專利名稱：：一種藥品、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的快速檢測系統(tǒng)及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種快速檢測系統(tǒng)及其檢測方法，尤其涉及一種藥品、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的快速檢測系統(tǒng)及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：中藥是中華民族流傳幾千年的醫(yī)學(xué)文化瑰寶，毒副作用小，效果好，作用及療效可靠。大部分消費者認為"西藥治標，中藥治本"。不僅國人一直認可中藥，近年來國際上也興起了中藥熱。一些不法企業(yè)在利益的驅(qū)使下，為了迎合國人對中藥的信賴，利用西藥療效快、作用迅速的特點，將西藥成分非法添加到中成藥中，并隨意夸大療效，騙取患者的信任，高價銷售牟取暴利。在中成藥中添加西藥本身并不違規(guī)，但必須經(jīng)過嚴格的臨床實驗并經(jīng)相關(guān)部門審批，非法添加是一種非常危險的行為，存在以下危害第一，在中成藥中非法添加的化學(xué)藥物，未經(jīng)試驗驗證和國家相關(guān)部門審核批準，本身質(zhì)量難以控制，而且所添加藥物的量往往隨機而定，可多可少，導(dǎo)致藥品成分含量不穩(wěn)定，甚至嚴重超標，安全性無法保證。第二，添加的化學(xué)藥物成分雖然有時療效明顯，但多屬于處方藥物，服用時有嚴格的適應(yīng)癥、禁忌癥和一定的副作用，某些病人不能服用。而不法廠家在非法添加了這些化學(xué)成分后，患者在不知情的情況下使用了這些產(chǎn)品，容易攝入過量的化學(xué)藥物成分引起嚴重的藥物不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡。第三，中藥成分復(fù)雜，在使用過程中，非法添加的化學(xué)成分很有可能與其它藥物發(fā)生相互作用，給患者帶來不可預(yù)料的危害。很多保健食品和食品也打著中藥的旗號，魚目混珠，濫竽充數(shù)，非法添加化學(xué)成^S某取暴利。據(jù)有關(guān)調(diào)查結(jié)果顯示，目前擅自添加化學(xué)成分比較嚴重的中成藥和保健食品按5照功能分類主要有補腎壯陽類、減肥類、抗風(fēng)濕鎮(zhèn)痛類、抗菌消炎類、降糖類、降壓類、止咳平喘類、抗疲勞類、排毒養(yǎng)顏類等。有效打擊制假售假行為，保證人民群眾的飲食用藥安全已成為政府工作的重點之一。傳統(tǒng)的分析方法主要靠氣相色譜、液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用或液質(zhì)聯(lián)用等手段，通常繁瑣復(fù)雜，樣品前處理過程復(fù)雜、工作量大、儀器昂貴、要求有熟練的技術(shù)人員及較長的分析周期。雖然監(jiān)督管理部門近年來也在下大力氣整頓中成藥、保健食品和食品的非法添加情況，但由于監(jiān)管對象、種類、數(shù)量、范圍過于龐大，監(jiān)管資源相對有限，不能在短時間內(nèi)及時準確地對大量樣品進行檢測，或者只能對少數(shù)在監(jiān)管視線以內(nèi)的違禁化學(xué)成分進行有針對性的檢測，而對一些未知的添加物則難以--進行檢測。因此，迫切希望有一種簡單、快速、靈敏及價廉的檢測技術(shù)能在現(xiàn)場進行大批量的篩選試驗，并有一種相應(yīng)的檢測標準對篩選出的樣品進行確證。發(fā)展快速檢測系統(tǒng)是解決此問題的有效手段之一。中成藥、保健食品和食品本身成分復(fù)雜，各成分之間干擾嚴重，檢驗標準很不完善，加上添加的化學(xué)成分變化不定，難以用統(tǒng)一的標準對其進行檢測。因此，中成藥、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的檢測方法要求更具專屬性和準確性。以下是目前添加化學(xué)成分的常用分析手段理化反應(yīng)法、薄層色譜法、近紅外光譜法、拉曼光譜、免疫分析方法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)語聯(lián)用技術(shù)。單味的中藥成分已很復(fù)雜，復(fù)方中成藥、保健食品和食品的化學(xué)成分更為復(fù)雜多樣，加上生產(chǎn)工藝的影響，使得添加化學(xué)成分的檢測方法要求更具專屬性?，F(xiàn)有技術(shù)中，被認為最有效的添加化學(xué)成分確證手段是液質(zhì)聯(lián)用法，國家標準也主要采用液質(zhì)聯(lián)用法來檢測確證添加化學(xué)成分，此法只能對少數(shù)在監(jiān)管視線以內(nèi)的違禁化學(xué)成分進行有針對性的檢測，而對一些未知的添加物無能為力。與非法添加化學(xué)成分的龐大監(jiān)管對象相比，監(jiān)管資源顯得相當(dāng)有限，只有液質(zhì)聯(lián)用法根本無法滿足監(jiān)督檢驗的需求。