專利名稱：一種活性小分子核素探針平臺(tái)及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種活性小分子核素探針平臺(tái)及其在生 物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞分化增殖是生物醫(yī)學(xué)關(guān)鍵點(diǎn)之一。人體各種細(xì)胞的分化增殖、更新(以補(bǔ)償 細(xì)胞凋亡中損失的細(xì)胞)及凋亡與許多疾病有重要關(guān)系，人的一生就是全身各種細(xì)胞生 長(zhǎng)、更新、衰老、死亡的過(guò)程。特別是今天中國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，衰老、亞健康狀態(tài)、惡性增殖 性疾病(如腫瘤)、慢性退行性疾病(如老年呆癡癥、骨質(zhì)疏松癥、II型糖尿病的胰島β-細(xì) 胞凋亡)的研究、及治療(促進(jìn)再生或預(yù)防凋亡)，都與研究人體各種細(xì)胞分化增殖、增殖動(dòng) 力學(xué)有關(guān)。生物醫(yī)學(xué)界近年較注重細(xì)胞凋亡，但在細(xì)胞凋亡的另一面則是細(xì)胞分化、增殖、 更新，同樣與再生醫(yī)學(xué)、抗衰老醫(yī)學(xué)、重大復(fù)雜疾病的防治密切相關(guān)。長(zhǎng)期以來(lái)，只能從病理切片上靜止地觀察細(xì)胞增殖(采用免疫組織化學(xué)、 熒光標(biāo)記技術(shù))，或者體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)，這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi) 真實(shí)性相比，有極大差異和滯后性。目前世界上常用的兩種動(dòng)物活體內(nèi)標(biāo)記方法: (l)3H-thymidine (3H-dT)標(biāo)記法具有放射性；(2) Bromodeoxyuridine (BrdU)標(biāo)記法具有生 物毒性(在活體內(nèi)標(biāo)記DNA后會(huì)導(dǎo)致基因突變、骨髓抑制、殺死敏感細(xì)胞、具有致癌性)。 上述兩種標(biāo)記方法均不能用于人體活體標(biāo)記研究。無(wú)法獲得人體細(xì)胞增殖、增殖動(dòng)力曲 線(Nakaguchi T，Usui T，Yamada H,etal. Acute, subacute and chronic toxicities of 5-bromo-2-deoxyuridine in mice and rats. Chemical Abstracts 1971 ；76 :108022s. National Institutes of Health. 5-Bromo-2-Deoxyuridine Safety Data Sheet. Bethesda， MD :Division of Safety, Environmental Control and Research Program， NIH，USA, 1988)。同時(shí)，由于受到生物毒性的影響，用于長(zhǎng)期(1周以上)動(dòng)物標(biāo)記、檢測(cè)緩 慢增殖細(xì)胞時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果常常有很大爭(zhēng)議，實(shí)驗(yàn)證明=BrdU明顯抑制某些緩慢代謝 細(xì)胞增殖(Jecker P, Beuleke A, Dressendorfer I, et al. Long-term oral application of5-bromo-2-deoxyuridine does not reliably label proliferating immune cells in theLEff rat. J Histochem Cytochem. 1997 Mar ；45 (3) :393_401)。而人體內(nèi)許多細(xì)胞(如 胰島細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞)的分化、增殖或細(xì)胞凋亡又是十分緩慢的(Teta M,LongSY,Wartschow LM,et al. Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice. Diabetes. 2005 Sep ； 54(9) :2557-67)。另外兩種替代標(biāo)記方法PNCA(proliferationcell nuclear antigen)和 Ki-67法只可短期標(biāo)記于細(xì)胞分化S期，但當(dāng)分化后的細(xì)胞進(jìn)入G期，標(biāo)記即喪失。不能反 映真實(shí)狀況(Lohr F，Wenz FiHaas S, et al. Comparison of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) staining andBrdUrd-label1ing index under different proliferative conditions in vitro by flowcytometry.Cell Prolif. 