專利名稱：：一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明特別涉及一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：核酸適體(aptamer)是指利用上個世紀(jì)末建立而發(fā)展起來的SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)體夕卜蹄選技術(shù),從隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選獲得的短單鏈寡核苷酸配基，它能夠與靶分子特異結(jié)合，從而本身發(fā)生構(gòu)象變化。通過體外篩選技術(shù)，理論上可篩選到任意物質(zhì)的核酸適體，再加上高通量篩選的技術(shù)特點(diǎn)與核酸適體精確識別、易體外合成與修飾等特性，使得核酸適體在分析化學(xué)與生物醫(yī)藥研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，核酸適體在生物傳感器的設(shè)計中具有重要作用，被應(yīng)用于生物學(xué)、環(huán)境、安全等領(lǐng)域的檢測，包括蛋白質(zhì)(凝血酶、生長因子、HIV相關(guān)多肽等)、有機(jī)小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金屬離子(K+、Hg2+、Pb2+等)，其他新的令人興奮的應(yīng)用包括基于核酸適體的蛋白質(zhì)芯片，和在蛋白質(zhì)組學(xué)中用于高通量成像、基于DNA酶和RNA酶的分子尺度的邏輯DNA分子計算機(jī)等。除此之外，還有一些其他的DNA序列也可以在某一特定環(huán)境下發(fā)生構(gòu)象變化。核酸適體和這些DNA對各自的靶物質(zhì)來說都有其特異性的核酸結(jié)構(gòu)，可與靶物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，從而本身發(fā)生構(gòu)象的變化。這種核酸結(jié)構(gòu)在遇到相應(yīng)的靶分子進(jìn)行結(jié)合時通常會伴有明顯的構(gòu)象變化。這種結(jié)構(gòu)的差異形成了基于核酸結(jié)構(gòu)傳感器的理論基礎(chǔ)。一個典型的基于核酸結(jié)構(gòu)的傳感器包括一個雙標(biāo)記的寡核苷酸序列(電子傳遞或能量傳遞的受體和供體)，因此，靶分子結(jié)合導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化可以直接影響到受體和供體之間的距離，從而可以高靈敏度的檢測到電信號或光信號的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，核酸結(jié)構(gòu)在分析化學(xué)方面的應(yīng)用逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，例如，Tan等將核酸適體應(yīng)用于分子信標(biāo)研究，發(fā)展了一種高效、高靈敏檢測生物分子的方法一分子aptamer信標(biāo)(MAB)，并進(jìn)一步用于凝血酶和血小板源生長因子(PDGF)的檢測。另外，由于核酸適體與抗體具有類似的特異結(jié)合性質(zhì)，因此在ELISA、免疫學(xué)分析、Western印跡法和生物傳感器等許多應(yīng)用中具有更大的發(fā)展?jié)摿?，并取得初步結(jié)果。目前基于DNA構(gòu)象變化的分子信標(biāo)的方法，主要是應(yīng)用雙標(biāo)記核酸序列，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，而猝滅基團(tuán)又主要以Dabcyl為主。為了進(jìn)一步提高熒光猝滅效率和檢測的靈敏度，科學(xué)家們不斷的研究開發(fā)新型的猝滅劑。近年來，科學(xué)家們通過研究發(fā)現(xiàn)與常規(guī)猝滅基團(tuán)DABCYL相比，納米金可以在可見到近紅外的波長范圍內(nèi)，有效地猝滅各種熒光染料，猝滅率達(dá)到90%以上?；诩{米金和核酸結(jié)構(gòu)的分析檢測方法也已受到關(guān)注。Huang等用納米金顆粒(GNPs)與核酸適體5’端的-SH直接作用形成的結(jié)合物(即Apt-AuNPs)來檢測PDGF及其受體(PDGFR)，發(fā)現(xiàn)由于Apt-AuNPs具有簡易性和專一性，所以非常適合于蛋白質(zhì)分析和癌癥診斷。Parlor等還將Apt-AuNPs用于光學(xué)檢測凝血酶。Dwarakanath等將熒光性能優(yōu)異的半導(dǎo)體納米晶粒_量子點(diǎn)用于標(biāo)記核酸適體，開辟了量子點(diǎn)技術(shù)與SELEX技術(shù)聯(lián)合使用的先河。