非法添加化學(xué)成分行為的監(jiān)督管理迫切需要一種能在現(xiàn)場短時間內(nèi)及時準確地對大量樣品進行快速篩查的技術(shù)和一種國內(nèi)基層藥品檢測機構(gòu)即能進行結(jié)果確證的常規(guī)臉測技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明主要是對藥品、保健食品或食品中添加的化學(xué)成分進行快速檢測，本發(fā)明的第一個目的是提供一種藥品、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的檢測系統(tǒng)，包括所述添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫、初篩設(shè)備或試劑盒、確證儀器和液質(zhì)聯(lián)用儀，初篩設(shè)備或試劑盒能對添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫進4亍初步篩查，確證儀器能對初步篩查結(jié)果進一步確證，液質(zhì)聯(lián)用儀能對檢測結(jié)果進行仲裁。所述初篩設(shè)備包括近紅外光譜設(shè)備，所述初篩試劑盒包括中成藥、保健食品和食品中添加的PDE5型抑制劑的理化反應(yīng)4全測試劑盒。優(yōu)選的，所述的藥品、保健食品和食品中添加的PDE5型抑制劑的理化反應(yīng)檢檢測試劑盒包括重量百分比濃度為1-20%的硫酸溶液、0.01-0.2mol/L高錳酸鉀溶液、三硝基苯酚飽和溶液、提取溶劑和顯色劑，所述提取溶劑包括甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯或丙酮，所述顯色劑包括稀>5克酸、高氯酸、鹽酸或硝酸。本發(fā)明的第二個目的是提供一種藥品、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的-險測方法，建立所述添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫，運用快速篩查方法對所述添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫進行初步篩查，再進一步確證，最后用液質(zhì)聯(lián)用法進行仲裁。所述快速篩查方法包括理化反應(yīng)檢測方法、薄層色譜、近紅外光譜、拉曼光i瞽或免疫分析。優(yōu)選的，所述理化反應(yīng)檢測方法包括如下步驟(1)取固態(tài)的藥品、保健食品或食品，加重量百分比濃度為3%的硫酸溶液8ml，或取液態(tài)的藥品、保健食品或食品，加重量百分比濃度為3%硫酸溶液6ml，振搖2分鐘使溶散，靜置片刻，過濾，收集續(xù)濾液；(2)取步驟(1)得到的續(xù)濾液2ml，滴加0.04mol/L高錳酸郜溶液，邊滴加邊振搖，至溶液出現(xiàn)的紫紅色在15秒內(nèi)不褪色，靜置片刻，待紫紅色褪去至無色或淺棕色；(3)向步驟(2)得到的溶液中滴加三硝基苯酚飽和溶液4-5滴，保持滴加時和滴完后試管未被振搖，觀察是否產(chǎn)生黃色渾濁；若3分鐘內(nèi)出現(xiàn)黃色渾濁，靜置后形成黃色沉淀物，即判斷樣品中含那非類PDEs型抑制劑。優(yōu)選的，所述理化反應(yīng)檢測方法包括如下步驟(1)取固態(tài)或液態(tài)的藥品、保健食品或食品，加提取溶劑l20ml，振搖1~2分鐘，靜置1~10分鐘，取上清液；(2)顯色反應(yīng)使所述步驟(1)的上清液1~2滴與0.5~10ml的顯色劑反應(yīng)，觀察是否產(chǎn)生紫色；若2分鐘內(nèi)溶液顯紫色，則初步判斷含拉非類化學(xué)成分。優(yōu)選的，所述確證采用高效液相色謙法或液質(zhì)聯(lián)用法。優(yōu)選的，所述仲裁方法為M聯(lián)用法。當(dāng)所述添加化學(xué)成分為未知化學(xué)成分時，將化學(xué)成分按照化學(xué)結(jié)構(gòu)進行分類，利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，采用紫外吸收光譜特征和二級質(zhì)鐠特征檢測已知添加化學(xué)成分的同系物、衍生物和改造物。所述化學(xué)成分包括很多，主要是指在中成藥、保健食品或食品中非法添加的一些化學(xué)藥物成分，如補腎壯陽類樣品中非法添加PDE5型抑制劑(磷酸二酯酶5型抑制劑，phosphodiesterasetype-5inhibitor)就是其中的一種典型代表，添加情況普遍，且針對檢驗標準的高科技造假日益增多，存在著嚴重隱患。添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫的建立是按照中成藥、保健食品和食品的功能分類建立的。本發(fā)明的理化反應(yīng)、薄層色諳、近紅外光譜、拉曼光譜、免疫分析等方法適合于在基層和監(jiān)督現(xiàn)場對樣品進行快速篩查，開發(fā)這些技術(shù)作為快速篩查方法在基層監(jiān)督現(xiàn)場應(yīng)用藥品檢測車或快檢試劑盒的流動實驗室對添加化學(xué)成分8的樣品進行初篩。