專利名稱：檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的elisa試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗體的ELISA試劑盒，屬于 獸醫(yī)生物技術領域。用于豬圓環(huán)病毒2的抗體檢測，以此判斷豬群中圓環(huán)病毒 2型感染情況以及對該病的流行情況以及免疫效果進行監(jiān)測。
背景技術：
豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2， PCV2)與豬群中發(fā)生的許多疾病 密切相關，諸如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Post weaning multisystem wasting syndrome, PMWS)豬皮炎腎炎綜合癥(Porcine dermatitis and n印hropathy syndrome, PDNS)、母豬繁殖障礙、增生性腸炎、仔豬先天性震顫、 豬呼吸道病綜合征等，我們將由PCV2引起的多種病癥統(tǒng)稱為PCVD (porcine circovirus disease, PCVD)，在諸多PCVD中，以PMWS最為常見，P麗S的主要引 起豬漸進性消痩、腹瀉、呼吸道癥狀、皮膚蒼白或出現(xiàn)黃疸、生產性能降低。 PCV2除了本身引起豬病外，因侵害豬的免疫系統(tǒng)，抑制豬的免疫功能，還能與 豬藍耳病、豬流感、豬支原體肺炎、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌病等常見豬疫病 病原相互作用，加重這些病的危害。目前PCV2已經在世界范圍內廣泛傳播，給 養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。
PCV2的實驗室診斷方法主要包括病理組織學檢測、病毒的分離與鑒定、 PCR、間接免疫熒光試驗(IFA)、原位雜交(ISH)、免疫組化法(IHC)等，但這些 方法主要用于檢測病原，且對試驗條件和技術要求較高。
近年來，國內外不少科研單位建立了檢測PCV2抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)，該方法具有操作簡單、敏感性高、快速、易標準化等優(yōu)點，尤其適合于大規(guī)模血清樣品的檢測。而目前用于檢査PCV2抗體的ELISA方法主要是 間接法，該方法的缺點是血清中所含的高濃度的非特異性抗體可直接吸附到固 相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面，從而導致本底較高或者可能出現(xiàn) 假陽性的結果。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種依據(jù)
雙抗原夾心ELISA的原理而研制的檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒， 用于豬圓環(huán)病毒2型抗體的檢測。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是 一種檢測豬圓環(huán)病 毒2型抗體的ELISA試劑盒，所述試劑盒依雙抗原夾心ELISA原理研制而成， 包括
a. ELISA板條每個試劑盒包含4塊真空包裝的ELISA板，每塊板含可拆 卸的已包被檢測抗原的ELISA微孔板條，規(guī)格為8孔X 12條；該包被抗原是依 據(jù)GenBank中PCV2的基因序列(登錄號AY943819)，設計兩條引物，上游 引物為GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC ; 下游引物為 GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC:通過PCR的方法從豬PCV2基因組中擴 增不含核定位信號的C鄰基因，將其克隆到pET32-a(+)原核表達載體中，構建 pET32a-Cap重組表達載體；轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，參照Novagen公 司pET Syetem Manual表達重組Cap融合蛋白，用親和層析法純化表達的融合 蛋白制得；
b. 洗滌液10倍濃縮的pH為7. 4的含0. 5% (體積百分比)吐溫-20的 1M PBS溶液200ml;
c. IOO倍濃縮的酶標抗原500ul:將上述純化的Cap融合蛋白用豬源腸激酶酶切去掉融合部分，并再次使用親和層析柱純化獲得不含核內化信號肽的
Cap蛋白，并用超濾管將其濃縮至2.0mg/ml，并采用改良過碘酸鈉法將辣根過 氧化物酶偶聯(lián)于Cap蛋白上；
d. 酶標稀釋液pH為7.4的0. 1M PBS溶液50ml;
e. 底物顯色液50ml:稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺，用100ml無水乙醇或DMSO 溶解后，以雙蒸水定容至1000ml，配置顯色液A;稱取9.33g檸檬酸，14.6g 磷酸氫二鈉，加入0. 75%(質量體積比)過氧化氫尿素6. 4ml，調pH值到5. 0 5.4，雙蒸水定容至1000ml，配制顯色液B;顯色液A、 B等體積混合，即為顯 色劑；量取111. 2ml 18M濃硫酸稀釋定容至1000ml即用；