Korgd等通過生物素和抗生物素的作用將前列腺專一性膜抗原(PSMA)的核酸適體連接到具有近紅外發(fā)光性能的CdTe量子點(diǎn)上來檢測前列腺癌細(xì)胞，取得了較好的結(jié)果，這給核酸適體量子點(diǎn)標(biāo)記在活細(xì)胞及生物體內(nèi)的分析檢測提供了新思路。但是這些方法主要是基于納米金和HS-DNA的組裝來進(jìn)行的，由于DNA需要標(biāo)記，而且組裝的過程較為繁瑣，耗時長、成本高，不利于推廣應(yīng)用。最近，Rothberg等人報道了一種利用未經(jīng)過修飾的金膠檢測靶DNA的比色法(H.Li,L.Rothberg,PNAS101,14036,September28,2004)該法基本原理是納米金顆?？梢院蛦捂淒NA，通過靜電作用發(fā)生瞬時的吸附結(jié)合，從而可以在高離子強(qiáng)度條件下有效地穩(wěn)定納米金，而雙鏈DNA則不具有這種作用。但是該方法只對特定的DNA進(jìn)行了檢測，而不適用于任意靶物質(zhì)的檢測，并且比色法的靈敏度有限。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是克服現(xiàn)有的納米金檢測靶DNA的比色法中對不同的靶分子，需要對檢測方案進(jìn)行不同設(shè)計、操作復(fù)雜、靈敏度有限的缺陷，提供一種簡便、快捷、通用型的、高靈敏度的納米金檢測靶物質(zhì)的比色法及其試劑盒，可以很方便地實(shí)現(xiàn)對任意靶物質(zhì)的檢測。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，核酸結(jié)構(gòu)在溶液中為無規(guī)卷曲狀態(tài)，可以吸附在納米金表面，因此將DNA序列的一端用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，當(dāng)它吸附在納米金表面時，其熒光基團(tuán)離納米金表面非常近(小于10nm)，熒光被猝滅；而當(dāng)有靶分子存在時，核酸分子會形成剛性的二級結(jié)構(gòu)，不能吸附在納米金表面，熒光素與納米金的距離足夠遠(yuǎn)，納米金不能夠猝滅DNA上的熒光。因此，本發(fā)明人提出了新的檢測策略利用納米金高效猝滅熒光的性質(zhì)來將其發(fā)展成為檢測核酸結(jié)構(gòu)的探針，可以很方便地實(shí)現(xiàn)對任意靶物質(zhì)的高靈敏檢測，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是，一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測方法，包括以下步驟1)將熒光標(biāo)記的能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與待檢溶液進(jìn)行反應(yīng)；2)將步驟1)的反應(yīng)溶液與納米金溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)；3)觀察步驟2)的反應(yīng)溶液的熒光光譜。本發(fā)明步驟1)為將熒光標(biāo)記的能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與待檢溶液進(jìn)行反應(yīng)。其中，所述靶分子可以是蛋白質(zhì)、有機(jī)小分子、金屬離子、甚至整個病毒顆粒等非DNA靶分子的檢測。較佳的靶分子可為三磷酸腺苷(ATP)、可卡因(Cocaine)、血小板衍生性生長因子(PDGF)、凝血酶(thrombin)、溶菌酶(lysozyme)、鉀離子、汞離子或氫離子(PH值)。本發(fā)明所述的熒光標(biāo)記的能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA為核酸適體和一些其他的DNA序列，這些DNA序列也可以在某一特定環(huán)境下發(fā)生構(gòu)象變化，核酸適體和這些DNA對各自的靶物質(zhì)來說都有其特異性的核酸結(jié)構(gòu)，可與靶物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，從而本身發(fā)生構(gòu)象的變化。較佳的特異性DNA為核酸適體、特異性結(jié)合汞離子的寡核苷酸(MS0，mercury-specificOligonuclide)、特異性結(jié)合鉀離子的寡核苷酸(PS0)或具有i-motif結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸。所述的熒光標(biāo)記所用的熒光基團(tuán)較佳的選自熒光素(FAM)、花菁染料Cy3和Cy5、羅丹明BOtodamineB)、異硫氰酸熒光素(FITC)和6-羰基-羅丹明(R0X)。