專利名稱：一種快速檢測萊克多巴胺的免疫磁珠層析試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種快速檢測萊克多巴胺的納米免疫磁珠層析試紙條及其制備方法，涉及 萊克多巴胺的檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
萊克多巴胺(Ractopamine，簡稱RAC),是一種苯酚胺類腎上腺素激素。RAC 是一種苯乙醇胺類衍生物，分子式C18H2303N，分子量301，化學(xué)名稱為1-(4-羥基苯基)-2-[l-甲基-3-(4-羥基苯基)-丙氨萄-乙醇鹽酸鹽，分子激動劑，能夠加 強(qiáng)心臟收縮，擴(kuò)張骨骼肌血管和支氣管平滑肌，在獸醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)上可用于治療 休克和支氣管痙攣。近年來，隨著對RAC研究的深入，表明RAC具有加強(qiáng)體 內(nèi)代謝，促進(jìn)脂肪分解，蛋白質(zhì)合成，降低脂肪的生成和減少蛋白分解的作用， 因此可以利用合成脂肪的能量和成分來增加蛋白質(zhì)的合成。但是當(dāng)在詞料中添 加過量的RAC時，會殘留在畜禽肌肉組織中，對人體產(chǎn)生毒副作用，極大的影 響畜產(chǎn)品的食品安全性，因此，歐洲和中國都禁止其在畜牧業(yè)中使用。在中國 非法使用萊克多巴胺的報道卻不斷出現(xiàn)，它是繼痩肉精后廣泛被用于家畜飼養(yǎng) 的Pr興奮劑。氣質(zhì)聯(lián)用或者液質(zhì)聯(lián)用是RAC的確證方法，但是由于其操作繁 瑣，以及長時間的樣本前處理和還原過程，導(dǎo)致檢測成本高，周期長，無法滿 足大批量樣本快速篩查的要求，而使其廣泛使用受到限制。免疫分析技術(shù)具有 較高的靈敏度和特異性，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于 大量樣本的檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，簡 稱為ELISA)和膠體金免疫層析法(Colloidal Gold Irnmuno-Chromatography Assay,簡稱為GICA)由于其廉價，特異，靈敏和快速等特點，被廣泛地使用于 獸藥殘留的快速篩査中。但ELISA試劑需要專用的實驗室和專業(yè)人員進(jìn)行檢驗， 操作復(fù)雜，時間較長；膠體金類試劑操作簡便、快速、適于現(xiàn)場檢測，但靈敏 度稍低，結(jié)果用肉眼直接觀察，會產(chǎn)生誤差，亦不能記錄。
納米免疫磁珠是含有鐵元素的超順磁納米顆粒，外面包覆著聚乙烯類高分 子物質(zhì)，并可帶有羧基或氨基，用于和蛋白質(zhì)分子交聯(lián)。免疫磁珠在細(xì)胞和大 分子分離、純化及診斷上都已得到應(yīng)用。
此納米免疫磁珠檢測試紙基本原理如下采用競爭法，即樣品中的萊克多 巴胺RAC和固定在包被膜上的包被抗原RAC-OVA競爭磁珠標(biāo)記的抗萊克多巴 胺多克隆抗體。
利用免疫磁珠標(biāo)記一種抗體，在試紙的NC膜上包被相應(yīng)的包被抗原和羊抗兔二抗。當(dāng)試紙條以樣品墊末端浸入樣本后，樣品溶液沿著試紙條通過毛細(xì)管 作用從下往上泳動，溶解磁標(biāo)墊上干燥的磁標(biāo)抗體，若待測樣品中不存在待測 藥物，則磁標(biāo)抗體會直接泳動到檢測線(T線)和硝酸纖維膜上的包被原
RAC-OVA發(fā)生免疫反應(yīng)，從而使磁珠顆粒發(fā)生聚集，形成黑色的線條，然后其 他未結(jié)合的磁標(biāo)抗體繼續(xù)通過毛細(xì)管作用向前泳動，與控制線(C線)上的羊抗 兔二抗發(fā)生第二次免疫反應(yīng)，同樣形成黑色線條，這樣包被膜上就會有兩條黑 色線條，表示樣品為陰性。若待測樣品中存在待測藥品，則磁標(biāo)抗體首先會和 樣品中的檢測物發(fā)生免疫反應(yīng)，當(dāng)未發(fā)生反應(yīng)的磁標(biāo)抗體有剩余時，才會在檢 測線上與RAC-OVA發(fā)生免疫反應(yīng)，形成黑色線條，其顏色強(qiáng)度弱于陰性時的 線條強(qiáng)度；而當(dāng)磁標(biāo)抗體全部和樣品中的待測藥品萊克多巴胺RAC發(fā)生免疫結(jié) 合時，就不會再有抗體與檢測線包被原結(jié)合，從而檢測線就不會有黑色線條出 現(xiàn)?？