專利名稱：對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)，具體涉及一種用于檢測(cè)對(duì)蝦白斑癥 病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的免疫檢測(cè)芯片或微陣列、制備方法及其應(yīng)用， 其屬于免疫學(xué)、病毒學(xué)及生物芯片技術(shù)交叉領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
疾病嚴(yán)重威脅對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，各種病害給對(duì)蝦養(yǎng)殖造成了重大損失，而病害控 制中的不合理用藥，造成耐藥性、藥物殘留和在環(huán)境中的擴(kuò)散問(wèn)題，嚴(yán)重影響了食品安 全和環(huán)境公共衛(wèi)生，因此，養(yǎng)殖對(duì)蝦疾病的早期準(zhǔn)確檢測(cè)診斷對(duì)疾病的預(yù)防和控制尤為
重要。由白斑癥病毒(wssv)引起的白斑癥病毒病是對(duì)蝦養(yǎng)殖中危害嚴(yán)重的疾病之一，導(dǎo) 致很高的對(duì)蝦死亡率，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。wssv可以自然感染對(duì)蝦(中國(guó)
對(duì)蟲(chóng)下、日本對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦、刀額新對(duì)蝦等)、蟹類(天津厚蟹、日本大眼 蟹、三疣梭子蟹等)、橈足類等，主要感染宿主的鰓、上皮、造血組織、皮下組織、淋巴 器官等。
鑒于目前白斑癥病毒病尚無(wú)有效的治療方法，快速準(zhǔn)確的病毒檢測(cè)技術(shù)己成為各國(guó) 學(xué)者研究的焦點(diǎn)之一。白斑癥病毒病的診斷主要是依靠實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)白斑癥病毒檢測(cè)來(lái)確
診，常用檢測(cè)技術(shù)有電鏡技術(shù)，PCR法，DNA探針原位雜交法，免疫熒光抗體技術(shù)，免 疫組織化學(xué)技術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法，斑點(diǎn)免疫印跡技術(shù)等。電鏡技術(shù)使用可靠但耗 時(shí)長(zhǎng)；PCR法靈敏度高，可用于無(wú)癥狀水產(chǎn)動(dòng)物的病原檢測(cè)，但易污染且易出現(xiàn)假陽(yáng)性； DNA探針原位雜交法具有高度的特異性和敏感性，但是，應(yīng)用同位素標(biāo)記核酸探針作分 子雜交有放射性，操作復(fù)雜，而非放射性標(biāo)記探針往往敏感性較差；酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè) 法及斑點(diǎn)免疫印跡技術(shù)是目前常用的檢測(cè)方法，但被檢組織的內(nèi)源酶會(huì)對(duì)其檢測(cè)結(jié)果產(chǎn) 生干擾，導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)。這些檢測(cè)技術(shù)都存在一定的局限性，效率低，耗時(shí)長(zhǎng)，實(shí) 用性較差。因此，建立一種適用于對(duì)蝦白斑癥病毒的快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)診斷技術(shù) 勢(shì)在必行，以期達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的，而新發(fā)展起來(lái)的生物芯片技術(shù)為其提供了 強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)，對(duì)蝦白斑癥病毒單克隆抗體的成功研制，為利用WSSV單克隆抗體 建立對(duì)蟲(chóng)下白斑癥病毒病的免疫芯片檢測(cè)診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。白斑癥病毒病多樣品檢驗(yàn) 并行處理的免疫芯片技術(shù)，在對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中病毒的檢測(cè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)狀和對(duì)蝦不具備獲得性免疫功能的特點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種能同 時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中的白斑癥病毒的免疫檢測(cè)芯片，用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中蝦類/蟹類白斑癥病毒
