專利名稱：魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海水養(yǎng)殖動物病原檢測技術(shù)的改進，具體涉及一種用于檢測魚類淋巴囊 腫病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV)的免疫檢測芯片或微陣列及其制備方法 與應(yīng)用，其屬于免疫學(xué)、病毒學(xué)及生物芯片交叉技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
魚類淋巴囊腫病是一種慢性病毒病，患病魚的表皮、鰭和尾部等處出現(xiàn)菜花樣囊腫， 影響其商品價值或?qū)е卖~死亡。淋巴囊腫病的病原為淋巴囊腫病毒(LCDV)，屬于虹彩 病毒科(Iridoviridae)。淋巴囊腫病流行地區(qū)較廣，呈世界性分布，目前已知至少42科 125種以上的海水、咸水和半咸水魚類可被LCDV感染。自1997年牙鲆淋巴囊腫病在我 國首次大規(guī)模暴發(fā)以來，我國山東、河北、廣東、浙江等省養(yǎng)殖的石斑魚、真鯛、美國紅 魚、許氏平觸、軍曹魚等均發(fā)生過此病，造成的直接和間接經(jīng)濟損失達百億元之巨。與 其他的病毒病一樣，魚類淋巴囊腫病毒病缺乏有效的治療藥物。LCDV感染具有潛伏期長 的特點，使LCDV極易隨著親魚與魚苗在不同地區(qū)間的交流而傳播，因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)中 急需LCDV的快速準(zhǔn)確檢測技術(shù)，以期達到早發(fā)現(xiàn)早預(yù)防的目的。
國內(nèi)外檢測魚類病毒的方法大致包括電鏡技術(shù)，PCR法，DNA探針原位雜交法，免 疫熒光抗體技術(shù)，免疫組織化學(xué)技術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附檢測法以及斑點免疫印跡技術(shù)等。 但這些檢測技術(shù)局限性大，靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性多不能兼顧，不能用于多樣品同時 并行檢測。因此，建立一種適用于魚類淋巴囊腫病毒的簡便、快速、準(zhǔn)確、多樣品并行 處理的檢測診斷技術(shù)勢在必行，而新發(fā)展起來的蛋白芯片技術(shù)為其提供了強有力的技術(shù) 平臺，微量化的反應(yīng)既可節(jié)約昂貴的試劑又可結(jié)合動力學(xué)的快速分析，在蛋白質(zhì)水平上 提供了一個廉價快速的測試手段，在診斷領(lǐng)域具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景。另外，魚類淋 巴囊腫病毒單克隆抗體的成功研制，為利用單克隆抗體建立魚類淋巴囊腫病的免疫芯片
檢測診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種能同時檢測多種樣品或同一樣品不同組織 中淋巴囊腫病毒的免疫檢測芯片，用于海水養(yǎng)殖魚類中LCDV的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測，以及進出口魚類中LCDV的檢疫。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述魚類LCDV免疫檢測芯片的制備方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供上述免疫檢測芯片在養(yǎng)殖魚類LCDV檢測中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片，其結(jié)構(gòu)包括芯片載體、鋪覆于芯片載體上的 瓊脂糖凝膠層、瓊脂糖凝膠層上固定有多個抗體微陣列，各個微陣列之間用芯片專用圍 欄或Super PAP Pen劃線隔開。A液滲透壓小于360mOsm/kg的低滲液；B液吐溫-磷酸鹽緩沖液(PBST) ; C液Cy3標(biāo)記的鼠抗LCDV的單克隆抗體(單抗)探針， 探針?biāo)脝慰故怯蓛芍觌s交瘤細胞分別分泌的特異性抗LCDV單抗(簡稱LCDV單抗 B和單抗C),雜交瘤細胞的保藏號分別為CCTCC —C200419和CCTCC一C200420，保 藏日期2004年12月14日。LCDV與該兩株單抗發(fā)生特異性結(jié)合的抗原決定簇位于病 毒囊膜上。