f. 終止液2M硫酸溶液50ml;
g. 標準PCV2陰、陽性血清各1.0ml。
上述采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶偶聯(lián)于Cap蛋白上，具體是于 5mg/ml HRP溶液中，加入0. 2ml新配的0. 1M阪104溶液，室溫下避光攪拌20 分鐘，對pH4.4的lmM醋酸鈉緩沖液4。C透析過夜，加20 u 1 0. 2M pH9. 5碳酸 鹽緩沖液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0 9.5，然后立即加入2ml待標 記的Cap蛋白至lml 0. 01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時，加0. lml 新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，4"C放置2小時，對pH7. 4的0. 15M PBS4。C透 析過夜，在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4"C放置1小時后3000rpm離 心半小時，棄上清；沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量PH7. 4 的0. 15M的PBS中，對pH7. 4的0. 15MPBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后， 10000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶標抗原。
雙抗原夾心ELISA由于具有更高的敏感性和特異性，在人醫(yī)上已廣泛使用。 與間接ELISA的主要不同之處在于用酶標抗原代替酶標抗抗體，酶標抗原不會與非特異性吸附的抗體結合，同時檢測標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其 敏感性和特異性相對高于間接法。在此基礎上，本發(fā)明將酶標抗原與待檢血清 同時加入到檢測孔中，使反應一步完成。
應用本試劑盒對豬繁殖與呼吸綜合癥病毒標準陽性血清、豬瘟病毒標準陽 性血清、偽狂犬病毒標準陽性血清、口蹄疫病毒標準陽性血清、豬細小病毒標 準陽性血清、大腸桿菌標準陽性血清進行檢測，結果均為陰性。說明本試劑盒 所用診斷抗原與其它病原抗體之間無交叉反應。
而本發(fā)明的ELISA試劑盒與西班牙INGENASA公司試劑盒比較INGENASA公司 檢測PCV2抗體的間接ELISA試劑盒(INGEZIM CIRCO IgG 11.PCV.K1)在歐美等 養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達國家被廣泛應用，是目前國際上公認的一種檢測PCV2抗體的優(yōu)質診 斷試劑盒。分別用本試劑盒與INGENASA公司檢測PCV2抗體的間接ELISA試劑盒 (INGEZIM CIRCO IgG 11.PCV.K1)檢測94份臨床送檢血清，比較其結果的一致 性，結果見表l。
表1本試劑盒與INGENASA公司試劑盒的比較試驗 INGENASA 公司本試劑盒檢測結果 PCV2試劑盒檢測
陽性陰性 陰性符合率陽性符合率總符合率
結果
陽性48頭份 43頭份 5頭份-- 89.58%
91. 49%
陰性46頭份 3頭份 43頭份93.47% —
從本發(fā)明的ELISA試劑盒與INGENASA公司試劑盒的對比試驗來看，大部 分被檢樣品中的最終判定結果一致，只有少數(shù)弱陽性血清和0D45。值接近判定標準的陰性血清的檢測結果不一致，這可能與兩種ELISA檢測系統(tǒng)所選用的診斷
抗原不同以及兩個系統(tǒng)本身的誤差有關。
另夕卜，與INGENASA公司檢測PCV2抗體的間接ELISA試劑盒相比，本發(fā)明 的ELISA試劑盒只需一步孵育，省去了酶標抗體孵育過程(30分鐘)和一個6 次的洗滌過程，從而節(jié)省了將近1個小時的檢測時間。
本發(fā)明的ELISA試劑盒與傳統(tǒng)的檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的間接ELISA方 法相比，具有相近的敏感性和更好的特異性，且操作過程更加簡單、所需檢測 時間更少。


圖1是重組Cap融合蛋白的表達及純化后電泳圖。
其中第l泳道重組表達菌裂解后沉淀；第2泳道重組表達菌裂解后 上清；第3泳道陰性對照全菌；第4泳道蛋白質標準，從上至下分別是94KD、 66KD、 45KD、 30KD、 26KD、 20KD、 14KD;第5泳道純化的重組Cap融合蛋白。 圖2是重組Cap融合蛋白的酶切及Cap蛋白的純化與濃縮后電泳圖。
其中第1泳道超濾濃縮后Cap蛋白；第2泳道酶切純化后C即蛋白； 第3泳道重組Cap融合蛋白酶切；第4泳道純化的重組Cap融合蛋白；第 5泳道:蛋白質標準，從上至下分別是97KD、 66KD、 44KD、 29KD、 22KD、 14KD。
具體實施例方式
包被抗原的制備
