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一種快速檢測海洋微藻脂肪酸含量的方法

文檔序號:6146545閱讀:755來源:國知局
專利名稱:一種快速檢測海洋微藻脂肪酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于海洋微生物領(lǐng)域,具體地說,其是對海洋微藻脂肪酸利用飽和 KOH-CH3OH快速檢測海洋微藻脂肪酸含量的方法。
背景技術(shù)
海洋微藻含有豐富的脂肪酸、多不飽和脂肪酸(PUFAs)、蛋白質(zhì)、各種維生素、生 物多糖等,具有優(yōu)異的營養(yǎng)保健功能。開發(fā)和利用微藻資源已成為當(dāng)今世界生命科學(xué) 與技術(shù)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一。
研究證實(shí),多不飽和脂肪酸對于生物體具有重要轉(zhuǎn)化成具調(diào)節(jié)某些生理功能的代 謝產(chǎn)物等。y—亞麻酸(y-linolenicacid)、 AA、 二十碳五烯酸[20:5 (n - 3),EPA] 和二十二碳六烯酸[22:6 (n- 3), DHA]是比較重要的PUFAs,其中EPA和DHA作為人體 必須脂肪酸,在營養(yǎng)強(qiáng)化、預(yù)防和治療多種疾病如預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病, 降低血漿中膽固醇和甘油三酯水平、減輕炎癥等有明顯療效。此外,已有關(guān)于EPA作 為抗癌劑的報(bào)道。
海洋微藻是海洋生態(tài)體系中重要的初級生產(chǎn)者,某些海洋微藻不僅含有較高的脂肪 酸和多不飽和脂肪酸,而且其組成比較單一,利于分離純化。海洋微藻具有資源豐富、 生長快等優(yōu)點(diǎn),在保健品和生物能源方面具有較大開發(fā)和利用的潛力,已經(jīng)成為國內(nèi)外 的研究熱點(diǎn)。
對海洋微藻脂肪酸的測定,目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)方法,大多數(shù)的方法是用有機(jī)溶劑提取 濃縮后得到微藻粗脂肪,粗脂肪加熱皂化兩個(gè)小時(shí)后用有機(jī)溶劑提取濃縮,再經(jīng)過一 個(gè)小時(shí)甲酯化,用有機(jī)溶劑提取,利用GC來測定脂肪酸的含量。
蔣霞敏等采用Bligh-Dyer法提取微藻中總脂。提取總脂加KOH甲醇溶液皂化2h。皂化液轉(zhuǎn)移到離心管中,用鹽酸調(diào),加飽和氯化鈉溶液,用氯仿正己烷提取兩次。合并 提取液,濃縮,濃縮液再甲酯化lh,最后用正己垸提取,上氣相色譜儀進(jìn)行分析。該方 法操作復(fù)雜,處理時(shí)間長,步驟繁瑣。
Chiara Bigogno的方法是在藻粉加入H2S04/甲醇溶液,將樣品瓶放入80 。C砂浴
(磁力加熱板)中加熱攪拌抽提lh 。再用正己烷萃取,離心15min。取出上層正己
垸層氮?dú)庀麓蹈桑偌尤?00 nL正己垸備測。與其它方法比較,該方法操作步驟雖
然已經(jīng)簡化,但還是比較繁瑣,操作時(shí)間較長,所以不適合在實(shí)驗(yàn)室快速檢測。
針對微藻脂肪酸,如何建立快速,簡便、準(zhǔn)確的檢測方法,是今后一段時(shí)期功能
食品研究開發(fā)的熱點(diǎn)。本文即針對這一問題,開展微藻脂肪酸快速測定方法研究,并
利用該方法探討從微藻中提取脂肪酸的最近試驗(yàn)條件,為其應(yīng)用提供前期基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測海洋微藻脂肪酸含量的方法,該方法利用飽和 K0H-CH30H對微藻中脂類提取并造化,使提取過程和造化過程合二為一,再用HC1-CH30H 進(jìn)行甲酯化,獲得脂肪酸,該組分經(jīng)過提取、皂化和甲酯化后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析, 本方法與傳統(tǒng)常用的微藻脂肪酸提取制備方法比較,具有操作步驟簡單、節(jié)省時(shí)間、 有機(jī)試劑用量少、減少了有機(jī)溶劑的使用量,節(jié)約了人力物力,大大提高了工作效率。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的,研制了一種快速檢測海洋微藻脂肪酸含
量的方法。該方法利用飽和KOH-CH30H對微藻中脂類提取并造化,使提取過程和造化
過程合二為一,再用HC1-CH30H進(jìn)行甲酯化,獲得脂肪酸,該組分經(jīng)過提取、皂化和
甲酯化后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析,具體步驟如下
(1) 樣品準(zhǔn)備
稱取8-10mg的藻粉樣品;配制飽和K0H—CH30H溶液和l moL / L的HC1"CH30H溶液(使 PH< 2);取15.00 mg十九碳酸于10 niL容量瓶中,用正己垸稀釋至刻度配制成內(nèi)標(biāo)溶液; 將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用正己垸稀釋至100倍成標(biāo)準(zhǔn)溶液;
(2) 脂肪酸的提取、皂化和甲酯化該方法利用飽和K0H-CH30H對微藻中脂類提取并造化,使提取過程和造化過程合 二為一,再用HC1-CH30H進(jìn)行甲酯化,獲得脂肪酸,該組分經(jīng)過提取、皂化和甲酯化 后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析,具體步驟如下