本發(fā)明的普通高效液相色譜儀配備二極管陣列檢測器后能夠準確檢測絕大部分藥品、保健食品和食品中添加的化學(xué)成分，儀器價格和維護成本比液質(zhì)聯(lián)用儀要低很多，適合在普通檢測機構(gòu)使用。因此，建立高效液相色鐠確證方法在市級或當(dāng)?shù)氐钠胀ㄋ幤窓z測機構(gòu)實驗室對初篩的可疑樣品進行確證。本發(fā)明的液質(zhì)聯(lián)用仲裁方法，在省級或授權(quán)藥品檢測機構(gòu)實驗室對影響較大或存在爭議的結(jié)果進行仲裁，條件較好的藥品檢測機構(gòu)也可采用液質(zhì)聯(lián)用法直接對初篩的可疑樣品進行確證。本發(fā)明進一步提出了添加已知化學(xué)成分同系物、衍生物或修飾物的檢測程序及思路，從而能不斷擴大檢驗對象，應(yīng)對非法添加違法手段的不斷更新。本發(fā)明按照添加化學(xué)成分的功能，分類建立添加化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫，通過逐級篩選、分層檢測的方法，將從基層流動實驗室到省級藥品檢測機構(gòu)建立一張監(jiān)督檢,瞼的網(wǎng)絡(luò)，有望解決部分藥品、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的技術(shù)監(jiān)督難題，全面提升藥品、保健食品和食品非法添加檢測的能力和水平，為依法監(jiān)管提供強有力的技術(shù)支撐，給售制假藥的不法分子形成巨大的威懾，對保證人民群眾的飲食用藥的安全有效和維護中藥聲譽具有非常重要的意義。具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例詳細介紹本發(fā)明方法的具體實施過程，進一步闡述本發(fā)明。補腎壯陽類是非法添加的一類典型4戈表，添加情況比較嚴重。本實施方式以檢測補腎壯陽類中成藥、保健食品或食品中添加的化學(xué)成分為例，詳細介紹本發(fā)明方法的具體實施過程，但本實施例僅作為本發(fā)明的示例而不對本發(fā)明做任何限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以清楚地通過本實施例的描述了解本發(fā)明，并應(yīng)用于其他類中成藥、保健食品或食品中是否添加化學(xué)成分的快速檢測。下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實^驗方法進4亍。建立補腎壯陽類中成藥、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的快速檢測系統(tǒng)的基本步驟如下一、按照中成藥、保健食品和食品的功能分類，建立常見添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫從造假售假分子的角度考慮，非法添加的化學(xué)成分應(yīng)為那些短時間內(nèi)有顯著效果并且價格低廉的藥物，最好現(xiàn)有標準無法檢測；從藥品監(jiān)管的角度考慮，那些副作用較大、可能被添加的化學(xué)成分也應(yīng)該重點關(guān)注。查閱國內(nèi)外文獻，補腎壯陽類樣品中添加的化學(xué)成分絕大部分為西地那非、伐地那非和他達拉非及其衍生物等PDEs型抑制劑；也有添加酚妥拉明、阿樸嗎啡、育亨賓等化學(xué)成分的報道，但添加情況不多，因此以PDEs型抑制劑作為非法添加的研究對象。美國食品藥品管理局(FDA)先后批準了西地那非、伐地那非和他達拉非三種PDEs型抑制劑，成為補腎壯陽類樣品中添加最早和最頻繁的化學(xué)成分。西地那非、伐地那非和他達拉非均屬于處方藥，服用時有嚴格的適應(yīng)癥、禁忌癥和一定的副作用，某些病人不能服用，患者在不知情的情況下攝入容易引起嚴重的藥物不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡。近年來，還發(fā)現(xiàn)了添加大量上述三種PDEs型抑制劑的未知衍生物，這些化學(xué)成分未經(jīng)過嚴格的安全性實驗，存在著嚴重隱患。國內(nèi)外文獻已經(jīng)報道了二十多種PDE5型抑制劑，本發(fā)明選擇其中具有代表性的十一種PDE5型抑制劑作為添加化學(xué)成分的基本數(shù)據(jù)庫，建立補腎壯陽類中成藥、保健食品和食品的快速檢測系統(tǒng)。十一種PDEs型抑制劑的化學(xué)名稱和結(jié)構(gòu)信息見表l。表1化學(xué)信息結(jié)構(gòu)式西地那非SildenafilC22H30N6O4SM.W.474.58o、乂oH^TN\i豪莫西地那非HomosildenafilC23H32N604SM.W.488.60NJlU^0、<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>二、采用近紅外光謙法快速篩查近紅外光譜技術(shù)在國內(nèi)開始日趨普及，我國已經(jīng)配備了近400輛藥品檢測車，每輛都配置了近紅外光i瞽儀。由于近紅外光鐠具有無需樣品預(yù)處理、不使用化學(xué)試劑、不破壞樣品、分析速度快等優(yōu)勢，在條件允許和近紅外光讒鑒別模型可行的情況下，應(yīng)優(yōu)先考慮應(yīng)用該技術(shù)。