根據(jù)GenBank中PCV2的基因序列(登錄號AY943819)，設計兩條引物， 上有引物為GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC ; 下游引物為 GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC。通過PCR的方法從豬PCV2基因組中擴 增不含核定位信號的Cap基因，將其克隆到pET32-a(+)原核表達載體(購自Novagen公司，產品編號69015-3)中，構建pET32a-Cap重組表達載體。轉 化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，參照Novagen公司pET Syetem Manual表達重 組Cap融合蛋白，該蛋白呈可溶性表達。用親和層析法(Novagen公司His-Bind Kit ，產品編號70239-3)純化表達的融合蛋白，見圖l。 PCV2抗體檢測板的制備
用0. 05M碳酸鹽緩沖液(PH9. 6)稀釋純化的C即融合蛋白，用方陣法確 定最佳包被濃度為5 u g/ml，取可拆96孔酶標板，每孔加入100 u 1， 4。C包被 24小時后用含0.05%吐溫-20 (體積比)的PBS (pH7.4)洗滌液(PBST)洗滌 2次，用5%脫脂奶粉(質量體積比)37。C封閉1小時，用PBST充分洗滌，室 溫風干，制備抗體檢測板。
酶標抗原的制備
將純化的Cap融合蛋白用豬源腸激酶酶(購自南京金思特公司，產品編號 Z01003)切去掉融合部分，并再次使用親和層析柱純化獲得不含核內化信號肽 的Cap蛋白，并用超濾管(購自Millipore公司，濾芯10KDa，產品編號U650886) 將其濃縮至2.0mg/ml用于標記，見圖2。
采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)于Cap蛋白上。具體 過程如下于5mg/ml HRP溶液中，加入0. 2ml新配的0. 1M阪104溶液，室溫 下避光攪拌20分鐘，對lmM醋酸鈉緩沖液(PH4. 4)4。C透析過夜，加20 u 1 0. 2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0 9.5，然后立即加 入2ml待標記的Cap蛋白至lml 0. 01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2 小時，加0. lml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，4。C放置2小時，對O. 15MPBS (PH7.4) 4"C透析過夜，在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4"C放置1小 時后3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0. 15M的PBS (PH7. 4)中，對0. 15M的PBS (PH7. 4)緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶標抗原。用單項滴定法確定酶標抗原的ELISA效價達1: 6000。緩沖液的制備
配制O. 1MPBS (PH7.4)作為PCV2抗體檢測試劑盒的酶標抗原稀釋液，含0. 5%吐溫-20的1M PBS (PH7. 4)為IOX濃縮洗滌液。顯色劑的制備
稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，用100ml無水乙醇或DMSO溶解后，以雙蒸水定容至1000ml,配置顯色液A。稱取9.33g檸檬酸，14. 6g磷酸氫二鈉(Na2HP04'12H20)，加入0.75% (質量體積比)過氧化氫尿素6.4ml，調pH值到5.0 5.4，雙蒸水定容至1000ml，配制顯色液B。顯色液A、 B等體積混合，即為顯色劑。量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml，備用。陰、陽性對照與判定標準.-
在ELISA過程中，不同操作人員和不同的檢測批次之間會存在一定的誤差，比如，加樣和反應時間的誤差等，這些誤差會導致檢測樣品OD值的誤差。但檢測樣品OD值/標準樣品OD值(S/P值)可以消除誤差，準確反應檢測結果，是優(yōu)化的判定標準。在PCV2標準陰、陽性血清中分別加入0.2mg/ml的NaN3，使其能在4t:長期保存而抗體效價變化不大。
判定標準當標準陽性血清0D值》0.8;標準陰性血清0D值〈0.3，說明試驗有效。當S/P》0. 3，樣品為抗PCV2抗體陽性，當S/P<0. 3，樣品為抗PCV2抗體陰性。
試劑盒的組裝
a. ELISA板條每個試劑盒包含4塊真空包裝的ELISA板，每塊板含可拆卸的已包被檢測抗原的ELISA板條，規(guī)格為8孔X 12條。
b. 洗滌液10倍濃縮的含0. 5%(體積)吐溫-20的1MPBS(PH7. 4)200ml。
c. 100倍濃縮的酶標抗原500ul。
d. 酶標稀釋液50ml。
e. 底物顯色液50ml。
f. 終止液2M硫酸溶液50ml。
g. 標準PCV2陰、陽性血清各1.0ml。樣品檢測的基本操作步驟為