較佳的，所述的特異性DNA的反應(yīng)濃度為1100μΜ，待檢溶液的反應(yīng)濃度為IOnM10mM，待檢溶液與特異性DNA的摩爾比為10011100。同常規(guī)，所述的反應(yīng)較佳地可在緩沖溶液中進(jìn)行，緩沖溶液較佳的可為Tris、PBS、胂酸鹽緩沖溶液或檸檬酸緩沖液，緩沖溶液的反應(yīng)濃度較佳的可為O25mM，另外較佳的還加入終濃度為O600mM的NaCl或者O50mM的MgCl2來調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，以滿足靶分子與DNA的結(jié)合。較佳的反應(yīng)溫度為437°C，反應(yīng)時間為130分鐘。本發(fā)明步驟2)為將步驟1)的反應(yīng)溶液與納米金溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)。其中，所述的納米金較佳的為粒徑1020nm納米金溶液。納米金的反應(yīng)濃度較佳的為1200nM，納米金與特異性DNA的摩爾比較佳的為411200。反應(yīng)溫度較佳的為437°C，反應(yīng)時間較佳的為15分鐘。本發(fā)明步驟3)為觀察步驟2)的反應(yīng)溶液的熒光光譜。其中，所述的步驟2)的反應(yīng)溶液較佳地可在加入緩沖溶液后再觀察熒光光譜。同常規(guī)，所述的緩沖溶液較佳的可為Tris,PBS或胂酸鹽緩沖溶液，反應(yīng)濃度較佳的可為O25Mm，另外較佳的還加入終濃度為O600mM的NaCl或者O50mM的MgCl2來調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度。所述觀察熒光光譜的方法較佳的可為分光光度法。分光光度法可為儀器檢測溶液的熒光光譜的變化光譜保持不變的，待檢溶液含靶分子呈陽性；對于FAM，觀察到熒光光譜530nm處吸收降低的，待檢溶液不含靶分子呈陰性。同常規(guī)，本發(fā)明可以采用水或靶分子類似物替換步驟1)中所加的靶分子溶液作為對照組。所述的靶分子類似物可以是靶分子的結(jié)構(gòu)類似物或性質(zhì)類似物。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是，一種如上所述的基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測方法進(jìn)行檢測的試劑盒，包含1)熒光標(biāo)記的能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA；2)納米金溶液；3)緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，該試劑盒中，所述的特異性DNA較佳的為特異性DNA為三磷酸腺苷、可卡因、血小板衍生性生長因子、凝血酶或溶菌酶的核酸適體，特異性結(jié)合鉀離子的寡核苷酸，特異性結(jié)合汞離子的寡核苷酸或具有i-motif結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸。所述的熒光標(biāo)記所用的熒光基團(tuán)較佳的選自熒光素、Cy3、Cy5、羅丹明B、異硫氰酸熒光素和6_羰基-羅丹明。所述的納米金溶液中的納米金的粒徑較佳的為1020nm。所述的納米金溶液的濃度較佳的為1200nM。所述的緩沖液較佳的為常規(guī)的Tris、PBS、檸檬酸緩沖液。所述的緩沖液的濃度較佳的為550mM。本發(fā)明整個反應(yīng)的體系可控制在微升級別，較佳的反應(yīng)體系的體積為5500微升，優(yōu)化實(shí)施方案可表述如下分別取2μL反應(yīng)濃度為1100μM的熒光標(biāo)記的特異性DNA(可以使用的熒光基團(tuán)包括FAM、Cy3、Cy5、RodamineB、FITC或ROX等有機(jī)染料)溶液與2μL反應(yīng)濃度為IOnMIOmM的靶分子溶液，加入ISyL的其他溶液如緩沖液進(jìn)行充分反應(yīng)。同時以不加靶分子溶液的一組、以及加入靶分子類似物的一組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入101000μL的納米金(粒徑1020nm，反應(yīng)濃度在1IOOnM)溶液(AuDNA的摩爾比例范圍在111100)，437°C條件下反應(yīng)15分鐘，較佳的為5min。然后加入緩沖溶液(Tris、PBS、胂酸鹽等常規(guī)生化體系，反應(yīng)濃度一般為ο.1IOmM)補(bǔ)足總體積0.2lmL，記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。