病的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，及進(jìn)出口蝦類/蟹類中wssv的檢疫。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片的制備方法。 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述免疫檢測(cè)芯片在養(yǎng)殖對(duì)蝦白斑癥病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的-
一種對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片，其結(jié)構(gòu)包括芯片載體、鋪覆于芯片載體上的瓊
脂糖凝膠層、瓊脂糖凝膠層上固定有多個(gè)4X4的抗體微陣列，各個(gè)微陣列之間用芯片專 用圍欄或Super PAP Pen劃線隔開(kāi)。A液滲透壓小于360mOsm/kg的低滲液；B液吐 溫-磷酸鹽緩沖液(PBST) ; C液Cy3標(biāo)記的鼠抗白斑癥病毒單克隆抗體(單抗)探 針，探針?biāo)脝慰故怯蓛芍觌s交瘤細(xì)胞分別分泌的鼠抗白斑癥病毒核衣殼單抗D和鼠抗 白斑癥病毒囊膜單抗E(簡(jiǎn)稱為單抗D、 E)，單抗D和E雜交瘤細(xì)胞的保藏號(hào)分別為 CCTCC-C200422和CCTCC-C200421 ，保藏日期2004年12月14日。
本發(fā)明以現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)際特點(diǎn)由于其一，對(duì)蝦不具備獲得性免疫功能，體內(nèi)無(wú)抗 體的形成，因此不能用間接法檢測(cè)樣品中的抗體；其二，對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦疾病的檢測(cè)診斷是 一個(gè)群體的概念，可以通過(guò)對(duì)多個(gè)個(gè)體的檢測(cè)達(dá)到對(duì)群體做出診斷的目的。因此，本發(fā) 明根據(jù)這些特點(diǎn)，采用夾心法檢測(cè)抗原，在芯片片基上固定病原的多克隆抗體(多抗)， 取待檢個(gè)體的靶器官組織制備待檢樣品液，直接將待測(cè)樣品液與固定有多抗的芯片孵育， 以捕獲抗原使其結(jié)合在芯片上，再加上熒光標(biāo)記的特異性單抗探針，通過(guò)CCD芯片掃 描儀讀取結(jié)果。
對(duì)蟲(chóng)下白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片的制備方法，包括如下步驟 (1)抗體的獲得及純化
從患白斑癥病毒病對(duì)蝦的鰓等靶器官中提取WSSV，常規(guī)方法免疫純種新西蘭白兔， 采血制備血清，得到兔抗WSSV抗體。
復(fù)蘇并培養(yǎng)小鼠雜交瘤細(xì)胞株單抗D和單抗E，注射小鼠腹腔生產(chǎn)腹水，得到大量 高效價(jià)、高特異性的鼠抗WSSV單抗。
取親和層析純化后的單抗D和單抗E，混合后，常規(guī)方法免疫純種新西蘭白兔，采 血制備血清，得到兔抗鼠抗WSSV單抗的抗體(兔抗鼠Ig的抗體)。
使用Amersham Phamacia Biotech公司的親禾口層禾斤豐主(HiTrap Protein G Sepharose Column)純化所得抗體。(2) Cy3標(biāo)記的抗體探針的制備
按照Amersham Phamacia Biotech公司的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用熒光素Cy3對(duì)親和層析 純化后的鼠抗WSSV單抗進(jìn)行標(biāo)記，并過(guò)凝膠柱純化。
(3) 載玻片的預(yù)處理
將載玻片分別用強(qiáng)堿和濃硫酸浸洗，雙蒸水沖洗，晾干；將清洗后的載玻片浸入0.4 %的親和硅垸的乙酸溶液中，調(diào)pH至4.5，室溫作用lh，雙蒸水沖洗，晾干。
(4) 瓊脂糖凝膠基片的制備
配制0.6~1.4%的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3min,使其完全溶解，將2mL瓊脂糖溶 液鋪覆在6(TC預(yù)熱的親和硅烷處理過(guò)的清潔玻片上；瓊脂糖凝固后，載玻片在37'C下過(guò) 夜干燥；使用前用0.02mol/LNaK)4溶液室溫下活化30min，超純水徹底沖洗3遍，并用 氮?dú)饬鞔蹈?，室溫干燥處保存?br> (5) 抗體的固定
① 用pH7.4的含10%~60%甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋兔抗WSSV抗體，使 其濃度為0.5~0.0001mg/mL;稀釋兔抗鼠Ig的抗體，使其濃度為0.1mg/mL。
② 用點(diǎn)樣儀將此抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為 50 70nL，點(diǎn)直徑為500 60(Him。每張芯片兩排四列共8個(gè)4X4亞陣列，每個(gè)亞陣列所 點(diǎn)樣品一致，第一列所點(diǎn)樣品為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照，第二、三列所點(diǎn)樣品 為兔抗WSSV抗體，第四列為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照 及固定對(duì)照。各個(gè)亞陣列之間用芯片專用圍欄或S叩er PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng) 單元。37'C飽和濕度放置0.5 2.5h，洗滌，晾干。