1、 脂肪酸提取條件的確定
脂肪酸測定方法稱取10mg左右的藻粉樣品,置于螺口試管中,加50化濃度為lmg/mL 的十九碳酸內(nèi)標(biāo)和lmL的飽和K0tMH30H溶液,充氨氣保護(hù),于75"C水浴皂化10 min,冷 卻后加2 mL的l moL/L的HCl—CH30H溶液(使pH〈 2).混勻.75。C水浴10 min。冷卻.加 0.5 mL正己烷和2 mL蒸餾水,充分振蕩,靜置,取正己烷層,用氣相色譜質(zhì)譜儀分析。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
內(nèi)標(biāo)溶液準(zhǔn)確稱取15.00 mg十九碳酸于10 mL容量瓶中,用正己烷稀釋至刻度。 標(biāo)準(zhǔn)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用正己烷稀釋至100倍。
2、 樣品的測定和計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定取標(biāo)準(zhǔn)溶液l叱注入氣相色譜儀,得到標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖,經(jīng)計(jì)算 得到各脂肪酸的校正因子。
樣品的測定取l化待測樣品注入氣相色譜儀進(jìn)行測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖進(jìn)行
定性,根據(jù)校正因子進(jìn)行定量。
游離脂肪酸含量的計(jì)算根據(jù)被測物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量及在色譜圖上相應(yīng)的峰面積比, 由校正因子按下式求游離脂肪酸的含量
Xi= WsxFsi xAi / (AsxWi)。
其中,Xi為微藻脂肪酸i的含量;Ws為樣品中加入內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量;As為內(nèi)標(biāo)物的峰面 積;Ai為脂肪酸i的峰面積,F(xiàn)si為相對校正因子,計(jì)算公式如下 Fsi=WixAs/ (WsxAi)。
3、 色譜條件
5將藻粉樣品置于螺口試管中一加50叱濃度為lmg/mL的十九碳酸內(nèi)標(biāo)和lmL的飽 和KOH—CH3OH溶液一充氨氣保護(hù)一于75'C水浴皂化10 min—冷卻后加2 mL的1 moL / L的HC]-CH30H溶液(使PH< 2)混勻一75。C水浴10 min—冷卻一加0. 5 mL正己垸和 2 mL蒸餾水一振蕩一靜置一取正己垸層用氣相色譜質(zhì)譜儀分析; (3)脂肪酸的氣相色譜檢測條件
a、 色譜柱HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmidX0.25um);
b、 載氣氦氣,流速為lmL/min,進(jìn)樣口溫度25(TC,傳輸線溫度為30(TC;
c、 電子能量70 eV,離子源溫度230 °C,四極桿溫度150 TT ;
d、 升溫程序?yàn)槌鯗?0。C , 1(TC/min升到280°C;
e、 進(jìn)樣量lpL,分流進(jìn)樣(10: 1),掃描方式為全掃描(Scan)方式; 各脂肪酸組分含量由對應(yīng)的峰面積和內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值求得。
本發(fā)明快速檢測海洋微藻脂肪酸含量的方法優(yōu)點(diǎn)是本方法的與傳統(tǒng)常用的微藻
脂肪酸提取制備方法比較,具有操作步驟簡單(兩步即可完成,傳統(tǒng)方法需要至少需
要五步)、節(jié)省時(shí)間(整個(gè)操作過程只需30min,傳統(tǒng)方法需要3-4h),有機(jī)試劑用量
少(每一個(gè)樣品只需2ml即可)等優(yōu)點(diǎn),減少了有機(jī)溶劑的使用量,節(jié)約了人力物力,
這樣大大提高了工作效率。傳統(tǒng)的脂肪酸計(jì)算方法是采用面積歸一化法計(jì)算相對百分
含量,計(jì)算的數(shù)據(jù)是一個(gè)相對值,數(shù)據(jù)之間可比性比較差,本發(fā)明的方法采用內(nèi)標(biāo)法
進(jìn)行定量分析,方法簡單快捷,數(shù)據(jù)直觀,增加了樣品之間的可比性。為微藻的開發(fā)
利用提供了科學(xué)可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。


圖1為脂肪酸氣相色譜分離圖; 具體實(shí)施例
本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例中,參見圖1本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如
下色譜柱HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30mX0. 25mm idX0.25um);載氣氦氣,流 速為lmL/min,進(jìn)樣口溫度250°C,傳輸線溫度為300°C。電子能量70 eV,離子源溫 度230 °C,四極桿溫度150 。C 。升溫程序?yàn)槌鯗?(TC , 10°C/min升到280°C。 進(jìn)樣量lpL,分流進(jìn)樣(10: 1),掃描方式為全掃描(Scan)方式。
4、 脂肪酸的鑒定
參照標(biāo)準(zhǔn)樣品和譜庫NIST 5.0進(jìn)行,用歸一化法計(jì)算出脂肪酸組分的百分含量, 以占脂肪酸總量的百分比表示。