1995Feb ；28 (2) :93_104· Mengel M，von Wasielewski R，WieseB, et al. Inter-laboratory and inter-observer reproducibility of immunohistochemicalassessment of the Ki_671abelling indexin a large multi-centre trial. J Pathol. 2002Nov ； 198 (3) :292_9)。同時(shí)這些標(biāo)記法 最后是用免疫組織化學(xué)方法來(lái)分析結(jié)果，需檢查大量的標(biāo)本切片來(lái)對(duì)比，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，低效。 Gillett CE等分析170個(gè)實(shí)驗(yàn)室、30種不同組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)方法常導(dǎo)致很高 批內(nèi)、批間變異系數(shù)，無(wú)法對(duì)比。亦無(wú)法用于新藥研發(fā)中大量候選藥物篩選(Gillett CE, Barnes DM, Camplejohn RS. Comparison of three cell cycle associated antigens as markers ofproliferative activity and prognosis in breast carcinoma. J Clin Pathol. 1993Dec ；46 (12) :1126_8)。另外兩種動(dòng)物活體標(biāo)記技術(shù)如活體生物發(fā)光成影技術(shù) (用熒光素酶基因克隆標(biāo)記動(dòng)物)和PET技術(shù)(使用發(fā)射正電子核同位素活體標(biāo)記，主要用 于臨床診斷)，均為瞬間標(biāo)記技術(shù)，且前者需基因克隆，不能用于人體；后者則不能鑒別細(xì) 胞的增殖，增殖動(dòng)力曲線情況。目前研究絕大多數(shù)研究又僅僅于動(dòng)物，用從動(dòng)物模型數(shù)據(jù)解釋人體。因?yàn)槿狈Π?全、有效的標(biāo)記物和測(cè)量手段，長(zhǎng)期以來(lái)，在活體狀態(tài)，人體內(nèi)多數(shù)細(xì)胞分化、增殖、更新及 增殖動(dòng)力曲線是用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為替代，缺乏人體真實(shí)數(shù)據(jù)。但事實(shí)證明動(dòng)物模型數(shù)據(jù) 解釋人體有相當(dāng)局限性，特別在新藥的研究中，許多在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功的藥物在人體實(shí)驗(yàn)中 失敗，也證明了人體內(nèi)生理、病理機(jī)制與動(dòng)物有巨大的差異。此外，近20年來(lái)，整個(gè)生物界注重于細(xì)胞和分子水平的研究。但是由于人體是以 一個(gè)整體來(lái)完成某一生理功能、或進(jìn)行某一病理過(guò)程，包括細(xì)胞分化增殖。最新數(shù)據(jù)也證明 細(xì)胞內(nèi)各種因子(功能基因、RNA、蛋白及小肽)相互作用，相互影響。在每一瞬間，體內(nèi)有 幾千個(gè)蛋白合成，同時(shí)又有幾千個(gè)蛋白降解。因此單個(gè)基因或蛋白功能不能解釋整體水平 細(xì)胞增殖復(fù)雜機(jī)理。所以，在目前已有大量的體外單基因、單個(gè)生物因子實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上， 迫切需要開(kāi)展整體水平細(xì)胞生物學(xué)研究。近年來(lái)功能基因組、功能蛋白組、功能代謝組及系 統(tǒng)生物學(xué)研究已成為國(guó)際生物學(xué)研究前沿。再者，在中醫(yī)藥研究中，由于中醫(yī)整體觀點(diǎn)、中 藥復(fù)方組成、多靶點(diǎn)作用，特別需要一種可以進(jìn)行人活體、中醫(yī)藥整體研究細(xì)胞增殖技術(shù)平 臺(tái)。綜上所述，對(duì)于活體、特別是人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖領(lǐng)域，長(zhǎng)期缺乏有效地標(biāo)記、動(dòng) 態(tài)跟蹤細(xì)胞分化增殖、及增殖動(dòng)力學(xué)方法。因此，本領(lǐng)域迫切需要研發(fā)相關(guān)技術(shù)平臺(tái)，用于 腫瘤、衰老、干細(xì)胞、再生醫(yī)學(xué)等重大課題。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于提供一種活性小分子核素探針平臺(tái)，用于 標(biāo)記、檢測(cè)活體動(dòng)物及人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖、線粒體DNA修復(fù)合成、及相關(guān)糖和蛋白代謝， 本發(fā)明的小分子核素探針平臺(tái)使用穩(wěn)定且對(duì)人體無(wú)害的核素氘(2H)標(biāo)記活體動(dòng)物或人體， 檢測(cè)核素氘(2H)原子在細(xì)胞核DNA及線粒體DNA的豐度，結(jié)合其電腦軟件系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè) 活體動(dòng)物及人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖，及相關(guān)糖、蛋白代謝的目的。