專利名稱：一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血清中蛋白質(zhì)測定用于慢性阻塞性肺病診斷，己有近十年歷史(用血清淀粉樣蛋白A 和C反應(yīng)蛋白聯(lián)合診斷慢性阻塞性肺病的急性發(fā)作期)。用血清淀粉樣蛋白A和C反應(yīng)蛋白 采用酶聯(lián)免疫檢測診斷慢性阻塞性肺病急性發(fā)作，十分方便，但是不靈敏，和沒有特異性， 存在著無法克服的缺點(diǎn)。肺功能檢査對確定氣流受限有重要意義，但是肺功能比較滯后和 不能總體反映慢性阻塞性肺病的狀態(tài)和病程，己成為改進(jìn)對慢性阻塞性肺病的診斷、預(yù)防 和治療措施的瓶頸。
系統(tǒng)性改變在慢性阻塞性肺病發(fā)生及進(jìn)展中的作用成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。許多研究 也顯示肺外的臟器功能失衡與慢性阻塞性肺病進(jìn)展相關(guān)，迄今已發(fā)現(xiàn)多種基因表達(dá)可以作 為慢性氣道疾病預(yù)測指標(biāo)。然而，慢性阻塞性肺病方面目前臨床尚沒有預(yù)測慢性阻塞性肺 病的試劑盒來預(yù)測該病的進(jìn)展及生存情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于改變肺功能研究比較滯后和不能總體反映慢性阻塞 性肺病的狀態(tài)和病程的狀況，研制一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過多聚酶鏈反應(yīng)檢測慢性阻塞性肺病血清蛋白的表達(dá)，
發(fā)現(xiàn)Wnt抑制因子l、腫瘤壞死因子P、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3ou腫瘤壞死因子(配體)超 家族成員10、血管內(nèi)皮生長因子D受體、嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白3/趨化因子配體26、糖 皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體家族相關(guān)蛋白18，特別這7種細(xì)胞因子的聯(lián)合作為一種可預(yù)測 慢性阻塞性肺病病人的生物標(biāo)記物，可以成為早期發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺病的篩查試劑，用于 發(fā)展成包含該細(xì)胞因子聯(lián)合的診斷試劑盒。
如圖1所示，為慢性阻塞性肺病疾病預(yù)測的質(zhì)心圖，其中，向右的線代表的是上調(diào)， 向左的代表的下調(diào)，線長代表上下調(diào)倍數(shù)比較大。慢性阻塞性肺病的預(yù)測蛋白名稱如下表 所示蛋白名稱l評分II評分III評分
Wnt抑制因子10.28152500.0633-0.273
腫瘤壞死因子e0.4797220.16360-0.0274
巨噬細(xì)胞炎性蛋白3a2.68E-020.158100
腫瘤壞死因子超0.24106700-0.0806
家族成員10
血管內(nèi)皮生長因子D受體0.9965770.053800
嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白30.2325880.048700
趨化因子配體26
糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受0.2377050.019500
體家族相關(guān)蛋白18本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，由細(xì)胞因子及其酶
標(biāo)抗體、PH9.6碳酸鹽緩沖液、pH7.4磷酸鹽緩沖液、血清蛋白稀釋液、終止液、四甲基 聯(lián)苯胺底物溶液、正常人血清和陽性對照血清組成，其特征在于所述細(xì)胞因子為Wnt抑 制因子1、腫瘤壞死因子0、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3a、腫瘤壞死因子超家族成員10、血 管內(nèi)皮生長因子D受體、嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白3和趨化因子配體26和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo) 的TNF受體家族相關(guān)蛋白。
進(jìn)一步地，所述的pH9.6碳酸鹽緩沖液為將1.59克碳酸鈉和2.93克碳酸氫鈉加到 1000ml蒸餾水中得到。
所述的pH7. 4磷酸鹽緩沖液為將0. 2克磷酸二氫鉀、2. 9克十二水合磷酸氫二鈉、8. 0 克氯化鈉、0. 2克氯化鉀和0. 5ml吐溫-20加到1000ml蒸餾水中得到。
所述的血清蛋白稀釋液為將0. 1克牛血清、羊血清或兔血清白蛋白加到100ml pH7.4 磷酸鹽緩沖液中得到。
所述終止液為2M硫酸溶液。
所述四甲基聯(lián)苯胺底物溶液為將0.5ml 10mg/5ml的四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇溶液、 10ml pH5. 0底物緩沖液與32 u 1 0. 75voW過氧化氫水溶液混合得到，其中，所述的Hi5. 0 底物緩沖液為含有0. 2M磷酸氫二鈉和0. 1M檸檬酸的蒸餾水溶液。
由上述研究得出本發(fā)明主要特點(diǎn)
l.本發(fā)明首次提出Wnt抑制因子1、腫瘤壞死因子(3、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3a、腫瘤壞 死因子超家族成員10、血管內(nèi)皮生長因子D受體、嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白3和趨化因子配 體26、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體家族相關(guān)蛋白18或與其它臨床指標(biāo)組合可成為慢性阻 塞性肺病診斷的主要指標(biāo)。2. Wnt抑制因子l、腫瘤壞死因子P、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3ou腫瘤壞死因子(配體)超家族成員10、血管內(nèi)皮生長因子D受體、嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白3/趨化因子配體26、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體家族相關(guān)蛋白18作為預(yù)測指標(biāo)明顯優(yōu)于目前用于預(yù)測慢性阻塞性肺病患者的肺功能臨床指標(biāo)，而且測定此蛋白表達(dá)水平簡單易行可靠。


圖1為慢性阻塞性肺病疾病預(yù)測的質(zhì)心圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來說明本發(fā)明。
實(shí)施例l
一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，由細(xì)胞因子及其酶標(biāo)抗體、pH9.6碳酸鹽緩沖液、pH7.4磷酸鹽緩沖液、血清蛋白稀釋液、終止液、四甲基聯(lián)苯胺底物溶液、正常人血清和陽性對照血清組成。