根據(jù)文獻報道，國內(nèi)目前補腎壯陽類樣品添加頻率最高的化學(xué)成分為西地那非，其次為他達拉非，涉及的劑型主要為硬膠嚢劑，其次為片劑和丸劑。按照包裝和劑型分別建立的近紅外光譜分析模型準確性較高。結(jié)合收集樣品的實際情況，本實施例選擇建立西地那非和他達拉非膠囊劑的定性鑒別模型，片劑、丸劑等其他劑型的近紅外光鐠鑒別模型可釆用類似的方法建立，具體步驟如下1.從市場收集59個不同廠家不同濃度的補腎壯陽類樣品作為代表性樣品建立參考樣品庫，包括中成藥、保健食品和食品；2.采集上述59個樣品的近紅外光謙用德國Bruker公司的MPA和MATRIX-F型光譜儀分別釆集近紅外光譜，測量方式為光纖漫反射，透過膠囊殼測量樣品，測定條件為分辨率8cm"，掃描次數(shù)32次，數(shù)據(jù)范圍4,000至12,000cm-1,檢測器為銦鎵砷，每個樣品測量3次；3.對上述59個樣品進行液相色語和液質(zhì)聯(lián)用分析，定性分析區(qū)分陰性樣品和陽性樣品，(本實施例定義添加了西地那非的樣品為西地那非陽性樣品，添加了他達拉非的樣品為他達拉非陽性樣品，未添加西地那非和他達4立非的樣品稱為陰性樣品)；根據(jù)液相色鐠和液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果，參考樣品的59個樣品中西地那非陽性樣品16個，他達拉非陽性樣品17,陰性樣品26個；4.收集西地那非和他達拉非對照品，分別采集近紅外光譜；5.建立鑒別模型采用Bruker公司OPUS軟件的IDENT程序建立定性鑒別模型；6.利用上述步驟5建立的鑒別模型對未知樣品進行分析，檢測樣品中是否添加PDEs型抑制劑。7.檢測結(jié)果為陽性的樣品需要現(xiàn)場抽樣，進一步用高效液相色譜法或^t聯(lián)用法確證。從市場收集305個不同廠家不同濃度的補腎壯陽類樣品作為未知樣品采用本實施例的方法進行檢測，同時將這305個未知樣品采用液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用分析，將兩種方法的檢測結(jié)果進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假陽性樣品2個，假陰性樣品2個，準確率達到98.7%,由此說明本發(fā)明的基于近紅外光鐠技術(shù)快速篩查補腎壯陽類樣品中添加化學(xué)成分的方法能夠滿足監(jiān)督檢驗的要求。三、采用理化反應(yīng)試劑盒快速篩查在沒有近紅外光譜儀或近紅外光鐠鑒別模型不適用的情況下，操作簡單、檢測成本低的理化反應(yīng)是快速篩查的優(yōu)選方法。在理化反應(yīng)原理基礎(chǔ)上制成的快檢試劑盒，容易在基層推廣應(yīng)用。本發(fā)明實施案例的十一種PDE5型抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息見表1,從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，可以把PDEs型抑制劑分為那非類和拉非類。那非類包括西地那非及其衍生物、伐地那非及其衍生物、紅地那非及其衍生物、艾地那非及其衍生物等；拉非類包括他達拉非及其衍生物。由于那非類和拉非類的核心結(jié)構(gòu)差異較大，他們相應(yīng)的物理和化學(xué)性質(zhì)也差異較大(如那非類PDEs型抑制劑一般溶于酸溶液，而拉非類PDE5型抑制劑一般不溶于酸溶液，溶于有機溶劑)，需要采用不同的理化反應(yīng)方法分別檢測。本案例的PDE5型抑制劑理化反應(yīng)快速篩查方法如下1.步驟一取膠嚢1粒(片劑約1/2片；丸劑、顆粒劑、散劑等固體制劑約每次服用量的1/10量；溶液劑2ml),置具塞試管中(片劑、丸劑需預(yù)先研細或剪碎)，加3。/。硫酸溶液8ml(溶液劑加6ml)，強力振搖約2分鐘使溶散，靜置片刻，濾過，取續(xù)濾液2ml，滴加0.04mol/L高錳酸郜溶液，邊滴加邊振搖，至溶液出現(xiàn)的紫紅色在15秒內(nèi)不褪色，靜置片刻，待紫紅色褪去至無色或淺棕色，滴加三賄基苯酚飽和溶液4~5滴(滴加時和滴完后切勿振搖試管)，觀察是否產(chǎn)生黃色渾濁。若3分鐘內(nèi)出現(xiàn)黃色渾濁，靜置后形成黃色沉淀物，即初1步判斷樣品中含那非類PDEs型抑制劑。2.步驟二若不呈上述陽性反應(yīng)，則取膠嚢劑l粒(片劑1片；丸劑、顆粒劑、散劑等固體制劑約每次服用量的1/2量)，置具塞試管中(片劑、丸劑需預(yù)先研細或剪碎)，加乙醇2ml，振搖約1~2分鐘，靜置約1分鐘，取上清液作為供試品溶液。在試管中加入45%的稀硫酸lml，滴加供試品溶液2滴，觀察是否產(chǎn)生紫色。若3分鐘內(nèi)供試品溶液顯紫色，則初步判斷樣品中含拉非類PDEs型抑制劑。3.檢測結(jié)果為陽性的樣品需要現(xiàn)場抽樣，進一步用高效液相色諳法或M聯(lián)用法確i正。通過組合步驟一和步驟二兩個理化反應(yīng)方法，可以檢測目前絕大部分已知的PDEs型抑制劑。根據(jù)樣品中添加PDE5型抑制劑的實際情況，如樣品以添加那非類PDEs型抑制劑為主，則按上述組合操作；如樣品以添加拉非類PDEs型抑制劑為主，則也可以交換步驟一和步驟二的順序使用。