為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，一方面，本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中提供了一種活性小分 子核素探針平臺(tái)，用于檢測(cè)生物及人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖、及相關(guān)糖、蛋白代謝，其包括(1)活性小分子核素探針，采用穩(wěn)定核素氘(2H)標(biāo)記細(xì)胞；(2) DNA的提取和純化試劑；(3)酶-化學(xué)水解衍生試劑；
(4)分析儀器，用于檢測(cè)活性小分子核素探針中核素氘(2H)原子在被標(biāo)記物中的 豐度，所述分析儀器包括高效液相分析儀和氣相_(激光)/質(zhì)譜聯(lián)動(dòng)裝置，其中氣相_(激 光)/質(zhì)譜聯(lián)動(dòng)裝置由自動(dòng)加樣器、20-m DB-17柱、氣瓶、激光發(fā)生器、質(zhì)譜儀、電腦組成；(5)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，使用獲取的檢測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)合相應(yīng)軟件可計(jì)算細(xì)胞增殖率或線粒 體DNA合成率以及相關(guān)糖、蛋白的代謝率優(yōu)選地，所述活性小分子核素探針是重水(2H2O)、重水(2H2O)和13C-葡萄糖的組合 劑，或者重水(2H2O)和13C-賴氨酸的組合劑。作為上述方案的一種優(yōu)選實(shí)施方式，在本發(fā)明的是實(shí)施方式中具體給出了采用活 性小分子重水探針(2H2O)作為標(biāo)記物，研究生物及人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖的活性小分子核素 探針平臺(tái)，該探針平臺(tái)還包括以下技術(shù)特征的部分或者全部所述活性小分子核素探針為重水探針(2H2O),用于標(biāo)記細(xì)胞核DNA或線粒體DNA ；所述被標(biāo)記物的提取試劑為DNA抽提試劑，抽提后的被標(biāo)記DNA采用核酸純化柱 純化；所述分析儀器用于檢測(cè)核素氘2H原子在DNA上的結(jié)合豐度；所述數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)使用分析儀器獲取的核素2H原子在DNA上的結(jié)合豐度數(shù)據(jù)，結(jié) 合其電腦軟件系統(tǒng)計(jì)算出細(xì)胞增殖率或線粒體DNA合成率。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述DNA抽提試劑是由3% -8%的聚乙二醇和 lmol/L的氯化鈉配制而成的濃縮液和DNA提取液組成； 所述核酸純化柱為L(zhǎng)C18SPE柱；所述酶-化學(xué)水解衍生試劑主要由DNA水解酶、98%冰醋酸、15%乙酸酐、2%甲基 咪唑、二氯甲烷組成。相應(yīng)地，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述高效液相分析儀采用日本島津公 司的高效液相分析儀系列。而所述的氣相_(激光)/質(zhì)譜聯(lián)動(dòng)裝置聯(lián)動(dòng)裝置(the positive chemical ionization GC-MS with a model 5973mass spectrometerand model 6890gas chromatograph，美國(guó)Agilent公司)，由自動(dòng)加樣器、20-mDB_17柱、氣瓶、激光發(fā)生器、質(zhì)譜 儀、電腦組成。相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)由以微軟2003服務(wù) 器和甲骨文數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)的電腦軟件系統(tǒng)組成。另一方面，本發(fā)明的具體實(shí)施方式