本發(fā)明的基本原理可總結(jié)為利用納米金對不同結(jié)構(gòu)DNA的吸附作用不同，以及納米金高效猝滅DNA標(biāo)記熒光的性質(zhì)來實(shí)現(xiàn)對DNA結(jié)構(gòu)的區(qū)分。在溶液中，核酸適體等核酸結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲的單鏈形式存在，主要表現(xiàn)為柔性。單鏈DNA可以通過鏈上堿基上的游離氨基吸附到納米金顆粒表面，拉近了熒光素和納米金的距離，而納米金可以非常高效地猝滅熒光，因此熒光被猝滅。而當(dāng)核酸適體等核酸結(jié)構(gòu)結(jié)合了靶分子后，表現(xiàn)出較強(qiáng)的剛性，例如主要以雙鏈、四分體、莖環(huán)、假結(jié)、凸環(huán)等形式存在。由于堿基被包含在剛性結(jié)構(gòu)內(nèi)部，不能吸附到納米金表面，因此納米金不能有效猝滅熒光。本發(fā)明的檢測原理圖可參見圖1。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下1)本發(fā)明改變了目前所使用的單鏈探針依賴于探針本身結(jié)構(gòu)變化提供信號的檢測模式，建立了一種通用的工作模式。也就是說本發(fā)明的檢測方法具有通用性，檢測對象可以是任意靶分子，應(yīng)用范圍廣。因?yàn)樵诶碚撋先魏伟形镔|(zhì)都可以通過SELEX技術(shù)尋找到特異性的核酸適體，而且自然界中還存在大量可以發(fā)生構(gòu)象變化的DNA片段是基于某一特定環(huán)境和特定物質(zhì)的。2)本發(fā)明的檢測方法具有高度特異性。因?yàn)楹怂峤Y(jié)構(gòu)通常都具有非常高的親和力，而高親和力使得可以很方便地檢測到極微量的靶分子，并將反應(yīng)信號直接傳輸?shù)綑z測元件進(jìn)行讀取，同時又不受其他非靶物質(zhì)的干擾，實(shí)現(xiàn)對靶分子的特異性檢測。3)本發(fā)明的檢測方法靈敏度高，利用熒光素和納米金，可以提高檢測的靈敏度到10_14mol數(shù)量級。4)本發(fā)明檢測快速。本發(fā)明建立了一種通用的工作模式，利用納米金進(jìn)行熒光檢測，可以很方便地實(shí)現(xiàn)對靶分子的快速的檢測。以下結(jié)合本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是本發(fā)明納米金_核酸結(jié)構(gòu)探針對靶物質(zhì)的檢測原理示意圖。圖2是本發(fā)明檢測可卡因的納米金溶液的熒光光譜圖。具體實(shí)施例方式下面用本發(fā)明對三磷酸腺苷(ATP)、可卡因、凝血酶、血小板衍生性生長因子(PDGF)、溶菌酶、汞離子、鉀離子、pH值(氫離子)檢測的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。其中的“室溫”是指進(jìn)行實(shí)施例操作的實(shí)驗(yàn)室溫度，為2225°C。^tjfeΤ^θHitachiF-4500FluorescencespectrophotometeriMjtMFAM的激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長范圍490900nm，用200μL石英比色皿，取200μL樣品進(jìn)行測量。本發(fā)明實(shí)施例中所用納米金顆粒參考文獻(xiàn)(S.Dwarakanathetal.，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications325，739，2004)制備。具體步驟如下，將IOOmL0.01%(w/w)的氯金酸溶液加熱到沸騰后，在劇烈攪拌下快速加入25mL的檸檬酸三鈉溶液(10mg/mL)并繼續(xù)加熱1530min，溶液變成酒紅色。停止加熱繼續(xù)攪拌30min后，靜置過夜。然后用0.22μm濾膜進(jìn)行過濾，并放置在冰箱4°C保存。根據(jù)本方法得到粒徑為1020nm，濃度為8InM的納米金溶液。在制備納米金時，使用的是同一濃度的氯金酸溶液，生成的顆粒越大，對應(yīng)的濃度就越低。此處，IOnm金的濃度為8nM左右，而20nm的金的濃度為InM左右。本發(fā)明實(shí)施例中所用的各種DNA序列如表1所示。這些序列的5’端都帶有熒光標(biāo)記FAM。在本領(lǐng)域，其他的熒光標(biāo)記也明顯適用于實(shí)施例中的反應(yīng)，因此不再贅述。這些序列均按照已公布的序列由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。其中，檢測ATP、PDGF、可卡因、凝血酶和溶菌酶所用的特異性DNA為核酸適體，檢測汞離子、鉀離子、pH值所用的特異性DNA分別為MSO、PSO和具有i-motif結(jié)構(gòu)的DNA。表1.