本發(fā)明以現(xiàn)有技術(shù)的實際特點其一，魚類體內(nèi)有免疫球蛋白一IgM的形成，但血 清中IgM的標(biāo)記程序較為復(fù)雜；其二，對海水養(yǎng)殖動物疾病的診斷是一個群體的概念， 可以通過對多個個體的檢測達到對群體做出診斷的目的。因此，本發(fā)明根據(jù)這些特點， 采用夾心法檢測抗原，在芯片片基上固定病原的抗體，取待檢個體病毒靶器官制備待檢 樣品液，直接將待測樣品液與固定有病原抗體的芯片孵育，再加熒光標(biāo)記的特異性單抗 探針，通過CCD掃描儀讀取結(jié)果。
魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片的制備方法，包括如下步驟
(1) 抗體的制備及純化
從患淋巴囊腫病的牙鲆體表腫瘤中提取LCDV，常規(guī)方法免疫純種新西蘭白兔，采 血制備血清，得到兔抗LCDV抗體。
復(fù)蘇井培養(yǎng)小鼠雜交瘤細胞株(LCDV單抗B和單抗C)，注射一定數(shù)量的雜交瘤細 胞入小鼠腹腔生產(chǎn)腹水，得到大量高濃度、高特異性、高效價的鼠抗LCDV單抗。
取親和層析純化后的LCDV單抗B和單抗C，常規(guī)方法免疫純種新西蘭白兔，采血 制備血清，得到兔抗鼠抗LCDV單抗的抗體(兔抗鼠Ig的抗體)。
使用Amersham Phamacia Biotech公司的親禾口層析柱(HiTrap Protein G Sepharose Column)純化所得抗體。
(2) Cy3標(biāo)記的單克隆抗體探針的制備
按照Amersham Phamacia Biotech公司的產(chǎn)品說明書，使用熒光素Cy3對親和層析 純化后的鼠抗LCDV單抗進行標(biāo)記，并過凝膠柱純化。
(3) 載玻片的預(yù)處理將載玻片分別用強堿和濃硫酸浸洗，雙蒸水沖洗，晾干；將清洗后的載玻片浸入0.4 %的親和硅垸的乙酸溶液中，調(diào)pH至4.5,室溫作用lh，雙蒸水沖洗，晾干。
(4) 瓊脂糖凝膠基片的制備
配制1.2%的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3min，使其完全溶解，將2mL瓊脂糖溶液鋪 覆在60'C預(yù)熱的親和硅垸處理過的清潔玻片上；瓊脂糖凝固后，玻片在37"C下過夜干燥； 使用前用0.02mol/LNal04溶液室溫下活化30min，超純水徹底沖洗3遍，并用氮氣流吹 干，室溫干燥處保存。
(5) 抗體的固定
① 用pH7.4的含50%甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋兔抗LCDV抗體使其濃度 為0.5~0.0001mg/mL;稀釋兔抗鼠Ig的抗體使其濃度為0.1mg/mL。
② 用點樣儀將此抗體稀釋液在修飾過的載玻片表面的不同區(qū)域點樣，點樣量為 50~70nL，點直徑為500 600fim。每張芯片兩排四列共8個4X4亞陣列，每個亞陣列所 點樣品一致，第一列所點樣品為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對照，第二、三列所點樣品 為兔抗LCDV抗體，第四列所點樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽性對照及固定對照。各 個亞陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔丌，形成獨立的反應(yīng)單元。37。C飽和 濕度放置2h，洗滌，晾干。
③ 在載玻片上點有抗體的區(qū)域滴加3%牛血清白蛋白封閉，37'C飽和濕度放置lh， 洗滌，晾干，4'C密封保存，得到魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片。
本發(fā)明的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片的應(yīng)用，所述該應(yīng)用步驟如下