還給出了本發(fā)明的活性小分子核素探針平臺(tái)， 在生物醫(yī)學(xué)研究、新藥及中藥篩選研發(fā)、農(nóng)牧業(yè)良種篩選培育中的運(yùn)用。其中，在生物醫(yī)學(xué)研究中的運(yùn)用包括對(duì)惡性腫瘤的檢測(cè)和對(duì)骨質(zhì)疏松、老年呆癡 及糖尿病的研究。為了詳實(shí)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，需要對(duì)本發(fā)明的原理進(jìn)行相應(yīng)的闡述，在采用 活性小分子重水探針(2H2O)作為標(biāo)記物，研究生物及人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖的活性小分子核 素探針平臺(tái)中，所用的標(biāo)記物活性小分子重水探針(2H2O)中包含氘(2H,亦稱重氫)，它是一 種核素，為氫的同位素，一個(gè)重水分子(2H2O)內(nèi)含2個(gè)氘原子(2H2)。因細(xì)胞內(nèi)外水分子存 在動(dòng)態(tài)交換平衡，所以重水分子(2H2O)可以作為外源性標(biāo)記物與細(xì)胞外水分子同時(shí)進(jìn)入細(xì) 胞內(nèi)。另外，由于細(xì)胞核內(nèi)DNA新鏈合成是細(xì)胞分化增殖標(biāo)記，在細(xì)胞分裂的S期，當(dāng)DNA 新鏈開(kāi)始合成時(shí)，原子2H可取代細(xì)胞內(nèi)水分子的氫原子H，摻合于DNA的新鏈中脫氧核糖嘧啶環(huán)的C-H鍵上(如圖1-3所示)，在圖1和圖2中，GNG 糖異生，DNNS 從頭核苷酸合成途 徑，PPP 磷酸核糖焦磷酸酯；在圖3中，每一條矩形框代表染色體中的一條DNA鏈，有背影 斜紋的矩形框代表被標(biāo)記了的DNA鏈，白色矩形框代表沒(méi)有標(biāo)記的DNA鏈，這是經(jīng)過(guò)兩次細(xì) 胞分裂或克隆擴(kuò)增的示意圖。在第一輪擴(kuò)增31后，有一半的DNA單鏈被標(biāo)記，而第二輪擴(kuò) 增32后6/8的DNA鏈被標(biāo)記。且氘原子2H摻合的量與DNA新鏈合成量成正比，因此即可用于標(biāo)記、示蹤細(xì)胞增 殖。采用氣相_ (激光)/質(zhì)譜聯(lián)動(dòng)裝置，檢測(cè)氘原子2H在標(biāo)記細(xì)胞核DNA上的豐度，再通過(guò) 相關(guān)的軟件可以計(jì)算出增殖的細(xì)胞率。如圖4和圖5，通過(guò)比較本發(fā)明的2H標(biāo)記法和BrdU 標(biāo)記法，圖4為采用2H標(biāo)記測(cè)出的細(xì)胞增殖率，圖5顯示的是本發(fā)明氘原子2H標(biāo)記后靶細(xì) 胞增殖率與BrdU標(biāo)記法相關(guān)系數(shù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)也證明該技術(shù)與常用的BrdU細(xì)胞增殖標(biāo)記法 結(jié)果具有98. 6%正相關(guān)?？梢跃_(2，000—10, 000個(gè)細(xì)胞)，高通量(30-200只動(dòng)物或人 體/次)、檢測(cè)活體內(nèi)相應(yīng)靶細(xì)胞的DNA合成的速率，即可計(jì)算出相應(yīng)靶細(xì)胞增殖、增殖動(dòng)力 代謝曲線。另外，從安全性上來(lái)分析，小分子重水是一種天然物質(zhì)，沒(méi)有放射性、亦無(wú)生物毒 性，(自然飲用水即含有萬(wàn)分之二的重水)，小分子重水(2H2O)用于人活體標(biāo)記、檢測(cè)，已有 50年的發(fā)展歷史，以前主要是用于水代謝的研究。在動(dòng)物體內(nèi)，2H2O標(biāo)記濃度為3%左右， 在人體內(nèi)，2H2O標(biāo)記濃度為1. 5 2%，在此范圍內(nèi)，對(duì)人體和動(dòng)物都是安全的，這個(gè)2H2O濃 度是國(guó)際科學(xué)界在研究人體水代謝中長(zhǎng)久使用，并經(jīng)長(zhǎng)期觀察無(wú)毒性，亦得到美國(guó)食品和 藥品管理局(FDA)的批準(zhǔn)。此外，根據(jù)上述分析原理和方法的闡述，本發(fā)明的活性小分子核素探針平臺(tái)還可 以用于其他擴(kuò)展研究在該平臺(tái)上如結(jié)合外源性13C-葡萄糖雙重標(biāo)記，可用于糖代謝研究。 如結(jié)合外源性必需氨基酸標(biāo)記，如13C-賴氨酸雙重標(biāo)記，可用于蛋白質(zhì)合成代謝研究。從以上分析可以看出本發(fā)明的活性小分子核素探針平臺(tái)是細(xì)胞水平上的原位、動(dòng) 態(tài)的標(biāo)記和活性示蹤新技術(shù)，也是目前世界上唯一可安全用于人體動(dòng)態(tài)標(biāo)記、檢測(cè)細(xì)胞分 化增殖核素探針平臺(tái)，較目前其他技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢(shì)。


圖1是本發(fā)明中將重水中的2H引入靶細(xì)胞合成DNA的流程圖；圖2是本發(fā)明中將重水中的2H引入靶細(xì)胞DNA的脫氧核糖部分C-H鍵的代謝通 路；圖3是本發(fā)明中2H標(biāo)記后靶細(xì)胞DNA的半保留復(fù)制示意圖；圖4是本發(fā)明中采用2H標(biāo)記測(cè)出細(xì)胞增殖率；圖5是本發(fā)明2H標(biāo)記后靶細(xì)胞增殖率與BrdU標(biāo)記法相關(guān)系數(shù)；圖6是本發(fā)明中采用2H標(biāo)記測(cè)出胰腺切除術(shù)(Px)與對(duì)照組(sham)在胰島細(xì)胞 增殖的影響；圖7是本發(fā)明中采用2H標(biāo)記測(cè)出藥物對(duì)胰島細(xì)胞增殖作用，其中Sham對(duì)照組，Px 胰腺切除術(shù)，CCK促胰液分泌素；圖8本發(fā)明中采用2H標(biāo)記測(cè)出年齡對(duì)胰島細(xì)胞增殖影響；圖9本發(fā)明中采用2H標(biāo)記測(cè)出年齡對(duì)腎細(xì)胞增殖的影響；