熒光標(biāo)記的特異性DNA的寡聚核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>步驟分別取2μL濃度為100μM的可卡因_核酸適體溶液與2μL濃度為1100μM的可卡因鹽酸鹽的水溶液，加入16μL緩沖溶液(25mMTris，pH8.2，0.3MNaCl)后混勻，室溫條件下反應(yīng)lOmin。同時以不加可卡因，加入2μL水作為空白組，以及加入2μLImM的苯甲酰芽子堿(W)、芽子堿甲酯(N2)的兩組作為對照。然后分別取2yL的上述反應(yīng)溶液加入100μL如上制備而得的納米金溶液(13nm，3.5nM)，室溫反應(yīng)5min后，加入如上緩沖溶液(25mMTris,pH8.2,0.3MNaCl)補(bǔ)足0.2mL后記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。結(jié)果熒光光譜圖見圖2，可見在含有可卡因的一組溶液中，可卡因-核酸適體與可卡因作用形成剛性的雙鏈結(jié)構(gòu)，不能吸附到納米金表面，因此熒光沒有明顯降低。而可卡因-核酸適體本身，以及遇到Ni、N2后，DNA均保持原來的單鏈狀態(tài)，熒光猝滅80%以上。。通過優(yōu)化條件，最低可以檢測出納米金溶液中可卡因的濃度在ΙΟηΜ，按照檢測時體積為0.2mL計算，可以檢測到2pmol的可卡因，如果用nano-drop熒光光譜檢測系統(tǒng)，檢測時樣品體積最小為1μL，此時可以最低檢測到IOfmol的可卡因。實(shí)施例2ΑΤΡ的檢測步驟分別取2μL濃度為100μM的ATP-核酸適體溶液與2μL濃度為0.1μMIOOmM的ATP的水溶液，加入16μL緩沖溶液(25mMTris，pH8.2,0.15MNaCl)后混勻，室溫條件下反應(yīng)30min。同時以不加ATP，加入2μL水的一組作為空白、以及加入2μLImM的CTP,UTP,GTP的三組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入100μL的如上制備而得納米金溶液(20nm，InM)，室溫反應(yīng)5min后，加入上述緩沖溶液補(bǔ)足0.2mL后記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入ATP的一組熒光沒有明顯變化，而空白組和對照組熒光明顯下降。利用此法檢測的靈敏度和檢測限參考實(shí)施例1。實(shí)施例3對二價汞離子的檢測步驟分別取1μL濃度為1μM的Hg2+-MSO溶液與1μL濃度為IOnM0.ImM的Hg2+的水溶液，加入18μL水后混勻，室溫條件下反應(yīng)lmin。同時以不加Hg2+，加入1μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。另外選擇性分析通過兩組實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行，一組加入2μL各25mM的Ca2+、Mg2+的，另外一組加入各0.5mM的混合離子(Fe2+，Cu2+，Co2+，Mn2+，Ni2+，Zn2+，Cd2+)。然后分別取5μL的上述反應(yīng)溶液加入5μL如上制備而得的納米金溶液(lOnm，200nM)，室溫反應(yīng)5min后，加入0.034%檸檬酸溶液(防止納米金不穩(wěn)定，造成聚集而變色)補(bǔ)足0.2mL后記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入Hg2+的一組熒光沒有明顯變化，而空白組和對照組熒光明顯下降。利用此法檢測的靈敏度和檢測限參考實(shí)施例1。實(shí)施例4對二價汞離子的檢測步驟分別取2μL濃度為100μM的Hg2+-MSO溶液與2μL濃度為0.01IOmM的Hg2+的胂酸鹽緩沖(10mM，pH8.0)溶液，加入16μL水后混勻，室溫條件下反應(yīng)lmin。同時以不加Hg2+，加入2μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。另外選擇性分析通過兩組實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行，一組加入2μL各25mM的Ca2+、Mg2+的，另外一組加入各0.5mM的混合離子(Fe2+，Cu2+，Co2+，Mn2+，Ni2+，Zn2+，Cd2+)。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入1000μL如上制備而得的納米金溶液(lOnm，InM)，37°C反應(yīng)Imin后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入Hg2+的一組熒光沒有明顯變化，而空白組和對照組熒光明顯下降。利用此法檢測的靈敏度和檢測限參考實(shí)施例1。