(1) 用于檢測的魚類組織包括魚體表瘤狀物、表皮、脾、胃、腸等，取樣與A 液約按1: 10 (W/V)的比例混合，勻漿，反復(fù)凍融3 4次，超聲破碎后，低溫離心， 5000rpm， 15min，取上清作為檢測樣品，待檢。
(2) 將不同待檢樣品加到上述芯片的不同亞陣列中，加樣量為10pL/陣列， 一張芯 片可同時檢測八個樣品，注意避免不同亞陣列間的液體混合。37。C飽和濕度放置0.25 2h， 洗滌，再加稀釋的C液(Cy3標(biāo)記的鼠抗LCDV單抗)，1(HiL/陣列，37'C飽和濕度放 置0.25 2h，洗滌，晾干。
(3) 激光掃描
上述檢測芯片用晶芯⑧EcoScanTM -100 CCD掃描儀掃描成像，激發(fā)波長為532nm， 檢測波長為585nm,熒光信號用Lab-chipscanner 2.0軟件分析。
檢測結(jié)果分析與判定掃描得到的圖像亞陣列中，第一列陰性對照的信號強度代表 實驗的本底值大??；第二 、三列出現(xiàn)綠色熒光亮點的為陽性，表明所檢測樣品中有L C D V, 無綠色熒光亮點的為陰性，表明所檢測樣品中無LCDV。信號強弱與樣品中病毒濃度有關(guān)；第四列陽性對照及質(zhì)量控制點出現(xiàn)綠色熒光為正常，如果沒有綠色熒光，說明檢測 操作有問題或者抗體蛋白發(fā)生變性，則檢測結(jié)果為無效。 (4)病毒的定量檢測及最低檢測限
分離純化后LCDV稀釋至25.6嗎/mL，再按二倍比稀釋所得的8個抗原濃度分別與 載玻片上的8個亞陣列孵育，經(jīng)抗體探針檢測，掃描分析后結(jié)果如圖3所示，隨抗原濃 度變化，熒光信號呈現(xiàn)梯度的變化。以抗原濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光信號強度為縱 坐標(biāo)分析信號強度變化，結(jié)果顯示抗原濃度在0.8 12.8嗎/mL范圍內(nèi)，相對信號強度和 抗原濃度之間有較好的線性關(guān)系，提示所構(gòu)建的抗體微陣列在一定的病毒濃度范圍內(nèi)可 以進行定量分析。此抗體微陣列所能檢測到的最低抗原濃度為1.6嗎/mL。
所述芯片載體具有經(jīng)過親和硅垸處理后，并用瓊脂糖凝膠修飾的玻璃表面，該表面 為三維多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)Nal04活化后，可以使抗體以物理吸附和共價連接兩種方式固定在 其上，同時，其親水環(huán)境還有利于保持固定在上面的抗體蛋白的活性。所述的抗體是兔 抗LCDV抗體、兔抗鼠Ig的抗體，但不僅僅限于這兩種抗體。
所用于點樣的親和層析純化后兔抗LCDV抗體最適濃度為0.5mg/mL。
所述的待檢樣品加到芯片上后，37'C飽和濕度放置30min，玻片上加稀釋的抗體探 針后，37'C飽和濕度下放置30min。
所述芯片單張玻片點有8個亞陣列，可以根據(jù)實際需要增加亞陣列數(shù)量，能夠?qū)崿F(xiàn) 更多樣品的同時檢測。
本發(fā)明的優(yōu)點在于可以同時檢測多個樣品或同一個體的多個不同組織中的LCDV， 它結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，通量易于擴充，實現(xiàn)多樣品的同時平行檢測，增加了不同標(biāo)本 數(shù)據(jù)之間的可比性，可快速、準(zhǔn)確、簡便地檢測多種養(yǎng)殖魚類體內(nèi)的LCDV。對樣品要 求簡單，少量樣品即可滿足檢測需要，并大大簡化了現(xiàn)有檢測技術(shù)的樣品處理步驟，甚 至可以在不殺死養(yǎng)殖動物的情況下取材檢測。同時由于陽性控制及陰性控制的設(shè)置及捕 獲抗體的重復(fù)點樣，增加了檢測結(jié)果的可靠性。另外免疫芯片反應(yīng)相對較快，操作過程 便捷， 一般人員即可操作，并且能夠相對定量檢測病原，適用于養(yǎng)殖過程中病毒病的快 速、準(zhǔn)確的檢測。