從市場收集149個補腎壯陽類樣品，采用高效液相色鐠法和液質(zhì)聯(lián)用法檢測發(fā)現(xiàn)其中102個添加那非類PDE5型抑制劑，涉及6種PDE5型抑制劑(分別為西地那非、羥基豪莫西地那非、紅地那非、那紅地那非、伐地那非和硫代艾地那非)；用本發(fā)明的理化反應(yīng)步驟一的方法檢測，出現(xiàn)假陽性樣品3個，準確率為98.0%。從市場收集156個補腎壯陽類樣品，采用高效液相色語法和液質(zhì)聯(lián)用法檢測發(fā)現(xiàn)其中17個添加拉非類PDE5型抑制劑，涉及他達拉非和氨基他達拉非兩種PDEs型抑制劑，用本發(fā)明的理化反應(yīng)步驟二的方法檢測，準確率為100%。由此說明本發(fā)明的理化反應(yīng)快速篩查補腎壯陽類樣品中添加化學(xué)成分的方法能夠滿足監(jiān)督檢-瞼的要求。四、高效液相色鐠法進行確證現(xiàn)有技術(shù)主要采用液質(zhì)聯(lián)用方法作為確證方法。高效液相色謙儀是國內(nèi)檢測實驗室的常規(guī)檢測設(shè)備，采用液相色譜法作為確證方法，在當(dāng)?shù)厮幤窓z測機構(gòu)的實驗室對初篩的陽性樣品進行快速確證，符合國內(nèi)藥品檢測機構(gòu)的實際情14況，有利于監(jiān)督檢驗的有效實施。本案例的液相色語方法的主要分析步驟如下1.色語條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色鐠柱(250mmx4.6mm，5拜)；二極管陣列檢測器，檢測波長為230nm,掃描波長范圍為200400nm;柱溫35。C;流速1.0ml/min;流動相A為磷酸三乙胺溶液(取三乙胺7ml用水稀釋至1000ml,用磷酸調(diào)pH至2.8)-甲醇-乙腈(60:20:20),流動相B為磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈(8:46:46)，按表2進行梯度洗脫。表2時間(分鐘)流動相A(%)流動相B(%)01000121000250100300謂3110003610002.對照品溶液的制備精密稱取那紅地那非、紅地那非、伐地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他達拉非、他達拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非和那莫西地那非對照品各10mg,置50ml量并瓦中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，用流動相A溶液稀釋制成每lml含50pg的溶液，即得。3.供試品溶液的制備若樣品為固體制劑，精密稱取一次服用量，研細，置50ml量瓶中，加乙腈40ml，超聲處理15分鐘，冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過；若樣品為液體制劑，精密量取一次服用量，置50ml量瓶中，加乙腈約40ml，振搖3分鐘，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液適量，根據(jù)樣品中添加PDE5抑制劑的量，用流動相A稀釋至與對照品溶液濃度相當(dāng)，搖勻，濾過，即得。4.測定方法(1)分別精密量取對照品溶液和供試品溶液lOpl適量注入液相色鐠^f義，記錄色傳圖及紫外光語圖(2)將供試品的色譜圖和對照品的色譜圖進行比較，保留時間與對照品保留時間相近(誤差范圍為±0.2分鐘)的組分即初步認為是相應(yīng)的PDE5型抑制劑。(3)由于中成藥、保健食品和食品種類繁多、成分復(fù)雜，不能完全排除存在干擾成分與PDEs型抑制劑在同一時間出峰的情況，采用二極管陣列檢測器可獲得PDE5型抑制劑的紫外吸收光譜圖，將供試品的紫外吸收光譜圖與對照品的紫外吸收光鐠圖進行比較，若兩者的最大吸收波長、最小吸收波長等光i瞽特征一致，進一步確證供試品中含有PDEs型抑制劑。如無法獲得PDEs型抑制劑的對照品，可參考表3的紫外吸收光譜特征進行比較。表3化學(xué)成分最大吸收(nm)肩峰(nm)最小吸收(nm)那紅地那非214,234,281222,254紅地那非214,234,281222,254伐地那非216245羥基豪莫西地那非214,225,294267西地那非214,225,294267豪莫西地那非214,225,294267氨基他達拉非221,285257他達拉非221,285257疏代艾地那非227,296,356367276,315偽伐地那非216245那莫西地那非208,225,294267(4)根據(jù)供試品溶液的實際濃度，用流動相A稀釋使其與對照品溶液的色諳峰面積相當(dāng)，按外標法計算樣品中添加化學(xué)成分的濃度，并按所附說明書計算出一次服用量所攝入的化學(xué)成分量。外標法計算含量時一般采用相應(yīng)的對照品計算含量。由于PDEs型抑制劑存在很多西地那非、伐地那非和他達拉非的衍生物，獲取這些衍生物的對照品十分困難，PDEs型抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，在230nm的紫外響應(yīng)值基本相當(dāng)，在相應(yīng)的對照品難以獲得的情況下，也可以用容易獲得的結(jié)構(gòu)類似物(如西地那非)作為參考對照品測定相對含量。