圖10本發(fā)明中采用2H標(biāo)記測(cè)出年齡對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。本發(fā)明實(shí)施方式中所公開(kāi)的一 種活性小分子核素探針平臺(tái)，包括(1)活性小分子核素探針，采用穩(wěn)定核素標(biāo)記被標(biāo)記物，所述被標(biāo)記物包括DNA、 糖類和蛋白質(zhì)；(2)被標(biāo)記物的提取和純化試劑；(3)酶-化學(xué)水解衍生試劑；(4)分析儀器，用于檢測(cè)活性小分子核素探針中核素原子在被標(biāo)記物中的豐度，所 述分析儀器包括高效液相分析儀和氣相_(激光)/質(zhì)譜聯(lián)動(dòng)裝置，其中氣相_(激光)/質(zhì) 譜聯(lián)動(dòng)裝置由自動(dòng)加樣器、20-m DB-17柱、氣瓶、激光發(fā)生器、質(zhì)譜儀、電腦組成；(5)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，使用獲取的檢測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)合相應(yīng)軟件可計(jì)算細(xì)胞增殖率或線粒 體DNA合成率以及相關(guān)糖、蛋白的代謝率。其中，在研究生物及人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖、及相關(guān)糖、蛋白代謝時(shí)，所要用到的活 性小分子核素探針是重水(2H2O)、重水(2H2O)和13C-葡萄糖的組合劑，或者重水(2H2O)和 13C-賴氨酸的組合劑。以下就以采用活性小分子重水探針(2H2O)作為標(biāo)記物，研究生物及 人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖為例，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，具體如下1、標(biāo)記物活性小分子重水(2H2O),為增加活性，可磁化或微波化。在動(dòng)物體內(nèi)， 2H2O體水豐度為3%左右，在人體內(nèi)，2H2O體水豐度為1. 5 2%，在此范圍內(nèi)，對(duì)人體和動(dòng)物 都是安全的，這個(gè)2H2O濃度是國(guó)際科學(xué)界在研究生物水代謝中長(zhǎng)久使用，并經(jīng)長(zhǎng)期觀察無(wú) 毒性，亦得到美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)的批準(zhǔn)。2、標(biāo)記對(duì)象培養(yǎng)細(xì)胞組織、或活體動(dòng)物、或活體人、或植物；。標(biāo)記對(duì)象處于病理 狀態(tài)、或在某一藥物處理下。以研究某一病理過(guò)程中或某一藥物作用下，某種細(xì)胞分化、增 殖或凋亡的速率。在人體研究中，則選擇臨床病人志愿者。對(duì)照組采用正常生理對(duì)照組、 或非藥物處理組、或藥物治療前后對(duì)比。統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)。P <0.05作為陽(yáng)性。3、標(biāo)記途經(jīng)或口服、或腹腔注射、或靜脈注射、或添加于培養(yǎng)液的方式。4、在腫瘤檢測(cè)中，標(biāo)記待檢腫瘤病人，收集相應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞分化增殖，與正常 人群對(duì)照。衰老、亞健康狀態(tài)篩選診斷中，標(biāo)記待檢病人，收集相應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞分化增殖 及線粒體DNA合成，與正常人群對(duì)照，在新藥、中藥篩選中，給予標(biāo)記動(dòng)物或人刺激細(xì)胞分 化、增殖的藥物、或預(yù)防細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物。然后進(jìn)行標(biāo)記如上文，根據(jù)研究的設(shè)計(jì)、細(xì)胞 特性、藥物作用的靶點(diǎn)等不同，觀察藥物對(duì)特定某種細(xì)胞分化、增殖或凋亡的作用5、細(xì)胞樣品獲得在不同標(biāo)記時(shí)間點(diǎn)，采用處死動(dòng)物、或活體穿刺組織(對(duì)動(dòng)物 或人體)，或抽取2-20ml外周血，或在手術(shù)治療病人時(shí)、切除病變組織時(shí)，取得5mg相應(yīng)組 織，然后針對(duì)不同細(xì)胞，采用不同分離手段獲得純凈細(xì)胞作為待測(cè)樣品，(特定純凈細(xì)胞 分離可參考相關(guān)文獻(xiàn)，例如對(duì)于人體免疫細(xì)胞分離，采用流式細(xì)胞儀(multi-parameter fluorescence-activated cell sorting、FACS方法)。而在糖尿病研究中，為取得胰島細(xì) 胞，可采用膠原酶消化、Fiocll梯度離心分離法等)。