另外本發(fā)明還為養(yǎng)殖魚類病毒、細菌等各類病原的檢測診斷提供了技術(shù)平臺，適用 于養(yǎng)殖過程中的疾病監(jiān)控及水產(chǎn)動物的出入境檢驗檢疫等，有著廣闊的應(yīng)用前景，能夠 有效避免養(yǎng)殖魚類疾病的傳播與流行。


圖l.魚類淋巴囊腫病毒免疫芯片結(jié)構(gòu)示意圖及點樣分布圖。其中，l-芯片載體，2-瓊脂糖凝膠層，3-抗體微陣列，4-芯片專用圍欄或Super PAPPen劃線，5-標(biāo)簽區(qū)域。點
樣分布①含50y。甘油的PBS，作為陰性對照；②、③為兔抗LCDV抗體；④兔抗鼠Ig
的抗體，作為陽性對照及固定對照等質(zhì)量控制。
圖2.魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片檢測不同來源魚類樣品中LCDV的CCD掃描 圖(掃描儀的熒光強度設(shè)定為88%)。 Al、 A2表明樣品中未檢出LCDV; A3、 B3表明 樣品中LCDV濃度較高；B2、 B4表明樣品中含一定量的LCDV，但濃度較A3、 B3低； A4、 Bl表明樣品中LCDV含量較低。
圖3.抗原濃度與信號強度的關(guān)系及此免疫芯片的檢測限。所檢測的抗原濃度依次 為25.6、 12.8、 6.4、 3.2、 1.6、 0.8、 0.4、 0.2|ag/mL。以抗原濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以 熒光信號強度為縱坐標(biāo)分析信號強度變化，結(jié)果顯示抗原濃度在0.8 12.8ng/mL范圍內(nèi)， 相對熒光信號強度和抗原濃度之間有較好的線性關(guān)系。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖并通過具體實施例來詳細說明本發(fā)明。
本發(fā)明所用儀器及試劑如下
小型手動芯片點樣系統(tǒng)(購自Whatman公司)；晶芯 EcoScanTM -100 CCD掃描儀 (購自北京博奧生物公司)；Cy3抗體標(biāo)記試劑盒(購自GE公司)；HiTrap Protein G Sepharose Column(購自GE公司);1640 (購自GIBCO公司)；胎牛血清(購自HYCLONE 公司)；牛血清白蛋白(購自SIGMA公司)；Tween-20 (購自SIGMA公司)；二甲基亞 砜(購自SIGMA公司)。
實施例l:
1. 抗體的制備及純化
從患淋巴囊腫病毒病的牙鲆體表瘤狀物中提取LCDV，常規(guī)方法免疫純種新西蘭白 兔，采血制備血清，得到兔抗LCDV抗體。
復(fù)蘇并培養(yǎng)小鼠雜交瘤細胞株單抗B和單抗C，注射一定數(shù)量的雜交瘤細胞入小鼠 腹腔生產(chǎn)腹水，得到大量高濃度、高特異性、高效價的鼠抗LCDV單抗。
取親和層析純化后的單抗B和單抗C混合，常規(guī)方法免疫純種新西蘭白兔，采血制 備血清，得到兔抗鼠Ig的抗體。
使用Amersham Phamacia Biotech公司的親禾口層析柱(HiTrap Protein G Sepharose Column)純化所得抗體。
2. Cy3標(biāo)記的單克隆抗體探針的制備按照Amersham Phamacia Biotech公司的Cy3產(chǎn)品說明書，使用熒光素Cy3對親和 層析純化后的鼠抗LCDV單抗進行標(biāo)記，并過凝膠柱純化。
3. 載玻片的預(yù)處理
將玻片分別用強堿和濃硫酸浸洗，雙蒸水沖洗，晾干；將清洗后的玻片浸入0.4% 的親和硅烷的乙酸溶液中，調(diào)pH至4.5，室溫作用lh，雙蒸水沖洗，晾干。
4. 瓊脂糖凝膠基片的制備
配制1.2%的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3min完全溶解，將2mL瓊脂糖溶液鋪覆在 60'C預(yù)熱的親和硅烷處理過的清潔玻片上；瓊脂糖凝固后，載玻片在37。C下過夜干燥； 使用前用0.02mol/LNal04溶液室溫下活化30min,超純水徹底沖洗3遍，并用氮氣流吹 干，室溫干燥處保存。
5. 芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計及點陣分布