5、 實(shí)際樣品的驗(yàn)證
按照對微藻中脂肪酸進(jìn)行提取,根據(jù)色譜條件進(jìn)行分析,最后按照樣品的測定和計(jì) 算進(jìn)行結(jié)果分析。
6、 微藻中脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜分析
在實(shí)驗(yàn)部分給出的色譜條件下, 一種微藻脂肪酸的色譜圖示于圖1,可以看出,個(gè) 脂肪酸峰型對稱、沒有脫尾現(xiàn)象,分離的效果很好。
7、 微藻中脂肪酸的含量
精密度實(shí)驗(yàn)取微藻樣品1份,按供試液制備方法制備供試液,采用色譜條件, 連續(xù)進(jìn)樣5次,結(jié)果相對峰面積大于1 %的8個(gè)色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積 RSD分別在O 0.19 %和0.38 % 3. 75 %的范圍內(nèi),說明該方法精密度良好。
重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一批號微藻樣品5份,按供試液制備方法制備供試液,分別測 定指紋圖譜。結(jié)果18個(gè)色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD分別為0 0.38 %和 0.57 % 5.6 %。表明該方法的重現(xiàn)性良好,符合測定的要求。
8、 提取液樣品的穩(wěn)定性考察
取微藻樣品l份,按供試液制備方法制備供試液,分別在O、 1、 3、 4、 8、 16、 24和48 h測定指紋圖譜。結(jié)果表明48 h前,18個(gè)色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于1 %,表明樣品在48 h內(nèi)測定是穩(wěn)定的。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解,在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi),對于上述實(shí)施例進(jìn)行修 改,添加和替換都是可能的,其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種快速檢測海洋微藻脂肪酸含量的方法,其特征在于利用飽和KOH-CH3OH對微藻中脂類提取并造化,使提取過程和造化過程合二為一,再用HCl-CH3OH進(jìn)行甲酯化,獲得脂肪酸,該組分經(jīng)過提取、皂化和甲酯化后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析,具體步驟如下(1)樣品準(zhǔn)備稱取8-10mg的藻粉樣品;配制飽和KOH—CH3OH溶液和1moL/L的HCl—CH3OH溶液(使pH<2);取15.00mg十九碳酸于10mL容量瓶中,用正己烷稀釋至刻度配制成內(nèi)標(biāo)溶液;將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用正己烷稀釋至100倍成標(biāo)準(zhǔn)溶液;(2)脂肪酸的提取、皂化和甲酯化將藻粉樣品置于螺口試管中→加50μL濃度為1mg/mL的十九碳酸內(nèi)標(biāo)和1mL的飽和KOH—CH3OH溶液→充氨氣保護(hù)→于75℃水浴皂化10min→冷卻后加2mL的1moL/L的HCl—CH3OH溶液(使pH<2)混勻→75℃水浴10min→冷卻→加0.5mL正己烷和2mL蒸餾水→振蕩→靜置→取正己烷層用氣相色譜質(zhì)譜儀分析;(3)脂肪酸的氣相色譜檢測條件a、色譜柱HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm id×0.25um);b、載氣氦氣,流速為1mL/min,進(jìn)樣口溫度250℃,傳輸線溫度為300℃;c、電子能量70eV,離子源溫度230℃,四極桿溫度150℃’;d、升溫程序?yàn)槌鯗?0℃,10℃/min升到280℃;e、進(jìn)樣量1μL,分流進(jìn)樣(10∶1),掃描方式為全掃描(Scan)方式;各脂肪酸組分含量由對應(yīng)的峰面積和內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值求得。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速檢測海洋微藻脂肪酸含量的方法,該方法是利用飽和KOH-CH3OH對微藻中脂類提取并造化,使提取過程和造化過程合二為一,再用HCl-CH<sub>3</sub>OH進(jìn)行甲酯化,獲得脂肪酸,該組分經(jīng)過提取、皂化和甲酯化后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析,具體步驟如下(1)樣品準(zhǔn)備,(2)脂肪酸的提取、皂化和甲酯化,(3)脂肪酸的氣相色譜檢測條件。該方法具有操作步驟簡單,節(jié)省時(shí)間,方法簡單快捷,數(shù)據(jù)直觀,增加了樣品之間的可比性。
文檔編號G01N30/02GK101532991SQ20091001987
公開日2009年9月16日 申請日期2009年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月21日
發(fā)明者濤 劉, 楊佰娟, 立 鄭, 韓笑天 申請人:國家海洋局第一海洋研究所
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