③ 向載玻片上點(diǎn)有抗體的區(qū)域分別滴加不同的封閉液(1~5%牛血清白蛋白、5% 脫脂奶粉、1%明膠、甘氨酸、谷氨酸、酪氨酸)進(jìn)行封閉，37'C飽和濕度放置0.25 2h， 洗滌，晾干，4'C密封保存，得到對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片。
本發(fā)明的對(duì)蝦WSSV免疫檢測(cè)芯片的應(yīng)用，所述該應(yīng)用的步驟如下
(1) 用于檢測(cè)的樣品包括蝦/蟹等的鰓、血淋巴等或橈足類等，取樣，與A液約 按1: 10 (W/V)的比例混合，勻槳，再沉降5 10min，取上清作為檢測(cè)樣品，待檢。
(2) 將待檢樣品加到上述芯片的不同亞陣列中，加樣量為10nL/陣列， 一張芯片可 同時(shí)檢測(cè)八個(gè)樣品，注意避免不同亞陣列間的液體混合。37t:飽和濕度放置0.25~2h， 洗滌，再加稀釋的C液(Cy3標(biāo)記的鼠抗WSSV單抗)，10pL/陣列，37'C飽和濕度放置 0.25~2h，洗滌，晾干。
(3) 激光掃描
上述檢測(cè)芯片用晶芯@6003(^11^ -100 CCD掃描儀掃描成像，激發(fā)波長(zhǎng)為532nm，
6檢測(cè)波長(zhǎng)為585nm，熒光信號(hào)用Lab-chipscanner 2.0軟件分析。
檢測(cè)結(jié)果分析與判定掃描得到的圖像亞陣列中，第一列陰性對(duì)照的信號(hào)強(qiáng)度代表 實(shí)驗(yàn)的本底值大??；第二、三列出現(xiàn)綠色熒光亮點(diǎn)的為陽(yáng)性，表明所檢測(cè)樣品中有WSSV， 無(wú)綠色熒光亮點(diǎn)的為陰性，表明所檢測(cè)樣品中無(wú)WSSV。信號(hào)強(qiáng)弱與樣品中病毒濃度有 關(guān)；第四列質(zhì)量控制點(diǎn)出現(xiàn)綠色熒光為正常，如果沒(méi)有綠色熒光，說(shuō)明檢測(cè)操作有問(wèn)題 或者抗體蛋白發(fā)生變性，檢測(cè)結(jié)果為無(wú)效。
(4)病毒的定量檢測(cè)及最低檢測(cè)限
分離純化的WSSV稀釋至25.6pg/mL，再按二倍比稀釋所得的8個(gè)抗原濃度分別與 檢測(cè)芯片上的8個(gè)亞陣列孵育，經(jīng)抗體探針檢測(cè)，掃描分析后結(jié)果如圖3所示，隨抗原 濃度變化，熒光信號(hào)呈現(xiàn)梯度的變化。信號(hào)強(qiáng)度分析顯示相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度和抗原濃度之間 有較好的線性關(guān)系，提示所構(gòu)建的抗體微陣列在一定的病毒濃度范圍內(nèi)可以進(jìn)行定量分 析。此抗體微陣列所能檢測(cè)到的最低抗原濃度為0.8嗎/mL。
所述芯片載體具有經(jīng)過(guò)親和硅垸處理后，并用瓊脂糖凝膠修飾的玻璃表面，該表面 為三維多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)Nal04活化后，可以使抗體以物理吸附和共價(jià)連接兩種方式固定在 其上，同時(shí)，其親水環(huán)境還有利于保持固定在上面的抗體蛋白的活性。所述的抗體是兔 抗WSSV抗體、兔抗鼠Ig的抗體，但不僅僅限于這兩種抗體。
所述的瓊脂糖濃度為1.2%為宜。
所述的磷酸鹽甘油緩沖液甘油濃度為50%。
所用于點(diǎn)樣的親和層析純化后兔抗WSSV抗體最適濃度為0.1mg/mL。 所述的用點(diǎn)樣儀將抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片表面的不同區(qū)域點(diǎn)樣，其放置溫度 為37°C，飽和濕度下放置2h。
所述的封閉液為3%牛血清白蛋白，封閉時(shí)間為60min。
所述的待檢樣品加到芯片上后，37t:飽和濕度放置15 30mhv，芯片上加稀釋的抗體 探針后，37。C飽和濕度下放置15 30min。
所述芯片單張玻片點(diǎn)有8個(gè)亞陣列，可以根據(jù)實(shí)際需要增加亞陣列數(shù)量，能夠?qū)崿F(xiàn) 更多樣品的同時(shí)檢測(cè)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可以同吋檢測(cè)多個(gè)樣品或同一個(gè)體的多個(gè)不同組織中的WSSV， 它結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本低廉，通量易于擴(kuò)充，實(shí)現(xiàn)多樣品的同時(shí)平行檢測(cè)，增加了不同標(biāo)本 數(shù)據(jù)之間的可比性，可簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物如蝦類和蟹類中的WSSV。 