(5)從上述十一種PDE5型抑制劑中選擇那紅地那非、伐地那非、西地那非、他達拉非和硫代艾地那非作為代表性PDEs型抑制劑進行方法學(xué)驗證3個16濃度9份供試品溶液的平均回收率分別為99.1%、96.2%、105.0%、102.1%和103.0%;7次進樣主成分峰面積的RSD分別為0.8%、0.8%、0.8%、0.6%和0.5%;檢測限分別約為6ng、6ng、4ng、2ng和2ng,表明本發(fā)明的方法滿足高效液相色譜含量測定的方法學(xué)駘3正要求。(6)合理設(shè)置中成藥、保健食品和食品中非法添加化學(xué)成分的限量水平對于區(qū)分人為添加和評估非法添加的危險程度具有重要的意義。西地那非類的起效劑量為50100mg，伐地那非類和他達拉非類的起效劑量為5~20mg。按最低起效劑量5mg計算，設(shè)定人為添加的限量值為最低有效劑量的1/10,即0.5mg/次服用量。在評估添加化學(xué)成分對人體健康的危害程度時，該限量值可作為參考。即便每次服用0.5mg上述化學(xué)成分，在臨床上也不會產(chǎn)生顯著效果，從而使得非法添加用來牟取不法利益變得毫無意義。從市場收集194個各種補腎壯陽類樣品，其中132個添加PDEs型抑制劑，涉及8種PDE5型抑制劑。采用液質(zhì)聯(lián)用法對上述高效液相色鐠法的測定結(jié)果進行驗證，準確率為100%，表明高效液相色譜方法滿足作為確證方法的要求。五、液質(zhì)聯(lián)用法i^行仲裁或確證液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)集液相色譜的高分離能力和質(zhì)語的高靈敏度、高定性專屬性于一體，尤其是多級質(zhì)語串聯(lián)檢測技術(shù)，可獲得更多的化合物結(jié)構(gòu)信息。在復(fù)雜混合物的定性鑒別分析方面具有許多優(yōu)越性，是目前非法添加檢測技術(shù)中最準確的方法。但是液質(zhì)聯(lián)用儀價格昂貴，維護成本高，在國內(nèi)實驗室的配置還不普及。對于配置液質(zhì)聯(lián)用儀的實驗室，可以直接用該方法對初篩的結(jié)果進行確證，也可以對影響較大或存在爭議的檢測結(jié)果進行仲裁。本案例的十一種PDE5型抑制劑液質(zhì)聯(lián)用檢測方法如下1.色譜條件以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；檢測波長230nm;以含0.1%乙酸的0.02mol/L乙酸銨溶液為流動相A，曱醇為流動相B，乙腈為流動相C，按表4進行梯度洗脫表4時間(分鐘)流動相A(%)流動相B(%)流動相C(%)075101515602515253055153530551540751015457510152.質(zhì)譜條件電噴霧離子化源(ESI)，毛細管電壓5,5kV,離子源溫度400°C，離子噴霧氣流速800ml/min,正離子檢測方式，掃描方式為全掃描一級質(zhì)語、全掃描二級質(zhì)謙，掃描范圍50~600amu。3.對照品溶液的制備取西地那非、他達拉非、伐地那非、紅地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他達拉非、偽伐地那非、硫代艾地那非、那紅地那非對照品約10mg,置50ml量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，用50%乙腈溶液稀釋制成每lml含5pg的溶液，即得。4.供試品溶液的制備若供試品為固體制劑，精密稱取一次服用量，研細后轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加乙腈約40ml，超聲處理15分鐘，冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過；若供試品為液體制劑，精密量取一次服用量，置50ml量瓶中，加乙腈約40ml，振搖3分鐘，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液適量，用50%乙腈稀釋至與對照品溶液濃度相當(dāng)，搖勻，濾過，即得。5.測定法分別精密量取供試品溶液及對照品溶液各lOyl注入;M聯(lián)用儀，以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；以含0.1%乙酸的0.02mol/L乙酸銨溶液為流動相A,曱醇為流動相B，乙腈為流動相C,按表l梯度洗脫程序洗脫；以電噴霧離子化源(ESI)離子化(毛細管電壓5.5kV，離子源溫度400。C，離子噴霧氣流速800ml/min)，釆用正離子方式，全掃描一、二級質(zhì)譜，掃描范圍50~600amu;記錄液相色譜圖和一、二級質(zhì)i普圖。6.結(jié)果判斷采用比較供試品與對照品的色譜圖、一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)i普圖的方法進行定性分析，確定供試品中添加的化學(xué)成分。