該芯片結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括芯片載體U)、鋪覆于芯片載體上的瓊脂糖凝膠層(2)， 瓊脂糖凝膠層上固定有兩排四列共8個4X4的抗體微陣列(3)，點樣量為50-70nL，點 直徑為500~600|am。各個微陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen劃線(4)隔開。 所述的芯片載體為標(biāo)準(zhǔn)載玻片，在玻片一端可以留出標(biāo)簽區(qū)域(5)。
6. 抗體的固定
① 用pH 7.4的含50%甘油的PBS緩沖液稀釋兔抗LCDV抗體，使其濃度為0.5、 0.1、 0.05、 0.01、 0.005、 0.001、 0.0005、 0.0001mg/mL。
② 用點樣儀將此不同濃度抗體稀釋液在修飾過的載玻片表面的不同區(qū)域點樣，每張 芯片兩排四列共8個4X4亞陣列，每個亞陣列為不同濃度的兔抗LCDV抗體，各個亞 陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開，形成獨立的反應(yīng)單元。37。C飽和濕度 放置2h，洗滌，晾干。
③ 在載玻片上點有抗體的區(qū)域滴加3%牛血清白蛋白進行封閉，37。C飽和濕度放置 lh，洗滌，晾干，4'C密封保存，得到魚類LCDV免疫檢測芯片。
實施例2:
步驟1、 2、 3、 4、 5同實施例1。 6.抗體的固定
① 用pH 7.4的含50%甘油的PBS緩沖液稀釋兔抗LCDV抗體，使其濃度為 0.5mg/mL;稀釋兔抗鼠Ig的抗體使其濃度為0.1mg/mL。
② 用點樣儀將此抗體稀釋液在修飾過的載玻片表面的不同區(qū)域點樣，點陣分布如圖 l所示，每張芯片兩排四列共8個4X4亞陣列，每個亞陣列所點樣品一致，其中，第一列所點樣品為磷酸鹽甘油緩沖液，作為陰性對照；第二、三列所點樣品為兔抗LCDV抗 體；第四列所點樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽性對照及固定對照等質(zhì)量控制點。各個亞 陣列之間用芯片專用圍欄Super PAP Pen隔開，形成獨立的反應(yīng)單元。37'C飽和濕度放 置2h，洗滌，晾干。
③在載玻片上點有抗體的區(qū)域滴加3%牛血清白蛋白進行封閉，37'C飽和濕度放置 lh,洗滌，晾千，4。C密封保存，得到魚類LCDV免疫檢測芯片。
實施例3:
檢測魚類淋巴囊腫病毒采用的是夾心法。 步驟1、 2、 3、 4、 5、 6同實施例2。 7.病原的檢測
① 取待檢魚類組織(表皮、鰓、胃或腸等)，與A液約按1: 10 (W/V)的比例混 合，勻漿，反復(fù)凍融3 4次，超聲破碎后，低溫離心，5000rpmX15min，取上清液作為 檢測樣品，待檢；
② 將待檢樣品加入上述芯片同一載體不同亞陣列中，加樣量為10pL/陣列， 一張芯 片可同時檢測八個樣品，注意避免不同亞陣列間的液體混合。37'C飽和濕度孵育15min、 30min、 45min、 60min、 90min、 120min，洗滌，在芯片上加稀釋的C液，10pL/陣列， 37。C飽和濕度放置孵育15min、 30min、 45min、 60min、 90min、 120min，洗滌，晾干；
③激光掃描
上述檢測芯片用晶芯@￡0030&111^ -100 CCD掃描儀掃描成像，激發(fā)波長為532nm， 檢測波長為585nm，熒光信號用Lab-chipscanner 2.0軟件分析。
檢測結(jié)果分析與判定掃描得到的圖像亞陣列中，第一列陰性對照的信號強度代表 實驗的本底值大??；第二、三列出現(xiàn)綠色熒光亮點的為陽性，表明所檢測樣品中有LCDV, 無綠色熒光亮點的為陰性，表明所檢測樣品中無LCDV。信號強弱與樣品中病毒濃度有 關(guān)；第四列陽性對照及固定點出現(xiàn)綠色熒光為正常，如果沒有綠色熒光，說明檢測操作 有問題或者抗體蛋白發(fā)生變性，檢測結(jié)果無效。
實施例4:
抗原的定量分析及最低檢測限