獲得細(xì)胞后，為了確定是否獲得相應(yīng) 純凈細(xì)胞，可采用相應(yīng)組織化學(xué)染色技術(shù)對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。亦可用激光微刻技術(shù)取得樣品。6、細(xì)胞GC/MS樣品獲得待測(cè)純凈細(xì)胞后，提取細(xì)胞核中DNA 根據(jù)DNA試劑合指 導(dǎo)提取DNA。取1-5微克DNA量，采用酶一化學(xué)水解法切斷DNA鏈，并經(jīng)LC18SPE柱、高效 液相分析儀純化，獲得DNA鏈上標(biāo)記脫氧核糖，再次化學(xué)水解、衍生，制成GC/MS樣品。7、樣品的檢測(cè)在氣相(GC)_(激光)/質(zhì)譜(MS)聯(lián)動(dòng)儀上(the positivechemical ionization GC-MS with a model 5973mass spectrometer and model 6890gas chromatograph, Agilent 公司)，自動(dòng)加樣器，20_m DB-17 柱，250-275 波長(zhǎng)，即可 測(cè)得樣品H2的豐度，該豐度量與DNA合成量成正比直線關(guān)系，進(jìn)而可以計(jì)算新分化的細(xì)胞 量。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，含10，000個(gè)細(xì)胞的樣品即可獲得穩(wěn)定可靠的細(xì)胞更新結(jié)果。8、數(shù)據(jù)計(jì)算利用甲骨文數(shù)據(jù)庫(kù)電腦軟件，計(jì)算出細(xì)胞增殖及增殖動(dòng)力曲線。也可 反向計(jì)算細(xì)胞凋亡。同時(shí)與正常值對(duì)比，即可獲得待測(cè)細(xì)胞增殖、更新結(jié)果。同理，測(cè)得樣 品13C的豐度。獲得相關(guān)糖、蛋白代謝率。以下是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，結(jié)合上述詳細(xì)說(shuō)明，各實(shí)施例就本發(fā)明在生物醫(yī)學(xué) 研究、中藥新藥篩選研發(fā)及農(nóng)牧業(yè)良種篩選培育中的運(yùn)用詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明的活性小分子核素探針平臺(tái)在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的運(yùn)用本探針平臺(tái)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，活體動(dòng)物、或人體重水標(biāo)記，采用如上述詳細(xì)說(shuō)明 中給出的方法，分析相應(yīng)細(xì)胞的增殖率，可以獲得在生理狀態(tài)或疾病狀態(tài)下、活體動(dòng)物或人 體的大量真實(shí)可靠的整體水平細(xì)胞分化增殖、增殖動(dòng)力學(xué)的最終結(jié)果；及糖代謝，用于代謝 病研究、某些蛋白代謝，用于蛋白抗體研究。比如利用惡性腫瘤細(xì)胞，特別是來(lái)源于上皮細(xì)胞位于泌尿道、呼吸道、消化道的癌 瘤具有快速增生、易于脫落的特征。本試劑盒探針標(biāo)記人體，分析相應(yīng)細(xì)胞的增殖率，可對(duì) 惡性腫瘤研究。在對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型或病人進(jìn)行標(biāo)記，可獲得骨皮質(zhì)細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)數(shù) 據(jù)。而對(duì)老年呆癡動(dòng)物模型或病人進(jìn)行標(biāo)記，可獲得相應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。而對(duì) 糖尿病動(dòng)物模型或病人進(jìn)行標(biāo)記，可獲得相應(yīng)關(guān)鍵胰島細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，如圖6所示， 采用氘(2H)標(biāo)記測(cè)出胰腺切除術(shù)(Px)與對(duì)照組(sham)在胰島細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)比較 正常情況與胰腺切除術(shù)(Px)的胰島細(xì)胞增殖，從而研究胰腺切除術(shù)(Px)對(duì)胰島細(xì)胞增殖 的影響。實(shí)施例2本發(fā)明的活性小分子核素探針平臺(tái)在研究亞健康_衰老中的運(yùn)用線粒體DNA是細(xì)胞核外唯一的遺傳物質(zhì)，與核DNA共同編碼線粒體蛋白，衰老時(shí) 線粒體DNA突變?cè)黾?，修?fù)合成減少，致使線粒體功能下降，進(jìn)而導(dǎo)致全身性生理功能的降 低，是衰老的重要原因，運(yùn)動(dòng)或某些保健品可增加線粒體DNA修復(fù)合成，減少DNA突變，提 高老年人有氧能力，延緩衰老進(jìn)程。