對(duì)樣品要求簡(jiǎn)單，少量樣品即可滿足檢測(cè)需要，并大大簡(jiǎn)化了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的樣品處理 步驟。同時(shí)由于陽(yáng)性控制及陰性控制的設(shè)置及捕獲抗體的重復(fù)點(diǎn)樣，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的 可靠性。反應(yīng)相對(duì)較快，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)2h，操作過(guò)程便捷， 一般人員即可操作，并且能夠相對(duì)定量檢測(cè)病原，適用于對(duì)蝦、蟹類等的養(yǎng)殖過(guò)程中白斑癥病毒病的快速、 簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)及水產(chǎn)動(dòng)物的出入境檢驗(yàn)檢疫等。


圖1對(duì)蟲(chóng)下白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)示意圖及點(diǎn)樣分布圖。
l-芯片載體，2-瓊脂糖凝膠層，3-抗體微陣列，4-芯片專用圍欄或Super PAP Pen劃 線，5-標(biāo)簽區(qū)域。點(diǎn)樣分布①含50。/。甘油的PBS，作為陰性對(duì)照；②、③為兔抗WSSV 抗體；④兔抗鼠Ig的抗體，作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照等質(zhì)量控制。
圖2抗原濃度與信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系及免疫芯片的檢測(cè)限。
a-h所檢測(cè)的抗原濃度依次為25.6、 12.8、 6.4、 3.2、 1.6、 0.8、 0.4、 0.2pg/mL。
圖3:用對(duì)奸白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片檢測(cè)不同來(lái)源對(duì)蝦樣品中WSSV的CCD掃
描圖(掃描儀的熒光強(qiáng)度設(shè)定為88%)。
Al、 A2表明樣品中WSSV濃度較高，A3、 A4、 Bl、 B2、 B4表明樣品中未檢出
WSSV， B3表明樣品中WSSV含量較低。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明所用儀器及試劑如下
小型手動(dòng)芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)(購(gòu)自Whatman公司)；晶芯⑧EcoScanTM -100 CCD掃描儀 (購(gòu)自北京博奧生物公司)；Cy3抗體標(biāo)記試劑盒(購(gòu)自GE公司)；HiTrap Protein G Sepharose Column(購(gòu)自GE公司)；1640 (購(gòu)自GIBCO公司)；胎牛血清(購(gòu)自HYCLONE 公司)；牛血清白蛋白(購(gòu)自SIGMA公司)；Tween-20 (購(gòu)自SIGMA公司)；二甲基亞 砜(購(gòu)自SIGMA公司)。
實(shí)施例1:
1.抗體的獲得及純化
從白斑癥病毒病的對(duì)蝦靶器官提取wssv，常規(guī)方法免疫純種新西蘭白兔，采血制 備血清，得到兔抗wssv抗體。
復(fù)蘇并培養(yǎng)小鼠雜交瘤細(xì)胞株單抗D和單抗E，注射小鼠腹腔生產(chǎn)腹水，得到大量 高效價(jià)、高特異性的鼠抗WSSV單抗。
取親和層析純化后的單抗D和單抗E,混合后，常規(guī)方法免疫純種新西蘭白兔，采 血制備血清，得到兔抗鼠Ig的抗體。"f吏用Amersham Phamacia Biotech公司的親禾卩層析豐主(HiTrap Protein G Sepharose Column)純化所得抗體。2. Cy3標(biāo)記的抗體探針的制備按照Amersham Phamacia Biotech公司的Cy3產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用熒光素Cy3對(duì)親和 層析純化后的鼠抗WSSV單抗進(jìn)行標(biāo)記，并過(guò)凝膠柱純化。3. 載玻片的預(yù)處理將玻片分別用強(qiáng)堿和濃硫酸浸洗，雙蒸水沖洗，晾干；將清洗后的玻片浸入0.4% 的親和硅烷的乙酸溶液中，調(diào)pH至4.5，室溫作用lh，雙蒸水沖洗，晾干。4. 芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)該芯片結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括芯片載體(1)、鋪覆于芯片載體(1)上的瓊脂糖凝膠 層(2),瓊脂糖凝膠層(2)上固定有兩排四列共8個(gè)4X4的抗體微陣列(3)，點(diǎn)樣量 為50-70nL，點(diǎn)直徑為500~600nm。各個(gè)微陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen劃 線(4)隔開(kāi)。