a. 將濃縮的酶標抗原用酶標稀釋液100被稀釋至使用濃度，加入到ELISA板的反應孔內，每孔加入80ul，然后每孔加入血清20y 1，震蕩混勻，封板，置37'C孵育1小時。
b. 每孔加入300 u 1洗滌液洗板5次，吸干空內殘留液體后每孔加入100ul底物TMB， 37"C避光顯色15分鐘。
c. 每孔加入終止液2M硫酸100 u 1終止顯色，立即用酶標儀在450nm波長下讀數(shù)。
注除濃縮的酶標抗原外，其它試劑盒組分以及待檢血清用前恢復至室溫。
權利要求
1、一種檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述試劑盒依雙抗原夾心ELISA原理研制而成，包括a.ELISA板條每個試劑盒包含4塊真空包裝的ELISA板，每塊板含可拆卸的已包被檢測抗原的ELISA微孔板條，規(guī)格為8孔×12條；該包被抗原是依據(jù)GenBank中PCV2的基因序列(登錄號AY943819)，設計兩條引物，上游引物為GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC；下游引物為GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC；通過PCR的方法從豬PCV2基因組中擴增不含核定位信號的Cap基因，將其克隆到pET32-a(+)原核表達載體中，構建pET32a-Cap重組表達載體；轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，參照Novagen公司pET Syetem Manual表達重組Cap融合蛋白，用親和層析法純化表達的融合蛋白制得；b.洗滌液10倍濃縮的pH為7.4的含0.5％(體積百分比)吐溫-20的1M PBS溶液200ml；c.100倍濃縮的酶標抗原500μl將上述純化的Cap融合蛋白用豬源腸激酶酶切去掉融合部分，并再次使用親和層析柱純化獲得不含核內化信號肽的Cap蛋白，并用超濾管將其濃縮至2.0mg/ml，并采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶偶聯(lián)于Cap蛋白上；d.酶標稀釋液pH為7.4的0.1M PBS溶液50ml；e.底物顯色液50ml稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺，用100ml無水乙醇或DMSO溶解后，以雙蒸水定容至1000ml，配置顯色液A；稱取9.33g檸檬酸，14.6g磷酸氫二鈉，加入0.75％(質量體積比)的過氧化氫尿素6.4ml，調pH值到5.0～5.4，雙蒸水定容至1000ml，配制顯色液B；顯色液A、B等體積混合，即為顯色劑；量取111.2ml18M濃硫酸稀釋定容至1000ml即用；f.終止液2M硫酸溶液50ml；g.標準PCV2陰、陽性血清各1.0ml。
2、如權利要求1所述的檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶偶聯(lián)于Cap蛋白上，具體是于5mg/ml HRP溶液中，加入0. 2ml新配的0. 1M NaI(V溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，對pH4. 4的lmM醋酸鈉緩沖液4'C透析過夜，力B 20 u 1 0. 2M pH9. 5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0 9.5，然后立即加入2ml待標記的Cap蛋白至lml O.OIM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時，加0. lml新配的4mg/ml NaBIV液，混勻，4。C放置2小時，對pH7. 4的0. 15MPBS4"C透析過夜，在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4"C放置1小時后3000rpm離心半小時，棄上清；沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量PH7. 4的0. 15M的PBS中，對pH7. 4的0. 15M的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后，10000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶標抗原。
全文摘要
一種檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒，該試劑盒依雙抗原夾心ELISA原理研制而成，包括ELISA抗原預包被板條、洗滌液、100倍濃縮的酶標抗原、酶標稀釋液、底物顯色液、終止液及標準PCV2陰、陽性血清。本試劑盒采用酶標抗原代替酶標抗抗體，酶標抗原不會與非特異性吸附于ELISA板的抗體結合，同時待檢測血清標本不需預先稀釋，直接與工作濃度的酶標抗原混合后即可直接用于測定，操作簡單，所需檢測時間更少。
文檔編號G01N33/569GK101629956SQ20091004387
公開日2010年1月20日 申請日期2009年7月9日 優(yōu)先權日2009年7月9日
發(fā)明者余興龍, 李潤成, 維 羅, 猛 葛, 蔣大良 申請人:湖南農業(yè)大學