專利名稱：甲醛測定試劑(盒)及甲醛濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲醛測定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定甲醛濃度的方法，屬
于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甲醛測定的測定方法主要有分光光度法、色譜法、電化學(xué)法、化學(xué)滴定法等
分光光度法測定的主要方法有乙酰丙酮法、鉻變酸法、MBTH法、付品紅法、AHMT法 等幾種。分光光度法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便；缺點(diǎn)是靈敏度較低，有污染介質(zhì)，對(duì)測定有干擾。
色譜法主要有氣相色譜、高效液相色譜法、離子色譜法等，直接利用色譜法較少， 一般是和其它分析儀器相連用，如GC-MS、HPLC-UV等。色譜法方法簡單、快速、直接，但是操 作繁瑣、試劑消耗量大、方法選擇性差等缺點(diǎn)。 電化學(xué)法包括示波極譜法、吸附伏安法和哥臘衍生試劑法，該法空氣中甲醛的靈 敏度和準(zhǔn)確度都很高，適合于測定室內(nèi)空氣中微量甲醛。 熒光分析法因具有快速、簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)而受到人們廣泛的重
視，尤其是用于室內(nèi)空氣環(huán)境中痕量甲醛的分析監(jiān)測，其優(yōu)點(diǎn)更為突出?；瘜W(xué)發(fā)光分析法具
有靈敏度高，線性范圍寬，儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)。 化學(xué)滴定法主要包括電位滴定法、碘量法及酸堿滴定法。 綜合上述，沒有一個(gè)方法可以使用自動(dòng)化儀器檢測甲醛的，酶法檢測甲醛的試劑， 酶法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高不受干擾、操作方便、成本低廉、可以大批量檢測，方法靈敏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用酶倍增法(Enzymatic
DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法
(CoupleReaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長
處吸光度的變化，得以測定甲醛濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的甲醛
測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)
行甲醛濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明甲醛濃度測定方法如下 甲醛+輔酶+水甲醛脫氡酶甲酶+還原型輔酶 甲酸+高鐵細(xì)胞色素甲酸脫氡酶二氧化碳+亞鐵細(xì)胞色素 二氧化碳+兒茶酚+輔酶+氯氯苯甲酸_1,2-加雙氧酶2-氯苯甲酸+還原型輔 酶+氧 這種方法應(yīng)用甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase ;EC 1. 2. 1. 46)酶(偶) 聯(lián)甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase ;EC 1. 2. 2. 1 ;EC 1. 2. 2. 3)、氯苯甲酸_1， 2_加雙 氧酶(Chlorobenzoate 1， 2-dioxygenase ;EC 1. 14. 12. 13)酶促反應(yīng)比色終點(diǎn)法。甲醛脫 氫酶酶解甲醛反應(yīng)產(chǎn)生甲酸，再通過(偶)聯(lián)合甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-l，2-加雙氧酶的作用，最終二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上 升的程度，可以測算甲醛的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明甲醛測定試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L輔酶3mmol/L甲醛脫氫酶10000U/L甲酸脫氫酶12000U/L氯苯甲酸-1，2- 加雙氧酶12000U/L高鐵細(xì)胞色素7mmol/L兒茶酚7mmol/L氯化鎂9mmol/L本發(fā)明的甲醛領(lǐng)U定試劑(盒)可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1，2-加雙氧酶、高鐵 細(xì)胞色素、兒茶酚、氯化鎂。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l



緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素、兒茶酚、氯化鎂。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加雙氧酶。 輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶、高鐵細(xì)胞色素、兒茶 酚、氯化鎂在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l
肆





緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素、兒茶酚、氯化鎂。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶。
輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶、高鐵細(xì)胞色素、兒茶 酚、氯化鎂在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定甲醛濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的甲醛測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶
甲醛脫氫酶 甲酸脫氫酶
氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶 高鐵細(xì)胞色素 兒茶酚










氯化,
:大
3mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L 7mmol/L 7mmol/L 9mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甲醛樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)?br> 正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出甲醛的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的甲醛測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
高鐵細(xì)胞色素 7mmol/L
兒茶酚 7mmol/L
氯化鎂 9mmol/L
試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 甲醛脫氫酶 10000U/L 甲酸脫氫酶 12000U/L 氯苯甲酸-l，2-加雙氧酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甲醛樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢效 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出甲醛的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的甲醛測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 輔酶
高鐵細(xì)胞色素 兒茶酚

















氯化鎂 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
甲酸脫氫酶
氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 甲醛脫氫酶
IOO,I, 50mmol/L 3mmol/L 7mmol/L 7mmol/L 9mmol/L
100,1, 500,1/L 12000U/L 12000U/L
1
100,1/ 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定甲醛濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始
吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甲醛樣品與試劑1、試劑2、試劑3 的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測 時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出甲醛的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)12mmol/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確 度，其相對(duì)偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 18±0. 09 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā) 明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法的甲醛的濃度測定方法，其方法如下甲醛+輔酶+水 甲醛脫氫酶 甲酸+還原型輔酶甲酸+高鐵細(xì)胞色素 甲酸脫氫酶 二氧化碳+亞鐵細(xì)胞色素二氧化碳+兒茶酚+輔酶+氯 氯苯甲酸-1，2-加雙氧酶 2-氯苯甲酸 +還原型輔酶+氧將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出甲醛的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種甲醛測定試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。氯化鎂可以用其它氯鹽取代。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲醛測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加雙氧酶、高鐵細(xì) 胞色素、兒茶酚、氯化鎂組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲醛測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加雙氧酶、高鐵細(xì) 胞色素、兒茶酚、氯化鎂組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素、兒 茶酚、氯化鎂組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加 雙氧酶組成。輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加雙氧酶、高鐵細(xì)胞色素、兒 茶酚、氯化鎂在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲醛測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶、高鐵細(xì) 胞色素、兒茶酚、氯化鎂組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素、兒 茶酚、氯化鎂組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶組成； 試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶組成。輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2_加雙氧酶、高鐵細(xì)胞色素、兒茶酚、氯化鎂在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲醛測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmo1/ L或O. 1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙 二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶甲醛脫氫酶 甲酸脫氫酶氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶 高鐵細(xì)胞色素兒茶酚 氯化鎂
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的甲醛測定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定甲醛濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、高鐵細(xì)胞色素、兒茶酚、氯化鎂、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1，2-加雙氧酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出甲醛的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N35/00GK101793781SQ200910028549
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司