所述的芯片載體為標(biāo)準(zhǔn)載玻片，在玻片一端可以留出標(biāo)簽區(qū)域(5)。5. 瓊脂糖凝膠基片的制備配制0.6%、 0.8%、 1.0%、 1.2%、 1.4%的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3min完全溶解， 將2mL瓊脂糖溶液鋪覆在6(TC預(yù)熱的親和硅垸處理過(guò)的清潔玻片上；瓊脂糖凝固后， 玻片在37'C下過(guò)夜干燥；使用前用0.02mol/LNalO4溶液室溫下活化30min，超純水徹底 沖洗3遍，并用氮?dú)饬鞔蹈?，室溫干燥處保存?. 抗體的固定① 用pH 7.4的PBS甘油緩沖液稀釋兔抗WSSV抗體、兔抗鼠Ig的抗體，使其濃 度為0.1mg/mL。② 用點(diǎn)樣儀將此抗體稀釋液在不同濃度瓊脂糖修飾的載玻片表面的不同區(qū)域點(diǎn)樣， 芯片結(jié)構(gòu)及點(diǎn)陣分布如圖l所示，每張芯片兩排四列共8個(gè)4X4亞陣列，每個(gè)亞陣列所 點(diǎn)樣品一致，第一列所點(diǎn)樣品為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照，第二、三列所點(diǎn)樣品 為兔抗WSSV抗體，第四列為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照 及固定對(duì)照。各個(gè)亞陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng) 單元。37X:飽和濕度放置2h，洗滌，晾干。③ 向載玻片上點(diǎn)有抗體的區(qū)域滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37。C飽和濕度放置 lh，洗滌，晾干，4'C密封保存，得到對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片。實(shí)施例2:步驟1、 2、 3、 4同實(shí)施例1。5. 瓊脂糖凝膠基片的制備配制1.2%的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3min完全溶解，將2mL瓊脂糖溶液鋪覆在 6(TC預(yù)熱的親和硅垸處理過(guò)的清潔玻片上；瓊脂糖凝固后，玻片在37'C下過(guò)夜干燥；使 用前用0.02mol/L Nal04溶液室溫下活化30min，超純水徹底沖洗3遍，并用氮?dú)饬鞔蹈桑?室溫干燥處保存。6. 抗體的固定① 用pH7.4的分別含10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%甘油的PBS緩沖液稀 釋兔抗WSSV抗體、兔抗鼠Ig的抗體，使其濃度為0.Img/mL。② 用點(diǎn)樣儀將此抗體稀釋液在載玻片表面的不同區(qū)域點(diǎn)樣，每張芯片兩排三列共6 個(gè)4X4亞陣列，每個(gè)亞陣列所點(diǎn)樣品一致，為含不同濃度甘油的PBS緩沖液稀釋的抗 體。其中第一列所點(diǎn)樣品為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照，第二、三列所點(diǎn)樣品為兔 抗WSSV抗體，第四列為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固 定對(duì)照。各個(gè)亞陣列之間用芯片專用圍欄或SuperPAPPen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。 37'C飽和濕度放置2h，洗滌，晾干。③ 向載玻片上點(diǎn)有抗體的區(qū)域滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37'C飽和濕度放置 lh，洗滌，晾干，4。C密封保存，得到對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片。實(shí)施例3:步驟1、 2、 3、 4、 5同實(shí)施例2。 6.抗體的固定① 用pH 7.4的含50%甘油的PBS緩沖液稀釋兔抗WSSV抗體，使其濃度為0.5、 0.1、 0.05、 0.01、 0.005、 0.001、 0.0005、 0.0001mg/mL。② 用點(diǎn)樣儀將不同濃度抗體稀釋液在載玻片表面的不同區(qū)域點(diǎn)樣，每張芯片兩排四 列共8個(gè)4X4亞陣列，每個(gè)亞陣列為不同濃度的兔抗WSSV抗體，各個(gè)亞陣列之間用 芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37。C飽和濕度放置2h，洗 滌，晾干。③ 向載玻片上點(diǎn)有抗體的區(qū)域滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37'C飽和濕度放置 lh，洗滌，晾干，4。C密封保存，得到對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片。實(shí)施例4:步驟1、 2、 3、 4、 5同實(shí)施例2。 6.