取制備好的魚類LCDV免疫檢測芯片，將分離純化的LCDV稀釋至25.6)ag/mL，再 按二倍比稀釋所得的8個抗原濃度分別與玻片上的抗體微陣列孵育，經(jīng)抗體探針檢測后， 掃描結(jié)果利用計算機軟件處理。結(jié)果顯示，隨抗原濃度變化，熒光信號呈現(xiàn)梯度的變化。以抗原濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以熒光信號強度為縱坐標(biāo)分析信號強度變化，結(jié)果顯示 抗原濃度在0.8 12.8g/mL范圍內(nèi)，相對信號強度和抗原濃度之間有較好的線性關(guān)系，提 示所構(gòu)建的抗體微陣列在一定的病毒濃度范圍內(nèi)可以進行定量分析。此抗體微陣列所能 檢測到的最低抗原濃度為1.6jig/mL。
實施例5:
魚類LCDV免疫檢測芯片的特異性檢測-
取正常魚組織(鰓、胃、表皮等)，經(jīng)PCR檢測未感染LCDV，組織破碎后勻漿， 反復(fù)凍融后超聲破碎，低溫沉降10min，取上清，與魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片上 的抗體微陣列孵育，經(jīng)抗體探針檢測后掃描，無熒光信號，證實所制備的魚類淋巴囊腫 病毒免疫檢測芯片與組織無交叉反應(yīng)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修 改、添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1、一種魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片，其特征在于它包括芯片載體、鋪覆于芯片載體上的瓊脂糖凝膠層，瓊脂糖凝膠層上固定有多個抗體微陣列，各個微陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen劃線隔開。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片，其特征在于所述的芯片載體 為標(biāo)準(zhǔn)載玻片，所述芯片載體具有經(jīng)過親和硅烷處理后，并用瓊脂糖凝膠修飾的玻璃表面，該 表面為三維多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)Nal04活化后，可以使抗體以物理吸附和共價連接兩種方式固定在其 上。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片，其特征在于所述的抗體 是兔抗淋巴囊腫病毒抗體、兔抗鼠Ig的抗體。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片的制備方法，其特征是它包括如 下步驟(1) 抗體的制備制備兔抗淋巴囊腫病毒抗體，兔抗鼠Ig的抗體，鼠抗淋巴囊腫病毒單克隆抗體(單抗)， 親和層析法純化所得抗體；(2) Cy3標(biāo)記單克隆抗體探針的制備將親和層析純化后的鼠抗淋巴囊腫病毒單抗用Cy3標(biāo)記，并過凝膠柱純化；(3) 載玻片的預(yù)處理將載玻片分別用強堿和濃硫酸浸洗，雙蒸水沖洗，晾干；將清洗后的載玻片浸入0.4%的親 和硅垸的乙酸溶液中，調(diào)pH至4.5,室溫下作用lh，雙蒸水沖洗，晾干；(4) 瓊脂糖凝膠基片的制備配制1.2%的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3min，使其完全溶解，將2ml瓊脂糖溶液鋪覆在經(jīng) 60'C預(yù)熱的親和硅烷處理過的清潔載玻片上；待瓊脂糖凝固后，將玻片在37。C下過夜干燥；使 用前在室溫下用0.02mol/LNaKV溶液活化30min,超純水沖洗3遍，用氮氣流吹干，室溫干燥 處保存；(5) 抗體的固定① 用pH 7.4的含50%甘油的PBS緩沖液稀釋兔抗淋巴囊腫病毒抗體，使其濃度為 0.5~0.0001mg/mL、稀釋兔抗鼠Ig的抗體，使其濃度為0.1mg/mL:② 用點樣儀將此抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片的不同區(qū)域點樣，點樣量為50~70nL，點直 徑為500 600Mm。