專利名稱：一種同時檢測食品中15種同化激素殘留的液相色譜法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種同時檢測動物源食品中同化激素藥物殘留的高效液相 色譜法。
背景技術(shù)：
激素是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類調(diào)節(jié)機(jī)體代謝生理功能的微量物質(zhì)，獸藥用
同化激素主要包括甾類同化激素，非甾類雌性激素以及P2-受體激動劑。 三者均有強(qiáng)的蛋白質(zhì)同化作用，可提高蛋白質(zhì)沉積，降低脂肪比率，從而提 高飼料轉(zhuǎn)化率。然而，長期攝入此類激素類藥物會導(dǎo)致消費(fèi)者內(nèi)分泌紊亂和
性早熟，增加致癌、致畸的風(fēng)險(xiǎn)。早在1988年1月1日歐盟就發(fā)出了禁止使用 促生長同化激素,我國農(nóng)業(yè)部也于1988年6月30日發(fā)布的《獸藥管理?xiàng)l例實(shí)施 細(xì)則》中規(guī)定"不得添加激素類藥品"。但近年來,先后發(fā)生過我國出口的雞 肉含有己烯雌酚、鰻魚等含有避孕藥事件， 一度造成外貿(mào)活動中斷；同時由 于全球飼料價(jià)格的上漲，有些養(yǎng)殖戶受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動，非法使用這類禁藥 有可能進(jìn)一步嚴(yán)重化。
國內(nèi)外對同化激素多殘留檢測的測定方法主要有GC、 HPLC、 GC-MS、 LC-MS-MS。檢測樣品主要是血漿、尿液和水。同時檢測藥物種類少，還沒 有甾類同化激素和32-受體激動劑同時檢測方法的研究。對于復(fù)雜生物樣品， 多種激素藥物殘留檢測技術(shù)還處于探索研究階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種簡便快速、靈敏 可靠，且成本低的檢測動物源食品中同化激素藥物殘留的液相色譜法。
按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種同時檢測動物源食品中15種同化激素
藥物殘留的液相色譜法包含如下步驟
取樣動物肌肉組織剔除脂肪及其他結(jié)締組織，剁碎，研磨均勻，稱取 樣品；
提取稱取的樣品用甲醇超聲提取同化激素；動物肌肉組織質(zhì)量與甲醇
分析純A.R，質(zhì)量體積比g/mL為1:2 1:9，提取2~4次，每次超聲提取時間 為0.25 lh，得到同化激素提取液；將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35 60。C水浴 蒸干，用體積分?jǐn)?shù)20%~60%甲醇水溶液溶解殘?jiān)?；凈化提取液上C18固相萃取柱進(jìn)行固相萃?。幌扔眉状?、水活化C18
固相萃取小柱；再將樣品提取液以1~4 mL/min的速度過該固相萃取柱；然 后用體積分?jǐn)?shù)25% 50%甲醇水溶液淋洗小柱；最后用體積分?jǐn)?shù)60%~95%甲 醇水溶液洗脫，收集洗脫液；洗脫液用氮?dú)獯蹈?，用體積分?jǐn)?shù)20%~50%甲醇 水溶液定容至lmL，過0.45pm濾膜后供HPLC分析；
上機(jī)測定濾液用反相高效液相色譜測定，并用外標(biāo)法-峰面積定量，色
譜柱為C18柱，色譜柱柱溫為20~40°C;紫外檢測波長為240nm;流動相 A相為乙腈，B相為0.003 0.007mol/L庚烷磺酸鈉水溶液；二元梯度洗脫 Omin， A， B兩相體積比為40: 60; 5min， A相由40%線性升至47%; 15min， A相由47%線性升至50%; 25min， A相由50%線性升至65%; 30min， A相 由65%線性升至75%，保持12min，進(jìn)樣體積為5ul。
所述同化激素為動物源食品中雌三醇、雌二醇、雌酮、炔雌醇、睪酮、 甲基睪酮、丙酸睪酮、群勃龍、諾龍、孕酮、醋酸甲羥孕酮、已烷雌酚、己 烯雌酚、萊克多巴胺和克倫特羅。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所檢測樣品為復(fù)雜生物樣品牛肉，雞肉，豬肉， 同時檢測甾類同化激素和P 2 -受體激動劑的15種代表性獸用激素藥物。所用 的試劑或藥品純度均為分析純A.R或色譜純。所建立的方法在約1小時時間
可完成一次檢測，簡便快速、靈敏可靠且成本低，比已有的GC或HPLC方 法同時分析的獸用激素藥物種類多，操作較簡便；比已有的GC/MS及LC/MS 或LC/MS/MS方法成本低，溶劑毒性低，儀器較普及，利于推廣應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明十五種動物源同化激素標(biāo)準(zhǔn)品同時檢測的HPLC譜圖(標(biāo)準(zhǔn) 品色譜分離圖)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1:本發(fā)明一種同時檢測動物源食品中15種同化激素藥物殘留的 液相色譜法，采用以下步驟