抗體的固定10%甘油的PBS緩沖液稀釋兔抗WSSV抗體、兔抗鼠Ig的抗體， 使其濃度為0.1mg/mL。② 用點(diǎn)樣儀將此抗體稀釋液在載玻片表面的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)陣分布如圖1所示， 每張芯片兩排四列共8個(gè)4X4亞陣列，每個(gè)亞陣列所點(diǎn)樣品一致，第一列所點(diǎn)樣品為磷 酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照，第二、三列所點(diǎn)樣品為兔抗WSSV抗體，第四列為質(zhì)量 控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照。各個(gè)亞陣列之間用芯片 專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37匸飽和濕度分別放置0.5h、 lh、 1.5h、 2h、 2.5h，洗滌，晾干。③ 向載玻片上點(diǎn)有抗體的區(qū)域滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37'C飽和濕度放置 lh，洗滌，晾干，4'C密封保存，得到對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片。實(shí)施例5:步驟1、 2、 3、 4、 5同實(shí)施例2。 6.抗體的固定①用pH 7.4的含50%甘油的PBS緩沖液稀釋兔抗WSSV抗體、兔抗鼠Ig的抗體， 使其濃度為0.1mg/mL。(D用點(diǎn)樣儀將此抗體稀釋液在載玻片表面的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)陣分布如圖1所示， 每張芯片兩排四列共8個(gè)4X4亞陣列，每個(gè)亞陣列所點(diǎn)樣品一致，第一列所點(diǎn)樣品為磷 酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照，第二、三列所點(diǎn)樣品為兔抗WSSV抗體，第四列為質(zhì)量 控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照。各個(gè)亞陣列之間用芯片 專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37。C飽和濕度放置2h，洗滌， 晾干。③向載玻片上點(diǎn)有抗體的區(qū)域分別滴加1% 5%牛血清白蛋白、5%脫脂奶粉、1% 明膠、甘氨酸、谷氨酸、酪氨酸等封閉液進(jìn)行封閉，37'C飽和濕度放置15min、 30min、 45min、 60min、 90min、 120min，洗滌，晾干，4'C密封保存，得到對(duì)蝦白斑癥病毒免疫 檢測(cè)芯片。實(shí)施例6:檢測(cè)對(duì)蝦白斑癥病毒采用的是夾心法。 步驟1、 2、 3、 4、 5同實(shí)施例2。 6.抗體的固定①用pH7.4的含50%甘油的PBS緩沖液稀釋兔抗WSSV抗體、兔抗鼠Ig的抗體，使其濃度為0.1mg/mL。② 用點(diǎn)樣儀將此抗體稀釋液在載玻片表面的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)陣分布如圖l所示， 每張芯片兩排四列共8個(gè)4X4亞陣列，每個(gè)亞陣列所點(diǎn)樣品一致，第一列所點(diǎn)樣品為磷 酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照，第二、三列所點(diǎn)樣品為兔抗WSSV抗體，第四列為質(zhì)量 控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照。各個(gè)亞陣列之間用芯片 專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37"C飽和濕度放置2h，洗滌， 晾干。③ 向載玻片上點(diǎn)有抗體的區(qū)域滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37'C飽和濕度放置 lh,洗滌，晾干，4'C密封保存，得到對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片。7.病原的檢測(cè)① 取待檢樣品(蝦/蟹等的鰓或血淋巴或橈足類等)，與A液約按1: 10(W/V)的比 例混合，勻漿，再沉降5-10min，取上清液作為檢測(cè)樣品，待檢。② 將待檢樣品加入上述芯片同一載體不同亞陣列中，加樣量為10pL/陣列， 一張芯片 可同時(shí)檢測(cè)八個(gè)樣品，注意避免不同亞陣列間的液體混合。37'C飽和濕度孵育15min、 30min、 45min、 60min、 90min、 120min，洗滌，在玻片上加稀釋的C液，10pL/陣列， 37'C飽和濕度放置孵育15min、 30min、 45min、 60min、 90min、 120min，洗滌，晾干。③ 激光掃描上述檢測(cè)芯片用晶芯@￡0030&11， -100 CCD掃描儀掃描成像，激發(fā)波長(zhǎng)為532nm， 檢測(cè)波長(zhǎng)為585nm，熒光信號(hào)用Lab-chipscanner 2.0軟件分析。