在沒有對照品情況下，若供試品質(zhì)鐠圖中出現(xiàn)表5中相應(yīng)的準分子離子峰及三個以上二級質(zhì)語特征碎片離子時，確定供試品中添加了化學(xué)成分。表5化學(xué)成分一級質(zhì)譜準分子離子峰二級質(zhì)譜主要碎片離子西AL那非475377、311、283、100、58豪莫西地那非489377、311、283、113、99、72、58羥基豪莫西地那非505487、377、311、283、99那莫西地那非460377、329、311、299、283、256、84石充代艾地那非505448、393、327、299、113、99紅地那非467420、396、353、325、297、127、111那紅地那非453406、353、325、297、113、97、71伐地那非489377、312、299、284、151偽伐地那非460432、377、312、299、284、151他達拉非390302、268、262、240、197、169、135氨基他達拉非391269、262、250、197、169、149、135六、添加已知化學(xué)成分同系物、衍生物或修飾物的檢測程序及思路當(dāng)用理化反應(yīng)法和近紅外光諳法快速篩查未知樣品的結(jié)果為陽性時，在采用高效液相色譜法或液質(zhì)聯(lián)用法進行確證時又發(fā)現(xiàn)該樣品中明顯添加了化學(xué)成分而該化學(xué)成分又不屬于標準中的檢測對象時，有可能是該樣品中添加了已知化學(xué)成分的同系物、衍生物或修飾物，應(yīng)該對該化學(xué)成分進一步詳細分析。因為理化反應(yīng)和近紅外光諳是針對PDE5型抑制劑中某種官能團或某類典型結(jié)構(gòu)的通用型篩查方法。本發(fā)明對未知化學(xué)成分的檢測思路和方法為利用高效液相色諳-二極管陣列檢測器和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)對化學(xué)成分進行分類，采用紫外吸收光譜特征和二級質(zhì)譜特征檢測已知添加化學(xué)成分的同系物、衍生物和改造物。本發(fā)明在上述十一種PDEs型抑制劑的基礎(chǔ)上，查閱了大量國內(nèi)外文獻報道的PDE5型抑制劑的紫外吸收光譜和二級質(zhì)譜特征，將已知PDEs型抑制劑歸納總結(jié)分為西地那非類、紅地那非類、硫代那非類、伐地那非類、他達拉非類等類。西地那非類包括西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、那莫西地那非、艾地那非(Aildenafil)、偽西地那非(Piperidinosildenafil)19等；硫代那非類包括硫代艾地那非、硫代西地那非(Thiosildenafil)、硫代豪莫西地那非(Thiohomosildenafil)等；紅地那非類包括紅地那非類、那紅地那非、羥基紅地那非(Hydroxyacetildenafil)、偽紅地那非(Piperidinoacetildenafil)等；伐地那非包括伐地那非、偽伐地那非等；他達拉非類包括他達拉非、氨基他達拉非等。各類PDE5型抑制劑的通用化學(xué)結(jié)構(gòu)式見表6，紫外吸收光諳和二級質(zhì)i普特征見表7。表6~分類名稱通用結(jié)構(gòu)式西地那非類紅地那非類碌u代那非類伐地那非類4也達拉非類表7<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如果檢測出的未知化學(xué)成分符合表6的紫外吸收光諳和二級質(zhì)諳碎片離子特征，那么就極有可能是PDEs型抑制劑的同系物、衍生物或修飾物，需要將化學(xué)成分從樣品中提取、純化，用核磁共振、紅外光i瞽、高分辨質(zhì)i瞽、元素分析等分析手段解析其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并盡快將其納入標準檢測的范疇。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。權(quán)利要求1、一種藥品、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的快速檢測系統(tǒng)，其特征在于，包括所述添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫、初篩設(shè)備或試劑盒、確證儀器和液質(zhì)聯(lián)用儀，所述初篩設(shè)備或試劑盒能對所述添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫進行初步篩查，所述確證儀器能對初步篩查結(jié)果進一步確證，所述液質(zhì)聯(lián)用儀能對檢測結(jié)果進行仲裁。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述初篩設(shè)備包括近紅外光譜設(shè)備，所述初篩試劑盒包括藥品、保健食品和食品中添加的PDEs型抑制劑的理化反應(yīng)快速檢測試劑盒。