透析液1.0ml，加入1.0ml乙酸緩沖液(I)，37℃水浴預(yù)熱5分鐘，加入已預(yù)熱至37℃的7.5mmol/l的植酸鈉溶液4ml，37℃精確水解30分鐘，加入4ml顏色終止液，反應(yīng)后室溫下靜置10分鐘，4000rpm離心10分鐘；上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在分光光度計(jì)415nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品空白和樣品溶液的吸光值；根據(jù)實(shí)測(cè)吸光值計(jì)算植酸酶的活性取25mL試管按表2所示順序進(jìn)行操作，在反應(yīng)過程中，從加入植酸鈉溶液開始，向每支試管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對(duì)一致，37℃水解30min表2反應(yīng)步驟、溶液用量<tablesid="tabl0002"num="0002"><table><tgroupcols="3"><colspeccolname="c001"colwidth="33%"/><colspeccolname="c002"colwidth="33%"/><colspeccolname="c003"colwidth="34%"/><thead></column></row><row><column><entrymorerows="1">反應(yīng)順序</entry><entrymorerows="1">樣品、標(biāo)準(zhǔn)</entry><entrymorerows="1">樣品空白(標(biāo)準(zhǔn)空白)</entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrymorerows="1">1.加入乙酸緩沖液(I)</entry><entrymorerows="1">1.0ml</entry><entrymorerows="1">1.0ml(2.0ml)</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">2.加入待反應(yīng)液</entry><entrymorerows="1">1.0ml</entry><entrymorerows="1">1.0ml</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">3.混合</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">4.37℃預(yù)熱5min</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">5.依次加入植酸鈉溶液</entry><entrymorerows="1">4ml</entry><entrymorerows="1">4ml(第二步)</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">6.混合</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">7.37℃水解30min</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">8.依次加入終止液</entry><entrymorerows="1">4ml</entry><entrymorerows="1">4ml(第一步)</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">9.混合</entry><entrymorerows="1">√</entry><entrymorerows="1">√</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">總體積</entry><entrymorerows="1">10ml</entry><entrymorerows="1">10ml</entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></tables>(2.4)樣品測(cè)定反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機(jī)上以4000r/min離心10min，上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在分光光度計(jì)415nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品空白和樣品溶液的吸光值，用直線回歸方程計(jì)算植酸酶的活性；(2.5)結(jié)果計(jì)算和表示(2.5.1)植酸酶活性計(jì)算式中C-----根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由直線回歸方程計(jì)算出的酶活性；F-----試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)；m----試樣重量；(2.5.2)結(jié)果表示兩個(gè)平行樣品的測(cè)定結(jié)果用算式平均值表示，保留整數(shù)。全文摘要本發(fā)明公開了一種添加在飼料中植酸酶活性的微量測(cè)定方法。該方法首先，用乙酸緩沖液I作為透析外液對(duì)樣品進(jìn)行透析處理，降低飼料中無機(jī)磷含量，以消除飼料中的無機(jī)磷對(duì)植酸酶水解反應(yīng)的影響；其次，在反應(yīng)時(shí)取待反應(yīng)液體積1ml代替現(xiàn)有方法中的0.2ml，加1ml乙酸緩沖液I代替現(xiàn)有方法的1.8ml乙酸緩沖液I，使樣品空白的吸光值落在一個(gè)合理的測(cè)定范圍內(nèi)，以避免因樣品空白中無機(jī)磷含量過高而引起測(cè)定的誤差；第三，在飼料中添加已知酶，通過測(cè)定已知酶，檢驗(yàn)已知酶在樣品提取、透析、測(cè)定過程中是否有損失。本發(fā)明能夠準(zhǔn)確測(cè)定添加在飼料中植酸酶含量。文檔編號(hào)G01N21/75GK101493418SQ20091000942公開日2009年7月29日申請(qǐng)日期2009年2月24日優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日發(fā)明者劉金山,史寶軍,崔細(xì)鵬,陳麗芝申請(qǐng)人:廣東溢多利生物科技股份有限公司