取樣將剔除脂肪及其他結(jié)締組織后的牛肉切碎并用食品粉碎機(jī)絞成勻 漿狀；
提取研磨均勻后的牛肉用甲醇超聲提取同化激素；牛肉質(zhì)量與甲醇分 析純A.R質(zhì)量體積比(m/v, g/mL)比為1 : 6，提取2次，每次提取時間為 0.5h,得到同化激素提取液；將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在4(TC水浴蒸干，用一定量20%&/力甲醇水溶液溶解殘?jiān)?br> 凈化ds固相萃取柱用3mL甲醇，5mL水活化后將樣品提取液以2mL/ min的速度過d8柱，等樣液全部流出后，用3mL35y。(V/V)甲醇水溶液淋洗 小柱，棄去淋洗液；再用3mL60n/。(v/v)甲醇水溶液洗脫。收集洗脫液，洗脫 液用氮?dú)獯蹈桑?0n/。(v/v)甲醇水溶液定容至lmL，過0.45pm濾膜后HPLC 測定。
上機(jī)測定用反相高效色譜外標(biāo)法-峰面積定量測定。液相色譜條件為 色譜柱為(:18柱，柱溫35。C，紫外檢測波長240nm，流動相A相為乙腈； B相為0.004mol/L庚垸磺酸鈉水溶液，二元梯度洗脫Omin， A， B兩相體 積比為40: 60; 5min， A相由40%線性升至47%; 15min， A相由47。/。線性 升至50%; 25min， A相由50%線性升至65%; 30min， A相由65。/。線性升至 75%，保持12min。
實(shí)施例2:本發(fā)明一種同時檢測動物源食品中15種同化激素藥物殘留的 液相色譜法，采用以下步驟
取樣將剔除脂肪及其他結(jié)締組織后的雞脯肉切碎并用食品粉碎機(jī)絞成 勻漿狀；
提取研磨均勻后的雞脯肉用甲醇超聲提取同化激素；雞肉質(zhì)量與甲醇 分析純A.R質(zhì)量體積比(m/v，g/mL)比為1:3，提取3次，每次提取時間為 0.75h，得到同化激素提取液；將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在48'C水浴蒸干，用 一定量35c/。(v/v)甲醇水溶液溶解殘?jiān)?br> 凈化C18固相萃取柱用3 mL甲醇，3 mL水活化后將樣品溶解液以3mL /min的速度過ds柱，等樣液全部流出后，用3 mL50y。(v/v)甲醇水淋洗小柱， 棄去淋洗液；再用2mL80r。(v/v)甲醇水溶液洗脫。收集洗脫液，洗脫液用氮 氣吹干，用35。/。(v/v)甲醇水溶液定容至lmL，過0.45pm濾膜后HPLC測定。
上機(jī)測定用反相高效色譜外標(biāo)法-峰面積定量測定。液相色譜條件為 色譜柱為C,8柱，柱溫25'C，紫外檢測波長240nm，流動相A相為乙腈； B相為0.006mol/L庚垸磺酸鈉水溶液，二元梯度洗脫Omin， A， B兩相體 積比為40: 60; 5min， A相由40%線性升至47%; 15min， A相由47。/。線性 升至50%; 25min， A相由50%線性升至65%; 30min， A相由65。/。線性升至 75%,保持12min。
實(shí)施例3:本發(fā)明一種同時檢測動物源食品中15種同化激素藥物殘留的 液相色譜法，采用以下步驟取樣將剔除脂肪及其他結(jié)締組織后的豬腿肉切碎并用食品粉碎機(jī)絞成 勻漿狀；
提取研磨均勻后的豬腿肉用甲醇超聲提取同化激素；豬腿肉質(zhì)量與甲 醇分析純A.R質(zhì)量體積比(m/v，g/mL)為1 : 4，提取4次，每次提取時間為 0.25h，得到同化激素提取液；將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在55X:水浴蒸干，用 一定量50。/。(v/v)甲醇水溶液溶解殘?jiān)?br> 凈化ds固相萃取柱用3mL甲醇、5mL水活化后將樣品溶解液以2.5 mL /min的速度過ds柱，等樣液全部流出后，用3mL25。/。(v/v)甲醇水淋洗小柱， 棄去淋洗液；再用3mL95M(v/v)甲醇水溶液洗脫。收集洗脫液，洗脫液用氮 氣吹干，用50。/。(v/v)甲醇水溶液定容至lmL,過0.45pm濾膜后HPLC測定。
上機(jī)測定用反相高效色譜外標(biāo)法-峰面積定量測定。液相色譜條件為 色譜柱為Cw柱，柱溫40。C，紫外檢測波240nm，流動相A相為乙腈；B 相為0.005mol/L庚垸磺酸鈉水溶液，二元梯度洗脫Omin， A， B兩相體積 比為40: 60; 5min， A相由40%線性升至47%; 15min， A相由47。/。線性升 至50%; 25min, A相由50%線性升至65%; 30min， A相由65%線性升至 75%，保持12 min。