刂凭€是為檢驗磁標(biāo)免疫層析方法本身是否有效而設(shè)定的，所以無論樣品 中是否存在待測藥物萊克多巴胺RAC，控制線都應(yīng)該顯現(xiàn)。如果控制線不顯色， 則說明試紙條失效。最后通過測定檢測線上捕獲磁珠的含量實現(xiàn)結(jié)果的判定。 和膠體金試紙類相比，免疫磁珠檢測試紙最大的不同在于將標(biāo)記膠體金改為標(biāo) 記磁珠，檢測結(jié)果時用Magnetic Assay Reader對檢測線上的磁珠含量進(jìn)行檢測 并把磁信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，而不是依靠肉眼去總判定，這樣可使得結(jié)果判定更 為精確、靈敏、客觀和便于記錄保存。利用納米免疫磁珠研制萊克多巴胺抗體 檢測快速診斷試紙尚無報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有檢測萊克多巴胺的技術(shù)的不足和缺陷，提供一種 基于納米磁免疫技術(shù)的、靈敏度高、反應(yīng)時間短、儀器設(shè)備便宜的可快速檢測 萊克多巴胺的檢測方法，使其能更加快速、靈敏、簡便地檢測動物中萊克多巴 胺的獸藥殘留。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種萊克多巴胺免疫磁珠層析檢測試紙條，由襯板和 在襯板上依次銜接的樣品墊、磁標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊組成。磁標(biāo)結(jié)合墊 為吸附萊克多巴胺磁標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用萊克多巴胺偶聯(lián)的 載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的直線式 隱形對照線C線。
所述的襯板為不吸水的硬質(zhì)塑膠條或硬紙條；樣品墊為玻璃纖維棉、尼龍 膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；包被膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜、或羧 化纖維素膜；吸水墊為吸水濾紙或濾油紙。
所述的萊克多巴胺磁標(biāo)抗體為磁珠標(biāo)記的萊克多巴胺的多克隆抗體。
所述的磁珠為表面修飾有羧基的Fe304磁珠。
所述偶聯(lián)萊克多巴胺的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA。所述萊克多巴胺免疫磁珠層析檢測試紙條的制備方法
1) 萊克多巴胺全抗原的合成及鑒定以琥珀酸酐作為衍生化試劑，并采用
混合酸酐法分別將BSA， OVA與萊克多巴胺RAC進(jìn)行偶聯(lián)，得到萊克多巴胺的 全抗原RAC-BSA以及RAC-OVA，并利用紫外掃描儀進(jìn)行鑒定；
2) 多克隆抗體的制備與純化以RAC-BSA作為免疫原，免疫新西蘭兔， 按常規(guī)方法制備RAC多克隆抗體并以硫酸銨純化；
3) 免疫磁珠的制備將RAC抗體與帶羧基的納米磁珠偶聯(lián)，制備含RAC 抗體的免疫磁珠，即萊克多巴胺磁標(biāo)抗體；以玻璃纖維棉吸附萊克多巴胺磁標(biāo) 抗體制備磁標(biāo)結(jié)合墊；
4) 包埋RAC-OVA及羊抗兔IgG至包被膜用噴膜儀分別將選定濃度的包 被原RAC-OVA噴載于包被膜的T線，以及羊抗兔IgG噴載于包被膜的C線上， 37°C烘箱干燥10min備用；
5) 檢測試紙條的制作將樣品墊、磁標(biāo)RAC抗體的結(jié)合墊、包埋包被原 RAC-OVA和羊抗兔IgG的包被膜、吸水墊依次銜接在襯板上，組成萊克多巴胺 免疫磁珠層析檢測試紙條；
6) 樣品檢測將檢測試紙條樣品墊插入待測樣品溶液，樣品將通過層析作 用從試紙條上流過，10 20秒后取出試紙條，再于室溫下反應(yīng)15分鐘后，將試 紙條放入Enviso System的Magnetic Assay Reader進(jìn)行檢測，此檢測儀將已經(jīng) 轉(zhuǎn)化成磁場信號的生物學(xué)反應(yīng)信號進(jìn)一步以電信號方式輸出；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后， 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品中萊克多巴胺的含量。