實(shí)施例5對鉀離子的檢測步驟分別取2μL濃度為100μM的PSO溶液與2μL濃度為IOOnMIOmM的K+的水溶液，加入16μL水后混勻，4°C條件下反應(yīng)30min。同時以不加K+，加入2μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)，0.IMNaCl作為對照組。然后分別取5μL的上述反應(yīng)溶液加入IOOyL如上制備而得的納米金溶液(13nm，10nM)，4°C反應(yīng)5min后，加入0.034%檸檬酸溶液(防止納米金不穩(wěn)定，造成聚集而變色)補(bǔ)足0.2mL后記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入K+的一組熒光沒有明顯變化，而空白組和對照組熒光明顯下降。利用此法檢測的靈敏度和檢測限參考實(shí)施例Io實(shí)施例6對pH-DNA結(jié)構(gòu)的檢測步驟分別取2μL濃度為100μM的pH_DNA溶液，加入到18μL檸檬酸緩沖溶液(0.05Μ,ρΗ5·5)以及18μLNa2C03/NaHC03緩沖溶液中(50mM,ρΗ8·5)，室溫條件下反應(yīng)5min，pH-DNA終濃度為10μM。同時以對比DNAl作為對照，如上操作。用HCl或NaOH調(diào)節(jié)如上制備而得的納米金溶液(13nm，IOnM)的pH值分別為4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入相同pH值的100μL的納米金溶液，室溫反應(yīng)5min后，加入上述緩沖溶液補(bǔ)足0.2mL后記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，對于pH-DNA實(shí)驗(yàn)，pH為5.5的一組熒光沒有明顯變化，而pH為8.5的一組熒光明顯下降。利用此法得到pH-DNA的半轉(zhuǎn)換點(diǎn)在6.3附近。另外一組對比DNAl實(shí)驗(yàn)，在pH5.5和8.5時，熒光均明顯下降，證明PH導(dǎo)致特異性pH-DNA的結(jié)構(gòu)變化。實(shí)施例7對pH的檢測步驟1、獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(1)分別取2μL濃度為100μM的pH_DNA溶液，加入到18μL檸檬酸緩沖溶液(0.05Μ,ρΗ5·5)以及18μLNa2C03/NaHC03緩沖溶液中(0.05M,ρΗ8·5)，室溫條件下反應(yīng)5min。(2)用HCl或NaOH制備pH分別為4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,10.0的水溶液，然后分別取50μL該不同pH值的水溶液加入到50μL如上制備而得的納米金溶液(13nm，3.5nM)中，混合均勻。(3)分別取2μL的步驟(1)的反應(yīng)溶液加入到步驟(2)的不同pH值的100μL的納米金溶液中，室溫反應(yīng)5min，加入上述緩沖溶液補(bǔ)足0.2mL后記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。2、樣品的檢測取50μL待測pH值的樣品加入到50μL如上制備而得的納米金溶液中(13nm，3.5nM)。再加入2yL的步驟(1)的反應(yīng)溶液，室溫反應(yīng)5min，然后加入上述緩沖溶液補(bǔ)足0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測溶液的pH值。結(jié)果可檢測的pH值的樣品的pH范圍是pH510。實(shí)施例8對凝血酶的檢測步驟分別取2μL濃度為1μM的凝血酶-核酸適體溶液與2μL濃度為IOnM0.ImM的凝血酶的水溶液，加入16μL緩沖溶液(20mMTris-乙酸，pH7.4，140mMNaCl，ImMCaCl2,ImMMgCl2)后混勻，室溫條件下反應(yīng)30min。同時以不加凝血酶，加入2μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。以及加入2yLlmM的BSA(牛血清白蛋白)的一組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入100μL如上制備而得的納米金溶液(lOnm，5nM)，室溫反應(yīng)5min后，加入上述緩沖溶液補(bǔ)足0.2mL后記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入凝血酶的一組熒光沒有明顯變化，而空白組和對照組熒光明顯下降。利用此法檢測的靈敏度和檢測限參考實(shí)施例1。實(shí)施例9對溶菌酶的檢測步驟分別取2μL濃度為10OμM的溶菌酶-核酸適體溶液與2μL濃度為10μMImM的溶菌酶的水溶液，加入16μL緩沖溶液(IOmMPB,ρΗ7.0,0.IMNaCl)后混勻，室溫條件下反應(yīng)30min。