測定結(jié)果根據(jù)上述方法，得到十五種同化激素(雌三醇、雌二醇、雌 酮、炔雌醇、睪酮、甲基睪酮、丙酸睪酮、群勃龍、諾龍、孕酮、醋酸甲羥 孕酮、已烷雌酚、已烯雌酚、萊克多巴胺、克倫特羅)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的液相色譜圖， 見附圖l。 15種同化激素在0.5 8mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方法的檢出 限(S/N=3)為0.012 0.079 mg/Kg，定量限為0. 041 0. 265 mg/Kg。方法 的平均加標(biāo)回收率為66. 1 101.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD )為2. 1 12.4%。
如附圖1所示雌三醇(EST，99. 0Q/。)、雌二醇(ES，97. 5%)、雌酮(ESN， 99. 0%) 炔雌醇(EES，99. 5%)、睪酮(TS，99. 0%)、甲基睪酮(MTS， 98. 5%)、丙酸睪酮 (PTS， 99. 0%)、群勃龍(TRE， 97. 0%)、諾龍(NT， 99. 5%)、孕酮(PG， 99. 5%)、醋 酸甲羥孕酮(99.0%)、已烷雌酚(HES， 98. 5%)、克倫特羅(CLB， 99. 5%)、己烯雌 酚(DES， 99. 5%)以上14種來自德國Augsburg公司；萊克多巴胺(RAC， 95%)來 自Sigma公司。
對被測定的動物肉樣品，并不是都含有上述激素殘留。但只要含有上述 十五種同化激素殘留，且含量高于本方法的檢出限及符合本方法的定量范圍 內(nèi)均可以被檢出。
權(quán)利要求
1、一種同時檢測食品中15種同化激素殘留的液相色譜法，其特征是包含如下檢測步驟取樣動物肌肉組織剔除脂肪及其他結(jié)締組織，剁碎，研磨均勻，稱取樣品；提取稱取的樣品用甲醇超聲提取同化激素；動物肌肉組織質(zhì)量與甲醇分析純A.R，質(zhì)量體積比g/mL為1∶2～1∶9，提取2～4次，每次超聲提取時間為0.25～1h，得到同化激素提取液；將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35～60℃水浴蒸干，用體積分?jǐn)?shù)20％～60％甲醇水溶液溶解殘?jiān)?；凈化提取液上C18固相萃取柱進(jìn)行固相萃??；先用甲醇、水活化C18固相萃取小柱；再將樣品提取液以1～4mL/min的速度過該固相萃取柱；然后用體積分?jǐn)?shù)25％～50％甲醇水溶液淋洗小柱；最后用體積分?jǐn)?shù)60％～95％甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液；洗脫液用氮?dú)獯蹈?，用體積分?jǐn)?shù)20％～50％甲醇水溶液定容至1mL，過0.45μm濾膜后供HPLC分析；上機(jī)測定濾液用反相高效液相色譜測定，并用外標(biāo)法-峰面積定量，色譜柱為C18柱，色譜柱柱溫為20～40℃；紫外檢測波長為240nm；流動相A相為乙腈，B相為0.003～0.007mol/L庚烷磺酸鈉水溶液；二元梯度洗脫0min，A，B兩相體積比為40∶60；5min，A相由40％線性升至47％；15min，A相由47％線性升至50％；25min，A相由50％線性升至65％；30min，A相由65％線性升至75％，保持12min，進(jìn)樣體積為5～100μl。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時檢測食品中15種同化激素殘留的液 相色譜法，其特征在于所述同化激素為動物源食品中雌三醇、雌二醇、雌酮、 炔雌醇、睪酮、甲基睪酮、丙酸睪酮、群勃龍、諾龍、孕酮、醋酸甲羥孕酮、 已垸雌酚、已烯雌酚、萊克多巴胺和克倫特羅。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測動物源食品中同化激素藥物殘留的液相色譜法，特征是先取樣動物肌肉組織剔除脂肪及結(jié)締組織，剁碎，研磨均勻，稱取樣品；提取稱取的樣品用甲醇超聲提取同化激素提取液；將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴蒸干，用甲醇水溶液溶解殘?jiān)?；凈化提取液上C₁₈固相萃取柱進(jìn)行固相萃取；上機(jī)測定濾液用反相高效液相色譜測定，并用外標(biāo)法-峰面積定量，再經(jīng)二元梯度洗脫。本發(fā)明所檢測樣品為復(fù)雜生物樣品所建立的方法在約1小時時間可完成一次檢測，簡便快速、靈敏可靠且成本低，比已有的GC或HPLC方法同時分析的獸用激素藥物種類多，操作較簡便；比已有的GC/MS及LC/MS或LC/MS/MS方法成本低，溶劑毒性低。
文檔編號G01N1/28GK101551362SQ20091002745
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者呂文平, 軍 戴, 王洪新, 許婷婷, 馬朝陽 申請人:江南大學(xué)