所述的免疫磁珠的制備將RAC多克隆抗體與納米磁珠偶聯(lián)，制備含RAC抗 體的免疫磁珠吸取適量磁珠至小試管中，離心使磁珠與貯存液分離，去除貯 存液并加入乙磺酸MES清洗緩沖液渦旋和超聲清洗并離心，重復(fù)幾次，最后重 懸磁珠，將一定體積的新鮮配置的水溶性碳化二亞胺EDC和N-羥基琥珀酰亞胺 NHS加入磁珠溶液中活化羧基，使磁珠表面羧基與EDC和NHS的摩爾比為1 :4 :3，渦旋混合后于室溫低速攪拌孵育反應(yīng)2小時，分別用MES清洗緩沖液及硼 酸清洗緩沖液清洗磁珠，隨后將RAC抗體緩慢滴加入至磁珠懸液中低速攪拌孵 育反應(yīng)過夜，再逐滴加入質(zhì)量濃度5。/。BSA，使BSA的終濃度為1。/。，持續(xù)攪拌5 min，以飽和游離的磁珠；低速離心去除凝聚的磁珠沉淀，然后再用硼酸清洗緩 沖液清洗磁珠去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，將磁珠轉(zhuǎn)移至新管，棄掉硼酸清洗緩沖液， 并用偶聯(lián)緩沖液重懸浮，放4°(]冰箱存放；用時則用定量加樣裝置將己經(jīng)標(biāo)記有 RAC抗體的磁珠加入磁珠結(jié)合墊，并放入37。C烘箱干燥10min備用組成檢測試紙 條。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是基于一種納米磁免疫技術(shù)進(jìn)行萊克多巴胺的 檢測方法，它具有靈敏度高、反應(yīng)時間短、儀器設(shè)備便宜、方便易用等特點。


圖l磁珠的TEM電鏡圖。
圖2免疫磁珠試劑條結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3陽性樣品的磁信號檢測示意圖。最高的尖峰代表檢測信號，第二高的 尖峰代表空白對照信號。
圖4萊克多巴胺5~200ppb時磁信號強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式
要制成萊克多巴胺的免疫磁珠檢測試紙條，首先需要制備偶聯(lián)萊克多巴胺
載體蛋白，用于制備相應(yīng)的檢測線(T線)和抗體；而且需要制備萊克多巴胺磁 標(biāo)抗原，用于制備相應(yīng)的磁標(biāo)抗原纖維棉；另外需要制備羊抗兔IgG抗體，用 于制備對照線(C線)。
1) 萊克多巴胺的全抗原的合成及鑒定先將萊克多巴胺與琥珀酸酐在吡啶
溶液中室溫反應(yīng)24小時，衍生化連接上羧基后，再采用混合酸酐法合成抗原， 并使用牛血清白蛋白BSA作為免疫抗原偶聯(lián)載體，卵清蛋白OVA作為包被抗 原偶聯(lián)載體，分別得到萊克多巴胺的全抗原RAC-BSA和RAC-OVA，并利用紫 外掃描儀進(jìn)行鑒定。
2) 多克隆抗體的制備與純化以RAC-BSA作為免疫原，采用新西蘭大白 兔作為被免疫的動物，首次免疫時將免疫源與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳 化劑，在大白兔背部皮下多點注射，免疫劑量為lmg/只，間隔2-4周后，用相 同劑量免疫源加等量弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，加強(qiáng)免疫，免疫期間監(jiān) 測抗體效價及特異性，最后一次免疫不加佐劑。最后一次免疫7天后心臟放血， 經(jīng)硫酸按分級沉淀得純化的RAC多克隆抗體。并以硫酸銨沉淀法純化抗體；得 到兔抗RAC-BSA的IgG。
3) 免疫磁珠的制備將RAC多克隆抗體與納米磁珠偶聯(lián)，制備含RAC抗體 的免疫磁珠；具體方法是吸取適量磁珠至小試管中，離心使磁珠與貯存液分 離，去除貯存液并加入乙磺酸(MES)清洗緩沖液渦旋和超聲清洗并離心，重 復(fù)幾次，最后重懸磁珠，將一定體積的新鮮配置的水溶性碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS )加入磁珠溶液中活化羧基，使磁珠表面羧基與EDC和NHS 的摩爾比為1:4:3，渦旋混合后于室溫震蕩孵育反應(yīng)2小時，分別用MES清洗 緩沖液及硼酸清洗緩沖液清洗磁珠，隨后將RAC抗體緩慢滴加入至磁珠懸液中 低速攪拌孵育反應(yīng)過夜，再逐滴加入5。/。BSA，使BSA的終濃度為1。/。，持續(xù)攪拌 5min，以飽和游離的磁珠。低速離心去除凝聚的磁珠沉淀，然后再用硼酸清洗 緩沖液清洗磁珠，高速離心，保留底部可流動的暗黑色沉淀而去除含有未結(jié)合 的蛋白質(zhì)的上清液，重復(fù)幾次，最好將磁珠轉(zhuǎn)移至新管，棄掉硼酸清洗緩沖液， 并用偶聯(lián)緩沖液重懸浮，放4。C冰箱存放。用時則用定量加樣裝置將已經(jīng)標(biāo)記有RAC抗體的磁珠加入磁珠結(jié)合墊，并放入37ec烘箱干燥10min備用以組成檢測試 紙條。