檢測(cè)結(jié)果分析與判定掃描得到的圖像亞陣列中，第一列陰性對(duì)照的信號(hào)強(qiáng)度代表 實(shí)驗(yàn)的本底值大??；第二、三列出現(xiàn)綠色熒光亮點(diǎn)的為陽(yáng)性，表明所檢測(cè)樣品中有WSSV， 無(wú)綠色熒光亮點(diǎn)的為陰性，表明所檢測(cè)樣品中無(wú)WSSV。信號(hào)強(qiáng)弱與樣品中病毒濃度有 關(guān)；第四列陽(yáng)性對(duì)照及質(zhì)量控制出現(xiàn)綠色熒光為正常，如果沒(méi)有綠色熒光，說(shuō)明檢測(cè)操 作有問(wèn)題或者抗體蛋白發(fā)生變性，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。實(shí)施例7:抗原的定量分析及最低檢測(cè)限取制備好的對(duì)蝦WSSV免疫檢測(cè)芯片，將純化的WSSV稀釋至25.6pg/mL，再按二 倍比稀釋所得的8個(gè)抗原濃度分別與玻片上的抗體微陣列孵育，經(jīng)抗體探針檢測(cè)后，掃 描結(jié)果利用計(jì)算機(jī)軟件處理。結(jié)果顯示，隨抗原濃度變化，熒光信號(hào)呈現(xiàn)梯度的變化。 信號(hào)強(qiáng)度分析顯示相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度和抗原濃度之間有較好的線性關(guān)系，由此可見(jiàn)所構(gòu)建的 抗體微陣列在一定的病毒濃度范圍內(nèi)可以進(jìn)行定量分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可算出待檢12樣品的病毒含量。此抗體微陣列所能檢測(cè)到的病毒最低濃度為0.8ug/mL。 實(shí)施例8:對(duì)蟲(chóng)下白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片的特異性檢測(cè)取正常蝦/蟹鰓、血淋巴等，經(jīng)PCR檢測(cè)未感染W(wǎng)SSV,組織勻漿后沉降，取上清， 與對(duì)奸白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片上的抗體微陣列孵育，經(jīng)抗體探針檢測(cè)后掃描，無(wú)熒光 信號(hào)，證實(shí)所制備的白斑癥病毒檢測(cè)芯片與組織無(wú)交叉反應(yīng)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修 改、添加和替換都是可能的，其都沒(méi)有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片，其特征在于它包括芯片載體、鋪覆于芯片載體上的瓊脂糖凝膠層，瓊脂糖凝膠層上固定有多個(gè)抗體微陣列，各個(gè)微陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen劃線隔開(kāi)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片，其特征在于所述的芯片載體為 標(biāo)準(zhǔn)載玻片，所述芯片載體具有經(jīng)過(guò)親和硅垸處理后，并用瓊脂糖凝膠修飾的玻璃表面，該表 面為三維多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)Nal04活化后，可以使抗體以物理吸附和共價(jià)連接兩種方式固定在其上。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片，其特征在于所述的抗體是兔 抗白斑癥病毒抗體、兔抗鼠Ig的抗體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片的制備方法，其特征是它包括如下 步驟(1) 抗體的制備及純化制備兔抗白斑癥病毒抗體，兔抗鼠Ig的抗體，鼠抗白斑癥病毒單克隆抗體(單抗)，親和 層析法純化所得抗體；(2) Cy3標(biāo)記單克隆抗體探針的制備將親和層析純化后的鼠抗白斑病毒單抗用Cy3標(biāo)記，并過(guò)凝膠柱純化；(3) 載玻片的預(yù)處理將載玻片分別用強(qiáng)堿和濃硫酸浸洗，雙蒸水沖洗，晾干；將清洗后的載玻片浸入0.4%的親 和硅烷的乙酸溶液中，調(diào)pH至4.5,室溫下作用lh，雙蒸水沖洗，晾干；(4) 瓊脂糖凝膠基片的制備配制0.6~1.4%的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3min，使其完全溶解，將2ml瓊脂糖溶液鋪覆 在經(jīng)60'C預(yù)熱的親和硅垸處理過(guò)的清潔載玻片上；待瓊脂糖凝固后，將玻片在37'C下過(guò)夜干燥； 使用前在室溫下用0.02mol/LNalO4溶液活化30min，超純水沖洗3遍，用氮?dú)饬鞔蹈?，室溫?燥處保存；(5) 抗體的固定① 用pH 7.4的含10%~60%甘油的PBS緩沖液稀釋兔抗白斑癥病毒抗體，使其濃度為0.5 0.0001mg/mL、稀釋兔抗鼠Ig的抗體，使其濃度為O.lmg/mL;② 用點(diǎn)樣儀將此抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為50 70nL，點(diǎn)直 徑為500400Mm。