所述細(xì)胞因子為Wnt抑制因子1、腫瘤壞死因子0 、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3 a 、腫瘤壞死因子超家族成員10、血管內(nèi)皮生長因子D受體、嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白3和趨化因子配體26和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體家族相關(guān)蛋白。
所述的pH9. 6碳酸鹽緩沖液為將1. 59克碳酸鈉和2. 93克碳酸氫鈉加到1000ml蒸餾水中得到。
所述的pH7. 4磷酸鹽緩沖液為將0. 2克磷酸二氫鉀、2. 9克十二水合磷酸氫二鈉、8. 0克氯化鈉、0. 2克氯化鉀和0. 5ml吐溫-20加到1000ml蒸餾水中得到。
所述的血清蛋白稀釋液為將0. 1克牛血清、羊血清或兔血清白蛋白加到100ml PH7.4磷酸鹽緩沖液中得到。
所述終止液為2M硫酸溶液。
所述四甲基聯(lián)苯胺底物溶液為將0.5ml 10mg/5ml的四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇溶液、10ml PH5. 0底物緩沖液與32u 1 0. 75vol。/。過氧化氫水溶液，混合得到。其中，所述的F^H5. 0底物緩沖液為含有0. 2M磷酸氫二鈉和0.1M檸檬酸的蒸餾水溶液。
上述試劑盒的使用方法如下
1. 包被:用0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩沖液將細(xì)胞因子稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 10 u g / ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加O. lml， 4'C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用pH7.4磷酸鹽緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。
2. 加樣分別加一定血清蛋白稀釋液稀釋的待檢樣品、正常人血清和陽性對照血清0. lml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37"C孵育1小時。然后洗滌。
3. 加辣根過氧化物酶標(biāo)抗體于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)抗體0. lral。 37。C孵育0. 5 1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入四甲基聯(lián)苯胺底物溶液0. lml， 37°C10 30分鐘。
5. 終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結(jié)果判定在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照0D值的2. l倍，即為陽性。
以正常對照品蛋白表達(dá)水平作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，慢性阻塞性肺病病人血清蛋白譜表達(dá)量除以此標(biāo)準(zhǔn)，從而確定慢性阻塞性肺病病人蛋白譜相對于正常人的表達(dá)比例，其中大于或等于2.4為增高，小于2.4為降低。
權(quán)利要求
1. 一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，由細(xì)胞因子及其酶標(biāo)抗體、pH9.6碳酸鹽緩沖液、pH7.4磷酸鹽緩沖液、血清蛋白稀釋液、終止液、四甲基聯(lián)苯胺底物溶液、正常人血清和陽性對照血清組成，其特征在于所述細(xì)胞因子為Wnt抑制因子1、腫瘤壞死因子β、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α、腫瘤壞死因子超家族成員10、血管內(nèi)皮生長因子D受體、嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白3和趨化因子配體26和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體家族相關(guān)蛋白。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，其特征在于，所述的pH9. 6碳酸鹽緩沖液為將1. 59克碳酸鈉和2. 93克碳酸氫鈉加到1000ml蒸餾水中得到。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，其特征在于，所述的pH7.4磷酸鹽緩沖液為將0.2克磷酸二氫鉀、2.9克十二水合磷酸氫二鈉、8.0克氯化鈉、0. 2克氯化鉀和0. 5ml吐溫-20加到1000ml蒸餾水中得到。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，其特征在于，所述的血清蛋白稀釋液為將O. l克牛血清、羊血清或兔血清白蛋白加到100ml pH7.4磷酸鹽緩沖液中得到。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，其特征在于，所述終止液為2M硫酸溶液。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，其特征在于，所述四甲基聯(lián)苯胺底物溶液為將0.5ml 10mg/5ml的四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇溶液、10ml pH5. 0底物緩沖液與32 P 1 0. 75voW過氧化氫水溶液混合得到，其中，所述的PH5. 0底物緩沖液為含有0. 2M磷酸氫二鈉和0. 1M擰檬酸的蒸餾水溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于預(yù)測慢性阻塞性肺病的試劑盒，由細(xì)胞因子及其酶標(biāo)抗體、pH9.6碳酸鹽緩沖液、pH7.4磷酸鹽緩沖液、血清蛋白稀釋液、終止液、四甲基聯(lián)苯胺底物溶液、正常人血清和陽性對照血清組成，其特征在于所述細(xì)胞因子為Wnt抑制因子1、腫瘤壞死因子β、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α、腫瘤壞死因子超家族成員10、血管內(nèi)皮生長因子D受體、嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白3和趨化因子配體26和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體家族相關(guān)蛋白。本發(fā)明明顯優(yōu)于目前用于預(yù)測慢性阻塞性肺病患者的臨床指標(biāo)，既適用于酶聯(lián)接免疫吸附劑測定，也可改為蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，操作十分簡便。
文檔編號G01N33/68GK101482568SQ20091004559
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月20日
發(fā)明者宋振舉, 卡 李, 王向東, 王耀麗, 白春學(xué), 蔣進(jìn)軍 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院