4) 包被RAC-OVA抗原和羊抗兔二抗至硝酸纖維素膜(NC膜)用噴膜儀將 一定濃度的RAC-OVA和羊抗兔二抗分別噴載于硝酸纖維素膜(NC膜)的檢測線
(T線)和控制線(C線)上，37。C烘箱干燥10min備用。
5) 檢測試紙條的制作分別將磁標(biāo)RAC多克隆抗體的偶聯(lián)墊、包埋抗原和 二抗的硝酸纖維素膜(NC膜)、樣品墊、吸水墊、覆蓋膜、測試板外卡組成檢測 試紙條(與金標(biāo)試紙條相似)。
6) 樣品檢測將萊克多巴胺免疫磁珠層析檢測試紙條的樣品端插入待測樣 品液中，插入深度不超過標(biāo)記線，樣品將通過毛細(xì)管層析作用從試紙條上流過， 10 20秒后取出試紙條，在室溫下反應(yīng)15分鐘以后，將檢測試紙條放入EnvisoTM System的Magnetic Assay Reader進(jìn)行檢測，并且此檢測儀器可以將已經(jīng)轉(zhuǎn)化成磁 場信號的生物學(xué)反應(yīng)信號進(jìn)一步以電信號的方式輸出；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，依據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品內(nèi)萊克多巴胺含量的具體值。得到該方法的檢測限為 5ppb左右。
實施例l:
稱取2g生長育肥豬配合飼料試樣于50mL離心管中，加入6mL乙腈提取液， 手搖均勻數(shù)次，然后再加入6mL碳酸鹽緩沖液，并再加入10mL乙酸乙酯，振蕩 提取30min，再超聲提取10min，最后以3000rpm低速離心10min，移取上層有機(jī) 相至另一新試管中，氮氣吹干。加入50pL甲醇溶解吹干殘留物，并用碳酸鹽PBS 緩沖液稀釋得到待測樣品溶液。最終用萊克多巴胺免疫磁珠層析檢測試紙條檢 測樣品液，插入深度不超過標(biāo)記線，樣品將通過毛細(xì)管層析作用從試紙條上流 過，10 20秒后取出試紙條，在室溫下反應(yīng)15分鐘以后，將檢測試紙條放入 Enviso System的Magnetic Assay Reader進(jìn)行檢測磁場信號。根據(jù)事先用萊克多 巴胺標(biāo)準(zhǔn)品測出的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測飼料樣品內(nèi)萊克多巴胺的含量為10ppb。
權(quán)利要求
1、一種萊克多巴胺免疫磁珠層析檢測試紙條，其特征是由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、磁標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊組成；磁標(biāo)結(jié)合墊為吸附萊克多巴胺磁標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用萊克多巴胺偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線C線；所述的襯板為不吸水的硬質(zhì)塑膠條或硬紙條；樣品墊為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；包被膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜、或羧化纖維素膜；吸水墊為吸水濾紙或濾油紙；所述的萊克多巴胺磁標(biāo)抗體為磁珠標(biāo)記的萊克多巴胺的多克隆抗體；所述的磁珠為表面修飾有羧基的Fe3O4磁珠；所述的偶聯(lián)萊克多巴胺的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA。