每張芯片兩排四列共8個4X4亞陣列，每個亞陣列所點樣品一致，第一列所點樣品為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對照，第二、三列所點樣品為兔抗淋巴囊腫病毒抗體，第 四列為質(zhì)量控制點，所點樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽性對照及固定對照。各個亞陣列之間用 芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開，形成獨立的反應(yīng)單元。37。C飽和濕度放置2h，洗滌，晾 干；③向載玻片上點有抗體的區(qū)域滴加3%牛血清白蛋白進行封閉，37'C飽和濕度放置lh，洗 滌，晾干，4'C密封保存，得到魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片的制備方法，其特征在于用Cy3 標(biāo)記親和層析純化后的鼠抗淋巴囊腫病毒單抗作為抗體探針，并使用兔抗鼠Ig的抗體作為陽性 對照及固定對照。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片的制備方法，其特征在于Cy3 標(biāo)記抗體探針?biāo)脝慰故怯蓛芍觌s交瘤細胞分別分泌的特異性抗淋巴囊腫病毒囊膜單抗B和單 抗C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片在養(yǎng)殖魚類淋巴囊腫病毒檢測中 的應(yīng)用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片的應(yīng)用，其特征在于它包括如下 步驟(1) 用來檢測的組織包括魚類體表瘤狀物、表皮、胃、腸等，取樣后與A液約按1: 10(W/V)的比例混合，勻漿，反復(fù)凍融34次，超聲破碎后，低溫離心，5000ipmX15min，取 上清作為檢測樣品，待檢；(2) 將不同待檢樣品加到上述芯片不同亞陣列中，37"飽和濕度放置0.25~211，洗滌，再加 稀釋的Cy3標(biāo)記的鼠抗淋巴囊腫病毒的單抗探針，37'C飽和濕度放置0.25 2h，洗滌，晾干；(3) 激光掃描上述玻片用晶芯&coScan1^-100 CCD掃描儀掃描成像，圖像用專業(yè)分析軟件分析，根據(jù) 熒光信號的強弱，得到樣品中魚類淋巴囊腫病毒含量的定性定量分析結(jié)果。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片的應(yīng)用，其特征在于使用夾心法 檢測魚體內(nèi)淋巴囊腫病毒，即所述抗體芯片與樣品中的淋巴囊腫病毒反應(yīng)形成的復(fù)合體，被高 特異性的Cy3標(biāo)記的抗體探針?biāo)R別，在532nm的激光下呈現(xiàn)綠色熒光。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片的應(yīng)用，其特征在于待檢樣品 加到芯片上后，37'C飽和濕度放置30min，玻片上加稀釋的熒光抗體后，37'C飽和濕度放置 30min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魚類淋巴囊腫病毒免疫檢測芯片，其結(jié)構(gòu)包括芯片載體、鋪覆于芯片載體上的瓊脂糖凝膠層、瓊脂糖凝膠層上固定有多個抗體微陣列，各個微陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen劃線隔開。本發(fā)明采用夾心法檢測抗原，在芯片片基上固定病原的抗體，取待檢個體病毒靶器官制備待檢樣品液，直接將待測樣品液與固定有病原抗體的芯片孵育，再加熒光標(biāo)記的特異性單抗探針，通過CCD掃描儀讀取結(jié)果。其優(yōu)點在于能同時檢測多種樣品或同一樣品不同組織中淋巴囊腫病毒，用于海水養(yǎng)殖魚類中LCDV的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測，以及進出口魚類中LCDV的檢疫。
文檔編號G01N33/569GK101629955SQ20091001783
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者徐曉麗, 戰(zhàn)文斌, 繩秀珍 申請人:中國海洋大學(xué)