同時以不加溶菌酶，加入2μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。以及加入2μLImM的BSA的一組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入100μL如上制備而得的納米金溶液(13nm，IOnM)，室溫反應(yīng)5min后，加入上述緩沖溶液補(bǔ)足0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入溶菌酶的一組熒光沒有明顯變化，而空白組和對照組熒光明顯下降。利用此法檢測的靈敏度和檢測限參考實(shí)施例1。實(shí)施例10對PDGF的檢測步驟分別取2μL濃度為100μM的PDGF-核酸適體溶液與2μL濃度為10μMImM的PDGF的水溶液，加入16μL緩沖溶液(5mMPB，pH7.0,0.2MNaCl)后混勻，37°C條件下反應(yīng)30min。同時以不加PDGF，加入2μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。以及加入2μLImM的BSA的一組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入100μL如上制備而得的納米金溶液(13nm，IOnM)，37°C反應(yīng)5min后，加入上述緩沖溶液補(bǔ)足0.2mL后，記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，熒光光譜顯示，加入PDGF的一組熒光沒有明顯變化，而空白組和對照組熒光明顯下降。利用此法檢測的靈敏度和檢測限參考實(shí)施例1。序列表<110>蘇州市長三角系統(tǒng)生物交叉科學(xué)研究院有限公司<120>一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測方法及其試劑盒<130>P4-081493C<140>200910047299·5<141>2009-03-10<160>9<170>PatentInversion3.4<2IOM<211>30<212>DNA<213>Artificial<220><223>可卡因核酸適體<400>1gacaaggaaaatccttcaatgaagtgggtc30<210>2<211>27<212>DNA<213>Artificial<220><223>ATP核酸適體<400>2acctgggggagtattgcggaggaaggt27<210>3<211>15<212>DNA<213>Artificial<220><223>凝血酶核酸適體<400>3ggttggtgtggttgg15<210>4<211>42<212>DNA<213>Artificial<220><223>溶菌酶核酸適體<400>4atctacgaattcatcagggctaaagagtgcagagttacttag42<210>5<211>22<212>DNA<213>Artificial<220><223>Hg2+-DNA(MSO)<400>5ttctttcttccccttgtttgtt22<210>6<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>K+-DNA(PSO)<400>6gggttagggttagggttaggg21<210>7<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>pH-DNA<400>7ccctaaccctaaccctaaccc21<210>8<211>35<212>DNA<213>Artificial<220><223>PDGF核酸適體<400>8caggctacggcacgtagagcatcaccatgatcctg35<210>9<211>24<212>DNA<213>Artificial<220><223>對比DNAl<400>9agcaacctcaaacagacaccatgg2權(quán)利要求一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)將熒光標(biāo)記的能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與待檢溶液進(jìn)行反應(yīng)；2)將步驟1)的反應(yīng)溶液與納米金溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)；3)觀察步驟2)的反應(yīng)溶液的熒光光譜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測方法，其特征在于，步驟1)所述的靶分子為三磷酸腺苷、可卡因、血小板衍生性生長因子、凝血酶、溶菌酶、鉀離子、汞離子或氫離子；所述的特異性DNA為特異性DNA為三磷酸腺苷、可卡因、血小板衍生性生長因子、凝血酶或溶菌酶的核酸適體，特異性結(jié)合鉀離子的寡核苷酸，特異性結(jié)合汞離子的寡核苷酸或具有i-motif結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測方法，其特征在于，步驟1)所述的特異性DNA的反應(yīng)濃度為1100yM，待檢溶液的反應(yīng)濃度為lOnM10mM，待檢溶液與特異性DNA的摩爾比為10011100。