2、 權(quán)利要求l所述萊克多巴胺免疫磁珠層析檢測試紙條的制備方法，其特 征是1) 萊克多巴胺全抗原的合成及鑒定以琥珀酸酐作為衍生化試劑，并采用 混合酸酐法分別將BSA, OVA與萊克多巴胺RAC進(jìn)行偶聯(lián)，得到萊克多巴胺的 全抗原RAC-BSA以及RAC-OVA，并利用紫外掃描儀進(jìn)行鑒定；2) 多克隆抗體的制備與純化以RAC-BSA作為免疫原，免疫新西蘭兔， 按常規(guī)方法制備RAC多克隆抗體并以硫酸銨純化；3) 免疫磁珠的制備將RAC抗體與帶羧基的納米磁珠偶聯(lián)，制備含RAC 抗體的免疫磁珠，即萊克多巴胺磁標(biāo)抗體；以玻璃纖維棉吸附萊克多巴胺磁標(biāo) 抗體制備磁標(biāo)結(jié)合墊；4) 包埋RAC-OVA及羊抗兔IgG至包被膜用噴膜儀分別將選定濃度的包 被原RAC-OVA噴載于包被膜的T線，以及羊抗兔IgG噴載于包被膜的C線上， 37°C烘箱干燥10min備用；5) 檢測試紙條的制作將樣品墊、磁標(biāo)RAC抗體的結(jié)合墊、包埋包被原 RAC-OVA和羊抗兔IgG的包被膜、吸水墊依次銜接在襯板上，組成萊克多巴胺 免疫磁珠層析檢測試紙條；6) 樣品檢測將檢測試紙條樣品墊插入待測樣品溶液，樣品將通過層析作 用從試紙條上流過，10~20秒后取出試紙條，再于室溫下反應(yīng)15分鐘后，將試 紙條放入Enviso System的Magnetic Assay Reader進(jìn)行檢測，此檢測儀將已經(jīng) 轉(zhuǎn)化成磁場信號的生物學(xué)反應(yīng)信號進(jìn)一步以電信號方式輸出；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后， 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品中萊克多巴胺的含量。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的免疫磁珠的制備將RAC多克隆抗體與納米磁珠偶聯(lián)，制備含RAC抗體的免疫磁珠吸取適量磁 珠至小試管中，離心使磁珠與貯存液分離，去除貯存液并加入乙磺酸MES清洗 緩沖液渦旋和超聲清洗并離心，重復(fù)幾次，最后重懸磁珠，將一定體積的新鮮 配置的水溶性碳化二亞胺EDC和N-羥基琥珀酰亞胺NHS加入磁珠溶液中活化羧 基，使磁珠表面羧基與EDC和NHS的摩爾比為1:4:3，渦旋混合后于室溫低 速攪拌孵育反應(yīng)2小時，分別用MES清洗緩沖液及硼酸清洗緩沖液清洗磁珠，隨 后將RAC抗體緩慢滴加入至磁珠懸液中低速攪拌孵育反應(yīng)過夜，再逐滴加入質(zhì) 量濃度5。/。BSA，使BSA的終濃度為ir。，持續(xù)攪拌5min，以飽和游離的磁珠； 低速離心去除凝聚的磁珠沉淀，然后再用硼酸清洗緩沖液清洗磁珠去除未結(jié)合 的蛋白質(zhì)，將磁珠轉(zhuǎn)移至新管，棄掉硼酸清洗緩沖液，并用偶聯(lián)緩沖液重懸浮， 放4。C冰箱存放；用時則用定量加樣裝置將己經(jīng)標(biāo)記有RAC抗體的磁珠加入磁珠 結(jié)合墊，并放入37。C烘箱干燥10min備用組成檢測試紙條。
全文摘要
一種快速檢測萊克多巴胺的免疫磁珠層析試紙條及其制備方法，涉及萊克多巴胺檢測技術(shù)領(lǐng)域。該試紙條由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、磁標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊組成。磁標(biāo)結(jié)合墊為吸附萊克多巴胺磁標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用萊克多巴胺偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的對照線C線。將試紙條樣品墊插入待測樣品溶液，10～20秒后取出，于室溫下反應(yīng)15分鐘，將試紙條放入磁信號檢測儀檢測，此檢測儀將已轉(zhuǎn)化成磁場信號的生物學(xué)反應(yīng)信號進(jìn)一步以電信號輸出；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品中萊克多巴胺含量。本發(fā)明用納米磁免疫技術(shù)進(jìn)行萊克多巴胺的檢測，具有靈敏度高、反應(yīng)時間短、儀器設(shè)備便宜、方便易用等特點。
文檔編號G01N33/566GK101561437SQ20091002758
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者劉麗強(qiáng), 李灼坤, 胥傳來, 偉 馬 申請人:江南大學(xué)