因此，檢測(cè)線粒DNA修復(fù)合成是一項(xiàng)敏感的衰老、亞 健康狀況篩選，診斷及臨床治療效果判斷指標(biāo)，如圖8、9、10所示，分別通過(guò)比較不同周齡 (week-old)的胰細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況，從而研究細(xì)胞或者生物體在不同的 生長(zhǎng)時(shí)期的衰老情況。本探針平臺(tái)標(biāo)記人體后，從全血中分離純化總DNA(包括未成熟紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、 血小板細(xì)胞核DNA，線粒體DNA)及線粒體DNA，采用如上述詳細(xì)說(shuō)明中的方法分析相應(yīng)細(xì)胞的增殖率，線粒體DNA合成率，方法簡(jiǎn)便、易行、且敏感。并可用于抗衰老、抗亞健康保健品 篩選研發(fā)。實(shí)施例3本發(fā)明的活性小分子核素探針平臺(tái)用于新藥的研發(fā)本探針平臺(tái)用于新藥的研發(fā)實(shí)用領(lǐng)域，可以快速、高通量篩選出在人體內(nèi)真正有 效的促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖的新藥?；虬l(fā)現(xiàn)老藥新用。并同時(shí)節(jié)約大量研究經(jīng)費(fèi)。特別在多 藥物、多靶標(biāo)綜合治療復(fù)雜疾病如腫瘤、艾滋病、糖尿病的藥物篩選。方法給予動(dòng)物、或人待篩選的藥物、化合物或生物活性物(小肽、蛋白因子等)， 并同時(shí)進(jìn)行本探針平臺(tái)標(biāo)記活體動(dòng)物或人體，采用如上述詳細(xì)說(shuō)明中的方法，分析相應(yīng)細(xì) 胞的增殖率，可獲得待篩選的藥物、化合物或生物活性物(小肽、蛋白因子等)刺激或抑制 細(xì)胞增殖的作用，指導(dǎo)篩選新的藥物或藥物組合，發(fā)現(xiàn)新藥。如圖7所示，可以采用2H標(biāo)記 測(cè)出藥物對(duì)胰島細(xì)胞增殖作用，從而篩選出在人體內(nèi)真正有效的促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖的新 藥，其中Sham對(duì)照組，Px胰腺切除術(shù)，CCK促胰液分泌素，從圖中可以看出CCK促胰液分泌 素能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。實(shí)施例4本發(fā)明的活性小分子核素探針平臺(tái)在中醫(yī)、中藥研究中的運(yùn)用本探針平臺(tái)亦可用于闡明中醫(yī)整體理論的代謝通路，中藥復(fù)方的作用位點(diǎn)，篩選 新的中藥復(fù)方。方法本探針平臺(tái)探針標(biāo)記活體動(dòng)物、或人體，給予待篩選的單味中藥、中藥 組方、中藥提取物，采用如上述詳細(xì)說(shuō)明中的方法，分析相應(yīng)細(xì)胞的增殖率，可獲得待篩選 的單味中藥、中藥組方、中藥提取物化合物刺激或抑制細(xì)胞增殖的作用。指導(dǎo)篩選新的中藥 物或中藥物組合，發(fā)現(xiàn)新中藥。實(shí)施例5本發(fā)明的活性小分子核素探針平臺(tái)用于干細(xì)胞篩選及再生醫(yī)學(xué)的研究本探針平臺(tái)亦可用于篩選干細(xì)胞、用于再生醫(yī)學(xué)研究，其方法為本探針平臺(tái)標(biāo)記 活體動(dòng)物、或人體，移植待篩選的干細(xì)胞；可同時(shí)給予藥物、化合物或生物活性物，或單味中 藥、中藥組方、中藥提取物；采用如上述詳細(xì)說(shuō)明中的方法，分析相應(yīng)細(xì)胞的增殖率，可獲得 待篩選干細(xì)胞在體內(nèi)分化增殖。用于再生醫(yī)學(xué)研究。實(shí)施例6本發(fā)明的活性小分子核素探針平臺(tái)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)良種篩選、培育重水標(biāo)記植物、或動(dòng)物、或水產(chǎn)生物，采用如上述詳細(xì)說(shuō)明中的方法，分析相應(yīng)細(xì) 胞的增殖率，可以用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)良種篩選、培育。以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式而已，當(dāng)然不能以此來(lái)限定本發(fā)明之權(quán)利范 圍，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可 以做出若干改進(jìn)和變動(dòng)，這些改進(jìn)和變動(dòng)也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種活性小分子核素探針平臺(tái)，用于檢測(cè)生物及人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖、及相關(guān)糖、蛋白代謝，其特征在于包括(1)活性小分子核素探針，采用穩(wěn)定核素氘(2H)標(biāo)記細(xì)胞；(2)DNA的提取和純化試劑；(3)酶 化學(xué)水解衍生試劑；(4)分析儀器，用于檢測(cè)活性小分子核素探針中核素氘(2H)原子在被標(biāo)記物中的豐度，所述分析儀器包括高效液相分析儀和氣相 (激光)/質(zhì)譜聯(lián)動(dòng)裝置，其中氣相 (激光)/質(zhì)譜聯(lián)動(dòng)裝置由自動(dòng)加樣器、20 m DB 17柱、氣瓶、激光發(fā)生器、質(zhì)譜儀、電腦組成；(5)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，使用獲取的檢測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)合相應(yīng)軟件可計(jì)算細(xì)胞增殖率或線粒體DNA合成率以及相關(guān)糖、蛋白的代謝率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性小分子核素探針平臺(tái)，所述活性小分子核素探針是重水 (2H2O)、重水(2H2O)和13C-葡萄糖的組合劑、重水(2H2O)和13C-賴氨酸的組合劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性小分子核素探針平臺(tái)，用于檢測(cè)活體動(dòng)物及人體內(nèi)細(xì)胞 分化增殖，其特征在于所述活性小分子核素探針為重水探針(2H2O)，用于標(biāo)記細(xì)胞核DNA或線粒體DNA ；所述被標(biāo)記物的提取試劑為DNA抽提試劑，抽提后的被標(biāo)記DNA采用核酸純化柱純化；所述分析儀器用于檢測(cè)核素氘2H原子在DNA上的結(jié)合豐度；所述數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)使用分析儀器獲取的核素重氫2H原子在DNA上的結(jié)合豐度數(shù)據(jù)，結(jié) 合其電腦軟件系統(tǒng)計(jì)算出細(xì)胞增殖率或線粒體DNA合成率。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的活性小分子核素探針平臺(tái)，其特征在于所述DNA抽提試劑是由3% -8%的聚乙二醇和lmol/L的氯化鈉配制而成的濃縮液和 DNA提取液組成；所述核酸純化柱為L(zhǎng)C18SPE柱；所述酶-化學(xué)水解衍生試劑主要由DNA水解酶、98%冰醋酸、15%乙酸酐、2%甲基咪 唑、二氯甲烷組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的活性小分子核素探針平臺(tái)，其特征在于所述數(shù)據(jù)分析系統(tǒng) 由以微軟2003服務(wù)器和甲骨文數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)的電腦軟件系統(tǒng)組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性小分子核素探針平臺(tái)，其特征在于所述活性小分子核 素探針的標(biāo)記途經(jīng)包括口服、腹腔注射、靜脈注射或添加于培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性小分子核素探針平臺(tái)，在生物醫(yī)學(xué)研究、新藥及中藥篩 選研發(fā)、農(nóng)牧業(yè)良種篩選培育中的運(yùn)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的活性小分子核素探針平臺(tái)在生物醫(yī)學(xué)研究中的運(yùn)用，包括對(duì) 惡性腫瘤的檢測(cè)和對(duì)骨質(zhì)疏松、老年呆癡及糖尿病的研究。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種活性小分子核素探針平臺(tái)，用于標(biāo)記、檢測(cè)活體動(dòng)物及人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖、線粒體DNA修復(fù)合成、及相關(guān)糖和蛋白代謝，本發(fā)明的小分子核素探針平臺(tái)使用穩(wěn)定且對(duì)人體無(wú)害的核素氘(2H)標(biāo)記活體動(dòng)物或人體，檢測(cè)核素氘(2H)原子在細(xì)胞核DNA及線粒體DNA的豐度，結(jié)合其電腦軟件系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)活體動(dòng)物及人體內(nèi)細(xì)胞分化增殖，及相關(guān)糖、蛋白代謝的目的。本發(fā)明對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害、僅用微量細(xì)胞、活體動(dòng)態(tài)、高通量精確研究體內(nèi)細(xì)胞分化增殖、線粒體DNA修復(fù)合成、及相關(guān)糖、蛋白代謝?？捎糜谏镝t(yī)學(xué)研究、新藥及中藥篩選研發(fā)、農(nóng)牧業(yè)良種篩選培育等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N30/72GK101993911SQ20091004215
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
發(fā)明者陳松源 申請(qǐng)人:陳松源