每張芯片兩排四列共8個(gè)4X4亞陣列，每個(gè)亞陣列所點(diǎn)樣品一致，第一列所 點(diǎn)樣品為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照，第二、三列所點(diǎn)樣品為兔抗白斑癥病毒抗體，第四列為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照。各個(gè)亞陣列之間用芯 片專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37。C飽和濕度放置0.5~2.5h，洗滌， 晾干；③向載玻片上點(diǎn)有抗體的區(qū)域滴加1 5X牛血清白蛋白，或5%脫脂奶粉，或1%明膠，或 甘氨酸，或谷氨酸，或酪氨酸等封閉液進(jìn)行封閉，37'C飽和濕度放置0.25~2h,洗滌，晾干，4 'C密封保存，得到對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于用Cy3 標(biāo)記親和層析純化后的鼠抗白斑癥病毒單抗作為抗體探針，并使用兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì) 照及固定對(duì)照。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于Cy3標(biāo) 記的抗體探針?biāo)脝慰故怯蓛芍觌s交瘤細(xì)胞分別分泌的鼠抗白斑癥病毒核衣殼單抗D和鼠抗白 斑癥病毒囊膜單抗E。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片在養(yǎng)殖對(duì)蝦白斑癥病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片的應(yīng)用，其特征在于它包括如下步驟(1) 用于檢測(cè)的樣品包括蝦/蟹等的鰓、血淋巴等或橈足類等，取樣后與緩沖液約按1: 10 (W/V)的比例混合，勻漿，再沉降5 10min，取上清作為檢測(cè)樣品，待檢；(2) 將待檢樣品加到上述芯片的不同亞陣列中，37'C飽和濕度放置0.25~2h，洗滌，再加稀 釋的Cy3標(biāo)記的鼠抗白斑癥病毒單抗探針，37'C飽和濕度放置0.25 2h，洗滌，晾干；(3) 激光掃描玻片用晶芯850)803111^ -100 CCD掃描儀掃描成像，圖像用專業(yè)分析軟件分析，根據(jù)熒光 信號(hào)的強(qiáng)弱，得到樣品中對(duì)奸白斑癥病毒含量的定性定量分析結(jié)果。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片的應(yīng)用，其特征在于所用待檢樣品 為水產(chǎn)動(dòng)物組織勻漿液上清，所述抗體芯片與待檢樣品中白斑癥病毒反應(yīng)形成的復(fù)合體，被高 特異性的Cy3標(biāo)記的抗體探針?biāo)R(shí)別，在532nm的激光下呈現(xiàn)綠色熒光。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片的應(yīng)用，其特征在于待檢樣品滴 加到芯片上后，37。C飽和濕度放置15 30min,玻片上加稀釋的熒光抗體探針后，37'C飽和濕度 放置15 30min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)蝦白斑癥病毒免疫檢測(cè)芯片，其結(jié)構(gòu)包括芯片載體、鋪覆于芯片載體上的瓊脂糖凝膠層、瓊脂糖凝膠層上固定有多個(gè)4×4的抗體微陣列，各個(gè)微陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen劃線隔開(kāi)。本發(fā)明采用夾心法檢測(cè)抗原，在芯片片基上固定病原的多克隆抗體(多抗)，取待檢個(gè)體的靶器官組織制備待檢樣品液，直接將待測(cè)樣品液與固定有多抗的芯片孵育，以捕獲抗原使其結(jié)合在芯片上，再加上熒光標(biāo)記的特異性單抗探針，通過(guò)CCD芯片掃描儀讀取結(jié)果。其優(yōu)點(diǎn)在于能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中的白斑癥病毒，用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中蝦類/蟹類白斑癥病毒病的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，及進(jìn)出口蝦類/蟹類中WSSV的檢疫。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101629954SQ20091001783
公開(kāi)日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者徐曉麗, 戰(zhàn)文斌, 繩秀珍 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)