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述的藥品、保健食品和食品中添加的PDEs型抑制劑的理化反應(yīng)快速檢測試劑盒包括重量百分比濃度為1-20%的硫酸溶液、0.01-0.2mol/L高錳酸鉀溶液、三硝基苯酚飽和溶液、提取溶劑和顯色劑，所述提取溶劑包括曱醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯或丙酮，所述顯色劑包括稀石克酸、高氯酸、鹽酸或硝酸。4、一種藥品、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的快速檢測方法，其特征在于，建立所述添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫，運用快速篩查方法對所述添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫進行初步篩查，再進一步確證，最后用液質(zhì)聯(lián)用法進行仲裁。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測方法，其特征在于，所述快速篩查方法包括理化反應(yīng)檢測方法、薄層色語、近紅外光傳、拉曼光語或免疫分析。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測方法，其特征在于，所述理化反應(yīng)檢測方法包括如下步驟(1)取固態(tài)的藥品、保健食品或食品，加重量百分比濃度為3%的硫酸溶液8ml，或取液態(tài)的藥品、保健食品或食品，加重量百分比濃度為3%^克酸溶液6ml，振搖2分鐘使溶散，靜置片刻，過濾，收集續(xù)濾液；(2)取步驟(1)得到的續(xù)濾液2ml，滴加0.04mol/L高錳酸鉀溶液，邊滴加邊振搖，至溶液出現(xiàn)的紫紅色在15秒內(nèi)不褪色，靜置片刻，待紫紅色褪去至無色或淺棕色；(3)向步驟(2)得到的溶液中滴加三硝基苯酚飽和溶液4~5滴，保持滴加時和滴完后試管未被振搖，觀察是否產(chǎn)生黃色渾濁；若3分鐘內(nèi)出現(xiàn)黃色渾濁，靜置后形成黃色沉淀物，即判斷樣品中含那非類PDEs型抑制劑。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測方法，其特征在于，所述理化反應(yīng)檢測方法包括如下步驟(1)取固態(tài)或液態(tài)的藥品、保健食品或食品，加提取溶劑l~20ml，振搖1~2分鐘，靜置110分鐘，取上清液；(2)顯色反應(yīng)使所述步驟(1)的上清液12滴與0.5~10ml的顯色劑反應(yīng)，觀察是否產(chǎn)生紫色；若2分鐘內(nèi)溶液顯紫色，則初步判斷含拉非類化學(xué)成分。8、根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測方法，其特征在于，所述確證方法采用高效液相色i普法或液質(zhì)聯(lián)用法。9、根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測方法，其特征在于，所述仲裁方法采用M聯(lián)用法。10、根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測方法，其特征在于，當(dāng)所述添加化學(xué)成分為未知化學(xué)成分時，將所述化學(xué)成分按照化學(xué)結(jié)構(gòu)進行分類，利用高效液相色鐠-二極管陣列檢測器和高效液相色謙-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，采用紫外吸收光語特征和二級質(zhì)鐠特征檢測已知添加化學(xué)成分的同系物、衍生物和改造物。全文摘要本發(fā)明公開了一種藥品、保健食品和食品中添加化學(xué)成分的快速檢測系統(tǒng)及檢測方法，該檢測系統(tǒng)包括所述添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫、初篩設(shè)備或試劑盒、確證儀器和液質(zhì)聯(lián)用儀。建立添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫，運用快速篩查方法對添加化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫進行初步篩查，再進一步確證，最后用液質(zhì)聯(lián)用法進行仲裁。本發(fā)明實現(xiàn)了對中成藥、保健食品和食品中非法添加化學(xué)成分的有效監(jiān)管，解決了監(jiān)管資源不足的難題，全面提升中成藥、保健食品和食品非法添加檢測的能力和水平，為依法監(jiān)管提供強有力的技術(shù)支撐，給售制假藥的不法分子形成巨大的威懾，對保證人民群眾的飲食用藥的安全有效和維護中藥聲譽具有非常重要的意義。文檔編號G01N30/02GK101592613SQ20091004085公開日2009年12月2日申請日期2009年7月6日優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日發(fā)明者李延志,楊德忠,林生文,羅卓雅,毅雷,魏嘉陵申請人:廣東省藥品檢驗所