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測方法，其特征在于，步驟1)所述的反應(yīng)在緩沖溶液中進(jìn)行。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測方法，其特征在于，步驟1)所述的反應(yīng)的反應(yīng)溫度為437°C，反應(yīng)時間為130分鐘。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測方法，其特征在于，步驟2)所述的納米金的反應(yīng)濃度為1200nM。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測方法，其特征在于，步驟2)所述的納米金與特異性DNA的摩爾比為111100。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測方法，其特征在于，步驟2)所述的反應(yīng)的反應(yīng)溫度為437°C，反應(yīng)時間為15分鐘。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測方法，其特征在于，步驟3)所述的反應(yīng)溶液在加入緩沖溶液后再觀察熒光光譜。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的靶分子檢測方法，其特征在于，所述的緩沖溶液為常規(guī)的Tris、PBS、胂酸鹽緩沖溶液或檸檬酸緩沖溶液。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子檢測方法，其特征在于，步驟3)所述觀察熒光光譜的方法為分光光度法。12.—種如權(quán)利要求111任一項所述的基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測方法進(jìn)行檢測的試劑盒，其特征在于，包含1)熒光標(biāo)記的能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA；2)納米金溶液；3)緩沖液。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述的熒光標(biāo)記所用的熒光基團(tuán)選自熒光素、Cy3、Cy5、羅丹明B、異硫氰酸熒光素和6_羰基-羅丹明。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述的納米金溶液中的納米金的粒徑為1020nm。15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述的納米金溶液的濃度為1200nM。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述的緩沖液為常規(guī)的Tris、PBS、胂酸鹽緩沖溶液或檸檬酸緩沖溶液。17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述的緩沖液的濃度為550mM。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測方法及其試劑盒，包括以下步驟1)將熒光標(biāo)記的能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與待檢溶液進(jìn)行反應(yīng)；2)將步驟1)的反應(yīng)溶液與納米金溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)；3)觀察步驟2)的反應(yīng)溶液的熒光光譜。本發(fā)明的檢測方法具有通用性，檢測對象可以是任意靶分子，應(yīng)用范圍廣。利用本發(fā)明可以很方便地實(shí)現(xiàn)對靶分子的快速、靈敏、選擇性檢測。文檔編號G01N21/76GK101832935SQ200910047299公開日2010年9月15日申請日期2009年3月10日優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日發(fā)明者宋世平,樊春海,王麗華申請人:蘇州市長三角系統(tǒng)生物交叉科學(xué)研究院有限公司